SEDIMENTACIJA

U
CENTRIFUGI
dr. Mara Aleksi, vanr. prof

SEDIMENTACIJA TALOENJE
U HETEROGENIM DISPERZNIM
SISTEMIMA

Dve faze: disperzna faza i disperzno sredstvo

Disperznu fazu ine dispergovane estice koje mogu biti razli

razliitih dimenzija
Ponavljanje Fizika hemija:
Podela estica prema veliini prenika (za estice sfernog oblika):
d < 1 nm, pravi rastvori,
1 < d < 100 nm koloidni disperzni sistemi
d > 100nm grubo disperzni sistemi (suspenzije i emulzije)

Dispergovane
estice

d < 1 nm
Haoti
Haotino
BrownBrown-ovo kretanje

1 < d < 100 nm

d > 100nm

Haoti
Haotino
BrownBrown-ovo kretanje
Sedimentacija
u centrifigi

Sedimentacija
pod dejstvom
gravitacije

Brown-ovo kretanje

Dispergovane estice pre

prenika manjeg od 5 m
kroz disperzno sredstvo kre
kreu se haoti
haotino,
sudaraju se sa molekulima disperznog sredstva i
stalno menjaju pravac.
Spontano se ne taloe i ostaju ravnomerno
rasporeene u rastvoru.
rastvoru.
Ove estice mogu se taloiti samo u centrifugi
gde je mnogostruko
pove
poveana
gravitaciona sila.

Sedimentacija pod dejstvom

zemljine tee

Fg = Ft r

Fg gravitaciona sila
Ftr sila trenja
r polupre
poluprenik estice
gustina rastvara
rastvaraa
0 gustina estice
g gravitaciona konstanta
f koeficijent trenja
brzina sedimentacije
koeficijent viskoznosti

Fg =

4 3
r ( 0 )g
3

Ftr = 6 r = f
=

2r 2 ( - 0 ) g
9

Stoksova jednaina

Sedimentacija eritrocita

Brzina sedimentacije eritrocita je brzina kojom se taloe crvena krvna zrnca zavreme od ~ 1h. To je uobiajen
hematoloki test koji se izvodi u tkz. Westergren tubes vertikalno postavljenim graduisanim cevicama koje
se ispune uzorcima krvi, a brzina sedimentacije se izraava u mm/h (ESR - erythrocyte sedimentation rate )
Normalne ESR vrednosti iznose 3mm/h za mukarce i 7mm/h . Ove vrednosti rastu sa godinama starosti i
generalno su vee kod ena. ESR vrednosti su poviene u stanjima anemije.

Sedimentacija ....

Prehrambeni

priozvodi
- sirupi, sokovi...

Kozmetiki preparati
- losioni, ....

Farmaceutski preparati
- medicinski sirupi
- suspenzije za oralnu upotrebu...

Sedimentacija u centrifugi

Dispergovane estice male mase koje se

ne taloe spontano, pod dejstvom

gravitacione sile, mogu se taloiti ako na
njih deluje sila koja je jaa od
gravitacione.

To se postie u centrifugama...

Centrifugiranje - teorijski principi

Na esticu deluju tri sile:
1. Centrifugalna sila (Fc)
2. Sila potiska (Fp)
(buoyancy Fb)

3. Sila trenja (Ftr) (friction Ff)

Fc = m 2 r

Fp = m 2 rV

Ftr = f

Fc = Fp + Ftr

m 2 r = m 2 rV + f

r rastojanje od estice
do ose rotacije
m masa estice
ugaona brzina
V parcijalna specifi
specifina
zapremina estice
brzina sedimentacije
gustina rastvara
rastvaraa

m 2 r (1 V )
=
f
m(1 V )
s=
f

= s 2r

s=

Koeficijent sedimentacije s predstavlja

sedimentacionu brzinu pri jedininoj
vrednosti centrifugalnog ubrzanja
m(1 V )
f

ms 1

s = 2 [=] 2 = s
r ms

= s 2r

Brzina sedimentacije predstavlja

promenu rastojanja od ose rotacije sa vremenom:

s=

dr
= s 2r
dt

m( 1 V )

=
2r
f

Principi centrifugiranja
Centrifuga je ureaj za izdvajanje estica iz rastvora na osnovu njihove
 Veli
eliine
 Oblika

s=

 Gustine ili
 Viskoznosti

m( 1 V )
=
2r
f

u zavisnosti od
 sredine u kojoj se nalaze
ili
 brzine rotiranja

Postoji veza izmeu faktora oblika f i koeficijenta difuzije D

Postoji veza izmeu faktora oblika f i koeficijenta difuzije D

 Pri taloenju estica raste njihova koncentracija na dnu.

