EXTRACCION DE ADN

Muestra: BACTERIAS
1. En un tubo eppendorf con 500 L de T.E. resuspender y colocar la cosecha de un cultivo
puro.

2. A este tubo , agregarle micro perlas ( aproximadamente hasta que ocupen un volumen de
0.1 ml ) y sellarlo muy bien con parafilm.
3. Llevar a vortex por 5 minutos ( revisar cada cierto tiempo comprobando que no se pierda
volumen )
4. La mezcla ( debe estar turbio ) , pasarlo a un nuevo eppendorf y agregarle 600 ul de Fenolcloroformo-alcohol isoamilico. Agitar por inversin unos segundos y se obtendr un color
cremoso homogneo.
5. Aadir 500L de la mezcla Fenol : Cloroformo : Alcohol isoamilico.
6. Agitar vigorosamente 50 veces o usar un vrtex.

7. Centrifugar 10 minutos a 13000 RPM. (Debemos tener un volumen aproximado de 1000 L

(500 L de T.E. + 500 L F:CL:AI.)
8. Recuperar el sobrenadante en un nuevo tubo eppendorf (aprox. 300 400 L de muestra)
sin tocar la interfase.
9. Aadir 800 L de Isopropanol (minimo se aaden 1,5
volmenes de solucin)
10. Centrifugar por 10 minutos a 13 000 RPM (verificar si hay
precipitacin).
11. Colocar los tubos eppendorf con la cabeza dirigida hacia
afuera (esto nos indicara la posicin de nuestro DNA).

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(Eliminar el isopropanol por inversin en un papel toalla una sola vez). quedarse con el
pellet.
Lavar con 500 L de Etanol al 75%.
Centrifugar a 13 000 RPM por 30 60 segundos. Volver a retirar el sobrenadante por
inversin.
Centrifugar nuevamente a 13 000 RPM por 30 segundos. Retirar el sobrenadante con una
micropipeta de 200 L tratando de no tocar el pellet.
Secar a 60C por 5 minutos en una estufa o termoblock.
Resuspender el DNA con 100 uL. de agua destilada estril.
Analizar el DNA por Electroforesis.

Muestra: HISOPADO BUCAL

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Colocar el hisopo en el tubo eppendorf

Agregar 300 ul de buffer de Lisis + 2 ul de proteinasa K y mezclar con la pipeta.
Incubar a 65C por 10 minutos
Pasado el tiempo retirar los hiposo del tubo con una pinza tratando de que la mayor
cantidad de liquido quede en el tubo.
Agregar 4 ul de RNAsa al tubo
Incubar a 37C por 30 minutos
Una vez terminada la incubacin, 500 ul de la mezcla fenol: cloroformo: Alcohol isoamilico
, cerrar bien el tubo y llevarlo a vortex por 10 segundos ( turbidez )
Centrifugar por 10 minutos a 13 000 rpm
Centrifugar 10 minutos a 13000 RPM. (Debemos tener un volumen aproximado de 1000 L
(500 L de T.E. + 500 L F:CL:AI.)
Recuperar el sobrenadante en un nuevo tubo eppendorf (aprox. 300 400 L de muestra)
sin tocar la interfase.
Aadir 800 L de Isopropanol (minimo se aaden 1,5 volmenes de solucin)
Agregar Isopropanol frio ( aproximadamente 800 ul ) y mezclar por inversin unos minutos
Centrifugar a 13 000 rpm por 10 minutos ( se
observara un pellet )
Eliminar el isopropanol por decantacin y
proceder al lavado del ADN
Agregar 500 ul de Etanol 75 y centrifugar
nuevamente a 13 000 rpm de 1 2 minutos
Eliminar el Etanol y dejar secar en un
termoblock a 65 por unos minutos ( tubo
abierto )
Una vez que se evaporo todo el Etanol,
resuspender en ADN en 100 ul de Agua ultrapura e incubar en calor de 3 4 minutos y
congelar hasta su uso.

Muestra: TEJIDO VEGETAL

1. Colectar 1g de tejido y proceder inmediatamente o congelar a -20 C
2. Homogenizar el tejido fresco o triturar el tejido congelado en nitrgeno lquido y transferir
a tubo eppendorf.
3. Colocar 500 ul de la mezcla Fenol-cloroformo-alcohol isoamilico a 300 ul de muestra lisada
y mezclar por vortex por 60 seg.
4. Centrifugar por 10 minutos a 12000 RPM
5. Transferir la fase acuosa (300 ul) a un nuevo tubo eppendorf, use tip nuevo para cada
muestra. Descarte el tubo con las fases organica e intermedia.
6. Adicionar 2 volmenes de Isopropanol absoluto, mezclar (Invertir) el tuvo varias (30-40)
veces. Y dejar en reposo por 10 min a 0C
7. Centrifugar los tubos por 5 minutos a temperatura ambiente, en una microcentrifuga.
8. Descarte el sobrenadante
9. Enjuague en pellet con 0.5 ml etanol fro al 70%, el etanol de debe aadir muy despacio sin
destruir o disolver el pellet.
10. Centrifugar los tubos por 5 minutos a temperatura ambiente, en una microcentrifuga.
11. Remover el sobrenadante, deje los tubos abiertos e invertidos para secar los pellet.
12. Resuspender el pellet en 50 ul de agua desionizada o TE.