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Cultivo de microorganismos
Gran parte de la microbiologa depende de la capacidad de
cultivar y mantener microorganismos en un laboratorio, y esto
solo es posible si se dispone de los medios de cultivo adecuados.
Adems, los medios especiales son imprescindibles para aislar e
identificar los microorganismos, evaluar la sensibilidad a los
antibiticos, analizar el agua y los alimentos, en la microbiologa
industrial y en muchas otras actividades. Aunque todos los
microorganismos necesitan fuentes de energa, carbono,
nitrgeno, fsforo, azufre y varios minerales, la composicin
precisa de un medio adecuado depender de la especie que se
quiere cultivar, porque las necesidades nutricionales varan
considerablemente. El conocimiento del hbitat normal de un
microorganismo es a menudo til para elegir un medio de cultivo
apropiado, porque sus necesidades de nutrientes reflejan su
ambiente natural.
Peso seco
(%)b
Molculas
por clula
Clases
diferentes
96
55
5
9.1
3.1
20.5
3.5
0.5
2
0.5
1
24,610,000
2,350,000
4,300
22,000,000
2.1
255,500
~2,500
1,850
2c
4d
1
~650
~350
~100
~50
~200
18
100
Los datos son de Neidhardt, F.C. y col (eds).1996. Escherichia coli y Salmonella typhimurium-Cellular and
Molecular Biology, 2a, ed, ASM; b Peso seco de una clula de E. coli creciendo activamente (2.8 x 10-13 g); c
Asumiendo que la peptidoglicana y el glucgeno son los polisacridos mayoritarios presentes; d Existen diversas
clases de fosfolpidos; de cada uno de ellos se presentan muchas formas debido a la variabilidad de los cidos
grasos entre las especies y las condiciones de crecimiento.
a
Requerimientos nutricionales
Las sustancias en el ambiente utilizadas por los organismos para
el anabolismo y el catabolismo se denominan nutrientes.
Nutriente. Sustancia requerida por los organismos para la
sntesis de materiales celulares y para la generacin de
energa y que es obtenida del ambiente
Los nutrientes se pueden dividir en dos clases: 1.
Macronutrientes, los que se requieren en grandes cantidades.
2. Micronutrientes, aquellos que se necesitan en pequeas
cantidades.
Algunos nutrientes constituyen la base sobre la cual la clula
sintetiza macromolculas u otras importantes estructuras
mientras que otros nutrientes sirven solo como generadores de
energa sin ser directamente incorporados al material celular;
algunos nutrientes pueden jugar los dos papeles.
Carbono
Oxgeno
Nitrgeno
Fsforo
Azufre
Potasio
Magnesio
Sodio
Calcio
Hierro
Manganeso
Molibdeno
Nquel
Selenio
Tungsteno
Vanadio
Zinc
Hierro
Funcin Celular
Requerido por los mamferos en el metabolismo de la glucosa, no se
conoce algn microorganismo que lo requiera
Vitamina B12, Transcarboxilasa (bacterias del cido lctico)
Lo requieren como cofactor algunas protenas implicadas en la
respiracin (citocromo c oxidasa), la fotosntesis (plastocianina) y las
destoxificacin de radicales libres (superxido dismutasa)
Varias enzimas lo requieren como cofactor. Por ejemplo, la
superxido dismutasa, la fotoliasa del fotosistema II.
Presente en enzimas que contienen flavina. Tambin presente en la
nitrogenasa, nitrato reductasa, sulfito oxigenasa, DMSO y TMAO
reductasas, formato deshidrogenasas, etc.
La mayora de las hidrogenasas, coenzima F430 de las metangenas,
deshidrogenasa de monxido de carbono, ureasa, etc.
Formato deshidrogenasa, selenocistena
Formato deshidrogenasas, oxotransferasas de termoflicos
Vanadio nitrogenasa, bromoperoxidasa
Anhidrasa carbnica, alcohol deshidrogenasa, DNA y RNA
polimerasas y protenas que se unen al DNA
Citocromos, catalasas, peroxidasas, protenas con hierro y azufre
(ferredoxina), oxigenasas, nitrogenasas
Constituyentes de los
microorganismos
Las cuatro principales macromolculas que
constituyen a los microorganismos son
entonces:
1. Protenas
2. Acidos nucleicos
3. Lpidos
4. Carbohidratos
Requerimientos de un medio de
cultivo
1. Fuente de carbono
2. Fuente de nitrgeno
3. Fuente de energa
4. Agua
5. Sales minerales
6. Factores de crecimiento
Medios definidos
Medio E de Vogel y
Bonner.
Medio de Knop
Medio de Fowell para
ascosporas
BHI
Gelosa sangre
Caldo nutritivo
Medio PDA
Medio Luria Bertani
Medio Baird Parker
Medios Simples
Los medios simples son medios comunes, que slo
tienen un tipo de infusin o extracto adems de
otros componentes. Son medios para fines
generales porque mantienen el crecimiento de
muchos microorganismos que no son muy
exigentes.
Ejemplo de estos tipos de medio son la gelosa
nutritiva, el PDA, el caldo simple o caldo
nutritivo.
