Determinacin de inmunoglobulinas sricas

Cortes, JC., Giraldo, M., Meja, MA,. Meja, LF.

ABSTRAC
Immunoglobulins are part of humoral immunity in humans five isotypes IgG , IgA , IgM , IgD and
IgE recognized , which can only be determined by immunochemical techniques , in which
precipitation of sodium sulfite is used , which It has as its foundation the precipitate
immunoglobulins and generate turbidity in the sample . In the present study the presence of serum
immunoglobulins was determined by carrying out the precipitation test sodium sulfite.
The samples used for the determination procedure Igs were obtained from different hatchlings,
which through an established procedure, appropriate behavior obtained when generating the set
objectives.
The procedure was performed for determining Igs in neonatal samples was proof precipitation of
salts of sodium sulfite, this test is based on the precipitation of Ig's serum by sodium sulphite salts.
This test is useful when the presence of Ig's in newborns is determined, which allows us through
some determinations and according to certain characteristics of the solutions made obtaining a
number of Ig present in a set amount of serum.
The infant depends on the mother for their antibodies, which are responsible for protecting your
body in its first months of life. In the mother during her last period of gestation secret colostrum
which provides proteins which are rich in IgA and IgG

RESUMEN
Las inmunoglobulinas hacen parte de la
inmunidad humoral, en el ser humano se
reconocen cinco isotipos lgG, IgA, lgM, lgD
e IgE, las que solo pueden ser determinadas
por tcnicas inmunoquimicas, en la cual se
emplea la precipitacin de sulfito de sodio,
que tiene como fundamento el de precipitar
las inmunoglobulinas y as generar turbidez
en la muestra. En el presente estudio se
determin la presencia de inmunoglobulinas

sricas llevando a cabo la prueba de

precipitacin de sulfito de sodio.
Las muestras utilizadas para realizar el
procedimiento de determinacin de Igs, se
obtuvieron de diferentes neonatos, las cuales
por medio de un procedimiento establecido,
obtuvieron un comportamiento adecuado a la
hora de generar los objetivos establecidos.
El procedimiento que se realiz para la
determinacin de Igs en las muestras de
neonatos fue la prueba de precipitacin de
sales de sulfito de sodio, esta prueba se basa

en la precipitacin de Igs del suero por sales

de sulfito de sodio. Esta prueba es til cuando
se determina la presencia de Igs en recin
nacidos, la cual nos permite por medio de
unas determinaciones y segn ciertas
caractersticas de las soluciones realizadas la
obtencin de un nmero de Ig presentes en
una cantidad establecida de suero.
El neonato depende de la madre para obtener
sus anticuerpos, los cuales sern responsables
de la proteccin de su organismo en sus
primeros meses de vida. En la madre durante
su ltimo periodo de gestacin secreta el
calostro el cual proporciona protenas las
cuales son ricas en IgA e IgG.

INTRODUCCIN
Las inmunoglobulinas (lgs) o anticuerpos
constituyen el componente humoral de la
respuesta inmune especfica en todos los
vertebrados. En el humano se reconocen
cinco clases o isotipos de lgs denominados
lgG, IgA, lgM, lgD e IgE, diferenciables
gracias a las propiedades estructurales y
antignicas particulares de sus cadenas
pesadas. Debido a su gran heterogeneidad
estructural y funcional (probablemente la ms
notable de todas las protenas sricas) las Igs
solamente pueden ser cuantificadas mediante
tcnicas inmunoqumicas. En todas estas
tcnicas, las Igs actan como antgeno frente
a sueros producidos en animales, especficos
contra epitopos (determinantes antignicos)
caractersticos de cada clase de cadena
pesada.
Entre
la
variedad
de
mtodos
inmunoqumicos que se ha implementado
para la cuantificacin de las principales clases
de lgs sricas (lgG, IgA, e lgM) se destacan
tres:

