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64397
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE
379%
4<.
t)
el
Departamento
de
Ingeniera
Asimismo, quiero expresar mi agradecimiento a todas las personas que me han ayudado y
apoyado a lo largo de todos estos aos:
Al Dr. Jos Luis Garca Lpez, su eterna buena disposicin, traducida en amenas
charlas, consejos sabios y el haber puesto siempre a mi disposicin instrumental que yo
necesitara para llevar a buen puerto mi investigacin. Adems, me ha proporcionado una
de las enzimas cuyo estudio forma parte de este trabajo.
Al Profesor Dr. Pedro Luis y Luis, sus consejos y el buen nimo que siempre me
ha transmitido, ya desde que empec a formarme en los conocimientos de la Ingeniera
Qumica, de lo cual ya hace once aos.
Al Profesor Dr. Jos Antonio Casas dc Pedro, siempre al lado para ensearme
citando era menester, especialmente el uso del cromatografo H.P.L.C. y los trucos
precisos para mantenerlo en buen uso. Tambin quiero agradecerle su amistad y
compaerismo.
Al Profesor Dr. Arturo Romero Salvador, los conocimientos sobre catlisis y
reactores cuando yo estudiaba y las oportunidades de ensearlos, menester que me es
querido, cuando ha sido preciso.
A todos mis profesores, por el cario que han puesto en formarme y, adems,
muchas veces, simplemente por su cario.
A mis padres, por todo el amor que han puesto en mi persona en cada instante de
mi vida, que es lo que ha hecho posible estar donde estoy ahora y ser quien soy.
A mis hermanos, con quienes he compartido tantos aos de vida, por el cario que
nos profesamos.
A Pedro y a Esther, por la generosidad y bondad de la que siempre han hecho gala
para conmigo.
A todas las personas cuya amistad y cario han sido y son un motor que me
impulsa a vivir.
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Indice
1.3.- ~-galactosidasas
18
18
23
27
33
36
2.1.1.- Lactozym
2.1.2.- ~-galactosidasa de E. cot
36
37
39
2.2.1.-Equipos e instalaciones
2.2.2.- Materiales y reactivos
2.2.3.- Mtodos de anlisis
2.2.4.- Desarrollo de los experimentos
2.3.- Experimentacin con enzima inmovilizada
2.3.1.- Equipos e instalaciones
2.3.2.- Materiales y reactivos
2.3.3.- Mtodos de anlisis
2.3.4.- Desarrollo de los experimentos
39
42
43
49
50
50
57
60
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78
91
101
Indice
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113
124
171
200
200
205
220
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241
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276
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cviie,:tmoviizaua
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347
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392
Indice
400
400
404
405
407
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412
414
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418
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429
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436
5.7.1.-Distribucin de la enzima
5.7.2.- Difusin interna en ausencia de reaccin qumica
5.7.3.- Difusin interna en presencia de reaccin qumica
5.8.~ Discusin
437
445
460
473
479
483
490
507
507
Indice
514
516
523
525
526
531
537
7.2.- Conclusiones
549
564
571
1.- INTRODUCCIN
Las enzimas son protenas con accin cataltica sobre determinados compuestos
llamados sustratos. De hecho, las enzimas son los catalizadores de las reacciones que
tienen lugar en los sistemas biolgicos, aunque hay otras molculas de carcter proteico
(anticuemos) y no proteico (RNA) que pueden tener una accin cataltica, aunque mucho
menor que en el caso de las enzimas (Comish-Bowden, 1995).
Las cadenas proteicas de las enzimas pueden tener de 100 a 2500 aminocidos.
Algunas enzimas no requieren ningn otro componente, adems del sustrato, para ser
activas. Sin embargo, otras enzimas requieren un componente no proteico para desarrollar su
actividad, este componente se denomina cofactor. Los cofactores pueden ser iones metlicos
o compuestos orgnicos que, por ejemplo, en el cuerno humano, son derivados de las
vitaminas U. Los cofactores que se unen firmemente a la enzima se denominan grupos
prostticos. Al conjunto de enzima y cofactor o grupo prosttico se le llama holoenzima
(que es la forma activa), pero cuando el cofactor se separa, a la protena restante se la
denomina apoenzima (y es inactiva).
Capitulo 1. Introduccin
Al ser las enzimas protenas, su accin cataltica est muy marcada por cl carcter
polimrico de su estructura qumica. El conocimiento de dicha estructura es muy til para
detenninar, en parte, cmo transcurre la accin cataltica. Las tcnicas de mutagnesis
dirigida pern-iiten conocer con exactitud los aminocidos que son esenciales en la accin
cataltica, mientras que la observacin por RMN permite el estudio de la unin enzimasustrato y de la posible dinmica de la transformacin. Sin embargo, quedan muchos
estudios que realizar antes de establecer claramente la relacin estructura-funcionalidad,
ya que todava ni siquiera se puede predecir con exactitud el plegamiento de una protena
conocida su secuencia de aminocidos. Naturalmente, en este camino, las aproximaciones
son varias: por un lado se estudian las propiedades catalticas de las enzimas,
determinando el mecanismo de las reacciones catalizadas y los parmetros de las
ecuaciones que se derivan de ellos, por otra parte, se llevan a cabo estudios estructurales
que determinan las secuencias de aminocidos (estructura primaria), sus plegamientos
iniciales en hlices o lminas (estructura secundaria) y sus plegamientos finales que
llevan a la conformacin ms estable en las condiciones ambientales reinantes (estructura
terciaria y cuaternaria), dando lugar a lo que se conoce como estructura nativa o de menor
energa libre de Gibbs. Las dos aproximaciones son clsicas en otros campos de
investigacin dc la Qumica y llevan a conclusiones compartidas que mejoran el
conocimiento que se tiene sobre la accin de las enzimas. No obstante, se debe considerar
que la accin de una molcula compleja, como es una enzima, ha de ser compleja a su
vez, si se compara con la accin de otros catalizadores ms sencillos desde el punto dc
vista qumico.
Las enzimas son catalizadores muy activos, multiplicando por un factor de i03 a
ti
10 la velocidad dc la reaccin sin catalizar. Adems, son catalizadores muy selectivos o
especficos, tanto ms cuanto ms importante es el control de su accin biolgica. Esta
selectividad se refiere tanto al tipo de reaccin catalizada como al sustrato o sustratos
sobre los que se ejerce la accin cataltica. Para cl caso dc enzimas cuya accin es menos
controlada, pueden catalizar una reaccin y su inversa, dependiendo de las condiciones
Capitulo 1. Introduccin
fisicoqumicas del medio de reaccin, y, adems, pueden actuar sobre sustratos similares
entre si, no necesariamente ismeros. Otras enzimas, sin embargo, son capaces de
discernir entre dos estereoismeros y de catalizar exclusivamente una reaccion concreta
de uno de ellos.
Existen varios tipos de enzimas, segn el tipo de reaccin que catalizan (Chaplin y
Bucke, 1997):
tomo o
grupo de tomos, con exclusin de los que son catalizados por hidrolasas u
oxidoreductasas.
HUiro/asas: catalizan la transferencia de molculas de agua. Son las enzimas con
ms aplicaciones actualmente.
transferasas intramoleculares.
Captulo 1. Introduccin
nomenclatura por nmeros que hacen referencia al tipo de enzima (liasa, pe.), al sustrato
o sustratos o tipo de enlace sobre el que acta, al tipo de partculas, tomos, iones,
molculas.., que se manejan en la reaccin y a un nmero de enzima, si hay otras enzimas
con la misma actividad (Price y Stevens, 1989). As, la histidasa tambin se llama,
sistemticamente, L-histidina amoniaco liasa o EC 4.3.1.3.
Capitulo 1. Introduccin
Una vez se produce la unin, la enzima acta sobre los sustratos favoreciendo el
intercambio electrnico necesario para la reaccin. Esto implica que se necesita menos
energa para llegar a un estado transitorio desde el cual sea posible que se formen los
productos. En este proceso, la enzima puede actuar como donante o aceptor de densidad
electrnica. Todos los procesos que ocurren en esta etapa suelen ser reversibles. Hay
casos en los que, cuando se obtienen los productos, stos suelen tener una entalpa menor
que la de los sustratos de partida, con lo que el paso de productos a sustratos est ms
dificultado (un caso tpico son las hidrlisis enzimticas). Sin embargo, hay varias
reacciones enzimticas en las que el paso a productos no es irreversible, sino que tambin
est en equilibrio con las etapas anteriores (un caso tpico son las reacciones de sntesis).
Las enzimas, como catalizadores que son, aceleran las reacciones qumicas. La teora de
la catlisis enzimtica encierra tres aspectos, que condicionan su desarrollo:
(1)
(2)
(3)
Los reactivos deben poseer la energa suficiente para que se produzca la reaccin.
Captulo 1. Introduccin
aumenta hasta alcanzar un mximo; a esta etapa se la conoce como estado de transicin
de la reaccin. Las enzimas disminuyen la energa de ese mximo (energa de activacin)
mediante la formacin del complejo enzima-sustrato. La enzima distorsiona la
conformacin inicial del sustrato y la transforma en la del estado de transicin, debido a
que aparecen interacciones favorables de van der Waals, enlaces de hidrgeno e
interacciones inicas entre la enzima y su sustrato, con lo que se consigue una interaccin
ms fuerte entre ambos. Como consecuencia, disminuye la energa de activacin, lo que
se traduce en un aumento de la velocidad de reaccin. En la Figura 1.1 se muestra el
transcurso de la accin cataltica de las enzimas, comparado con cl de una reaccion no
cataltica y en la Figura 1.2 se representa esquemticamente la formacin del complejo
enzma-sustrato segn los modelos de adaptacin inducida y de llave-cerradura (Stryer,
1985).
La utilizacin prctica de las enzimas se ha realizado desde hace siglos, ya que son
los catalizadores que utilizan los microorganismos en procesos fermentativos, que han
sido empleados por el hombre desde tiempos prehistricos. La utilizacin asociada al
conocimiento de su naturaleza y de su funcin es mucho ms reciente. Desde principios
de siglo se ha diversificado el empleo de enzimas, pues comenz siendo importante el uso
de proteasa alcalina en detergentes y actualmente las enzimas se emplean en campos tan
diversos como la alimentacin, la industria farmacutica, la industria qumica y en
aplicaciones analticas y ambientales. El mayor conocimiento de la qumica de las
protenas est aumentando el empleo de enzimas, creando nuevas aplicaciones, como la
sntesis de nuevas especialidades farmacuticas, la asociacin de enzimas y electrnica en
los llamados biosensores y el empleo de enzimas en la industria alimentaria como
innovadoras de antiguos procedimientos, como el malteado, o creadoras de nuevos
productos, como el jarabe rico en fructosa procedente del procesado enzimtico del
almidn. Algunas de las aplicaciones industriales ms importantes de las enzimas quedan
recogidas en la Tabla 1.1.
[SI-S2-jj#
(U
O)
L..
ci)
[E-SI-S2-...]#
1
1
Captulo 1. Introduccin
Producto
APLICACIONES INDUSTRIALES
Enzima
Reaccin
Acrilamida
Aspartamo
Termolisina
(soluble o inmovilizada)
Amilasas solubles en tanque agitado y
xilosa isomerasas en reactores de lecho
fijo
6-APA
L-tert-leucina
L-aminocidos
Dolencia
Falta de ureasa
Tubos reactores
Sondas bioanalitieas
Reactivos en fase slida
Hidrlisis de acrilonitrilo a
acrilamida
Unin estercoespecfica de
pptidos en agua
Hidrlisis de almidn a
glucosa y posterior
isomerizacin de esta a
fructosa
Hidrlisis quimioselectiva de
cido fenilactico en
penicilina (1
Aminacin reductora
enantioespecfica de cido
alfa-ceto con formato
amnico
Hidrlisis L-especifica de N
acetil amida
APLICACIONES TERAPEUTICAS
Enzima
Reaccin
Ureasa inmovilizada sobre carbn activo
Eliminacin de urea de la
sangre
APLICACIONES ANALTICAS
Tubo de nylon impregnado internamente con una o ms enzimas (glucosa
oxidasa, ureasa, uricasa)
Enzima inmovilizada sobre un sensor electroqumico
(medida de glucosa, cido lactico, colesterol, etanol, etc)
Sistemas enzimticos inmovilizados sobre un adsorbente que cambian de
color en presencia del analito
Capitulo 1. Introduccin
lo
Capitulo 1. Introduccin
11
Captulo 1. Introduccin
12
Captulo 1. Introduccin
13
Captulo 1. Introduccin
(r01> )
C<
= kf(Cj~
[1.1]
14
Captulo 1. Introduccin
2C
D~f d
dr2
~+
a-ldC
r dr
]rw
[1.2]
5 es la concentracin de sustrato en
15
Captulo 1. Introduccin
Finalmente, los procesos enzimticos suelen ser isotermos. Este hecho se debe
a que la energa de reaccin en las transformaciones enzimticas no son importantes.
De esla formw no existe
_____
~~
la
n~,t-tin,iin
r~
16
Captulo 1. Introduccin
1.3.- 13-GALACTOSIDASAS
grupo aglicn
presente en el medio,
en
una reaccin
conocida como
la historia y por los mltiples estudios e investigaciones a que han sido sometidas. La j3galactosidasa de E. ccli, a pesar de ser la ms estudiada, encuentra aplicacin slo en
Qumica Analtica, ya que presenta algunos problemas de toxicidad cuando se utiliza en la
industria alimentaria Las propiedades de las fl-ga!actosidasas dependen de sus fuentes de
origen -Tabla 1.2 (Gekas y Lpez-Leiva, 1985)-. El mayor tamao molecular corresponde a
la [3-galactosidasadc E. ccli (520.000-850.000 Dalton), mientras que para las enzimas de A.
oryzae y S. fragilis los pesos moleculares oscilan alrededor de 90.000 y 200.000 Dalton,
respectivamente. La ftiente y preparacin comercial de la enzima, el mtodo de inmovilizacin empleado y el tipo de soporte escogido influyen en las condiciones de temperatura y pH
que deben utilizarse. En general, las f3-galactosidasas de hongos tienen un pH ptimo en la
zona cida (2,5-4,5) y las j3-galactosidasas de levaduras y bacterias funcionan en la zona
neutra de pH (entre 6 y 7 y entre 6,5 y 7,5, respectivamente). Esta propiedad, de poseer un
18
Captulo 1. Introduccin
pH ptimo, permite que cada fl-galactosidasa tenga una aplicacin especfica. As, las
enzimas procedentes de hongos son usadas para la hidrlisis de la lactosa del lactosuero,
mientras que las de levadura y bacterias son empleadas para la hidrlisis del azcar presente
en la leche (pH = 6,6) y enjarabes de lactosuero (pH = 6,1).
