Caracterizacin de putativas bacterias promotoras de crecimiento

vegetal aisladas desde volcanes Lascar e Isluga

Sebastin Hernndez
Estudiante de pregrado, Departamento de Ciencias Qumicas y Recursos Naturales,
Facultad de Ingeniera, Ciencias y Administracin, Universidad de La Frontera, Temuco,
Chile

Resumen
En los ltimos aos como consecuencia del cambio climtico la aridez propia de los suelos del norte chileno
se ha desplazado hacia el sur del pas, lo que con el paso del tiempo se ha convertido en una modificacin
notoria en cuanto a produccin agrcola. Dentro de las caractersticas propias de suelos ridos se encuentra la
elevada presencia de sales y la deficiencia de agua que afectan negativamente al crecimiento de los cultivos.
Las estrategias agrcolas utilizadas en la actualidad es la utilizacin de bacterias promotoras de crecimiento
(PGPR) las cuales poseen cualidades beneficiosas para las plantas y su produccin. En este estudio s e
decidi caracterizar cepas bacterianas con putativa actividad PGPR extradas desde ambientes ridos como
son los volcanes Lascar e Isluga, con el fin de evaluar su resistencia al stress salino analizando su crecimiento
y su actividad antioxidante catalasa y SOD. Los ensayos que se llevaron a cabo fueron por medio de cultivos
suplementados con distintas concentraciones PEG para el dficit de agua y otros con concentraciones
diferentes de NaCl. Posteriormente se determin la actividad antioxidante de las c epas. La metodologa
mediante PEG da el crecimiento bacteriano debido al peso molecular mientras que la tolerancia al stress
salino abarc hasta la concentracin de 2,5% p/v. Las actividades antioxidantes fueron notorias a altos niveles
de NaCl. Las cepas investigadas presentaron un cierto grado de tolerancia al stress el cual no fue alto como lo
referencian otros estudios

1. Introduccin
El norte de Chile se caracteriza por ser una zona rida en donde se disponen de pocos o insuficientes
recursos de agua para abastecer las demandas de los diferentes sectores productivos (Astaburuaga, 2004).
Esta caracterstica se ha ido desplazando geogrficamente hacia el sur como una consecuencia del cambio
climtico que afecta al planeta. En esto Bascop (2013) prevee que para el 2050, Chile se convertir en un
pas ms caluroso, menos lluvioso lo que involucrar una modificacin de los paisajes debido a la menor
disponibilidad de agua y el avance de las zonas ridas lo cual afectara notoriamente la agricultura.
Es de importancia tener en cuenta el nivel de salinidad que afecta a los suelos ridos, en donde existen
importantes reas estriles o improductivas debido a la escasez de lluvias, por este motivo en climas como
este no existe la posibilidad del lavado natural del suelo. En ellos la escaza percolacin profunda junto a una
alta acumulacin de sales en el perfil del suelo afecta el normal crecimiento y desarrollo de muchas especies
+
cultivadas (Sierra, 2000). El NaCl es la sal principal en estos suelos y el in Na es mayormente responsable
del estrs osmtico que hace ms difcil la incorporacin de agua para las races generando inmediatamente
una prdida de turgencia en las clulas de la planta (Viramontes, 2015).

Microorganismos provenientes desde ambientes extremos son conocidos por adaptarse a las condiciones de
sus alrededores. As las bacterias extradas de condiciones salinas podrn tolerar altas concentraciones de
sal y las provenientes de ambientes con dficit hdrico podrn sobrevivir en altas temperaturas y bajo
contenido de humedad (Egamberdieva, Shrivastava, & Varma, 2015). Dentro de las estrategias para mejorar
la produccin agrcola est la utilizacin de las llamadas PGPR (Plant-Growth promoting rhizobacteria),
microorganismos con efecto benfico para el crecimiento vegetal a travs de mecanismos como estimul ar la
absorcin de nutrimentos o evitando la accin de agentes patgenos (Esquivel-Cote, Gavilanes-Ruiz, CruzOrtega, & Huante, 2013).
Dentro del rea ocupada por el Desierto de Atacama y los Andes Centrales conocidas como Regin de
Tarapac y Regin de Antofagasta entre los 18 y 26S corresponden a las reas de mxima penetracin de
la aridez hacia el interior del continente sudamericano (Villagrn & Castro, 2003). Estas zonas extremas
pueden ser un interesante reservorio de microorganismos PGPR, es por esto que en esta investigacin se
estudiarn putativas PGPR obtenidas desde los volcanes Lascar (232145S 674355 W) e Isluga
(190715S 684915 W) con el fin de evaluar su eficiencia en la tolerancia a estrs salino y deficiencia de
agua, para as tener mayores indicios del potencial reservorio de microorganismo de inters productivo que el
Norte de Chile puede llegar a ser.