La inmunonefelometria se basa en la
medicin de la dispersin de la luz causada
por la formacin de complejos antgenoanticuerpo, al agregar un suero anti-lg (G, A o
M, segn el caso) a la muestra de suero a
determinar. Posee la ventaja de proveer
resultados en un lapso muy breve, de poder
automatizarse para analizar gran nmero de
muestras y, adems, debido a que no se basa
en la difusin, no causa error la presencia de
polmeros de Igs de tamaos diversos. Sin
embargo, su desventaja principal radica en la
interferencia que puede causar la turbidez de
la muestra, ya sea por la presencia de
complejos inmunes contaminantes, o por
agregados moleculares de origen no
inmunolgico
La inmunoelectroforesis en cohete se ha
utilizado para cuantificar las lgs. Se hace
migrar electroforticamente al antgeno
dentro de un gel de agarosa que contiene los
anticuerpos correspondientes, de tal modo
que se forma un precipitado alargado cuya
altura guarda proporcionalidad con la
concentracin de antgeno en la muestra.
Por ltimo, la inmunodifusin radial (IDR)
se basa en la difusin libre de la muestra en
un gel que contiene los anticuerpos contra la
Ig que se desea cuantificar, lo que da lugar a
la formacin de un anillo o crculo de
precipitacin alrededor del punto de
aplicacin, cuya rea guarda proporcionalidad
con la concentracin de antgeno en la
muestra.
Esta tcnica se puede efectuar de dos formas.
La primera, llamada de difusin completa o
de Mancini, permite la difusin total de la
muestra (lo que implica un tiempo de 48-72
horas para la lectura) y permite obtener una
lnea recta al graficar el dimetro del anillo
precipitado elevado al cuadrado contra la
concentracin de lg La cuantificacin de las

lgs sricas tiene inters tanto desde el punto

de vista clnico como de investigacin.2
La cantidad de inmunoglobulinas totales en
muestras sricas puede determinarse por su
precipitacin diferencial con sulfato de Sodio,
Zinc u otras sales, en concentraciones
apropiadas. Este es un ensayo cualitativo y se
usa
comnmente
para
medir
las
concentraciones de inmunoglobulinas en el
suero. La adicin de sulfato de Sodio en una
muestra de suero resulta en una solucin
turbia debido a las globulinas precipitadas y
suspendidas en el mismo.
La turbidez es proporcional a la cantidad de
miligramos de inmunoglobulina utilizando
controles
estndar
conocidos
para
compararlos con el del animal. Existen varias
maneras de medir la cantidad de
inmunoglobulinas
1. Espectrofotmetro, la turbidez se
mide en un espectrofotmetro a A600
nm. Una curva estndar se realiza
usando los valores del suero
problema
A
contra
la
600
concentracin mg/ml
2. Mtodo practico o de campo, donde
se compra la turbidez en los tubos
contra un papel impreso
La cantidad de inmunoglobulinas en el suero
de un animal se incrementan con la edad,
indicando el desarrollo gradual de
inmunocompetencia.3

prueba es til cuando se determina la

presencia de Igs en recin nacidos hasta tres
semanas de edad. Su interpretacin es de tipo
objetivo y tiene un porcentaje de
confiabilidad de aproximadamente 93%. Es
indispensable que la muestra sea de suero y
no plasma, ya que este contiene protenas que
se precipitaran con las Igs, dando falsos
resultados. La hemlisis parcial de la muestra
parece no afectar los resultados de esta
prueba. Esta prueba permite diagnosticar la
Falla en la Transferencia de Igs.5
El objetivo de esta prctica determinar la
presencia de inmunoglobulinas (Igs) sricas
llevando a cabo la prueba de precipitacin de
sulfito de sodio.
PALABRAS CLAVE: Prueba, Precipitacin,
Sales, Suero, Hemolisis.

METODOLOGA
Para dar inicio a la prctica se necesitaron:

Tres beakers
Pipetas plsticas
Pipeteadores
Puntas de pipetas
Sulfito de Sodio
Muestra de neonatos
(Ver figura 1)

Test del Sulfito de Sodio (PSNa):

Es una tcnica similar a la anterior. La lectura
se efecta a ojo desnudo, por la presencia,
ausencia o ligera turbidez producida por el
sulfito de sodio que precipita las Igs.4
Fundamento
Esta prueba se basa en la precipitacin de Igs
del suero por sales de sulfito de sodio. Esta

Figura 1. Fotografa de los materiales utilizados para inciar el

laboratorio de inmunologia. Foto: Mariana Giraldo:
Laboratorio Microbiologa Universidad Libre Seccional
Pereira Sede Belmonte. Foto tomada con Mvil Samsung
Galaxy S4, Cmara 13 MP 19

Se prepararon tres soluciones de sulfito de

sodio al 14%, 16% y 18% agregando 2.0 ml
de agua destilada. (Ver figura 2).