19
Captulo 1. Introduccin
bromo-2-naftil-9-D-galactsido (BNG), cuya hidrlisis de un producto insoluble, el 6bromo-2-naftol. Es un sustrato muy usado en estudios histoqtmicos y en deteccin de
actividad en geles de protenas. El uso de sustratos fluorognicos ha mejorado la
sensibilidad de la deteccin de la actividad 3-galactosidas. Los sustratos ms usados son:
mono-fluorescena-3-D-galactsido, di-fluoresceina-[3-galactsido y metillunbilferil -13D-galactsido, aunque continuamente salen al mercado otros nuevos.
Melocotn
Almendras
Albaricoque
Granos dc Kcfir
lipes de rosas silvestres
Semilla de alfalfa
Bayas de caf
Organos de animales
Intestino
Tejidos de la piel y sesos
Levaduras
Bacterias
lfstherichia <oil
Bat//vs ,negaterivin
Thermus aqualicus
Streptocaccus ladis y lhermaphi/u.s
LactabacH/vs bulgaricus y he/vec.rts
Bur//vs crtulaus
Bat//vs stearothermophilvs
Lactabati//vs sporagt~W5
1 tongos
Neurasporas crassa
Asperg//vsJetid.s
Asperg//vs nger
Asperg//vs oyzae
Asperg/lus phoencs
Mutar puciltus
Mutar ni it/ile
Scapulorapsis
A itern aria pa/ini
Fusuriuni nan/ifarnie
A heroaria a/ternura
20
Captulo 1. Introduccin
0,01
a 0,1
o-9
moles de
NO
H20
CH2OH
CH2OH
H050
(rj
H
3
NO3
+
1-10
2
OH
OH
ONPG
Galactosa
o-Nitrofenol
La purificacin
tradicionales:
21
Capitulo 1. Introduccin
El tratamiento con urea lleva a formas inactivas pero que conservan la estructura,
lo mismo que cuando no existen determinados iones en el medio (como Mg2~). Entonces,
se consigue reactivar la enzima mediante la eliminacin del desnaturalizante o la adicin
de iones al medio (Wallenfelds y Weil, 1972).
El peso molecular de las 13-galactosidasas suele ser grande, oscilando entre 100
KDa en algunas levaduras hasta los 400 KDa para la enzima de E. cdi. Son enzimas que
suelen tener una estructura cuaternaria, de 2 a 4 subunidades segn los mtodos cinticos
de contaje de centros activos y la sedimentacin en SDS (Mahoney, 1980). La enzima de
E. coIl tiene 4 subunidades iguales, la de K. fragilis tiene 2 subunidades distintas, aunque
22
Capitulo 1 Introduccin
metaloenzimas, ya que no existe unin qumica entre la enzima y el in. Parece, sin
embargo, que son importantes en la unin del sustrato a la enzima. El jn Mn2~ parece
tener un efecto estabilizador importante frente a la desactivacin trmica en el caso de la
enzima de K. fragilis (Mahoney, 1978), ya que multiplica por siete la vida media de la
enzima a 500C. El in Hg2+ es un inhibidor irreversible de enzimas de hongos. Estas
enzimas requieren para ser activas iones divalentes como magnesio, pero no
monovalentes. Algunas caractersticas de enzimas con actividad j3-galactosidasa se
encuentran recogidas en la Tabla 1.3 (Lpez-Leiva y Gekas, 1985).
23
Captulo 1. Introduccin
galactosil-enzima (Mooser,
1992; Wallenfelds y
Weil,
1972); varias
aproximaciones cinticas pueden tener en cuenta este hecho. Ciertas glicosidasas tienen
un mecanismo ping-pong o ping-pong modificado (Mooser, 1992).Adems, la existencia
del intermedio est basada tambin en estudios cinticos con sustratos que modifican la
etapa limitante de la velocidad de reaccin, que puede ser la glicosilacin o la
deglicosilacin. En el caso de la 3-galactosidasa, hay varios sustratos que pueden actuar
como aceptores o donadores del grupo galaetsido: agua, metanol, etanol y otros
alcoholes son buenos aceptores, mientras que varios arilgalactsidos cromforos son
buenos donadores. Como mecanismos se han propuesto dos, en principio, que responden
a los siguientes esquemas:
ti
EG-X T7ECr-X
k2
~EGX~Th~*EG+X
[1.4]
EG-X TtEG-X
k2
>E+GX
[1.5]
24
Captulo 1. Introduccin
autores encontraron que en las reacciones con metanol 0,247 M y etanol 0,171 M, usando
como donadores de galactsido varios sustratos arilgalactsidos, la relacin fenol:alquil[3-galactsido permaneci constante, lo que indicaba que se formaba primero un
intermedio, el cual podra reaccionar con cualquiera de los dos aceptores de grupo
galactsido.
De los aminocidos que actan durante la catlisis, el primero cuyo papel fue
reconocido fue Glu-461 (cido glutmico, posicin 461 de la cadena polipeptdica)
25
Captulo 1. Introduccin
26
Captulo 1. Introduccin
enzimtica. Por ltimo, se debe tener en cuenta que la lactosa presente en el suero de la
leche, como subproducto en la elaboracin de quesos, genera un gran problema de
contaminacin ambiental por las grandes cantidades de lactosuero que son vertidos por
industrias de este tipo, ya que la lactosa no es fcilmente biodegradable. Este material
presenta una demanda biolgica de oxgeno muy elevada y persistente, siendo costoso de
tratar como residuo. Por ello, se han desarrollado numerosos procesos para aprovechar los
componentes orgnicos de] suero. La primera etapa en estos tratamientos consiste,
usualmente, en la recuperacin de los compuestos proteicos que no se utilizan despus de la
preparacin del queso. Una vez extrada la protena, queda una solucin que contiene lactosa
y sales diversas, y que puede hidrolizarse de forma enzimtica (Figura 1.5).
CH2OH
HO
CH2OH
cH2OH
H20
OH
OH
OH
OH
OH
Lactosa
Galactosa
27
OH
Glucosa
Capitulo 1. Introduccin
Los productos lcteos tratados con 3-galaetosidasa pueden ser utilizados en tres tipos
de aplicaciones:
28
Captulo 1. Introduccin
29
Captulo 1. Introduccin
30
Captulo 1. Introduccin
[Enzima
Compaa
[Instalacin
Libre
Vallo
Libre
Novo PUS
Libre
Tetra Pak
Industrial (Suecia)
Inmovilizada
Snamprogetti
Inmovilizada
Coming Glass
Inmovilizada
Connecticut-Lehigh
University
Inmovilizada
Vaho
Inmovilizada
Gist Brocades
Inmovilizada
Rbm Ombil
Inmovilizada
Sumitomo
Inmovilizada
Amerace Corp
31
Milano
Captulo 1. Introduccin
El objeto general de este trabajo es estudiar los fenmenos que se dan en las
reacciones enzimticas, en particular en las de hidrlisis catalizadas por 9galactosidasas, tanto en disolucin como inmovilizadas. Para ello, se estudiarn los
siguientes aspectos:
Para abordar los aspectos anteriores hay que poner a punto equipos y
procedimientos, para realizar los experimentos necesarios en los estudios cinticos, en
los de difusin y en los de desactivacin, as como desarrollar las tcnicas de anlisis
necesarias para determinar la cantidad y actividad de la enzima y protena (y su
distribucin en el caso de la inmovilizacin) y poner a punto el mtodo de anlisis
33
Capitulo 1 Introduccin
34
Captulo
1. Introduccin
35
2.- PROCEDIMIENTO
EXPERIMENTAL
Esta enzima es producida industrialmente por Novo Nordisk Ltd. Se obtiene por
fermentacin sumergida de la levadura Kluyveromyces fragilis. El nombre comercial del
producto es Laetozym 3000 L, tipo HP-G (alta pureza de glicerol). En la Tabla 2.1. se
recogen sus principales propiedades fisicas y qumicas. Conservada en frigorfico a 40C
mantiene la actividad declarada al menos durante 6 meses, segn garantiza el fabricante, y
se ha comprobado durante el desarrollo de este trabajo.
102
La actividad especfica del preparado enzimtico respecto a o-nitrofenil-3-Dgalactsido (ONPG) es de 65000 Ul. Si se tiene en cuenta que las enzimas puras de
muchas especies presentan una actividad especfica respecto a este sustrato de 300000
se deduce que aproximadamente un 20% de la protena es enzima. La concentracin
de protena total es de 35 mg/mL.
36
1,1156
Aspecto
Olor
Rango Temperatura
Rango pl1
Activadores
Kt, NH
Inhibidores
Nat, Ca*
ENSAYO
METODO
LIMITE
LIMITE
SUPERIOR
INFERIOR
3000
Lactasa (LAtJ2/cm3)
NOVO 171
Proteasa (RU/cm )
NOVO 81
6,0
NOVO 49
8,0
NOVO E 5
50000
I~evadura 1 g
NOVO 13 7
100
Hongo/g
N0V0137
100
Bacteria coliforme / g
NOVO 13 6
30
E. cali enteropatognica /g
6,0
No detectado
Salmonela g
NOVO 13 10
No detectado
Aflatoxina
NOVO 109
No detectado
LAU es la actividad de enzima que rinde 1 timol ele glucosa por mio a 37C en tampn BM (un tampn
mixto citrato-fosfato con la composicin salina que la leche) con una concentracin de lactosa de 50 g/L.
37
Fuente
Eseherichia cali
Actividad especfica
300000 UI/mga
2.7 mg/mI
i?JI es la actividad de enzima que rinde 1 niuol de o-nitrophenol por mm a 280C en tampn Z
(Na-phosphate 100 mM pH 7.0, 10 mM KCI, 1 mM MgSO
4, SmM inercaptoetanol).
38
39
Intervalo de temperaturas
Jinlabo SW2O
t.a. 5-900C
+0 FC
0.10C
FC
1600 W
1500W
150 r.p.m.
200 r.p.m.
Recorrido de vaivn
12 cm
3 cm
Capacidad
27L
27L
220 V, 50 Hz
220 V, 50 Hz
digital
Potencia del calefactor
Velocidad mxima de vaivn
Voltaje
)ESCEI$Cit4 IECNIC~,
flrd n na, a & vi~c,e~l ~ioE, coba,
2~ Iriei ~t,Et~s~general
de sWal~z aE~dn de ay,rr.,
Eilc,tn de ~9lLzac~dr fle~ calefactos..
S Mando del
Orrs~r
FuE, do
7~ Oidc, de
1 E5
~e4:44sOtle Ii, tuErta,
II
Figura 2.1.- Esquema del bao termosttico de agitacin orbital Selecta Unitronie Orbital
40
Marca
Pureza (%)
PANREAC
RIEDEL-deHAEN
PROBUS
RIEDEL-deHAEN
RIEDEL-deHAEN
PANREAC
PANREAC
PROBUS
PANREAC
RIEDEL-deHAEN
PROBUS
Marca
Pureza (%)
Concentracin
K2HPO4
KH2PO4
2-Mercaptoetanol
N4gCI2.6H20
RIEDEL-deHAEN
RIEDEL-deHAEN
SIGMA
PANREAC
99,9
99,9
14.3 M
99,9
5,00
1,00
42
99,9
99,9
99,9
99,9
99/)
Concentracin
(mM)
2,70
7,91
1,03
99,9
Reactivo
Marca
Pureza (%)
HCI
PANTREAC
35,0
112504
PANREAC
98,0
Na2CO3
PANREAC
98,0
o-Nitrofenol
SIGMA
>99,0
ONPG
SIGMA
>99,0
D(+) Lactosa.H20
PANREAC
99,9
D(+> Galactosa
SIGMA
98,0
D()Glucosa
RIEDEL-deHAEN
99,9
RIEDEL-deHAEN
43
CONP
(g/L)
12.1]
Los azcares se han analizado por HPLC en fase reversa, utilizando para la
separacin una columna de base slicea Kromasil-NH2 y para la deteccin de los analitos
un detector de dispersin de luz. Las condiciones del anlisis se resumen en la Tabla 2.8.
Cada azcar se cuantifica por el area bajo su pico. Para conocer la relacin entre el
area del pico y la concentracin del analito y para conocer los tiempos de retencin de
cada analito se realizaron calibrados tanto para el reactivo como para los productos. En
estos calibrados se us sacarosa como patrn interno, ya que el detector es muy sensible a
este analito y que su pico sale claramente separado tanto del pico de monosacridos como
del de lactosa. La sacarosa se utiliz en todos los casos, en muestras y en patrones a una
concentracin constante de 1,88 g/L. Los patrones se prepararon como se detalla a
continuacin:
Se toman 0,3 ml de estos patrones y se les aade 0,75 ml de una solucin de sacarosa
a 7,5 gIL y 1,85 ml de agua destilada. Con ello, se obtienen patrones cuya
concentracin de analito oscila entre O y 3,45 gIL. Este intervalo de concentraciones
es adecuado para realizar el anlisis fijando la ganancia del detector en 7.
44
Los calibrados se muestran en las Figuras 2.5 y 2.6 y en las ecuaciones [2.2] y
[2.3].
Calibrado de lactosa:
Ciae / Csae
0,00894 +
[2.2]
Calibrado de monosacridos:
Cn~on
I Csae
[2.3]
45
Kromasil-NH2 30C
46
0.070.06
0.05
Y =-0.001~O.03 X
,1
7
Y
-y
~004-
u
*
O)
0.
0.03
0.02
0.01
<5
u,
.7
0.00 0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
25
Abs420
2.0
1
1.5
7s
Y
Y
o
y
0.5
s
y.