2. Objetivos
2.1 Objetivo General
Evaluar la tolerancia a stress salino por parte de putativas PGPR obtenidas desde los volcanes Isluga y
Lascar.
2.2 Objetivos Especficos
Evaluar la tolerancia a la sequa por parte de putativas PGPR a distintas concentraciones de PEG.
Evaluar el nivel de crecimiento bacteriano de putativas PGPR a distintas concentraciones de NaCl.
Determinar actividades enzimticas catalasa y superxido dismutasa a distintas concentraciones de NaCl para
putativas PGPR.
3. Metodologa
3.1 Cepas PGPR
Las putativas PGPR fueron obtenidas desde los volcanes Lascar (232145S 674355 W) e Isluga
(190715S 684915 W) desde muestras de suelo en Diciembre de 2014. Los cdigos de cada cepa son:
I1, I6, I13, I14, I27, I28, L7, L25, L8, L17, 67B, 76A, LS132, SA32A, SS234.
3.2 Ensayo de tolerancia a la sequa mediante PEG
Se inocul 50L de stock perteneciente a cada cepa en tubos de LB estriles incubndose en shaker durante
24 horas a 30C y 90 rpm. Cumplido este tiempo se transfirieron 200L de cada cultivo a una multiplaca y se
midi el OD de estas a 600 nm, procedindose a igualar la densidad ptica entre las cepas. Por otra parte se
transfirieron 200L de cada concentracin de medio LB suplementado con PEG (0%,20%,40%,60%) a una
multiplaca. Se tomaron 10L de cada cepa con OD estandarizada y se llevaron a los medios LB
suplementados con PEG para cada concentracin llevndose a incubacin en shaker a 28C y 90 rpm por 96
horas. Se realizaron mediciones de absorbancia a 600 nm cada 24 horas hasta cumplir el tiempo total.
3.3 Ensayo de tolerancia a stress salino

Se prepar un cultivo over night tomando 50L de stock de cada cepa e inoculando tubos con 5mL de LB
estril para incubarlos en shaker durante 24 horas a 30C y 90 rpm. Pasado este tiempo, de la misma forma
que en el ensayo con PEG, se igualaron las OD de los cultivos ya crecidos. Por otra parte fueron preparados
medios LB suplementados con NaCl a distintas concentraciones (0%,5%,7.5% y 10% p/v) tomando 200L de
cada concentracin y llevndola a microplaca. Desde los cultivos con OD estandarizada se tomaron 10L y se
inocularon los respectivos medios LB suplementados con NaCl. El ensayo en microplaca fue incubado a 30C
y 90 rpm durante 96 horas, realizando mediciones de absorbancia en un lector de microplaca cada 24 horas.
Se procedi a graficar el crecimiento por da y tratamiento en Microsoft Excel y las dos cepas con mejor
eficiencia fueron seleccionadas para ensayos posteriores.
3.4 Obtencin de extracto enzimtico
Inicialmente se procedi a preparar distintos medios de LB con 0%, 5%, 7.5% y 10% p/v de NaCl utilizndose
5mL de cada concentracin de medio en tubos de ensayo. Se realizaron inculos tomando 50L de dos
stocks bacterianos (I27 y L8) para cada concentracin de NaCl correspondiente. Estos fueron incubados en
shaker a 30C y 90 rpm durante 48 horas. Cuando ya hubo crecimiento, se realiz una extraccin de protenas
mediante ciclos de congelado-descongelado como lo indica Johnson & Hecht (1994). El extracto proteico fue
cuantificado mediante el mtodo de Bradford (Bradford, 1976).
3.5 Medicin de actividad catalasa
Para la medicin de catalasa la reaccin se llev a cabo con 15L de extracto enzimtico, 29L de buffer
fosfato de potasio TFK 1M (pH=7) y 58L de H 2O2 el cul fue adicionado mediante un inyector SynergyTM HT
multimode microplate reader. Despus de 60s de iniciada la reaccin se procedi a medir la absorbancia de
las muestras a 240 nm. Las actividades enzimticas fueron calculadas mediante la ley descrita por Whiteley &
Lee (2006):