 estice prelaze iz oblasti vee gustine u u oblast manje gustine
 JAVLJA SE DIFUZIJA.
DIFUZIJA

D=

RT
Nf

Koeficijent difuzije

f = 6r

Kombinacijom jedna
jednaina...

s=

s=

m( 1 V )
=
2r
f

m( 1 V )
RT
ND

Molekulska
olekulska masa
makromolekula

D=

mN =

M=

RT
Nf

sRT
D( 1 V )

sRT
D( 1 V )

Svedbergova jedna
jednaina

Teoriju centrifuge postavio je 1923

vedski nau
naunik Theodor Svedberg
(18841884-1971)

1926 dobio je Nobelovu nagradu!

Svedberg je....

konstruisao prve ultracentrifuge,

izveo jedna
inu
jedna
inu za brzinu
brzinu talo
taloenja makromolekula
u centrifugi,
centrifugi,
postavio jednu od najta
najtanijih metoda za merenje
molekulskih masa makromolekula


ms 1
s = 2 [=] 2 = s
r ms
Jedinica za koeficijent sedimentacije s
Vrednosti koeficijenta sedimentacije za bioloke molekule su 1-500 x10-13s
U ast T. Svedberga koeficijent sedimentacije se izraava u jedinicama Svedberg (S)

1S 10 13 s

CETRIFUGA
Ureaj u kome se pod dejstvom centrifugalne
sile razdvajaju estice razli
razliite:

mase (veli
(veliine, oblika),
gustine,
viskoznosti sredine,
brzini rotacije

Delovi centrifuge
1. Rotor
2. Elektromotor
3. Kivete

ROTORI

Telo

rotora

Nosa kiveta

Telo rotora je povezano je sa

elektromotorom.
Rotori su napravljeni od legura
Al i Ti - velika vrstina
Obrtanje rotora stvara
centrifugalno polje.
Uzorci se nalaze u kivetama
koje se postavljaju u nosa

ROTORI

SA FIKSNIM

UGLOM

SA PROMENLJIVIM

POLOAJEM
KIVETA (swing-out rotori)

ROTORI SA FIKSNIM UGLOM

Ugao izmeu ose kivete i ose rotacije je stalan.

stalan.
o
o
25 -40
estice se talo
taloe na zidu kivete, a ne na dnu.
Nedostatak: postavljanjem kiveta u vertikalan polo
poloaj
talog mo
moe da se vrati u rastvor

ROTORI SA FIKSNIM UGLOM

ROTORI SA PROMENLJIVIM POLO

POLOAJEM
KIVETA

SWING-OUT ROTORI

ROTORI SA PROMENLJIVIM POLO

POLOAJEM
KIVETA

SWING-OUT ROTORI

Leita za kivete su vezana za rotor preko osovine.

Kada rotor ubrzava, pod dejstvom centrifugalne sile, kivete
zauzimaju horizontalan poloaj.

Kada rotor usporava, kivete se vraaju u vertikalan poloaj.

Smer centrifugalne sile je uvek ka dnu kivete, gde se estice i taloe.

ROTORI SA PROMENLJIVIM POLO

POLOAJEM KIVETA

SWING-OUT ROTORI

Rotori sa promenljivim poloajem kiveta su sporiji.

Koriste se za sedimentaciju velikih estica.

Primer razdvajanje eritrocita od plazme.

Manjeg su kapaciteta.

KIVETE
Plastine za jednokratnu upotrebu
razliitih zapremina
50l do nekoliko cm3
Staklene
sa ravnim, okruglim ili konusnim dnom
Eppendorf

Ispravno korienje centrifuge

Pre smetanja u rotor
centrifuge, proverite da li je
kiveta suva, a telo rotora isto.

Uravnote
Uravnoteite kivete i
izbegavajte da ih prepunite.
Kod rotora sa fiksnim uglom
pod dejstvom centrifugalne sile
rastvor se podie u kivetama,
pa moe iscureti iz kivete.