Figura 4. Extraccin del plasma del neonato Jonny

Giraldo. Foto: Mariana Giraldo: Laboratorio Microbiologa
Figura 2. Soluciones preparadas al 14%, 16% y 18%. Foto:
Mariana Giraldo: Laboratorio Microbiologa Universidad Libre
Seccional Pereira Sede Belmonte. Foto tomada con Mvil Samsung
Galaxy S4, Cmara 13 MP 19

Se tom la solucin preparada de sulfito de

sodio agregndose 1000 micro litros y 100
micro litros de suero a los tres tubos de
ensayo segn correspondiera. (Ver figura 3).

Figura 3. Agregando la solucin preparada a uno de los

tubos de ensayo. Foto: Mariana Giraldo: Laboratorio
Microbiologa Universidad Libre Seccional Pereira Sede
Belmonte. Foto tomada con Mvil Samsung Galaxy S4,
Cmara 13 MP 19

Para continuar con el laboratorio se tom la

muestra de neonatos (Jonny Giraldo),
extrayendo el plasma de este (Ver figura 4)

Universidad Libre Seccional Pereira Sede Belmonte. Foto

tomada con Mvil Samsung Galaxy S4, Cmara 13 MP 19

El plasma extrado se insert en los tres tubos

de ensayo (Ver figura 5), finalmente se esper
aproximadamente 30 minutos para observar y
analizar su resultado.

Figura 5. Tres tubos de ensayo con su plasma extrado del

neonato. Foto: Mariana Giraldo: Laboratorio Microbiologa
Universidad Libre Seccional Pereira Sede Belmonte. Foto
tomada con Mvil Samsung Galaxy S4, Cmara 13 MP 19

RESULTADOS Y DISCUSION

Al terminar de realizar correctamente el

procedimiento de la prueba, se analiz el
resultado obtenido teniendo en cuenta la
composicin de los tubos de ensayos para
observar respectivamente segn la turbidez y
precipitacin
de
stos
la
correcta
interpretacin de los resultados.
Como se pudo observar (Fig. 5) la turbidez se
present en los ensayos realizados con las
soluciones al 16% y 18%. Los resultados

obtenidos en la prueba se interpretan de la

siguiente manera.
Precipitacin en los tubos con 14, 16 y
18%: 15 mg Ig/ml de suero.
Precipitacin en los tubos con 16 y 18%: 5
- 15 mg Ig/ml de suero.
Precipitacin en los tubos con 18% o
ninguna precipitacin: 5 mg Ig/ml de
suero.5
Segn estos datos teora consultada se indica
que la muestra analizada presenta de 5 15
mg de Ig por cada ml de suero.
El anlisis realizado se hace con muestras
obtenidas de neonato para determinar que por
medio del calostro el recin nacido adquiera
Ac maternos y no incurra en infecciones
neonatales que pueden causar de la muerte.
Es por eso que se realiza la prueba con sangre
de recin nacido para determinar la cantidad
de inmunoglobulinas en cada una de las
muestras. 6
La reaccin que se da en la precipitacin de
Ig, segn la teora consultada en el artculo
realizado por Arriaga C. Efecto del uso de
calostro comercial sobre la inmunidad pasiva
en terneros Holstein nacidos en invierno de la
Universidad Austral de Chile, ocurre una
precipitacin selectiva de protenas de alto
peso molecular, incluyendo inmunoglobulinas
que en el caso de los neonatos vienen
secretadas en el calostro. El aumento de la
concentracin de reactivo o solucin salina
induce turbidez en concentraciones menores
de protenas de alto peso molecular, el
problema es que a soluciones ms bajas de
sulfito
de
sodio
genera
mayores
concentraciones de Ig, por lo cual da una
sobre estimacin de Ig.7