3.6 Medicin de actividad SOD

La actividad SOD se midi de acuerdo a la capacidad de inhibir la reduccin fotoqumica del azul de tretazolio
(NBT). Los blancos fueron analizados sin extracto enzimtico
Una unidad enzimtica fue definida como la cantidad de extracto libre capaz de inhibir el 50%del azul de
tretazolio a pH 7. La actividad especfica fue expresada como Umg-1 (Bojadzhieva & Emanuilova, 2005)

3. Resultados
3.1 Identificacin de cepas bacterianas
Las bandas de ADN analizadas por DGGE y previamente secuenciadas fueron comparadas con las
secuencias existentes en la base de datos NCBI mediante la herramienta BLAST con el fin de identificar el
gnero al cual podran pertenecer las putativas PGPR utilizadas en este estudio. Los resultados obtenidos se
pueden observar en la Tabla 1.
3.2 Crecimiento bacteriano bajo stress por sequa
Los resultados del ensayo realizado para testear como afecta la deficiencia hdrica en el crecimiento
bacteriano mediante la utilizacin de PEG en los medios de cultivo revelaron un decrecimiento considerable
de estos como puede observarse en la Figura 1. Al comparar el OD obtenido a las 12 horas para el
tratamiento al 0% en PEG y el medido a las 48 horas se pudo notar esta drstica disminucin de los niveles
de absorbancia, por ejemplo para la cepa I27 al 0% la cual registr un OD de 0,17 a las 12 horas, pas a 0,01
al final del ensayo. Comportamiento similar sufrieron el resto de las cepas cultivadas en los distintos

tratamientos de PEG, donde incluso algunas cepas inhibieron totalmente su crecimiento a las 48 horas para
los 20% y 60%; al 40% no hubo crecimiento bacteriano en absoluto
3.3 Crecimiento bacteriano bajo stress salino
El nivel de crecimiento bacteriano registrado a las 24 horas (Figura 2) indica que no existe una diferencia
notoriamente significativa entre las cepas I1, I14, I27 y L25 al 0% de NaCl comparadas con el tratamiento
preparado al 2,5% de NaCl. Entre los tratamientos 0% y 5% se exponen un mayor grado de diferencia para
las cepas I27, L25 y L8 las que son significativamente distintas con respecto al tratamiento al 0% de N aCl al
realizar un anlisis de varianzas unicamente entre los comentados tratamientos. Los cultivos realizados a las
concentraciones de 7,5% y 10% de NaCl difieren notoriamente con respecto al 0% NaCl representando un
bajo grado de tolerancia al stress salino.
Con respecto a los resultados registrados en la segunda medicin a las 48 horas de comenzado el ensayo se
obtuvo un grado de similitud aceptable para las cepas I1, I14, L7 y L25 entre el 0% y 2,5% de NaCl, en cambio
existi diferencias significativas entre I27 y L8 de los mismos tratamientos, teniendo el ltimo un n ivel de
crecimiento considerable a 2,5% NaCl
Tabla 1. Identificacin de putativas PGPR desde Isluga y Lascar mediante BLAST con sus respectivos
cdigos utilizados en este estudio.
Cepa
I1

Origen
Isluga

I6

Isluga

I13
I14

Isluga
Isluga

I27
I28

Isluga
Isluga

L7

Lascar

L25
L8

Lascar
Lascar

L17

Lascar

Secuencia relativa o clonados ms cercanos (Accesion no.)