QQ
0.0
0.2
0.4
0.6 A 0.8
tO
A
glu+gal
1.2
1.4
1.6
~c
4.7
1.8
2.0
1.5
(0
O
1.0
o
0.5
0.0
0.0
A/A
1.0
0.5
lac
1.5
2.0
~c
600
500
400
~300
100
o
0
10
15
20
25
48
49
50
51
a) Zona de alimentacin:
52
b) Zona de reaccin:
53
1.2
1.0-
u
u
0.8-
0.6-
7
UY
0.40.2
u
-
0.0
10
20
30
40
50
60
Ah(cm)
Figura 2.10.- Calibrado del magistral de la bomba de 0,8 L/h
0.251
Y ~.005934C.00449X
71
0.20A
0.15
Ya
Y
80
<Y
Y
10<
Y,.
0.05-
0.00
10
20
30
40
50
60
=h(cm)
Figura 2.11.- Calibrado del magistral de la bomba de 0,2 L/h
56
Soporte
Este soporte tiene una estructura porosa bimodal (Santos, 1992), presentando
micro y macroporosidad, siendo sus propiedades fisicas las que se recogen en la Tabla
2.9. En la Figura 2.12 se presenta la distribucin de radio de poros obtenida mediante
porosimetra de Hg y desorcin de N2 y en la Figura 2.13 se muestran fotografias del
catalizador, obtenidas mediante Microscopia Electrnica de Barrido (SEM), en la que se
aprecia claramente la estructura bimodal que presenta cl slido (granos porosos).
Reactivos
57
Composicin
e (total)
0,535
0,219
0,316
rM (amstrongs)
3330
r~, (amstrongs)
45
Sg(m g)
126
10
2g~)
SgM(m
Sg~t(m2g)
116
$
a
VS
04o
58
59
Marca
Pureza
HNO3
PANREAC
99,9%
3-aminopropiltrietoxisilano
FLUKA
99,9%
Glutaraldehido grado II
SIGMA, RIEDEL-deHAEN
25 % (aq)
SIGMA
50 % (aq)
NaBH4
FLUIKA
99,9%
PANREAC
99,9%
H3P04
RIEDEL-deHAEN
99,9%
Etanol
PANREAC
96,0%
F ITC
SIGMA
99,9%
60
Cproteina (mg
>protea
(mg
lact<>zyii
e-gaL E. cot
/ L)
0,51 +
[2.4]
[2.5]
61
120
100
80
60
o,
40
20
O 0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
Abs595 orn
Figura 2.14. Calibrado
Cprotci,a en Laetozyrn
Abs595
40
30
2
~ 20
a
10
o
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
Abs595 orn
Figura 2.15. Calibrado C proteinaco (1-gal E. coil
62
AbS595
0.35
0.40
63
Se carga el contenido del recipiente opaco en la columna, se deja que penetre en ella y
se eluye con BP, recogindose las muestras en tubos Eppendorf de 1,5 mL. Se
obtienen dos picos, uno entre 10 y 22 minutos y otro a los 60 minutos,
aproximadamente. El primero corresponde a la protena marcada, como se puede
comprobar diluyendo y midiendo la protena por Bradford o aadiendo a un tubo con
ONPG muestras de este pico (la enzima conserva la actividad an marcada con
ETC). El segundo es el FITC restante y otras pequeas molculas marcadas o no. Si
se quiere que se conserve la actividad, hay que eluir con HP y no con cualquier
tampn fosfato sin mercaptoetanol, porque este quedara retenido en la columna y la
enzima se desactivara. Un pico de protena tpico se puede observar en la Figura 2.1 7.
Se mide la protena de cada muestra del primer pico mediante el mtodo de Bradford,
ya que, dada la cantidad elevada de protena y FITC en estas muestras, se puede
seguir tambin a 490 nm por el color amarillo que se observa. Conocida la cantidad de
protena de cada muestra, estas se pueden mezclar para obtener una solucin
concentrada de protena marcada,
64
CE
b 1(x)
[2.6]
3 ff(x) x2dx
65
25
M~: ~ss
oiA2 =
20-
l.~?91
1
46276
0.~~B
0.10749
xc 15.79971
w 3.14253
A
0.~401
33.85858
7.42~6
?15-
~ 10Oj
U
y
o
12
16
20
24
dWn
di
50
100
150
200
250
67
Para llevar a cabo experimento hay que seguir las siguientes etapas:
OSiOH
o Si
EtO
O
OSi
+ Et
OSiOH
(C112)3N112
Et O
Si (CH
2)3 NR2
SiSi--
(CH2)3NR2
EtOH
Slice-Almina
limpia
aminopropiltrietoxisdano
SIlice-Alilimina aminada
0C
68
O Si
Si (C112)
3N112
CHO
(CH2)2
Si (CH2)3 ----NH2
CHO
Glutaraldehido
Slice-Almina aminada
Si (CH2)3
0Si
CH (CH2), CILIO
0Si
Si (CH2)3N
CH(C112)yCHO
69
Si (CH2)3N
CLICll2fl
Si(CH2)3N
CRO
+ Enz-NH2
CH(CH2)2CH~NEn
70
Se lava el slido con HP, guardndose las aguas de lavado para medir posteriormente
la concentracin de protenas y la actividad enzimtica. En este caso, para medir la
actividad, se mezclan 10 mL de aguas de lavado y 40 mL de una solucin de ONPG,
en una concentracin de 0,625 g/L en HP, tras termostatizar ambas a 25C.
---~
s(CH2)3N=CH(CH2)2 CH2OH
2)
Si
CH (CH2)2C11
(CH2)3 NI-!
ENZ + NaBH4
NHENZ
0C.
71
Se lava el slido empleado en cada reaccin con agua destilada y se deja secar 12
0C. Se pesa una vez seco; como se conoce la cantidad de enzima
horas a 11 0
inmovilizada (en mg enzima por g de soporte) y se conoce el peso seco de soporte,
se puede obtener la cantidad de enzima empleada en el experimento.
72
H2504 0,5 M. En principio, no sera necesario parar la reaccin, ya que esta se para en
el momento en que el lquido de la muestra deja de estar en contacto con el slido que
contiene la enzima, pero se evita as que contine la reaccin si parte de la enzima
hubiera pasado del slido al medio de reaccin.
Se analizan las muestras tomadas por HPLC como se describi en el apartado 2.2.3.
73
[2.7]
Para calcular la cantidad de enzima inmovilizada que debe introducirse en la cesta del
reactor se realiza un balance de materia al reactor CSTR donde se sustituye en el
trmino de velocidad la ecuacin cintica obtenida en discontinuo. Se fija el caudal de
alimentacin, la conversin deseada, la concentracin inicial de lactosa y el volumen
de lquido en el reactor, con lo que se puede despejar el peso de inmovilizado
necesario.
74
Se pesa la cantidad requerida del inmovilizado en una cesta en forma de sobre (dc 0,5
mm de luz de malla).
Cuando la temperatura del medio de reaccin sea la adecuada y el caudal sea estable,
se introduce la cesta con el inmovilizado con ayuda de unas pinzas estriles en la cesta
soporte que hay en el reactor. Se cierra la tapa, se fija la velocidad de agitacin en 600
r.p.m. y se coloca a Ja entrada del reactor Ja tubera de alimentacin con la solucin de
lactosa pasando al caudal fijado. A los pocos minutos, comienza a salir lquido por el
codo de salida, actuando el reactor durante cierto tiempo como reactor semicontinuo
que ir progresando hacia un cierto estado estacionario que a su vez se puede ir
modificando con la desactivacin.
75
El experimento se mantiene mientras haya una conversin alta (seguida por HPLC) y
una actividad importante en el slido. Si es necesario, se aade ms solucin de
lactosa al depsito de alimentacin con ayuda de la bomba peristltica y del filtro
estril de gran capacidad.
Se coloca la columna en el homo y se hace pasar agua milli-Q a un caudal alto (> 5
mL/mm). Se saca la columna y se observa si hay huecos en la zona de entrada del
lquido, en cuyo caso se rellena con ms slido. Se calcula el peso total de slido
introducido y se determina la porosidad del lecho.
16
.77
3.1.-
INTRODUCCIN
78
especfica, propias del metabolismo primario, la cintica puede ser una funcin sigmoidal.
Sin embargo, la mayora de las reacciones llevadas a cabo mediante enzimas de
aplicacin industrial, farmacutica y analtica actualmente en el mercado siguen cinticas
de tipo hiperblico.
se plantea es el siguiente:
E+SYjES--*EP
79
[3.1]
CES
tt
k,CE,CS
k./CES
2CES
[3.2]
C~, C5
k, + k2
[3.3]
C5~ O
(,<,
k2)
KM
[3.4]
CES
+ CES
[3.5]
CES
CE
KM+
C5
CX
[3.6]
dc
tt
k.
Q~
80
k2 C~ C5
KM+ 0
____
[3.7]
siendo
Urna,
Y max 0
KM + C
5
[3.8]
Urna,,
(bCO.
kcat
o nmero de
recambio, cuando la enzima slo tiene un centro activo. Si la enzima tiene n centros
activos, k2 es igual a nkcM. El nmero de recambio indica el nmero de molculas de
sustrato que pueden reaccionar con la enzima por unidad de tiempo y por centro activo.
i)
81
u)
Mt
E+S
&yES*ES+X-*E+P
[3.9]
(K.,K3)/(K2K3) C C
(K5K3)/(K2 +K3)C5 ~
[3.10]
KM=KSKK
82
[3.11]
[3.12]
1<3
Con lo que la ecuacin [3.10] tiene la misma expresin que la cintica de MichaelisMenten de la ecuacin [3.7].
ESVjEStIEP<EP
[3.13]
(KM2).
La ecuacin
donde:
KMI
KM.
[3.14]
[3.15]
[3.16]
83
Captulo
3.
-i-CACB
[3.17]
[3.18]
E+ByEBA tEAB
EAB
C1. CA C~
K5 +KA C~ +KB CA+CACB
*3
KA
84
[3.19]
<
donde:
k
1<
[3.20]
k2
KB
1<
-
[3.21]
-2
py
[3.22]
A,
A,
EA77>EABYSEAB>EXY
*3
CE CA
[3.23]
[3.24]
donde:
KA
KB
1
k
[3.25]
k -2
[3.26]
continuacion:
A,
EATJ>E tEX
E+B ~EB~=~~*EY
A
85
[3.27]
*2
CE CB CA
KBCA +KA
[3.28]
CBCACB
donde:
*
___
KB
k~3
1<,
[3.29]
[3.30]
E+A Y7EA~4EAX
[3.31]
*2
rx
ry=
C5
KM +
CA
CA
C~ CACB
KM+CA
*4*3*2
[3.32]
[3.33]
86
*3
C~
CE
CA
[3.34]
~ 1<
k~ C5
CA
[3.35]
*2
*1
Bk
87
1. Inhibicin total
kj
*2
ESY7ES*EP
[3.36]
E I<-m--*EI
donde:
[3.37]
C~C,
CE,
*2
CE
C
5
[3.38]
KJlK)+ C5
Esta es una inhibicin por bloqueo del complejo ES. Se supone que en la enzima
existen dos tipos de centros, uno que interacciona con el sustrato y el otro con el
inhibidor, pero ste ltimo slo puede fijarse en forma reversible sobre el complejo
88
A,
[3.39]
E +p
C5 C,5
[3.40]
KM +
Csh+Kj
donde:
[3.41]
C~C1
CES
En este tipo de inhibicin, la velocidad mxima
Urna,
y la constante KM aparentes
El inhibidor puede formar complejos con la enzima libre y con eJ complejo ES. El
mecanismo es:
E -rS a
~j>[ES]-~ffl~*E + P
K
ES 1
<~~~*
89
ES
[3.42]
donde:
[343]
C,C,
[3.44]
CE.S C,
C ES
La ecuacin cintica que se deriva de este mecanismo es:
*2
CE
C,
[3.45]
Kj+K)
Cj1+;)
Urnav.
*2
(KM
CE
C5
[3.46]
Cjl-l-K)
90
E--SYj[ES]-L--*EP
[3.47]
ESI~
ES
11~EIS-21~EJP
EJS
a--
dC~
tt
PC)
*2
1+j<t)
CECS
1+
CC
K,
[3.48]
C
~
KJX~
K,
donde:
=
*1
* l
..K~=K,
[3.49]
91
hidrlisis enzimtica de lactosa tienen como punto de partida el mecanismo de MichaelisMenten considerando diversos tipos de inhibicin:
fi- de la galactosa.
fi-
reaccin lateral.
Este modelo ha sido el ms aplicado para describir la hidrlisis de lactosa por flgalactosidasas, ha sido propuesto por varios autores (Yang y Okos, 1989; Papayannakos y
col., 1993; Carrara y Rubiolo, 1996; Santos y col., 1998). Se ha utilizado con enzimas de
diferentes microorganismos: A. niger y K. fragilis. El esquema de reaccin implicado es
el siguiente:
A,
*2
ElactElac>E-i-glu-i-gal
a-E + gal <~~1ss
[3.50]
E gal
*2
CE
C,0~
[3.51]
(Cg)
Kn~l +
92
Ciar
Donde K,
gal
A diferencia del mecanismo anterior, en este mecanismo se distingue entre los dos
anmeros, a- y
fi-,
Estudios anteriores con la enzima dc A. niger (Flasehel y col., 1982) demostraron que el
anmero a- de la galactosa inhiba ms que el anmero
fi-
~-
a la a- es
rpida, lo que obliga a tener en cuenta la presencia de este ltimo anmero en el medio de
reaccin (Fasehel y col., 1282; Bakken y col., 1992). Los parmetros_ cinticos de la
mutarrotacin de a- a /1-galactosa se estiman independientemente de la hidrlisis de
lactosa. El mecanismo propuesto es el siguiente:
Eac ~
glu-i-/} gal
[3.52]
fi gal<--~* agal
A
3
1-agalT7E a-gal
siendo
Krnut
1-.
LS
~ 1~
v
C
K figal
15~,,,
r.
It-/5
--,ac
[3.53]
agal
+
K
O-gal
Donde K1 ~ga y Ki
osgal
ecuacin [3.37].