CONCLUSIONES

Aunque los neonatos nacen con el sistema

inmune competente, es importante realizar
anlisis de Ig en neonatos para determinar la
capacidad antignica para que el recin
nacido no incurra en infecciones neonatales.
La prueba realizada se fundamenta en la
obtencin de un anlisis a ojo de
caractersticas que se nos presenta en las
soluciones realizadas con sales de sulfito y
suero para determinar por medio de unas
estimaciones, unas cantidades establecidas de
medicin de mg de Igs en ml de suero.
La estimacin dada para el anlisis de las
muestras realizadas en el laboratorio dio
como resultado una turbidez en las muestras
de las soluciones 16% y 18% debido a la
precipitacin de las Igs, la cual nos sirve
como indicador para realizar un marco de
lectura que nos muestra 5 15 mg de Ig por
cada ml de suero. A lo que podemos afirmar,
que el individuo al que se le extrajo la
muestra calostro inadecuadamente, siendo por
tanto susceptibles a enfermar.8

ANEXOS
1. Investigar que es un anticuerpo
monoclonales.
Los
anticuerpos
monoclonales
son
glucoprotenas especializadas que hacen parte
del sistema inmune, producidas por las
clulas B, con la capacidad de reconocer
molculas especficas (anticuerpos).
Son herramientas esenciales en el mbito
clnico y
biotecnolgico; ya que, han
probado ser tiles en el diagnstico de
enfermedades infecciosas, inmunolgicas y
neoplasticas, asi como tambin en el estudio
de interacciones patgeno-hospedero y

marcacin, deteccin y cuantificacin de

diversas molculas 9
2. Describa tcnicas en las cuales se
emplean anticuerpos monoclonales
Actualmente, la incorporacin de las tcnicas
de biologa molecular e ingeniera gentica y
proteica han permitido ampliar el horizonte
de la generacin de anticuerpos monoclonales
y sus usos. Se han encontrado tcnicas como
hibridacin, quimerizacion humanizacin,
produccin de anticuerpos monoclonales
humanos9

3. Investigar las tcnicas que tiene

mayor
sensibilidad
para
la
deteccin de anticuerpos

Inmunofluorescencia indirecta: La
inmunofluorescencia indirecta (IFI)
es una de las tcnicas ms utilizadas
en los estudios de autoinmunidad
debido a su fcil manejo y
estandarizacin. Sin embargo, la
lectura e interpretacin requieren de
amplia experiencia. La tcnica se
basa en el reconocimiento de los
anticuerpos
que
reconocen
estructuras antignicas celulares
nativas.
Deteccin de anticuerpos antiIDNAn con Crithidia luciliae como
sustrato: El ensayo se fundamenta en
el reconocimiento de los anticuerpos
que reaccionan contra el DNAn de la
mitocondria gigante (cinetoplasto)
del parsito Crithidia luciliae. La
tcnica es altamente especfica, pero
poco sensible, por lo que es
conveniente
en
ciertos
casos
confirmar los resultados con otras
pruebas ms sensibles como el
ELISA.

Anticuerpos antinucleares: La
identificacin y cuantificacin de los
anticuerpos antinucleares (ANA) no
solo incluye antgenos que se
localizan en el ncleo de clulas
HEp-2, sino tambin antgenos del
citoplasma.
Anticuerpos anticitoplasma del
neutrfilo: Para la deteccin de los
ANCA, la IFI se utiliza tambin
como prueba de tamizado inicial,
debido a que en ella se observan los 3
patrones de tincin que se relacionan
con manifestaciones clnicas de
autoinmunidad. Los patrones son: el
citoplsmico
o
cANCA,
el
perinuclear o pANCA y el atpico o
xANCA. El patrn cANCA se
caracteriza por presentar una tincin
citoplsmica en neutrfilos fijados
con etanol o acetona.
Anticuerpos rgano especfico:
Mediante IFI se identifica la
reactividad de los autoanticuerpos
presentes en las muestras de
pacientes
con
enfermedades
autoinmunes, los cuales reconocen
antgenos
especficos
de
determinados
rganos.
Para
caracterizar el o los antgenos
especficos reconocidos por los
anticuerpos, es necesario utilizar
ELISA que contienen los antgenos
especficos.
Ensayo inmunoenzimtico: ELISA
es una de las tcnicas ms utilizadas
para identificar o confirmar la
especificidad de los anticuerpos
presentes en las muestras de los
pacientes
con
enfermedades
autoinmunes. Adems, por su fcil
estandarizacin, manejo y variedad
de
antgenos
disponibles,
ha
desplazado notablemente a otras