Stress tolerant bacteria Serratia sp. BHU-S105 from agricultural
soil (KF863909)
Antimicrobial bacteria Klebsiella sp. 090305 from magrove plants
(EF522816)
Klebsiella oxytoca strain UICT/G2 from soil (FJ465169)
Phytase production bacteria Klebsiella sp. AR58 from poultry field
soil (KC189608)
Erwinia amylovora strain HSA 6 (GQ222272)
Enterobacteriaceae bacterium EKM601Z from Luffa acutangula
seeds (KT222785)
Ammonia-oligotrophic and diazotrophic heavy metal-resistant
Serratia liquefaciens strains isolated from pioneer plants and
main tailings (KR150436)
Klebsiella sp. strains yjk3 16S ribosomal RNA gene (KJ150720)
Antifungal bacteria Serratia sp. salahi.zh from rhizosphere soil
(KF434590)
Endophytic bacteria Klebsiella michiganensis strain AB-181
isolated from Populus euphratica grown in arid and semi-arid
areas (KF817784)

Identidad (%)
99
99
100
99
100
99,7
100

99
99,9
99,9

Figura 1. Crecimiento bacteriano de putativas PGPR ante stress por sequa inducida por PEG. Las barras con misma
letra no son significativamente diferentes (Tukey, 0,05).

Existi una baja similitud significativa entre las cepas I1, I14, L7 y L8 de los tratamientos al 0% y 5,0% de NaCl
(Figura 2) , mientras que I27 y L25 difieren entre tratamientos. Los cultivos dispuestos a las concentraciones
7,5% y 10% de NaCl mantuvieron su bajo nivel de crecimiento obteniendo una diferencia alta con respecto al
0%.
3.4 Mediciones de actividades antioxidantes
Se cuantific la cantidad de protenas por mL para dos cepas putativas PGPR las cuales fueron I27 y L8
despus de crecer al 0%, 5%, 7,5% y 10% de NaCl durante 48 horas. Los mayores niveles de protena se
obtuvieron al 0% para I27 y L8. En cuanto a la actividad CAT los niveles ms altos se obtuvieron para el
tratamiento al 10% de NaCl (Figura 3) siendo L8 el mayor valor con 249,5 U/mg siguindolo I27 con 182,9
U/mg. El valor de actividad obtenido al 0% para L8 registra un valor de 70,07 U/mg el cual no tuvo una
diferencia significativa con respecto al valor de actividad registrado en 7,5% el cual fue de 82,84 U/mg. Los
valores ms pequeos de actividad se obtuvieron al tratamiento de 5% NaCl para I27 y L8 con 8,19 U/mg y

38,95 U/mg respectivamente, cayendo tambin en esta categora I27 al 0% con 47,80 U/mg el cual no tuvo
una diferencia significativa.
El ensayo de actividad SOD mostr en cambio que al tratamiento de 10% I27 logr los nivele s ms altos de
actividad enzimtica con 64,49 U/mg mientras que L8 al mismo tratamiento obtuvo 15,18 U/mg. Los valores
ms bajos de actividad SOD se registraron al 0% de NaCl con 8,87 U/mg para I27 y 6,71 U/mg siendo estos
similares a I27 al 5% el cual tuvo 9,35% NaCl. La tendencia del ensayo fue un aumento de la actividad SOD a
medida que la concentracin salina creca.
4. Discusin
El alineamiento local realizado mediante BLAST indic que las cepas extradas desde los volcanes Lascar e
Isluga pertenecan a la familia Enterobactericiae, especficamente a los gneros Serratia, Klebsiella y Erwinia.
Ahemad & Kibret (2013) exponen especies de bacterias PGPR con funciones ya conocidas, como Klebsiella
oxytoca y Serratia marcescens. Por otra parte Erwinia amylovora ha sido identificada como un patgeno de
plantas, existiendo otra especie del mismo gnero, Erwinia herbicola, la cual es una PGPR caracterizada por
combatir al patgeno (Bent & Sadik, 2006).

Figura 2.Crecimiento de cultivos y tolerancia al stress salino a distintas concentraciones de NaCl. Las
barras con misma letra indican que no hay diferencias significativas (Tukey,P 0,05).

Figura 3. Mediciones de actividad enzimtica a distintas concentraciones de NaCl para I27 y L8. Las barras con
misma letras no representan diferencias significativas (Tukey, P 0,05).