93
*,rn,t (C~
C,,)
[3.54]
(C
50
C5
Cgajo) Kmi,i
1+Kirnt
[3.55]
Este modelo fue propuesto por Flasehel y col. (1982) y utilizado posteriormente
por Bakken y col. (1989) en sus estudios sobre reactores enzimticos. El esquema de
reaccin en este caso es similar al anterior, pero incluye, adems, un trmino en el que el
anmero a- de la galactosa forma un nuevo complejo con el complejo E lac, segn:
[3.56]
fi +gal+--~
E
fi gal ~
E +a
gal
a galE fi
<~------>
Ea
gal
gal
gal
94
*2
CE
C,0~
(
Cftgj + C0~g0
(
C.~
Ku~l + Kj1j~g<,j
K,0 -gcii ,~ + Chfl.KIKj<~~g,,
- ga/~
Donde K1
~gaI
y K1
a-gal
[3.57]
E+lac <jEgalgin
[3.58]
A2
Egal yjEgal
1<2
C,, (1,,
+
95
+12
donde K1
gal
[3-
a-Elac
yElac
E + gal <~
E lac + gal
E gal
E lac gal
*2
r =
C~ Ciar
1
(KM
[3.60]
Cga ~
+ Ciar) 1
x
1<,
gal
[3.61]
vi
Donde K
[3.41], ya que, para esta inhibicin, ambas constantes, K1 y K1, son iguales.
Chen y col. (1985) ajustaron a este modelo sus datos experimentales, obtenidos
con clulas de K. fragilis como catalizador permeabilizadas con acetona. Se propone el
siguiente esquema de reaccin y se obtiene la ecuacin cintica de la expresin [3.63]:
*2
E-i-lac_77>Elac*E-vglugal
E+gal~lifiEgal
E tic + glu
<~~~---~
96
E lac gin
[3.62]
*2
Cga
(
~
C~ C,0.
[3.63]
77
T~Z
+ (K,, +
Este modelo fue propuesto por Bakken y col. (1992) para la [3-galactosidasade la
bacteria liacil/us circulans. Considera que se produce la reaccin de transgalactosidacin
de la [3-galactosidasacomo reaccin lateral. Esta es una reaccin que sucede cuando hay
ms dc un aceptor del grupo galactsido. En la hidrlisis de lactosa, la glucosa y la
galactosa pueden ejercer como aceptores de tales grupos. En el caso de la galactosa, esta
reacciona con ellos formando molculas de 2, 3, 4 y 5 molculas de galactosa, siendo los
que estn en mayor concentracin los oligogalactsidos de 2 y 3 molculas de galactosa.
Estos son productos que, dejando que la reaccin transcurra el suficiente tiempo, tambin
son hidrolizados, por lo que presentan un mximo de concentracin durante el transcurso
de la reaccin. No todas las enzimas tienen la misma capacidad dc formarlos y su
concentracin es mayor a concentraciones elevadas de lactosa y del aceptor de
galactsido que compite con el agua (Stevenson, 1993). Esta reaccin lateral parece ser
importante para la sintesis de numerosos compuestos de inters farmacolgico (Menzer,
1997).
El modelo introduce algunas simplificaciones: slo se consideran trisacridos
como producto de la transgalactosidacin y se asume que las reacciones de inhibicin por
a- y
fi-
complejos E lac, E3gal y E2gal. Se asume el estado estacionario para los complejos y se
derivan las ecuaciones cinticas, siguiendo el procedimiento propuesto por King y
Altman (1956). El modelo considera la reaccin de mutarrotacin independientemente de
la reaccin de hidrlisis. Al final, se obtiene un grupo de ecuaciones diferenciales que
97
Elac
Elac yjEgalglu---*E-i-figlufigal
[3.64]
fi gal<--~> a gal
E + fi
gal <~ftiit5=~>E fi
gal
Ea~gal<~~~tll Ea -gal
A
4
Egalglu j7Egal+glu
A6
di
flCar2PiC
1-i-K
10 galc:4 gal
dCgj,~
fl
Ciar + P
2 lar
[3.66]
+ 1% Car Cgai
l+Kja~ga
PC lar
dCgai
2~ Cd; + 1~ C~ [4 Ciar C~
0~
dt
5 Ciar ~ji
P7C~1
PgCar Cga
dCdl
di
2ar
_
PsCarCdi
P2C
P
6 Cg,d CId
[~
Cga ~
[3.67]
[3.68]
[3.69]
dt
dCa~gai
(CK
gal
_______
dt
gal
gr
2C
di
dEL.
C~
[3.65]
mu
2~
[3.70]
>agal
98
99
CC
o
o
~0
00
00
-t
o
1~
O
00
O-
-3
o
A
O
00
0
00
oa
-3
<
<
<.6
rt
O
cs
<
e4
~.E
-~
~ oG
<
<.6
r
~
rl
u-
a
o
00
3D
t
h
~
en
tI
\O
rn
Co
en
oc
00
CI
oc
r-
00
h
0
t~
a
.4
~3
3
3D
a
h
h
3
00
00
te
rl
3D
0
O
3D
en
~
0V
CI
-~
~.
e
o
te
roO
0
CON 0000vi
00
u-
oc
00
u-
A
3,
o
O
A
0
0
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Reactores discontinuos, en los que se obtienen datos integrales (C. frente a tiempo).
101
1. Mtodo diferencial
tIC5
[3.71]
dt
Calculados los valores de velocidad de reaccin a cada tiempo, se proponen
diversos modelos cinticos, y se ajustan los valores de velocidad y los valores de
concentracin de reactivo o producto de acuerdo a los modelos considerados. Para ajustar
los datos experimentales a los modelos propuestos se utilizan mtodos numricos de
regresin lineal o no lineal.
102
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KM ~L
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[3.72]
C5
[3.73]
[3.74]
103
que la ecuacin [3.7], pero se pueden linealizar por los mismos procedimientos, llegando
a ecuaciones similares a las ecuaciones [3.72] a [3.74]. En estos casos, hay ms de una
variable independiente, por lo que la regresin lineal utilizada debe ser mltiple.
104
as una expresin donde las variables son concentraciones y tiempo y los parmetros a
determinar las constantes cinticas del modelo. Para un reactor discontinuo, el balance de
materia, una vez sustituido rpor una f(T,Cs) resulta ser una integral del tipo:
trf~
dQ
f(T,C)
[3.75]
Se pueden ajustar los datos obtenidos a una temperatura, y calcular los parmetros
cinticos de cada modelo propuesto para esa temperatura. Tambin se puede considerar la
temperatura como una variable y analizar a la vez todos los datos obtenidos a todas las
temperaturas.
Cualquiera que sea la regresin que se utiliza, esta tiene una funcin objetivo que
minimizar. Esta funcin siempre es una relacin entre valores experimentales y valores
calculados y, al hacerla mnima, se busca el mejor ajuste posible para el modelo aplicado.
Tanto en la regresin lineal como en la no lineal, la funcin objetivo es la suma de
residuos al cuadrado.
105
a) Criterios estadsticos:
La E de Fischer, que indica la significacin del modelo y que debe tener un valor
superior a un cierto valor tabulado para una probabilidad determinada (95%,
usualmente)
El valor de la suma de residuos al cuadrado (SQR), que debe ser lo menor posible.
La F de Fiseher.
b) Criterios fisicos:
El grado de validez de cada uno de los mtodos puede ser cuestionado, siendo, en
general, ms fiables (reproducen mejor los datos) los parmetros obtenidos utilizando el
mtodo integral, concretamente, la regresin no lineal con la temperatura como variable
106
(es decir, ajustar todos los datos experimentales a los modelos cinticos propuestos). Una
posibilidad es combinar los mtodos anteriores en la siguiente secueneja:
Aplicar, en segundo lugar, el mtodo integral. En este caso, dado que se utiliza la
regresin no lineal generalmente, los parmetros iniciales pueden ser los obtenidos en
el mtodo diferencial.
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Capitulo
3.2~ MODELOS CINTICOS DE LAS REACCIONES DE HIDRLISIS CON !3GALACTOSIDASA DE KluyveromycesftagIis EN DISOLUCIN
113
114
Tabla 3.5
-.
PLD-l
CKI2o4
C<~po~
50
C~<o~
PLD-2
200
Crviercaptoetaiioi
25
25
0,98
92,5
10
PLD-3
25,5
24,5
74,5
10
PLD-4
25,5
24,5
74,5
PLD-5
25,5
24,5
74,5
2,5
PLD-6
25,5
24,5
74,5
PLD-7
25.5
24,5
74,5
0.5
PLD-8
25,5
24,5
74.5
PLD-9
25,5
24,5
74.5
10
PLD-0
25,5
24,5
74,5
PLD- 1
25,5
24,5
74,5
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PLD-12
25,5
24,5
74,5
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CK+
50
C~ig
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PLD-2
LD-3
LD-3
LD-4
LD-4
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LD-6
Nota: las
t (h)
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168
CK112P04
25
25
25,5
CK211P04
25
25
CKt}l[
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0,98
Ci<
92,5
92,5
24,5
74,5
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lO
10
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25
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0,98
92,5
168
25
25
0,98
92,5
concentraciones son mM. La concentracin dc Mg~ es dc 1 mM en todos.
115
dCONP
dt
=C
(=0
ONPGO
dXOPG
dt
[3.76]
PLD-2 PLD-3
0,45
0,63
PLD-3 PLD-4
0,62
0,64
PLD-4 PLD-6
0,63
0,46
PLD-6
0,46
Con los resultados obtenidos se eligi el siguiente tampn para realizar los
experimentos cinticos: tampn fosfato potsico 50 mM pH 7,0 (C~po4kz25,5 mM y
24,5 mM) al que se le aade MgCl
CFI2PO4~~
2 1 mM y mercaptoetanol 5 mM. En este
tampn (blanco) se realizaron varios experimentos, aadiendo varios cationes divalentes y
116
trivalentes, para analizar cal era su influencia sobre la actividad de la enzima. Estos
cationes se aadieron al medio seleccionado en una concentracin 0,1 mM. Cada
experimento se realiz siguiendo el procedimiento estndar de medida de actividad
(Herrero, 1995). La actividad relativa se calcula como el cociente de velocidades iniciales
de reaccin; los resultados se muestran en la Figura 3.5.
Los resultados que muestra la Figura 3.5 indican que el manganeso y, en menor
medida, el cobalto y el zinc activan la enzima Lactozym. En el caso del manganeso, esa
activacin llega al 50%; de hecho, todos los iones probados activan en mayor o menor
grado la enzima, excepto el hierro.
147
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
10
15
25
20
1 (mm)
Figura 3.1.- Efecto de la concentracin de jn K~ sobre la actividad de la f3-galaetosidasa
deK.fragilis. CMg2~= lmM; Ciws= 10 mM
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
0
10
15
<mm)
20
25
30
lIS
lmM
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
10
12
14
16
t<min)
Figura 3.3.- Efecto de la concentracin de in Mg2~ sobre la actividad de fl-galactosidasa
de K. fragilis. CKI2po4 25,5 mM; CK=I.uo4~24,5mM; CK+ 74,5 mM; CMF= 5mM
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0.5
0.6
0.4
0.2
0.0
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15
t(min)
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CC
80
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20
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Co
Ni
Cu
Al
Zn
Cr
Mn
ln presente en el medio
Figura 3.5.- Actividad de I3-galactosidasa de K. fragilis frente a distintos cationes
metlicos. Actividad relativa vs. in aadido al BP.
0.25
u
tactozym BM
e- LactozymBP
0.20
0.15
ono
u
0.05
1~U
e
10
pH
Figura 3.6.- Efecto del pH en la hidrlisis de lactosa por la j3-galactosidasa de K. fragilis.
Velocidad inicial vs pH en distintos tampones. T=400C; Cae o~5o g/L; CE=7 mg/L
122
0.30
0.25
u tactozym BM
e- LactozyniBP
U
__
020-
a0
10.10-
U.,
0.05
0.03-
5
10
pH
Figura 3.7.- Efecto del pH en la hidrlisis de ONPG por la [3-galactosidasade K. fragilis.
Velocidad inicial vs pH en distintos tampones.T=250C; CQN.oo=O,5 g/L;C1~0,7mg/L
100k
U.
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.5
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.0
5,0
23,0
10-
pH
123
a,
1..
0
0
50
100
150
250
203
300
350
400
450
500
t (miri)
3.2.2.-
124
realizados se recogen en las Tablas 3.9 a 3.13. Los resultados obtenidos se muestran en
las Figuras 3.16 a 3.22, expresados como
Xac
enzima. En todos los casos, la conversin de lactosa a trisacridos se mantuvo por debajo
del 3%, por lo que la transgalactosidacin es una reaccin lateral que apenas es
importante en la cintica del sistema de reaccin aqu considerado.
125
LL
75
0
0
7
LL2
50
0
0
7
LL3
50
7,5
0
7
LL4
50
15
0
7
0
0,12
0,2
0,45
0,62
0,78
0
0,12
0,26
0,38
0,55
0,8
0,87
--
0
0,10
0,23
0,35
0,49
0,62
0,73
-
0
0,1
0,21
0,29
0,46
0,59
0,67
-
0,88
0,92
0,83
-
0,8
-
LL5 LL6
50
50
0
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7
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0
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0,3
0,14
0,35 0,31
0,58 0,44
0,71 0,66
0,85 0,67
0,77
0,86 0,82
-
LL7 LI.
25
50
0
0
0
0
7
4,6
LL9 LLIO
50
50
7,5
15
0
0
4,6
4,6
0
0,28
0,52
0,82
0,9
-
0
0,06
0,1
0,22
0,31
0,54
0,6
0,78
.
0
0,17
0,26
0,33
0,46
0,56
0,67
0,81
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0
0,09
0,16
0,22
0,35
0,48
0,6
0,77
--
LL12
LL13
LL14
LLS
LLI6
LL17
Ciac(g/L)
EXP
50
50
50
50
50
50
25
Cgai(g/L)
7,5
15
Cgiu(g/L)
7,5
15
CE(mg/L)
4,6
4,6
2,33
tiempo(mn)
7,5
15
2,33
2,33
2,33
2,33
Xiac
60
0,05
0,09
0,06
0,04
0,04
120
0,11
0,1
0,15
0,11
0,07
0,08
0,08
180
300
0,15
0,31
0,27
0,24
0,16
0,13
0,21
0,23
420
480
600
660
0,52
0,63
0,4
0,59
0,46
-
0,39
-
0,25
0,34
-
0,4
0,46
0,41
0,43
900
1200
0,8
0,76
0,54
0,7
0,56
0,64
0,46
0,59
0,62
0,71
0,58
0,65
126
LL24
75
0
0
7
o
0,09
0,19
0,39
0,68
0,8
0,9
-
LL2S LL26
50
50
0
7,5
0
0
7
.