tcnicas como el radioinmunoensayo

para la deteccin de anticuerpos antiDNAcd (conocido tambin como
prueba de Farr), ya que no utiliza
radionclidos, lo que hace que sea
una tcnica accesible y de bajo
riesgo.
Ensayo luminomtrico mltiple: La
deteccin de ELM se realiza por
fluorescencia, con lo que la
sensibilidad del ensayo es mayor. El
ELM se fundamenta en la deteccin
de anticuerpos que reaccionan

contra antgenos especficos, los

cuales recubren esferas que
contienen diferentes proporciones
de un fluorforo (combinaciones

de un fluoruro rojo y otro infrarrojo).

Electroinmunotrasferencia:
Se
fundamenta en el reconocimiento de
anticuerpos que tienen especificidad
por antgenos que se absorben en una
membrana (de nitrocelulosa o nylon).
Los antgenos adsorbidos en la
membrana
fueron
previamente
separados
en
geles
de
poliacrilamidadodecil sulfato de
sodio (PAGE-SDS) y transferidos a
las membranas.
Nanoensayo
luminomtrico
mltiple: Permite identificar la
reactividad simultnea contra 10
autoantgenos. Es una tcnica que
deriva de la EIT y se fundamenta en
el reconocimiento de autoantgenos
adsorbidos en pequeas cantidades o
puntos, en placas de 96 pozos de
ELISA con fondo de membrana de
nitrocelulosa.10

4. Que tcnicas podra diferenciar

animales vacunados de animales
infectados?

La
estrategia
que
permite
diferenciaranimales
infectados
de
vacunados o DIVA, se ha propuesto como
una posible solucin para erradicacin
del virus de la influenza sin tener que
eliminar las aves.
El empleo de test de inhibicin de la
neuraminidasa se utiliza para el estudio
de anticuerpos en muestra de suero de
animales vacunados o infectados11
5. Indicar
que
es
una
inmunoglobulina,
tipos
de
inmunoglobulina y sus esquemas

Las inmunoglobulinas son los

ingredientes fundamentales de la
respuesta inmune adquirida humoral.
Las inmunoglobulinas son un grupo
de glicoprotenas presentes en los
fluidos de suero y el tejido de todos
los mamferos, clasificndose en base
a la diferencia estructural en las
regiones constantes en las cadenas
pesadas.
Existen 5 tipos bsicos de
inmunoglobulinas: IgG, IgM, IgA,
IgD, IgE. Son sintetizadas por los
linfocitos B (IgM, IgD) y por las
clulas plasmticas derivadas de ellos
(IgG, IgA, IgE).12
IgM e IgG se detectan principalmente
en el plasma sanguneo y en el
lquido intersticial

Estructura IgM, Tomado de:

http://recursostic.educacion.es/cie
ncias/biosfera/web/alumno/2bachill
erato/inmune/contenidos11.htm

Estructura IgA, tomado de:

http://recursostic.educacion.es/cienc
ias/biosfera/web/alumno/2bachillera
to/inmune/contenidos11.htm

Estructura IgG, tomado de:

http://www3.uah.es/mapa/seminarios/act
ivos/Biol%20Sanitaria/Temas%207%20a
%2010/IgG/pages/IgG1_jpg.htm

Las IgA aparecen fundamentalmente

en secreciones (saliva, lgrimas,
secrecin
intestinal,
etc.),
recubriendo mucosas expuestas al
ataque
de
agentes
patgenos
externos.