El anlisis a travs del alineamiento local realizado representa una aproximacin para la identificacin de una
cepa bacteriana, del cual podemos tener una idea de la familia y gnero pero donde se hace necesario un
anlisis genmico y fenotpico ms profundo para determinar especficamente la especie a la cual pertenece
cada aislado bacteriano.
En cuanto al ensayo realizado mediante PEG para inducir stress por sequa en las cepas bacterianas se pudo
observar un decrecimiento notable a medida que pasaba el tiempo. As al final del ensayo, los niveles de
absorbancias haban ya disminuido desde 10 a 20 veces aproximadamente. Este comportamiento anmalo
pudo deberse al peso molecular del polmero de PEG que fue utilizado en este ensayo. Cox (1966) realiz un
estudio acerca de la viabilidad en el crecimiento de cultivos bacterianos con respecto al peso molecular de los
reactivos de PEG (200, 600, 1540, 15000 respectivamente) y las concentraciones de este (0, 10, 20, 30, 40,
50 y 60% p/v). El resultado demostr la decada en la viabilidad de los cultivos bacterianos a medida que se
aumentaba el peso molecular del PEG y la concentracin de este. La explicacin a este fenmeno se basa en
que el tamao del polmero de PEG 15000, debido a su tamao, penetra muy lentamente la pared celular sin
entrar al citoplasma lo que implica un dao tanto de la pared como de la funcin de divisin celular.
El rango de tolerancia al stress salino observado segn los resultados fue desde 0% hasta 2,5% de
concentracin de NaCl. Despus de este rango se comenz a observar una cada progresiva en la viabilidad
celular a medida que aumentaba la concentracin, manifestada en la disminucin de la cantidad de OD
registrada. Con respecto al tiempo de exposicin al stress este no pareci daar el crecimiento de los cultivos
ya que las OD se mantuvieron o incluso aumentaron en ciertos casos. El caso de la cepa L8 result
interesante debido que a las 24 y 48 horas present un nivel de crecimiento notoriamente ms elevado que el
resto de las cepas. Nakbanpote et al. (2014) identific putativas cepas PGPR como Serratia sp. las cuales
presentaban alta actividad PGPR como fijacin de N 2, produccin de IAA y solubilizacin de fsforo bajo
condiciones de stress salino, donde el rango de crecimiento en NaCl abarcaba hasta el 8% p/v. Egamberdieva
& Kurachova (2009) obtuvieron que la tolerancia al stress por sal en Serratia sp. llegaba hasta el 3% p/v.
Estudios en Klebsiella pneumoneae muestran una OD muy cercana a 0,08 a un porcentaje de NaCl de 2% p/v
el cual es similar a los valores de OD que las cepas I14 y L25 dieron a las 48 hrs en 2,5% NaCl. El ensayo de
tolerancia al stress salino realizado durante este estudio debera ser acompaado de un anlisis de viabilidad
mediante crecimiento de colonias y otros que muestren la actividad PGPR bajo stress por NaCl con el fin de
corroborar la eficiencia de las cepas ms all de su nivel de su capacidad de crecimiento.
El sistema antioxidante enzimtico es uno de los mecanismos protectores los cuales incluyen a la SOD y
catalasa (Scandalios, 1993). El aumento de las actividades enzimticas se caracteriz por un aumento frente
a la mayor concentracin de stress salino que se aplic a cada tratamiento. Catalasa y SOD son enzimas

involucradas en el alivio frente al stress causado por especies reactivas de oxgeno (ROS) protegiendo a las
clulas del dao de estas molculas reactivas, capaces de causar peroxidacin en la membrana lipdica de las
clulas (Kim & al., 2012). Los altos niveles de actividad al 10% de NaCl resultante para las cepas L8 e I27 son
entonces una consecuencia del sometimiento frente a un stress salino alto.
5. Conclusiones
La identificacin de cepas obtenidas desde Lascar e Isluga da como resultado gneros bacterianos que ya
han sido documentados por su capacidad de promover el crecimiento de plantas.
El estudio del stress causado por dficit hdrico mediante PEG debe ser llevado a cabo con uno que no sea
txico para las clulas bacterianas para as obtener resultados fiables.
La utilizacin de NaCl para evaluar el cambio frente al stress dio que las cepas investigadas llegaban a una
tolerancia cercana al 2,5% de NaCl donde luego decaan su crecimiento. El aumento de concentracin s alina
eso s dio con un aumento de actividades enzimticas antioxidantes las cuales son consecuentes con un
stress alto.
Las cepas estudiadas demostraron un grado de tolerancia al stress salino, el cual no fue alto con respecto a lo
que puede ser observado en la literatura.
6. Bibliografa
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