7
o
0,27
0,47
0,75
0,84
0,93
-
LL27
50
15
0
7
o
0,27
0,39
0,58
0,77
0,85
o
0,14
0,38
0,61
0,8
0,83
LL2S
50
0
15
7
Xiac
o
0,24
0,44
0,73
0,76
0,81
-
LL29
25
0
0
7
o
0,26
0,50
0,78
0,91-
o
0,17
0,35
0,57
0,68
0,71
0,77
0,82
o
0,15
0,29
0,5
0,63
0,72
0,74
0,79
o
0,1
0,23
0,44
0,56
0,66
0,68
0,77
LL34
LL35
LL36
LL37
LL38
Ciac(g/L)
Cgai(g/L)
EXP
50
O
50
25
50
50
50
25
7,5
0
0
7,5
0
15
0
0
15
Cg~ij(g/L)
0
0
50
0
7,5
50
O
15
CE(mg/L)
4,6
4,6
4,6
2,33
2,33
2,33
2,33
2,33 2,33
tiempo(min)
15
0,15
30
60
0,16
0,32
0,15
0,31
120
0,55
180
240
Xac
o
LL39 LL4OLL4I
0
0,29
0,53
0,09
0,17
0,07
0,17
0,06
0,13
0,06
0,13
0,07
0,17
0,07
0.15
0.26
0,55
0,75
0,33
0,32
0,23
0,23
0,32
0,48
0,68
0,76
0,65
0,71
0,88
0,94
0,52
0,63
0,45
0,56
0,35
0,44
0,35
0,44
0,58
0,62
0,64
0,81
300
0,78
0,74
0,7
0,6
0,49
0,49
0,63
0,89
360
0,84
0,75
0,77
0,67
0,56
0,56
0,7
127
LLiS
LL19
LL2O
LL21
LL22
Ciac(g/L)
LL23
50
C~~(g/L)
Cgiu(g/L)
15
tiempo(mn)
0
0,25
0,45
0,09
0,19
0,06
0,13
0,09
0,15
0,23
0,29
0,37
180
0,66
0,49
0,59
0,3
0,2
240
0,74
0,58
0,66
0,35
0,25
300
0,77
0,65
0,72
0,44
0,33
360
0,79
0,69
0,75
0,48
0,35
0,4
420
0,82
0,72
0,79
0,51
0,4
0,45
Tabla 3.12.-
0C con la 9-galactosidasa de K.
fragilis.
EXP
Ci~~(g/L)
C~
0i(g/L)
Cgiu(gIL)
CE(mg/L)
tiempo(rnin)
LL42
50
LL43
50
LL44
50
LL4S
50
LL46
50
LL47
50
0
0
7
15
0
7
0
15
7
0
0
2,33
15
0
2,33
0
15
2,33
Xtac
30
0,34
0,3
0,26
0,12
0,04
0,1
0,24
60
0,4
0,47
0,53
0,20
0,13
120
0,79
0,68
0,71
0,42
0,29
180
0,85
0,77
0,78
0,55
0,43
240
0,88
0,8
0,81
0,63
0,54
300
360
0,91
-
0,84
0,84
0,83
0,87
0,7
0,72
0,59
0,64
128
0,4
0,55
0,62
0,68
0,72
0
0.1
0,26
0,47
0,7
0,86
-
0
0,18
0,35
0,63
0,86
-
0
0,06
0,18
0,36
0,62
0,81
0,84
tC con la 3-galactosidasa de
Tabla 3.13.(eont.)-K.Resultados
fragilis. de la hidrlisis de lactosa a 40
EXP
C
LL66
5~(g/L)
Cg~i(gL)
50
15
50
0
25
0
50
0
50
5
50
15
50
0
50
0
25
0
Cgiii(g/L)
15
15
C5(mg/L)
4,6
4,6
4,6
2,33
2,33
2,33
2,33
0,07
0,07
0,19
2,33 2,33
tiempo(min)
0
5
15
Xia.
0,17
0
0,2
0,12
0,33
00,09
0
0,05
0,04
0,08
30
0,3
0,35
0,55
0,17
0,14
0,11
0,19
0,17
0,36
60
90
0,46
-
0,55
-
0,81
-
0,33
0,44
0,3
0,43
0,22
0,3
0,32
0,45
0,31
0,4
0,59
-
120
180
270
0,66
0,8
-
0,72
0,83
-
0,82
-
0,51
0,65
0,71
0,53
0,6
0,73
0,4
0,51
0,6
0,5
0,62
0,82
0,5
0,62
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29
3.2.2.2.-
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Tenneratura
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0.10
0.12
(mol/L)
Figura 3.11. Hidrlisis de lactosa con la 3-galactosidasa de K.fragilis: cociente entre las
velocidades iniciales con y sin galactosa inicial vs C531 a varias temperaturas.
Ciar j 50 g/L; C51,C O g/L.
131
1.2
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0.10
0.12
~(mol/L)
Figura 3.12. Hidrlisis de lactosa con la j3-galactosidasa de K.fragilis: cociente entre las
velocidades iniciales con y sin glucosa inicial vs C511, a varias temperaturas.
C1,00 50 gIL; Cgaio O g/L.
Se han realizado una serie de experimentos para analizar el efecto de los dos
anmeros de la galactosa sobre la hidrlisis de lactosa con Lactozym. Flasehel y col.
(1982) observaron que los dos anmeros de la galactosa inhiban de forma distinta la
reaccin de hidrlisis de lactosa con 3-galactosidasa de Aniger. En este caso, los modelos
cinticos que pretendan explicar los resultados experimentales tienen que considerar la
reaccin de mutarrotacin de la galactosa como lateral e incluir trminos de inhibicin
distintos para cada uno de los anmeros.
Un test propuesto por Flasehel y col. (1982), sencillo de llevar a cabo, consiste en
hacer reacciones de hidrlisis de lactosa en medios que contengan galactosa a tiempo cero
en una determinada concentracin. En un experimento, la galactosa se aade al medio de
reaccin varias horas antes de aadir la enzima, con lo que en el medio hay a- y /1galactosa en equilibrio (una proporcin aproximada de 33% de la especie a- y 66% de la
especie /1-). En otro, se aguarda a aadir la galactosa en polvo justo antes de aadir la
enzima, de forma que la galactosa est como su enantimero a, que es el que existe en el
azcar en polvo. Si la inhibicin por a- y /3-gal es distinta, la conversin evolucionar con
132
133
Para calcular r hay que derivar la curva C vs t por algn procedimiento numrico.
En este caso, sc ha elegido ajustar la concentracin de producto a una doble exponencial:
[3.77]
[3.78]
entre modelos que consideren una inhibicin distinta por los anmeros a- y 3- de la
galactosa, puesto que se ha demostrado que el efecto de estos dos anmeros sobre la
135
30
sobre el total
Los valores de los parmetros obtenidos, pata cada modelo por las distintas
linealizaciones, no coinciden entre s. La variacin del valor de los parmetros con la
temperatura, cuando stos no son negativos, no sigue la ecuacin de Arrhenius.
136
dato es proporcional a r, lo que supone que el error experimental se comporta igual. Esta
suposicin es discutible, ya que depender, al menos, del mtodo de anlisis utilizado
para seguir la reaccin enzimtica.
La regresin no lineal es una tcnica que puede aplicarse a los datos obtenidos a
una temperatura (ajuste a temperatura constante) o a todos los datos conseguidos a todas
las temperaturas (ajuste con temperatura variable).
Cuando los datos que se ajustan son datos diferenciales, (r, C), se ha de calcular la
velocidad de reaccin para cada par de valores experimentales (concentracin, tiempo),
Los modelos cinticos que se proponen para ajustar los datos diferenciales son [os
modelos presentados en la Tabla 3.2. Estos modelos implican la inexistencia de inhibicin
o la existencia de inhibicin por sustrato o por uno de los productos. Como se observ
que la galactosa era el nico compuesto que inhiba, no se necesitan modelos cinticos
ms
137
para cada modelo cintico aplicado, adems del intervalo de confianza de cadaparmetro.
Los parmetros que no pasan los criterios fisicos o estadsticos estn sombreados. En la
Tabla 3.20, se resume el cumplimiento de los parmetros de cada modelo los criterios
estadsticos y fisicos ya descritos en el apartado 3.1.3.2.
Se observa que, para varios de los modelos cinticos probados, los parmetros KM
y K1 tienden a acoplarse entre s, es decir, la variacin de cada uno influye en la variacin
del otro durante la iteracin. El resultado de este fenmeno es un mejor ajuste del modelo
a los datos de cada temperatura, pero la relacin de los valores de los distintos parmetros
a varias temperaturas no sigue una tendencia razonable. Adems, como en el modelo 8,
los parmetros pueden incluir el cero en el intervalo de confianza. El modo de evitar este
fen-meno es obligar a los parmetros cinticos a seguir una tendencia lgica con la
temperatura, mediante la ecuacin de Arrhenius, ajustando todos los datos experimentales
a todas las temperaturas a los modelos cinticos propuestos, es decir, se lleva a cabo un
ajuste con la temperatura como variable.
138
Analizando la Tabla 3.24, los modelos que pasan los criterios estadisticos son los
modelos 1, 2, 3, 4 y 8. Los criterios fisicos (Ea dc la constante cintica > 0; valores
razonables para todas las energas de activacin) los cumplen todos los modelos
propuestos. De nuevo, el modelo que mejor ajusta los datos experimentales es el 8, siendo
su SQR casi la mitad del siguiente modelo en bondad de ajuste. En consecuencia, se
puede elegir el modelo 8 para ajustar los datos experimentales, lo que supone que la
galactosa
competitiva.
139
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ESTADSTICOS
CRITERIOS
FSICOS
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+
KM
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Michaelis-Menten
con inhibicin por
lactosa (3)
k
2
KM
0 (31)
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
glucosa (4)
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitva por
glucosa (5)
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
glucosa (6)
Michaelis-Menten
con inhibicin
mixta por glucosa
(7)
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
galactosa <8)
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
galactosa (9)
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
galactosa (10)
Michaelis-Menten
con inhibicin
mixta por galactosa
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KM
K
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No pasa.
SQR: 8,4 o-~ (50)
S
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No pasa.
SQR: 1,6 to~ (30)
Clave:
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KM
K1
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KM
K
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No pasa.
SQR: 1,3 io~ (7)
S
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No pasa. K1K1.
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KM
K1
k2
KM
7 (30)
SQR: 6,8 io-
K
1
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KM
+
0(11)
O (IT)
0 (31)
Criterios fisicos:
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-
fluctua ; 5
No pasa. K~K1.
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SQR: 5,2 o
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Criterios estadsticos:
Observaciones~
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CRITERIOS
CRITERIOS
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OBSERVACIONES
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Pasa.
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Michaelis-Menter
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acompetitiva por
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con inhibicin no
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Michaelis-Menten
con inhibicin
mixta por glucosa
(7)
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ESTADSTICOS
CRITERIOS
FSICOS
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OBSERVACIONES
Pasa.
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acompetitiva por
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Michaelis-Menten
con inhibicin
mixta por galactosa
(11)
Clave:
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Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
galactosa (10)
No pasa.
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Criterios tsicos:
O Parmetro negativo
O Parmetro positivo
Criterios estadisticos:
O incluye el cero en el intervalo de confianza
+ pasa
Observaciones: al valor de SQR le sigue el n de orden de mejor a peor ajuste, entre parntesis.
151
Los modelos cinticos que se utilizan para ajustar los datos integrales (C, t) son los
modelos utilizados en la discriminacin por el mtodo diferencial, propuestos en la Tabla
3.2. Como las ecuaciones diferenciales de estos modelos son complejas y su integracin
analtica no es sencilla ni, en ocasiones, posible, se recurre a su integracin numrica,
acoplando al algoritmo de regresin no lineal una integracin numrica por Runge-Kutta
de cuarto orden.
. -
El ajuste a temperatura constante de los datos integrales con los distintos modelos
cinticos propuestos lleva a los resultados de las Tablas 3.25 y 3.26, donde se muestran
los parmetros cinticos, sus intervalos de confianza, la suma de residuos al cuadrado
(SQR) y el valor de F para cada modelo ensayado. En la Tabla 3.27 se resume el
cumplimiento de los parmetros con los criterios estadsticos y fisicos del apartado
3.1.3.2. Los parmetros que no cumplen con algn criterio se muestran en las Tablas 3.25
y 3.26.
El anlisis de la Tabla 3.27 muestra que slo pasan los criterios estadsticos los
modelos 1, 2, 6 y lo. A estos modelos se les aplican los criterios fisicos y entonces slo
pasan el modelo 1 y el 2, ya que los dems tienen parmetros que fluctan con la
temperatura. Como en la discriminacin por el mtodo diferencial con regresin no lineal
con la temperatura como constante, el modelo 8, aunque tiene dos parmetros
(KM
y K~)
152
(KM
parmetros no varen con la temperatura de forma lgica, por lo que se hace necesario el
ajuste de los datos experimentales con la temperatura como variable.
En este caso, los parmetros cinticos se sustituyen por sus expresiones segn la
ecuacin de Arrhenius, y se ajustan los datos experimentales obtenidos a todas las
temperaturas a las ecuaciones obtenidas.
Las Tablas 3.28 a 3.30 agrupan los resultados del ajuste con la temperatura como
variable: valor de los neperianos de los trminos preexponenciales y de las energas de
activacin junto con sus intervalos de confianza y el SQR y el valor de F para cada
modelo cintico ensayado. La Tabla 3.31 resume el cumplimiento de los criterios
estadsticos y fisicos por parte de cada modelo. En estas tablas de resultados, los
parmetros que no pasan algn criterio estn sombreados.
Cuando se ajustan todos los datos a la vez, los modelos que pasan los criterios
estadsticos son los modelos 1, 2, 8 y 9.
diferencial, es el que mejor ajusta los datos experimentales, es decir, el que tiene un valor
dc SQR ms bajo (1,31 frente a 1,83 del siguiente modelo en el orden de mejor a peor
ajuste). Parece el modelo ms adecuado para la hidrlisis de lactosa con ~-galactosidasa
de K. fragilis.
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competitiva por
glucosa (6)
Michaelis-Menten
con inhibicin
mixta por glucosa
(7)
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
galactosa <8)
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompettiva por
galactosa (9)
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
galactosa (10)
Michaelis-Menten
con inhibicin
mixta por galactosa
(11)
1<,
KM
Clave:
CRITERIOS
FSICOS
S
S
NV
5
5 (valores muy altos)
fi
S
F
E
CRITERIOS
ESTADSTICOS
OBSERVACIONES
Pasa.