La IgD es una inmunoglobulina

asociada a la membrana de los
linfocitos B. Su funcin primaria de
las es la de servir como detectores de
antgenos para las clulas B. Se
detecta marginalmente en el plasma.14

Estructura IgD, tomado de:

http://recursostic.educacion.es/cienc
ias/biosfera/web/alumno/2bachillera
to/inmune/contenidos11.htm

Las IgE son anticuerpos que, si bien

inicialmente se liberan al plasma por
las
clulas
plasmticas,
son
integrados en la membrana de otras
clulas (mastocitos), participando en
las reacciones de hipersensibilidad.13

b- Separacin por adhesin selectiva:

- Los monocitos se adhieren a
superficies de vidrio o plstico y
se separan de los linfocitos.
- Los linfocitos B se fijan a
columnas o jeringas en lana de
nylon o algodn (se obtienen
poblaciones separadas de LB y
LT).
Estructura IgE, tomado de:
http://recursostic.educacion.es/cienc
ias/biosfera/web/alumno/2bachillera
to/inmune/contenidos11.htm

6. La
prctica
de
laboratorio
determina
cualitativa
o
cuantitativamente los resultados
justifique la respuesta.

Estudio de marcadores y antgenos de

membrana: (diferencia poblaciones y
subpoblaciones de clulas). Las tcnicas ms
empleadas son:
a) Citometra de flujo con FACS (separador
celular activado por fluorescencia)
b) Separacin
membrana:

por

sus

antgenos

de

Separacin magntica

La prctica realizada fundamentalmente

se trata de una prueba tanto cualitativa
como cuantitativamente, se debe de tener
en cuenta un anlisis a ojo de cualidades
como la turbidez y precipitacin en las
muestras, y determinar por medio de unas
estimaciones cuantitativas, unas cantidades
establecidas de medicin de mg de Igs en ml
de suero.7

7. Investigar qu tipo de tcnicas

pueden medir la inmunidad de
base celular.

Separacin de las clulas de la

respuesta inmune: Las clulas
inmunes se pueden separar por varios
mtodos.

a- Aislamiento por centrifugacin en

gradiente de densidad (FicollHypaque): Con esta tcnica
podemos obtener de forma
separada
las
clulas
mononucleares
(linfocitos
y
monocitos) de los granulocitos.

Separacin por afinidad en columnas

c) Formacin de rosetas por linfocitos B y T

Pruebas de proliferacin celular:

Ensayo de linfoproliferacin:
Se realiza sobre linfocitos purificados (capa
blanca) o sangre entera. Se basa en que los
linfocitos proliferan tras su estimulacin con
un mitgeno (inespecfico) o con un antgeno
especfico. Se emplea con dos fines:
Medir el estado global de la respuesta
celular de un animal.
Diagnosticar si un animal ha estado
expuesto previamente a un microorganismo
intracelular (por vacunacin o infeccin
natural).
Reaccin linfocitaria mixta: Se basa en que
los linfocitos proliferan cuando se incuban en
presencia de otras clulas con antgenos
CMH II diferentes. Se emplea para
determinar
la
histocompatibilidad
en
transplantes.

Determinacin de la produccin de
citoquinas (IFN-): valoracin de la
funcionalidad de linfocitos T CD4+

- Prueba del Interfern- : Deteccin por un

ELISA tipo sndwich del IFN- producido
por linfocitos Th1 tras su estimulacin con el
antgeno. Slo se estimulan los linfocitos con
contacto previo con el mismo antgeno. Se
realiza en sangre entera con heparina y es una
prueba complementaria a la tuberculina
para el diagnstico de la tuberculosis bovina.
- ELISPOT: Sirve para medir los linfocitos T
secretores de una determinada citoquina
mediante una modificacin del ELISA de
captura.
- Deteccin de citoquinas intracelulares
por citometra de flujo: Permite determinar
el perfil de citoquinas producidas por un tipo
celular mediante una citometra de flujo
especial que permite la entrada de los
anticuerpos al interior de la clula.

Ensayos
de
citotoxicidad:
valoracin de la funcionalidad de
los linfocitos T CD8+ o citotxicos y
de las clulas NK.

Determinan la capacidad del linfocito Tc para

lisar clulas diana que presenten el complejo
pptido-CMH I especfico que reconocen.
Estas clulas diana al haber sido cultivadas
previamente con cromo radiactivo (Cr51),
cuando se lisan liberan radiactividad que
puede medir. Se realiza con linfocitos
aislados de sangre perifrica.15

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