Tcnicas Analticas Instrumentales

Trabajo Prctico N 2

Espectroscopia de Fluorescencia

RESUMEN
En el siguiente trabajo se aprendi el manejo de aparatos tales como el Nanodrop 3000
(espectrofluormetro) y Nanodrop 1000 (Espectrofotmetro). Con los resultados obtenidos
se armaron grficas y curvas de calibracin, por medio de las mismas se hall la
concentracin de una muestra incgnita.
INTRODUCCIN

La fluorescena (C20H12O5) del grupo de la xantinas es una molcula hidrosoluble de

color rojizo intenso, sus enlaces doble conjugados captan un fotn de alta energa y lo
devuelven como fotn de baja energa produciendo fluorescencia.
La fluorescencia es un tipo particular de luminiscencia la cual consigue la excitacin
mediante la absorcin de energa en forma de radiacin electromagntica denominada
fotn. Una de sus caractersticas es absorber las radiaciones en la longitud de onda del
UV y transmitir a longitudes ms largas en el UV Visible, es decir, absorben fotones con
una determinada energa y liberan fotones con una energa menor. Este proceso es
inmediato, donde el tiempo de absorcin y emisin ronda en los 10 segundos, cuando se
cesa la radiacin tambin cesa el fenmeno de fluorescencia. En el procedimiento la luz
emitida es filtrada, recogida y medida por un detector, normalmente un tubo
fotomultiplicador (PMT), y cuantificada en unidades relativas de fluorescencia (RFU).
Existen variables que se deben tener en cuenta para realizar las mediciones, estas
afectan la fluorescencia tales como: la estructura, temperatura, solvente, pH,
concentracin y quenching (se refiere a cualquier proceso que disminuye la intensidad de
un fluorforo sin cambiar el espectro de emisin).
Un mtodo efectivo para descubrir la concentracin de una muestra incgnita es hacer
diluciones seriadas de la muestra madre o stock, medir sus absorbancias y luego aplicar
la ecuacin de Lambert-Beer teniendo ciertos recaudos en las limitaciones. Un factor que
se debe tener en cuenta es la deteccin de puntos discrepantes (valor extremo que
sobresale del resto de los valores de un conjunto de datos) o puntos correspondientes a
concentraciones muy elevadas. Aunque no todos los puntos discrepantes afectan de igual
manera a la recta de calibrado tiene mucha ms influencia los puntos situados en los
extremos que los situados en el intervalo. La presencia de estos ltimos suele afectar a
los coeficientes de regresin por ende a la ecuacin de la recta y por ello deben ser
eliminados para disminuir errores en los resultados.
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METODOLOGA EXPERIMENTAL
A partir de 8 diluciones seriadas 1/2 de una solucin madre de fluorescena
PM=332,306gr/mol en 0,1M en PBS (buffer fosfato salino PO pH=7) se llev a cabo un
barrido de emisin de las distintas soluciones a travs de un nanodrop 3000 y un barrido
de absorcin de las mismas a travs de un nanodrop 1000. El primer procedimiento se
realiz por medio de una micropipeta calibrada, se tom cada dilucin seriada en un
orden creciente de concentracin, para no arrastrar muestra entre pipeteos y afectar la
concentracin, se insert cuidadosamente en un nanodrop 3300.
-3
4

El barrido se realiz en un rango de 400-750 nm, a partir de los datos proporcionados por
el detector los RFU (relative fluorescence units) se construy un grfico de RFU vs
concentracin de las muestras y se obtuvo la ecuacin de la lnea de tendencia y el valor
de R2. Luego se procedi a calcular la concentracin de una muestra incgnita de
fluorescena.
En el barrido de absorcin de diluciones seriadas de fluorescena se obtuvo el espectro de
absorcin en un rango de 220-750 nm de las diluciones seriadas y se determinaron sus
longitudes de onda mxima. Luego se construy una curva de calibracin (absorbancia vs
concentracin), y se procedi a calcular la ecuacin de la recta lineal de lambert-beer se
elimin los puntos discrepantes de la misma para reducir el margen de error y se us esa

ecuacin para calcular la muestra incgnita la cual se interpolo al grfico de regresin

lineal.
RESULTADOS
1. Espectroscopia UV-VISIBLE , resultado obtenidos con el Nanodrop 3300 , se
mide absorbancia de las diluciones seriadas de fluorescena.

Se eligi una longitud de onda donde las muestras absorban en todos los puntos de forma
continua
longitud de onda

concentracin (M)

absorbancia

442 nm

0,00078125

0,317

0,0015625

0,613

0,003125

1,215

0,00625

2,003

0,0125

2,192

0,025

2,16

Se extrapolan los resultados a una grfica :

Para mejorar la regresin lineal se descartaron los puntos discrepantes correspondientes

a los valores de absorbancia 2,16 y 2,192 ya que los mismos no pertenecen a la porcin
lineal de la curva, no puede considerarse al aplicar la ecuacin de Lambert-Beer ya que
no es vlida ms all de dicha lnea.