No pasa.
(1 (3T)
O (3T)
+
0(21)
No pasa.
SQR: 2,13 (5)
O (2T)
k2
KM
K
5
E
fi
No pasa.
SQR: 4,00(9)
k2
KM
5
E
E
No pasa.
SQR:
k2
KM
K
No pasa.
k2
KM
K1
5
E
E
5 (valores altos)
5
F
F
k2
KM
K
5
F
E
k2
KM
K
5
E
fi
1
1
k2
KM
K
K1
5
NV
5
B (valores muy altos)
+
0(31)
0 (31)
O (3T)
O (31>
2,70 (60)
K1~K1.
SQI{: 4,01
(10)
0(31)
O (2T)
No pasa.
O (21)
0 (21)
+
.
No pasa.
SQR:
1,91 (40)
O (iT)
No pasa.
SQR: 1,41 (20)
No pasa. K1K1.
SQR: 1,90 (3)
Criterios fsicos:
157
E-,
ti
a
a
ti
Co
ti
a
ti
be
a
a
ti
-s
o
Ci
a>
Co
4
5->
ci
-ea>
St
Ci
cd
O-)
Ci
o
O
ci
o
o
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o
o
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O
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Co
ti
ti
a
ti
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~
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~
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O
C1r~.cen3Ooc
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O
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CI
1+14*14+1+1
Sr w~
00
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Sr
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ci ~
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>
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1-,
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-4
a
Co
ti
5-
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a
4
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ti
a
a
--5
5
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~
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O
-O
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Sr~
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Ce~>Z~CIO05~00
~
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Co
--5
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+1+1+1+1+1
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O O 000 CI
ci O O05OSrSr
~
ej
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4
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Ci
O
2-)
ccl
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O
2-)
ci
2-)
-e
o
o
-e4
ci O
-ea>ci~
-E
o
2-)
es
-5
Co
o
4-
a>
a
o-.-
4
e
rs
ci
rs
O
ci
cc~
Sr
SrCM
Sr CI
enO.
oc
PARAMETRO
Ln k0
Orden 1 (1)
Michaelis-Menten
simple (2)
CRITERIOS
ESTADSTICOS
+
E/R
Ln k0
>0
+
+
+
>0
ItMR
o
O
Lo k<,
Ea/R
-F
Ln KM
EaM/R
Ln KM
Michaelis-Menten
con inhibicin por
lactosa (3)
CRITERIOS
FSICOS
OBSERVACIONES
Pasa
SQR=5,48 (10)
No pasa.
SQR4,6l (90)
>0
Pasa.
SQR=S,44 (II)
>O
.y
>0
>0
No pasa.
SQI{=2,72 (4)
>0
>0
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
glucosa (5)
Ln k,
Ea/R
Ln KM
E3M/R
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
glucosa (6)
Ln k<,
E]R
Lo KM
ESM/R
Ln K1
MichaelisMenten
con inhibicin
mixta por glucosa
(7)
Ln k<~
Ea/R
Ln KM
E,M/R
LnK1
Eai/R
LnK
> O
No pasa.
SQR~232 (5>
> o
No pasa.
SQR=3,90 (8)
>o
<0
>0
>O
> O
Clave:
Criterios fsicos:
No pasa.
SQR=3,18 (6)
O Parmetro positivo
O incluye el cero en el intervalo de coiifianza
-i- pasa
Observaciones: al valor de SQR le sigue el n de urden de mejor a peor ajuste, entre parntesis.
>
Criterios estadsticos:
161
Captulo 3. Cintica de
PARAMETRO
La k<~
E3/R
Ln KM
EHM/R
LnK~
CRITERIOS
ESTADSTICOS
+
>0
Ln k0
MichaelisMenten
con inhibicin
mixta por galactosa
(11)
1-
> 0
> O
Ea/R
Ln KM
FaM/R
LnK1
>0
E0MIR
Ln K1
EMIR
Ln k<~
LnK1
Eai/R
LnK1
E~1/R
Clave:
Criterios fsicos:
Pasa.
SQR~2,44 (3)
1-
Ln k~
E~/R
Ln KM
Ea/R
Ln KM
EaM/R
Pasa.
SQR=l,34 (1)
> O
<0
-y
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
galactosa (10)
OBSERVACIONES
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
galactosa (9)
CRITERIOS
FSICOS
>0
Pasa.
SQR1,81 (2)
>0
<0
>0
No pasa.
SQRs=3,65 (70)
>0
O
0
O
0
<0
>0
Parmetro negativo
Parmetro positivo
Criterios estadsticos:
O incluye el cero en el intervalo de confianza
+ pasa
Observaciones: al valor de SQR le sigue el a de orden de mejor a peor ajuste, entre parntesis.
<0
>O
3.2.2.5.- Discusin
162
Como primera opcin, se han aplicado regresiones lineales para obtener los
parmetros cinticos para los distintos modelos propuestos. Estos modelos se linealizan
siguiendo los mtodos existentes para la ecuacin de Michaelis-Menten: LineweaberBurk, llanes y Eadie. Los parmetros que se obtienen para cada modelo por las distintas
linealizaciones no coinciden. Los ajustes son malos (r<O,9 en todos los casos); los valores
de F de Fiseher son ms bajos de lo que requiere un nivel de confianza del 95% en
muchos modelos. Hay muchos valores negativos de los parmetros, por tanto, sin sentido
fisico, en todos los modelos. Se podra pensar que hay que aplicar otros modelos, pero los
resultados son tan negativos que no parece ser ste el problema, ya que no hay mejoras
ostensibles de un modelo a otro con los ya aplicados. Por tanto, la utilizacin de las
linealizaciones a los datos cinticos, con la consiguiente manipulacin, para poder usar
regresiones lineales, no es un mtodo aconsejable en este estudio y no se aplicar a
ninguno de los sistemas de reaccin posteriores.
Como las ecuaciones diferenciales que ligan la velocidad con las concentraciones
son funciones no lineales de estas ltimas, se pueden ajustar los datos r vs C mediante
regresin no lineal. Los datos obtenidos se ajustaron de esta manera: primero se ajustaron
datos a la misma temperatura (ajuste con la temperatura como constante) y luego se
ajustaron datos a todas las temperaturas (ajuste a temperatura variable). En los ajustes a
temperatura constante se observ que los parmetros del denominador de las ecuaciones
diferenciales fluctuaban notablemente con la temperatura, cii vez de seguir una tendencia
concreta. Este fenmeno es debido a que estos parmetros se acoplan entre si para que se
ajusten mejor los datos de cada temperatura. Para evitarlo, se ajustan todos los datos de
todas las temperaturas a la vez en el ajuste a temperatura variable. Adems, en la
discriminacin de un nmero elevado de modelos que dan ecuaciones relativamente
parecidas, es estadisticamente ms correcto y ms esclarecedor aplicar la regresin no
lineal con la temperatura como vanable, porque se impone al sistema una variacin lgica
de los parmetros con la temperatura (Vrbel y coL, 1997). Al ap]icar regresiones no
lineales, los parmetros obtenidos ya tienen sentido fisico, obtenindose energas de
activacin razonables con varios modelos de los propuestos en la Tabla 3.2. As que,
claramente, la linealizacin no es aconsejable, sino lo que es adecuado es utilizar
regresiones no lineales cuando las ecuaciones diferenciales son funciones no lineales.
163
Tampoco parece muy aconsejable discriminar el modelo basndose en los resultados del
ajuste con la temperatura como constante. El modelo elegido por el mtodo diferencial
utilizando regresin no lineal y ajuste a temperatura variable es el modelo 8: inhibicin
competitiva por galactosa.
para generar,
utilizando un programa que tenga implementado el mtodo de integracin de RungeKutta de cuarto orden, valores de conversin de lactosa para cada valor de tiempo
experimental, que se pueden comparar con las calculadas en el ajuste de los datos
experimentales X vs t por el mtodo integral a temperatura como variable. Adems, con
la X experimental, se puede calcular el SQR en cada caso. El SQR al que se llega en la
simulacin que utiliza los parmetros obtenidos por el mtodo diferencial es 1,34, cuando
el SQR conseguido por el mtodo integral es 1,31. En la Figura 3.15 se observa la
tendencia de los residuos debidos al clculo de X con los parmetros obtenidos por los
mtodos diferencial e integral. Utilizar el mtodo diferencial no es ms til para la
discriminacin del modelo cintico que usar el mtodo integral y si exige un paso ms de
clculo, el clculo de las velocidades. En consecuencia, a partir de aqu slo se aplicar el
mtodo integral para la discriminacin de los modelos cinticos en los siguientes sistemas
reaccionantes.
164
simple. Estos modelos tienen varios parmetros que incluyen el cero en su intervalo de
confianza. Dc los modelos que incluyen la inhibicin por galactosa (modelos 8 a II), el
modelo que mejor ajusta los datos (menor SQR) es el modelo 8. Adems, los intervalos
de confianza de los parmetros de este modelo son los ms estrechos.
El anlisis de las velocidades iniciales indica que la inhibicin parece ser menor a
mayor temperatura, lo que lleva a un aumento de K1 al aumentar la temperatura, es decir,
que Eai es positiva, lo que est de acuerdo con lo obtenido en el modelo
8 y en
desacuerdo con lo que indica el modelo 9, que es el que mejor ajusta tras el modelo 8. La
ecuacin cintica que corresponde al modelo 8 es la siguiente:
K
M
k2 CE C,0~
[3.79 a]
Cgo
Kg,
donde:
5870441l
expyll,301,55- T
KM
12854+1223
Y
Kgal
101106200)
T
exp~24,581396 90016230
165
[3.79 b]
015
0.10
005
o
0.00
e-,
><o, -0.05
14 ~
-0.15
-0.20
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
tC~(minmg/L>
Figura 3.15.- Anlisis de residuos con los parmetros del mtodo diferencial y del
integral.
166
Los experimentos realizados, as como los resultados obtenidos, son los que se
reflejan en las Tablas 3.32 a 3.35. Las grficas X vs t CEN/IMA se presentan en las Figuras
3.27 a 3.35.
171
LOl
0,25
O
O
L02
L03
L04 - LOS
0,25
0,5
0,5
0,5
- 0,3 - O
0,15
15
00
0
0
o
0,061
0,148
0,26
0,40
0,50
0,56
0,77
0,79
0,86
0
0,06
0,15
0,24
0,37
0,43
0,57
0,72
0,84
0,78
0
0,03
0,12
0,13
0,25
0,29
0,42
0,64
0,79
0,76
XONPG
O
0,01
0,03
0,05
0,13
0,11
0,18
0,29
0,43
0,47
O
0,04
0,08
0,17
0,22
0,32
0,41
0,66
0,75
0,8
L06 - L07
0,5
1
0
0
0,25
0
L08L09
1 - 1
0,6 - 15
0
0
0
0,02
0,07
0,09
0,17
0,18
0,31
0,45
0,62
0,66
0
0,29
0,07
0,07
0,15
0,18
0,27
0,46
0,58
0,7
0
0,04
0,04
0,12
0,13
0,20
0,27
0,52
0,64
0,71
0
0,03
0,05
0,10
0,12
0,17
0,29
0,49
0,60
0,70
EXP
CoNpG(g/L)
Cgai(g/L)
CoNP(g/L)
tiempo(min)
LOtO
0,25
0
0
bu
0,25
0
0,05
L012
L013
0,5
0,5
0
15
0
0
XON Pc.
L014
0,5
0
0,25
LOiS
1
0
0
0,28
0,18
0,21
0,08
0,10
0,16
0,50
0,36
0,40
0,16
0,31
0,28
10
0,68
0,45
0,58
0,27
0,4
0,42
15
0,78
0,6
0,75
0,36
0,57
0,58
20
0,83
0,82
0,45
0,58
0,67
25
0,54
0,6
0,71
172
L016
0,25
O
O
L017
0,5
O
O
XON PC
o
0,3
0,56
0,7
0,85
o
0,41
0,68
0,85
LOIS
1
O
O
O
0,22
0,41
0,59
0,71
LOI
0,25
0
0
20
o
0,51
0,8
0,96
1
[
10,82
J0~83
173
[o,J
0,69 o~6s1o~s9I
L027
1
0,6
0
o
0,12
0,26
0,38
0,51
0,6
174
0.55
0.50
0.45
040
0.35
0.30
025
E 0.20
015
0.10
0.05
0.00
0.0
1OxlW
2OxlW
0ONPGO
4OxlU
3.0x10~
(rnolL)
0 vs
temperaturas.
Cgai o~ O gIL; CONRO
O g/L
175
()NIki
a varias
1.2
1enijerattwa
u 4(PC
O
25V
1.0-
__
o
ji
St
m~.
~0.6
xx
Ao
0.4
a.
a
8 0.2o
1-
0.0
0.00
002
004
0.06
Cgaio
1~
0.08
-r
0.10
0.12
(n-oIIL>
Figura 3.24. Hidrlisis de ONPG con la enzima de KJagilis: cociente entre las velocidades
iniciales con y sin galactosa inicial vs Craz o a varias temperaturas.CNpc~ ~ 0,5 g/L; CONPO O gIL.
1.2
E
II
1.0
o
a-
JO.8
0.6
O
Ao
0.
04
a
8 0.2
o
0.0
0.0
5.0x10
i.oxiW
15x103
2.OxlO
Caro (nnl/L>
Figura 3.25. Hidrlisis de ONPG con la enzima de K. fragilis: cociente entre las velocidades
iniciales con y sin ON? inicial vs CONPO a varias temperaturasCe-)NP(~ o 0,5 g/L; C~1 O gIL.
176
Se discrimina entre los modelos cinticos propuestos en las Tablas 3.2 y 3.3 Los
modelos de la Tabla 3.3 son modelos que consideran la inhibicin por los dos productos
de la reaccin. Estos modelos cinticos se utilizan para ajustar los datos experimentales
(C, t) por regresin no lineal teniendo en cuenta datos obtenidos a cada temperatura
(ajuste con la temperatura como constante) o ajustando todos los datos a la vez (ajuste con
la temperatura como variable).
Los modelos que pasan los criterios estadsticos son los modelos 1, 8, 9, 10, 12, 18
y 20. Al aplicar los criterios fsicos a los modelos cinticos, los modelos que superan los
citados criterios son los modelos 1 y 10.