Medios Enriquecidos
Los medios enriquecidos estn constituidos por algunas
sustancias que lo hacen ms nutritivo. En estos medios
puede crecer una gran variedad de microorganismos.
Como son medios complejos no se conocen las
cantidades exactas de sus componentes.
Se pueden incorporar sangre, suero, plasma y diversos
extractos nutritivos a un medio simple hacindolo
adecuado para el crecimiento de microorganismos
exigentes.
Ejemplos de estos medios de cultivo son el BHI, gelosa
sangre, medio Eugon, gelosa chocolate, agar Columbia,
medio Infusin de hgado, etc.
Medios Selectivos
Los medios selectivos favorecen el crecimiento de
microorganismos particulares debido a que entre sus ingredientes
poseen un inhibidor que nos permite escogerlos o seleccionarlos.
Las sales biliares o los colorantes como la fucsina bsica, el cristal
violeta, la eosina o el verde brillante permiten el crecimiento de las
bacterias Gram negativas, mientras que inhiben el crecimiento de
las Gram positivas.
Tambin se pueden aislar microorganismos incubndolos con
nutrientes que puedan utilizar de forma especfica. Un medio que
contenga celulosa ser muy efectivo para aislar bacterias que
digieran celulosa o bien la adicin de sustancias tales como el
NaCl o la sacarosa a concentraciones relativamente altas lograr el
propsito de aislar microorganismos definidos.
Ejemplos de medios selectivos son el agar EMB (Eosina Azul de
Metileno), agar ENDO, agar MacConkey, S-110, SS, gelosa Rosa
de Bengala, agar Biggy, agar Verde Brillante, etc.
Medio selectivo
En esta imagen se
observan colonias de
Legionella pneumophila
creciendo en el medio de
carbn
extracto
de
levadura.
Medios diferenciales
Son medios que distinguen, separan, diferencian grupos distintos
de bacterias e incluso permiten una identificacin tentativa de los
microorganismos segn sus caractersticas metablicas.
La gelosa sangre es tanto un medio diferencial como un medio
enriquecido. Sirve para distinguir entre bacterias hemolticas y no
hemolticas. La bacterias hemolticas producen zonas claras
alrededor de sus colonias debido a la utilizacin de los eritrocitos.
El agar MacConkey tambin es un medio diferencial ya que
contiene lactosa y rojo neutro de tal forma que las bacterias
fermentadoras del azcar aparecern de color rosa a rojo y son
fcilmente distinguibles de las colonias no fermentadoras.
Ejemplos de medios diferenciales son el Gelosa sangre, SS
(Salmonella-Shigella), agar MacConkey, agar Baird-Parker, agar
XLD, agar Vogel Johnson, Citrato de Simmons, LIA, Kligler,
Verde Brillante, etc. Ntese que algunos de estos medios son
adems selectivos.
Beta
Gamma
Medios de enriquecimiento
Enriquecer significa, en este caso, proporcionar al
microorganismo que se desea aislar todos los elementos nutritivos
necesarios para que alcance su ptimo crecimiento.
Las aplicaciones de esta metodologa estn sujetas a la pericia e
ingenio del investigador. Los medios de enriquecimiento se usan
para aumentar el nmero relativo de organismos de un tipo en
relacin al total. Por ejemplo, enriquecer un patgeno minoritario
particular presente en una muestra altamente contaminada con
otros microorganismos irrelevantes desde el punto de vista
mdico pero que se encuentran en franca mayora.
Ejemplos de estos medios son: caldo tetrationato de Meller,
caldo selenito de sodio, medio de Stuart, caldo Meller-Hinton,
caldo urea, caldo tioglicolato, agua peptonada, Monsur, etc.
Medios de transporte
Estos medios se utilizan para el transporte de
diversas muestras biolgicas evitando la muerte de
los microorganismos de inters.
La caracterstica de estos medios es que su
composicin permite la viabilidad de los
microorganismos
pero
no
permite
su
multiplicacin
Ejemplos de estos medios son los medios de
Stuart, de agua peptonada para Vibrio, Cary y
Blair, Glicerol-Solucin Salina, Amies y Douglas,
Hajna, Caldo de Fildes etc.
Bibliografa
2.9 Aislamiento
En los hbitats naturales, los microorganismos crecen en
poblaciones mixtas y complejas que contienen varias especies. Esto
representa un problema para el microbilogo porque no se puede
estudiar adecuadamente un nico tipo de microorganismo en un
cultivo mixto. Se necesita un cultivo puro o axnico, poblacin de
clulas que procede de una nica clula. La obtencin de cultivos
puros ha sido vital para el desarrollo y transformacin de la
microbiologa. Fue el bacterilogo alemn Robert Koch el iniciador
de las importantes tcnicas de aislamiento utilizando la superficie de
una papa, gelatina y mas tarde agar.
En casi 20 aos, se ha aislado a la mayora de los agentes patgenos
responsables de las principales enfermedades infecciosas humanas.