Tipovi centrifuga prema

broju obrtaja:

Standardne

2 000 - 4 000 rpm

Velike brzine
10 000-25 000 rpm

Ultrabrze
40 000-80 000 rpm

ispod 10 000 rpm

preko 20 000 rpm

Tipovi centrifuga prema nameni:

Laboratorijske centrifuge

Mikrocentrifuge

Centrifuge velikog kapaciteta

Ultracentrifuge

Protone centrifuge

EFIKASNOST CENTRIFUGE

Broj

obrtaja u minuti (n)

Revolutions per minute (rpm)

Relativna

centrifugalna sila
Relative centrifugal force RCF

Relativna centrifugalna sila

Fc r 2
RCF = =
g
g

RCF predstavja odnos

centrifugalne sile i
ubrzanja gravitacije

= 2 n/60
g=980cm/s2

RCF = 1,118 10-5 r n 2

Broj obrtaja u minuti (n)

Rastojanje od ose rotacije (r) u cm

Centrifuga bila bi efikasnija to je r ve

vee.
Ipak, centrifuge imaju relativno malo r (naprezanje materijala),
ali im se pove
poveava broj obrtaja n.

NOMOGRAM
veza izmeu n i RCF i r

Kod rotora sa fiksnim uglom razlikuju se min i max RCF

RCF = 1,118 10-5 r n 2

Na vrhu kivete, rmin
RCF = 1,118 10 -5 3,5 200002 g = 15680g

Pri dnu kivete,

kivete, rmax
RCF = 1,118 10 -5 7,0 20000 2 g = 31360 g

Kod rotora sa fiksnim uglom, max RCF mo

moe biti
dvostruko ve
vea od min RFC.
Kod rotora sa promenljivim polo
poloajem kiveta razlika
izmeu RFC mo
moe biti znatno ve
vea.

Tipovi centrifugiranja
Preparativno
centrifugiranje

Talo
Taloenje uzoraka ve
veih
dimenzija
Razdvajanje organela i molekula
Ve
Vee zapremine uzorka
Manje ist uzorak
Ne poseduje opti
optiki sistem za
detekciju (frakcije se sakupljaju i
analiziraju naknadno)
Mo
Moe se odrediti koeficijent
sedimentacije i molekulska masa

Analiti
Analitiko
centrifugiranje

Talo
Taloenje uzoraka malih
dimenzija
Male zapremine uzorka, <1ml
Uzorak mora biti veoma ist
Centrifuga poseduje opti
optiki
sistem za detekciju i pra
praenje
toka sedimentacije
Veoma precizno se odreuje
koeficijent sedimentacije i
molekulska masa molekula

Optiki sistem analitike

ultracentifuge
Za vreme rotacije rotora (ta
(tano odreenom
brzinomi na konstantnoj temperaturi) kroz
kivetu prolazi UV svetlost iz ksenonske
lampe (180nm 800nm) koja je
propu
proputena kroz opti
optiki sistem i sti
stie
fotomultiplikatota i detektora.
U zavisnosti od vrste opti
optikog sistema
mo
moe se meriti:
1. INDEKS PRELAMANJA
liren (schlieren)opti
(schlieren)optiki sistem
2. INTENZITET RASUTE SVETLOSTI
Rejlijev (Rayleigh) interferencioni sistem
3. APSORBANCIJA
apsorpcija UV svetlosti

Analitikim ultracentifugiranjem...

Na osnovu izmerenih vrednosti:

indeksa prelamanja,
prelamanja intenziteta rasute svetlosti ili apsorbancije
odreuje se raspodela koncentracije ispitivanog uzorka u
odreenim vremenskim intervalima, a na osnovu toga moe se
odrediti:

Relativna molekulska masa makromolekula

isto
istoa makromolekula

Promene u relativnoj molekulskoj masi kao posledica
graenja supermolekularnih
supermolekularnih kompleksa

Oblik i konformacione promene u strukturi proteina

Ispitivanje vezivanja liganda...

Tehnike centrifugiranja
Diferencijalno
centrifugiranje

Centrifugiranje u
gradijentu gustine

Brzinsko
ultracentrifugiranje

Ravnote
Ravnoteno
(izopikni
izopikniko)
ko)
centrifugiranje

Diferencijalno centrifugiranje
Centrifugiranje uzorka se ponavlja vie puta
Koristi se kada je:
gustina disperznog sredstva kontinualna

gustina disperznog sredstva << gustine estica koje se taloe

viskoznost disperznog sredstva mala

tada brzina sedimentacije zavisi samo od veli

veliine estica i
primenjene brzine centrifugiranja (G sile).
ZASNIVA SE NA RAZLICI BRZINA SEDIMENTACIJE
BIOLOKIH ESTICA USLED NJIHOVIH RAZLIITIH
VELIINA, OBLIKA I GUSTINE

t1

Dekantovan
supernatant

t2

talog

Dekantovan
supernatant

t3...

talog

Centrufugiranje uzorka se ponavlja vie puta

t1 - vreme prvog centrifugiranja, istaloe se najvee estice
Supernatant 1 se dekantuje i odvoji od taloga
t2 - vreme drugog centrifugiranja t2 > t1, brzina drugog centrifugiranja > brzina
prvog centrifugiranja, taloe se manje estice
Supernatant 2 se dekantuje i odvoji od taloga
t3 - vreme treeg centrifugiranja t3 > t2, brzina treeg centrifugiranja> brzina drugog
centrifugiranja, taloe se najmanje estice

PRIMER:

Diferencijalno
centrifugiranje
je
standardna tehnika
za izolovanje
elijskih organela iz
homogenizovanog
tkiva.