177
cumplen algn criterio fisico o estadstico estn sombreados. En la Tabla 3.44 se muestra
el grado de cumplimiento de los criterios estadsticos y fisicos por parte de los parmetros
de cada modelo cintico.
Con la temperatura como variable, pasan los criterios estadsticos los modelos 1,
2, 4, 5, 8, 9, 10, 13, y 15. Los criterios fisicos (Energa de activacin de la constante
cintica del numerador mayor que cero; valores razonables de las energas de activacin)
los pasan todos los modelos ensayados.
El modelo que mejor ajusta (con el menor valor de SQR: 1,28) es el modelo 15. El
modelo 12 es el siguiente modelo que mejor ajusta, con un valor de SQR de 1,56. El
modelo 1 5 tiene unos parmetros con intervalos de confianza ms estrechos que los del
modelo 12. Por estas dos razones, el modelo 15 parece el ms adecuado para ajustar los
datos de la reaccin de hidrlisis de ONPG con Lactozym.
3.2.3.4.- Discusin
P~s-a elegir el modelo final, se han utilizado las conclusiones del anlisis de las
velocidades iniciales y del ajuste a temperatura variable por el mtodo integral. Como el
modele 12 pronostica unos valores de K1 gal y de K1
la temperatura,
179
El modelo que tiene el SQR menor es el 18, seguido de cerca por cl 15 y por el 12,
por ese orden (sus respectivos valores de SQR son: 0,74; 0,78 y 0,79). Como el modelo
18 pasa todos los criterios y es el que tiene mejor SQR total, parece ser el ms adecuado.
Los nicos modelos que se eliminan en esta etapa son los modelos con inhibicin mixta
por ONP y por galactosa (modelos 7 y 11), porque los resultados obtenidos con estos
modelos son mucho peores que con los dems: estos modelos tienen cuatro parmetros,
pero sus valores de SQR son iguales o mayores que los dc los modelos con tres
parmetros; varios de sus parmetros incluyen el cero en sus intervalos de confianza a
varias temperaturas y, adems, la constante K1 tiene un valor mucho mayor que la K1, por
lo que el trmino del denominador en el que est dicha constante se hace despreciable y el
modelo que contempla la inhibicin mixta se transfomm en uno de inhibicin
competitiva.
gal
y K1
ONP) que
valores similares que, en general, carecen de sentido fsico. Este hecho falsea la
discriminacin que se realiza con el ajuste con la temperatura como constante, por lo que
no es fiable, y hay que recurrir al ajuste de los datos con la temperatura como variable
para discriminar el modelo cintico adecuado.
Para llevar a cabo el ajuste de los datos experimentales con la temperatura como
variable se sustituye cada parmetro cintico por su expresin segn la ecuacin de
Arrhenius. Luego, se ajustan todos los datos de todas las temperaturas con la ecuacin de
cada modelo cintico, en la que se han sustituido los parmetros por sus expresiones
segn Arrhenius.
Los resultados del ajuste con la temperatura como variable: neperianos dc valores
preexponenciales y energias de activacin con sus intervalos de confianza, el valor de
SQR y el valor de E, se muestran en las Tablas 3.41 a 343, donde los parmetros que no
178
se muestra el anlisis de residuos calculado con el modelo 15. Como se puede observar, la
mayoria de los valores calculados a partir del modelo cintico elegido tienen menos de un
1 0 % de error respecto a los valores experimentales. Sin embargo, hay varios casos en los
que los errores superan el 15%. La ecuacin cintica del modelo 15 es:
k2 CE
CNPG
[3.80 a]
KM (~+
i Kiga)
gal
1 + K,ONP)
ONP
donde:
expj34,0O13,20
121604203
T
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T
K)
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[3-80 b]
Se han reproducido los resultados experimentales de las Tablas 3.32 a 3.35 con el
modelo elegido (ecuaciones [3.80 a] y [3.80 b]). Los valores obtenidos de la reproduccin
se representan como lineas continuas en las Figuras 3.27 a 3.35.
180
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Figura 3.26.- Anlisis de residuos comparando los datos experimentales con los valores
calculados a partir del modelo 15.
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PARA[METRO
Orden 1 (1)
Michaelis-Menten
simple (2)
k2
Michaelis-Menten
cnn inhibicin por
ONPC (3)
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
ONP (4)
k2
KM
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
ONP (5)
CRITERIOS
FISICOS
CRITERIOS
ESTADSTICOS
S+
Pasa.
SQR=3,31 (200)
No pasa.
SQR2,62 (18)
No pasa.
SQR~2,29 (17)
E
F
0C valor alto)
KM
S (a 40 F
F (a 400C valor bajo)
O (lT)
O (2T)
O (3T)
OBSERVACIONES
O (3T)
k
2
KM
O (2T)
O (IT)
k2
KM
K>
E
F
F
O (2T)
O (2T)
O (2T)
No pasa.
SQRI,68 (12t
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
ONP (6)
k2
E
F
13
O (lT)
SQR=l,59 (l0~)
Michaelis-Menten
con inhibicin
mixta por ONP (7)
k2
KM
K,
E
S+
O (2T)
O (3T)
No pasa.
SQR2,16 (160)
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
galactosa (8)
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitva por
galactosa (9)
k2
1-
SQRI,90 (13)
SQR2,O7 (15)
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
galactosa (10)
k2
Pasa.
SQR=l,96 (14)
KM
KM
No pasa.
SQR1,60 (11)
k2
13
KM
E
E
KM
13 +
1<~
B+
E
B+
Michaelis-Menten
k2
con inhibicin
KM
mixta por galactosa K
(11)
K>
Clave: Criterios fisicos:
No pasa.
SQR2,70 (19)
0 (2T)
O (2T)
F fluctua; 5 sube; 8 baja (segn aumenta la temperatura)
Parmetro negativo, le sigue el nmero de veces que lo es con ese
modelo
Criterios estadisticos:
o incluye el cero en el intervalo de confianza, le sigue el nmero de
temperaturas en las que se da la circunstancia con ese modelo
+ pasa
Observaciones: al valor de SQR le sigue el n de orden de mejor a peor ajuste, entre parntesis.
-
E (valores altos)
186
Michaclis-Menten con
inhibicin no competitiva
por ONP y acompetitiva
por galactosa (19)
Michaelis-Menten con
inhibicin no competitiva
por ONP y no competitiva por galactosa
(20)
PARAMETRO
CRITERIOS
FSICOS
CRITERIOS
ESTADSTICOS
KM
F
S+
O (lT)
K>~>~
13 +
O (IT)
K ONU
n~
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13 +
O
O (iT)
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O (IT)
+
E
13 +
O (IT)
No pasa.
SQR=O,88 (5)
O <IT)
SQRt,78 (2>)
B -+
O (3T)
SQRO,98 (8)
B -f-
E
E
E
O (2T)
KM
Kga>
K QN?
KM
K~5>1
-,
OBSERVACIONES
No pasa.
SQRO,79 (3)
No pasa.
SQR0,97 (7>)
B+
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KM
Kg
ONU
KM
Ki5ai
K QN?
KM
O (2T)
O (2T)
No pasa.
SQRO,91 (6>)
Kigai
K ONU
O (lT)
+
+
+
KM
K151>
No pasa.
SQRO,74 (1)
ONU
+
KM
K~>
QN?
E
-2
0 (IT)
KM
Kg
B+
E
K1 QN?
13 +
No pasa.
SQR 49(9)
No pasa.
SQRW,8O (4)
Criterios estadisaicos:
pasa
187
Orden 1
(1)
Ln k0
34,560,87
EaIR
12687136
MichaelisMenten simple
(2)
Ln KMO
2999 + 1 20
11310342
2653 + 640
EaMIR
96512060
Lii K>o
Eai/R
SQR
4,98
1478
Michaelis-Menten con
inhibicin por ONPG
(3)
29,4512,45
105696582
25,4816,40
9826 8964
9~53t12~?
$649
3,79
3,85
1357
698
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
ONP (4)
2933 2,32
10975700
2653+11,00
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
ONP (5)
32,90 + 1 92
120585644
26,54+724
Michaelis-Menten con
inhibicin no
competitiva por ONP
(6)
30,71 2,32
11413684
2653+542
E~MtR
96513600
96512142
96511698
Ln K10
10,046,76
-36,92640
51392000
-86361900
~Z24t2t4
2,40
1050
1039
896
MODELO
Ln k0
E2IR
LIIKMO
SQR
F
188
Capitulo
Lii k,j
EaIR
LnKMO
EaM/R
LnK10
Eai/R
SQR
F
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
galactosa (8)
29,46+120
11128346
26,53+2605
96498520
Miehaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
galactosa (9)
2978120
11226354
2641 696
96782000
Michaelis-Menten con
inhibicin no
competitiva por
galactosa (10)
12,24+896
-2597+816
11,85+930
45342618
66422404
29,451,18
11122354
26,96+420
9653 1244
44092746
3,06
3,26
3,08
856
809
851
Michaelis-Menten con
inhibicin competitiva
por ONP y
acompetitiva por
galactosa (13)
Michaelis-Menten con
inhibicin competitiva
por ONP y no
competitiva por
galactosa (14)
108882634
26 53 + 8,32
105272289
Lii KMO
108782742
24,65+930
E2MIR
90692600
LnK~o
Eatg~</R
11,427,60
4429 2260
96522564
-25,488,24
2456+ 1022
9121 2750
1425789
-6333 2843
6821 4523
8,027,14
1016+7,96
989496
45032164
51831732
1,76
947
51251875
1,83
1037
MODELO
LnKIONPO
E~oNp/R
Michaelis-Menten con
inhibicin
competitiva por ONP
y competitiva por
galactosa (12)
SQR
1,56
1049
189
MODELO
Lnko
EJR
Ln KMO
EaM/R
LflKigaio
Eaigai/R
Ln Ko~po
EaIONP/R
SQR
E
MODELO
Lnko
E2/R
LnKMO
EaMIR
Lii Kigaio
EaigailR
Lii KoNpo
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
ONP y competitiva
por galactosa (15)
3400+13,20
121604203
Michaelis-Menten con
Michaelis-Menten con
inhibicin acompetitiva inhibicin acompetitiva
por ONP y
por ONP y no competitiva
acompetitiva por
por galactosa (17)
galactosa (16)
32,58+1280
119394282
119244524
26,5315 06
96513428
-6,55600
4
-35,89 + 1504
-82803826
1,80
1129
>5~k i41~t~
5~ltaB4Z4
2230 13,52
81413700
629+6,14
28931704
-35,86 + 1422
-80853982
1,28
1301
-2756+560
-69561700
-3598 + 15,40
-8313 3502
1,82
1137
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por ONP
y competitiva por
galactosa (18)
Michaelis-Menten con
inhibicin no
competitiva por ONP y
acompetitiva por
galactosa (19)
Michaelis-Menten con
inhibicin no competitiva
por ONP y no competitiva
por galactosa (20)
30 12+22,10
3041+2116
30,31+22 16
112094690
2653+12,06
96514182
1243+12,20
47362106
-6776,04
112964234
2653+1348
96514096
-678+1332
-98881850
-2529+678
62951900
953
112674336
26,531184
96514126
2,14
2,14
Eai ONP/R
SQR
F
32621170
1050
1,94
190
4,~t 2q~?
~47:oJ~-Q$~
-670+634
948
M ichaelis-Menten
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
ONP (4)
PARAMETRO
Ln k<>
E1/R
Ln k<,
CRITERIOS
ESTADSTICOS
CRITERIOS
FISiCOS
>0
Pasa.
SQR=4,98 (18)
Pasa.
>0
SQR=3,85 (17)
+
+
+
E>/R
LnKM
E>M/R
OBSERVACIONES
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EJR
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No pasa.
SQR-=3,79 (16)
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SQR=2,40 (lo)
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Miehaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
ONP (5)
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
ONP (6)
>0
Ln k<,
FJ/R
>0
Ln KM
EJM/R
LnK1
EJIR
+
+
Ln k<,
>0
<0
No pasa.
Y> O
SQR=2,85 (12)
Lo KNI
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
galactosa (8)
>0
3
K>
aVR
Ln k0
E1/R
Ln KM
c O
aprox. 200
<-0
Pasa.
SQR=3,06 (15)
>0
Ln K1
Clave:
Pasa
SQR=2,60 (II)
Criterios fsicos:
Criterios estadisticos:
.4
+
>0
+ pasa
Observaciones: al valor de SQR le signe el nade orden de mejor a peor ajustc, entre parntesis.
191
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
galactosa (10)
PARAMETRO
Ln k9
CRITERIOS
ESTADSTICOS
E1/R
Ln KM
EIM/R
Ln K1
Ln KM
EIM/R
LnK>
Ln k0
E2IR
Ln KM
EM/R
Ln K1 gal
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
ONP y acompetitiva
por galactosa (13)
Michaelis- Menten
con inhibicin
competitiva por
ONPyno
competitiva por
galactosa (14)
Clave:
>0
Pasa.
SQR3,08 (13)
>0
>0
No pasa.
SQR=i,59 (1)
O
+
LnKIONP
E2, oNP/R
Ln k0
E2/R
Ln KM
EIMR
Ln ~<1
g~i
E1> gaVR
LnKIONP
E11 oNpIR
Ln k0
E2/R
Ln KM
EIM/R
Ln K> gal
E1> g>/R
LnKIONP
E1, opIR
Criterios estadisticos:
Observaciones:
Pasa.
SQR3,26 (14)
>0
E11 511/R
Criterios fsicos:
OBSERVACIONES
>0
Ln k<>
Micliaclis-Menten
con inhibicin
competitiva por
ONP y competitiva
por galactosa (12)
CRITERIOS
FSICOS
Y> O
>0
Y> O
>0
Pasa.
SQR=I,76 (4)
Y> O
<0
>0
>0
No pasa.
SQR=l,63 (3)
>0
<0
Y> O
+ pasa
al valor de SQR le sigue el n de orden de mejor a peor ajuste, entre parntesis.
192
PARA-
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
ONP y competitiva
por galactosa (15)
Ln k~
E1/R
3 KM
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
ONP y acompetitva
por galactosa (16)
Lii k<>
E1/l{
Ln KM
L151/R
Ln K1 gal
CRITERIOS
CRITERIOS
OBSERVACIONES
Pasa.
EIM/R
Ln K> gal
>0
No pasa.