Para el aislamiento de microorganismos se cuenta con varios
mtodos, los mas usados son el mtodo de la estra cruzada y el
mtodo de las diluciones
Mtodos de Aislamiento
Mtodo de las diluciones
a) Dispersin con varilla
b) Vaciado en placa
Bibliografa
Aerobios obligados
Facultativos
Microaeroflicos
Aerotolerantes
Anaerobios
AEROBIOS OBLIGADOS
Los aerobios son capaces de crecer con
tensin de oxgeno que se encuentra en la
atmsfera (21%) y muchos pueden soportar
incluso concentraciones mas altas.
Estos microorganismos poseen enzimas como
catalasa, peroxidasa, superxido dismutasa
(SOD) que descomponen los productos txicos
derivados del metabolismo del oxgeno.
Ej.
Bacillus
spp.,
Pseudomonas
spp,
Mycobacterium
spp.,
Micrococcus
spp.,
Streptomyces spp.
ANAEROBIOS
Son organismos que carecen de sistemas
respiratorios y no pueden utilizar el oxgeno
como aceptor final de electrones. Estos
microorganismos no pueden producir energa
mediante la respiracin aerobia y deben utilizar
vas de fermentacin o respiracin anaerobia
para este objetivo. Mueren adems en su presencia
porque son incapaces de eliminar los productos
txicos derivados del metabolismo del oxgeno
(H2O2, O-2, OH- ).
Ej. Bacteroides, Fusobacterium, Clostridium,
Methanococcus.
FACULTATIVOS
Son microorganismos que pueden crecer en
ausencia o en presencia de oxgeno.
No lo requieren para crecer, pero lo hacen
mejor en su presencia llevando a cabo un
metabolismo aerbico. Cuando no hay
oxgeno, fermentan o realizan una
respiracin anaerbica.
Ej. Escherichia, Klebsiella, Salmonella,
Shigella.
MICROAEROFLICOS
Los microaeroflicos son aerobios que
pueden utilizar el oxgeno cuando su
tensin es mas baja que la del aire (210%), usualmente por su limitada
capacidad de respirar o porque poseen
algunas enzimas sensibles al oxgeno.
Ej. Campylobacter
AEROTOLERANTES
Son microorganismos que pueden tolerar o
soportar el oxgeno y crecer en su
presencia an cuando no lo utilizan.
Utilizan vas fermentativas o respiracin
anaerobia para la produccin de energa.
Ej, Enterococcus, Streptococcus.
Relacin con el
O2
Tipo de
metabolismo
Ejemplo
Habitat
Piel
Lo requieren
Respiracin aerbica
Micrococcus luteus
Facultativos
No lo requieren pero
crecen mejor en su
presencia.
Respiracin aerbica,
anaerbica y
fermentacin
Escherichia coli
Microaeroflico
Lo requieren pero a
niveles menores que
el atmosfrico
Respiracin aerbica
Spirillum volutans
No lo requieren y no
crecen mejor en su
presencia
Fermentacin o
Streptococcus
respiracin anaerbica pyogenes
Tracto respiratorio
superior
Daino o letal
Respiracin
anaerbica o
fermentacin
Suelo, fango.
ANAEROBIOS
AerotolerantesS
Obligados
Clostridium
botulinum
Instestino delgado de
mamferos.
Lagos
Microorganismos capnicos
Este grupo de microorganismos requieren
para su crecimiento una atmsfera de CO2
y por lo tanto deben incubarse en estufas
especiales que proporcionen este ambiente.
Ejemplos: Listeria, Brucella,
Bibliografa
Corto plazo
1. Subcultivos o resiembras peridicas
2. Suspensin en agua destilada o en agua de mar
estril.
Mediano plazo
1. Inmersin en aceite mineral
2. Congelacin
3. Desecacin
Largo plazo
1. Liofilizacin
2. Ultracongelacin
1. Riesgos de contaminacin
2. Equivocaciones al etiquetar
3. Seleccin de variantes o mutantes
4. Posible prdida del cultivo por un medio
de mantenimiento inadecuado, temperatura
de conservacin incorrecta o un intervalo de
transferencia equivocado
5. Espacio requerido para el almacenamiento
Desventajas
Mtodos de conservacin a
mediano plazo
3. Desecacin
Equipo de liofilizacin
Agentes Crioprotectores
Las clulas que se van a conservar por congelacin,
ultracongelacin o liofilizacin deben suspenderse en un agente
crioprotector.
Se tienen dos tipos de agentes crioprotectores, los que protegen
desde el interior de la clula y los que actan desde el exterior.
Entre los del primer tipo estn el glicerol y el dimetil sulfxido
(DMSO) que son capaces de atravesar la membrana citoplsmica y
proporcionar proteccin por dentro y por fuera de la clula durante
el drstico proceso de congelacin. Entre las sustancias que
protegen desde el exterior se encuentran la sacarosa, lactosa,
glucosa, manitol, sorbitol, dextrana, polivinilpirrolidona (PVP)
y el poliglicol.
Los agentes mas afectivos han sido el DMSO y el glicerol que se
utilizan de rutina a una concentracin del 5-10% (vol/vol). Sin
embargo la seleccin del mejor agente depender de la especie
bacteriana.
Bibliografa