Centrifugiranje u gradijentu gustine

Ako je gustina disperznog sredstva < gustine estica,

estice e se talo
taloiti u disperznom sredstvu,
na dnu kivete.

Ako je gustina disperznog sredstva > gustine estica,

estice e ostati na povr
povrini disperznog sredstva.

Kada je gustina disperznog sredstva = gustini estica,

estice e ostati ravnomerno rasporeene u disperznom
sredstvu.

Centrifugiranje u gradijentu gustine

Kontinualni
gradijent

Gustinski gradijent se formira

korienjem rastvora organskih
supstanci ija gustina raste od
vrha kivete ka dnu.

Koriste se rastvori: saharoze,
saharoze
glicerola, manitola, dekstrana,
polisaharida...

Materijal koji formira gustinski
gradijent ne sme da utie na
aktivnost i hidrodinamike
osobine biolokog uzorka.

Gustinski gradijent moe biti:
kontinualni ili
diskontinualni

Diskontinualni
gradijent

Centrifugiranje u gradijentu gustine

Brzinsko
ultracentrifugiranje

Gustinski gradijent se formira pre

nanoenja uzorka
Gustina estice je ve
vea od max
gustine rastvora saharoze.
estice se razdvajaju na osnovu
razli
razliite brzine sedimentacije
(gradijent gustine poveava razliku
u pojedinih komponenti)
m 2r (1 V)
=
f
estice ve
vee mase sedimentuju
br
bre

Ravnote
Ravnoteno (izopikni
izopikniko)
ko)
centrifugiranje

Gustinski gradijent ne formira se

pre nanoenja uzorka, ve se pravi
homogena smea uzorka i rastvora.
Samograde
Samogradei gradijenti
Najee se koristi CsCl
Gustina estice je manja od max
gustine rastvora CsCl (estice ne
mogu pasti na dno kivete).
estice sedimentuju samo dok ne
dou do sloja ija je gustina jednaka
njihovoj.
estice se razdvajaju na osnovu
razliite gustine FLOTACIONE
(PLOVNE) GUSTINE

Brzinsko ultracentrifugiranje

A. Gustinski gradijent se formira tako to se u epruvetu sipaju, sukcesivno, rastvori saharoze

razliitih gustina, od veih na dnu ka sve manjim ka vrhu kivete.
B. Kada se uspostavi gustinski gradijent paljivo se doda rastvor estica koje treba razdvojiti.
C. Zapo
Zapoinje centrifugiranje: va
vano je zaustaviti
zaustaviti centrifugiranje na vreme,
vreme da se ne bi sve
estice istaloile.
D. estice ve
vee mase sedimentuju br
bre.
E. Frakcionisanje. estice razdvojene u epruveti mogu se fiziki razdvojiti:
a) epruveta se probui na dnu i sadraj iskaplje u odvojene frakcije
b) sedimentacija se vri u posebnim cevicama koje se zamrzavaju, a zatim seku.

PRIMER: razdvajanje transportne RNK od

ribozomalne RNK

Ravnote
Ravnoteno (izopikni
izopikniko)
ko)
centrifugiranje
A.

B.

C.

Centrifugiranje homogene smee

uzorka i rastvora CsCl.Nagradi se
gustinski gradijent CsCl. estice
sedimentuju samo dok ne dou do
sloja ija je gustina jednaka njihovoj.
Frakcionisanje - epruveta se probui
na dnu i sadraj iskaplje u odvojene
frakcije.
Detekcija - merenjem veliina koji su
srazmerne koncentraciji: A, n...

A) Centrifugiranje

B) Frakcionisanje

C) Pakovanje za dalju analizu

ili neku drugu upotrebu

Ravnote
Ravnoteno (izopikni
izopikniko)
ko)
centrifugiranje

Koristi se za razdvajanje estica

priblinih ili istih molekulskih masa, ali

razliitih gustina
Kao to su:

Nukleinske kiseline ili

elijske organele