Se hacen los clculos de la ecuacin de la recta para averiguar la concentracin de la

muestra incgnita:
Y=305,95X +0,1407
Donde la variable Y indica la absorbancia y la variable x indica la concentracin.
Absorbancia (442 nm) = 1,67
1,67-0,1407 = X
305,95

X= 4,998 x10 M (CONCENTRACIN MUESTRA INCGNITA)

-3

Redondeamos cumpliendo con mtodo de cifras significativas a 5x10 M

-3

Se interpolo la muestra incgnita en el grfico de regresin lineal demostrando que

concuerda con dicha recta:

2) Se realiz las distintas mediciones de la misma diluciones de la muestra de

fluorescena, pero esta vez con un Espectrofotmetro el instrumento utilizado fue el
nanodrop 1000 :

Se plantea utilizando como en el caso anterior la utilizacin de la ecuacin de la recta

para calcular la concentracin de la muestra stock o madre :
RFU(ST0CK)= 95352,3
Y=2x10 -4647,8
7

Donde la variable y indica el RFU y la variable x indica la concentracin.

x= 95352,2 + 4647,8 = 5x10-3 M (concentracin muestra incgnita)
2x10
7

Se interpolo la muestra incgnita en el grfico de regresin lineal demostrando que

concuerda con dicha recta:

DISCUSIN
Analizando los resultados obtenidos se observ que la intensidad de fluorescencia medida
en unidades de RFU no se registr en las muestras uno, dos y ocho.
La intensidad de fluorescencia es directamente proporcional a la concentracin de la
especie absorbente (relacin lineal), debido a que al haber mayor nmero de molculas
excitadas hay una mayor conversin interna entre sistemas y como consecuencia una
mayor emisin fluorescente. Las muestras uno y dos se escaparon de la linealidad del
expuesto anteriormente, el factor de la no deteccin de fluorescencia podra ser que al
haber un exceso de fluorescena en solucin, la cantidad de choques entre molculas
excitadas es mayor (quenching colisional) hay mayor libertad de movimiento entre
molculas y como consecuencia hay una mayor prdida de energa en forma de calor al
medio, imposibilitando as la emisin de radiacin. Otra explicacin para este fenmeno
es la autoabsorcin, eso ocurre cuando la longitud de onda de emisin emitida se solapa
con un pico de absorcin y la radiacin emitida atraviesa la disolucin y es reabsorbida
por otras molculas fluorescentes. Otra cosa que podemos considerar es el hecho que la
fluorescena por su estructura molecular tiene posibilidad de formar puentes de hidrgeno
entre sus molculas formando dmeros u otros agregados, esto se produce a altas
concentraciones donde dichas molculas se encuentran muy cercanas, dichas uniones
provocan disminucin de la intensidad de fluorescencia.
Analizando la curva de calibracin de concentracin vs absorbancia, segn la ley de
Lambert-Beer, la concentracin de la muestra es proporcional a la absorbancia, es decir
las muestras como la tres y cuatro fueron las de mayor absorbancia, esto se debe a que
al aumentar el nmero de molculas en solucin, hay ms molculas que absorben y
emiten radiacin. La menor absorbancia se dio en las muestras ms diluidas tales como la

ocho y la siete. A medida que se analiz las muestras ms concentradas se observ un

incremento de la absorbancia hasta un punto en que la mquina no detect emisin. Esto
sucedi a partir de la muestra dos, lo cual se pudo deber a que una de las limitaciones de
la Ley es que solo se puede aplicar a diluciones de muy baja concentracin, ya que a
altas concentraciones la distancia entre partculas absorbentes es tan pequea que se
produce una modificacin en la distribucin de cargas de las mismas, lo que se traduce en
una alteracin en la capacidad de absorcin a una longitud de onda determinada.
CONCLUSIN
Se concluye que la intensidad de fluorescencia y absorbancia son directamente
Proporcionales a la concentracin de la muestra si las soluciones se encuentran en los
lmites de validez la ley de Lambert Beer.
BIBLIOGRAFA
Qumica Orgnica ,Ralph .J.Fessenden y Joan S. Fessenden, Editorial
Iberoamericana,1982
Principios de Anlisis Instrumentales (sexta edicin); Douglas A. Skoog y F.James Holler;
2008.
Anlisis Qumicos Mtodos Tcnicas Instrumentales Modernas; Francis y Annick
Rouessac; 2003; MacGraw-Hill