SQR-=Q82(6)
>0
No pasa.
SQR-t80 (5)
-0
No pasa.
SQRI 94(7)
E~ 531/R
La K1 ONU
~[
Michaelis-Meuten
con inhibicin acompetitiva por
ONP y no
competitiva por
galactosa (17)
05kR
Ln k
E>/R
Ln KM
E1~1/R
3 K1 gal
+
+
0
E11 giR
LnKboNP
E1> ONP/R
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
ONP y competitiva
por galactosa (18)
Ln k0
EJR
Ln K5>
EMIR
Ln K> gal
+
+
E1> ga>/R
LII KIONP
MichaelisMenten
con inhibicin no
competitiva por
ONP y acompetitiva
por galactosa (19)
Q5~,R
La k<>
E]R
Ln KM
Ln K> gal
E1> ga/R
t.n K> olgg
+
+
Criterios estadsticos:
SQR2,14 (8)
+
+
+
E1M/R
Criterios fisicos:
>0
-b
E11 ()NIIR
Clave:
O Parmetro positivo
+ pasa
Observaciones: al valor de SQR le sigue el
it
193
Clave:
PARAMETRO
Ln k0
CRITERIOS
ESTADSTICOS
+
E>IR
Ln K~
E>/R
Ln K
E1/R
LnK~
+
+
O
0
+
Eai=/R
Criterios fisicos:
>0
OBSERVACIONES
No pasa.
SQR2,14 (9)
>0
<0
<O
Criterios estadsticos:
CRITERIOS
FSICOS
Parmetro positivo
Observaciones: al valor de SQR le sigue el n de orden de mejor a peor ajuste, entre parntesis.
194
3.3.
f3-
%.
200
empleado, pero no la actividad mxima: con BM, el pH ptimo ronda el valor dc 7,0 y
con BP, se aproxima a 7,5. Como se puede observar, el pH ptimo vara con el sustrato
utilizado.
201
120
100
80
80
1.-
-o
5
40
(3
20
Blanco
Fe
Co
Ni
Cu
Zri
Cr
Mn
ln presente en el medo
Figura 3.36>- Actividad de las enzimas frente a distintos iones divalentes.
Actividad residual vs in aadido a BP.
202
0.tE
___________
Irr,In,A
0.05 -
xi
LztECo SP
0-ot
-~
E
E
-;
003-
002
0.01
u.
-.
-e
u,
005
4
10
pH
0.30
...
-
.ECoIi BM
e- ECoIl SP
0.25-~
..
0200.15
e,
-U,
a)
-;
-...
ji
010
0fl51
e
4
pH
203
100-
80
.
-
90o
~9.
..--.
-.
y
70
E
a)
E
60-
y-
50~0
y
1>5
40-
A. 5,0
230
3020loo
5
pH
lOOi 1.
.5..
te
80-
---4
E
-e.
60-
A
1.-
40-
Tem
-D
.5
r.cC
ratura
u 40C
20-
45C
y..
4
y
50
100
150
200
250
t (mm)
300
50C
55C
350
400
450
la temperatura.
204
3.3>2.1.-Resultados experimentales
Los experimentos realizados se recogen en las Tablas 3.45 a 3.47 y los resultados
obtenidos se muestran en las Figuras 3.45 a 3.50, como conversin de lactosa vs. el
producto tC17.
CLI
50
O
CL2
50
O
CL3
50
O
Cgiii(g/L)
15
2,33
3,5
120
330
1260
1500
2730
3420
0,02
0,04
0,12
0,13
0,13
0,16
0
0,025
0,12
0,16
0,21
0,29
0,02
0,05
0,26
0,29
0,43
0,5
CE(mg/L)
tiempo(min)
205
CL4
25
0
CL5
50
15
CL6
50
0
CL7
50
0
CLS
75
0
CL9
50
0
CLJO
50
15
Cgiu(g/L)
15
CLil
50
0
15
Cr(mglL)
3,5
3,5
3,5
3,5
3,5
0,02
0,02
0,05
0,10
0,02
tiempo(miu)
o
Xra.
o
30
60
0,03
0,01
0,01
0,03
0,01
120
180
0,15
0,09
0,026
0,06
0,05
0,04
0,04
0,09
0,17
0,29
0,11
0,05
0,13
0,09
450
8>70
1080
0,49
0,84
0,91
0,19
0,41
0,1
0,19
0,21
0,41
0,12
0,28
0,51
0,66
0,32
0,41
0,98
0,29
0,32
1350
0,50
0,60
210
300
390
420
0,02
0,07
0,08
CL12
Ciac(g/L)
50
Cga,(g/L)
0
0
3,5
Cgj(g/L)
CE(mg/L)
tiempo(min)
0
CL13
50
15
0
3,5
CL14
75
0
0
3,5
CLiS
50
0
0
7
CLI6
50
0
15
7
CL17
25
0
0
7
0,19
0
0,12
0,24
0,44
0,62
0,76
0
0,09
0,17
0,30
0,41
0,52
0,28
0,88
0,61
0
0,21
0,45
0,87
0,98
0,97
0,90
0,35
0,91
0,65
Xiac
0
0,01
60
0,03
0,08
120
0,21
0,13
180
300
0,3
0,39
0,51
0,24
0,35
0,50
0,01
0,02
0,05
0,14
360
0,61
0,56
30
240
0,04
206
El objeto del anlisis de las velocidades iniciales es dar una idea de los modelos
cinticos que pueden ser ms adecuados para explicar los resultados experimentales de la
reaccin en estudio. Sirve, por tanto, para realizar una discriminacin cualitativa del
modelo cintico.
Para calcular los valores de las velocidades iniciales, r0, en cada experimento, los
datos C vs t se ajustan a una funcin y la velocidad inicial se obtiene por derivacin
analitica a t=0, como ya se indic en el apartado 3.1.3.
inicial de lactosa. Este hecho sugiere que el orden neto para el sustrato es
tiempo cero sobre la velocidad inicial de reaccin. Comparando las Figuras 3.42 y 3.43,
se observa que la glucosa inhibe ms que la galactosa. Para un mismo valor de
concentracin de galactosa y de glucosa, la velocidad de reaccin disminuye ms con la
adicin de glucosa. Adems, la pendiente de las rectas de la Figura 3.43 disminuye al
aumentar la temperatura. Por tanto, la inhibicin debida a la glucosa disminuye con el
207
gli,
debera aumentar
0.10
0.00
0.00
0.04
0.08
012
0.18
0.20
0.24
0.28
0.32
C~0 (moIlL)
Figura 3.41.
1.2
1.0-
II
Te
..-.---_
.-
A.
0.8
ratiira
e 4(PC
25
u
Ate
m
~ o 0.6-
50.4-
02-
1-
00
0.00
0.02
0.04
006
0.08
0.10
0.12
C~0 (mol/L)
Figura 3.42. Hidrlisis de lactosa con la enzima de Cccli: cociente entre las velocidades
iniciales con y sin galactosa inicial vs C51> o a varias temperaturas. C~ 50 gIL; C511
O g/L.
208
1.2
u
k+enueratura
4tO
25>0
1.0-1
__
oII
.7-
ej
Va
e
~
.2 0.6 A~
04-4
ci
02~
0.0
002
004
0.06
0.00
0.08
010
0.12
Cgiuo (rruwL)
Figura 3.43. Hidrlisis de lactosa con la enzima de Ecoli: cociente entre las velocidades
iniciales con y sin glucosa inicial vs Cguo a varias temperaturas. Cu>Y>t 50 gIL; Cgte O gIL.
constante podia dar resultados no vlidos para discriminar el modelo cintico, ya que
carecia de fiabilidad estadstica. En el estudio cintico empleando la enzima de E. coli,
por tanto, no se aplicar el ajuste con la temperatura como constante, sino que se ajustarn
todos los datos experimentales recogidos en las Tablas 3.45 a 3.47 con la temperatura
como variable.
inhibicin por galactosa. Los modelos analizados en primer lugar son los que se muestran
en la Tabla 3.2, que consideran por separado la inhibicin de cada producto. En este caso,
P es glucosa o galactosa.
209
parmetros que no pasan los criterios fisicos o estadsticos del punto 313.2 estn
sombreados. En la tabla 3.50 se resume el cumplimiento de los criterios estadsticos y
fisicos por parte de los parmetros cinticos obtenidos en cada modelo.
Analizando la Tabla 3.50 se observa que los modelos 1,2, 5 y 6 pasan los criterios
estadisticos.
Los criterios fisicos los cumplen todos los modelos. Los modelos que
consideran inhibicin mixta por glucosa o por galactosa tienen varios parmetros sin
significacin estadstica, pues incluyen el cero en sus intervalos de confianza. Por tanto,
aunque el modelo 7 es el que menor residuo genera, se ha eliminado porque tiene 4
parmetros en cuyos intervalo de confianza se incluye el cero. El modelo que pasa los
criterios estadsticos y fisicos y genera el menor residuo
0,28). En consecuencia, no
se puede elegir en esta fase cul es el modelo ms adecuado entre los modelos 5 y 6.
Los modelos que incluyen inhibicin por galactosa no cumplen los criterios
estadsticos ya que incluyen el cero en el intervalo de confianza de la constante de
inhibicin. Por tanto, en adelante, no se considerarn aquellos modelos en los que haya
inhibicin por galactosa, lo que permite obviar los modelos de la Tabla 3.3.
3.3.2.4.- Discusin
Del anlisis realizado de las velocidades iniciales se deduce que el modelo debe
ser de tipo Michaelis-Menten con inhibicin por glucosa y, posiblemente, la inhibicin
temperatura como variable, se deduce que puede despreciarse la inhibicin por galactosa,
ya que las constantes de inhibicin de este producto no tienen significado estadstico.
210
Por el contrario, los modelos de la Tabla 3.32 que consideran inhibicin por
glucosa son los que dan parmetros estadisticamente ms fiables y generan menor
residuo, lo que confirma los resultados cualitativos obtenidos del anlisis de las
velocidades iniciales.
El anlisis dc los residuos calculados con los valores obtenidos del modelo 5 y los
datos experimentales se muestra en la Figura 3.44. Se puede observar que la diferencia
entre el valor calculado y el experimental es menor del 10% en la mayor parte de los
puntos, no observndose tendencia alguna en los residuos. El modelo cintico elegido se
da en las ecuaciones [3.81 a] y [3.81 b]:
1<, C~ Ch>
KM + CIOL 1
[3.81 a]
donde:
ki=exj13~710~60 7239lSOj
(
K~, ~exPyl 1,325,94
=e
=132
48941840
T
[3.81 b]
JI
1007596
1,28~
T
211
st -0.05
a
0.lo
-0.15
-0.20
0
500
1000
1500
t CE (mm
n~/L)
2000
2500
Figura 3.44.- Anlisis de residuos comparando los datos experimentales con los valores
calculados a partir del modelo 5.
212
Orden 1
(1)
MichaelisMenten simple
(2)
Michaelis-Menten con
inhibicin por lactosa
(3)
15,454070
13,26+043
71682250
72001264
1458+056
73011720
5,~7 *9,60
2609286S
29,48 + 24 00
107547420
E~1lR
SQR
2,91
846
4901 2750
0,68
1353
0,76
1844
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
glucosa (4)
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
glucosa (5)
1324+056
71341680
>4~I~~
1371+060
7239180
1132+594
48941840
La K10
1Gfl~7$ fI
1 32 + 1 28
E,11R
6003 iE240~
MODELO
Lnk~
EaIR
LnKMO
4hZ
E2MIR
563
0900
SQR
0,37
2463
1007 596
0,28
3500
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
glucosa (6)
Michaelis-Menten
con inhibicin
mixta por glucosa
(7)
Lnk0
1353+058
1333+065
Ea/It
7189164
Ln
KMO
KM/It
Ln K
10
10 53 + 5 80
47171696
7136202
23~2O
18;99i
t
75067428
225 + 1 80
1253564
1639 t2~;82
MODELO
E111R
60659012
Ln K10
340013 65
E11/It
SQR
E
1431 1056
0,26
0,27
3513
3513
213
7231130
-
YA
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
galactosa (9)
1318062
7175184
27,42+2340
101097400
Ln K10
Ea/R-
20:42t1t2M
?~
~6ih~.
400
SQR
0,75
5$40t3Q
0,75
1271
1228
MODELO Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
galactosa (10)
Lnk
0
13,47+054
Ea/R
7247156
Ln KMO
1
9
EaM/R
4
Ln K10
Ln K10
Eai/R
SQR
F
Michaelis-Menten
con inhibicin
mixta por
galactosa (11)
1321+054
7247387
9,~WF 4112
4$ 4tp; U>
$$>i>$:> >1~2S~
~>2y~t45V62
0,75
1225
0,70
1248
214
Michaelis-Menten
simple <2)
Michaelis-Menten
con inhibicin por
lactosa (3)
PARAMETRO
Lnk5
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
glucosa (6)
Michaelis-Menten
con inhibicin
mixta por glucosa
<7)
>0
Ln k0
Fa/R
>0
LnKr
EaM/R
Ln k1,
E>/R
Ln KM
EMIR
Ln k0
E>/R
Ln KM
F1M/R
LnK1
Eai/R
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva pnr
glucosa (5)
CRITERIOS
FISICOS
+
+
EaM/R
LnK1
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
glucosa (4)
CRITERIOS
ESTADSTICOS
Pasa.
SQR: 2,91 (1 1)
Pasa.
SQR: 0,76(10)
> O
>0
No pasa.
SQR: 0,68 (5>)
o
0
>0
O
0
>0
>0
No pasa.
SQR: 0,37(4>)
O
0
0
Ln k0
VR
Ln KM
EaM/R
LnK1
Eai/R
Ln k0
E~/R
Ln KM
F~NI/R
LnK1
> 0
>0
>0
Pasa.
SQR 0,27 (2)
+
+
>O
+
+
>0
>0
Pasa.
SQR: 0,27 (3<)
EMIR
Ln k(,
VR
Ln KM
E>M/R
Ln K1
>O
>0
>0
No Pasa.
SQR: 0,26(1)
O
>0
0
LnK1
OBSERVACIONES
<0
O
<0
~ O Parmetro negativo
> O Parmetro positivo
Criterios estadsticos:
O incluye el cero en el intervalo dc confianza
+ pasa
Observaciones: al valor de SQR le sigue el n de orden de mejor a peor ajuste, entre parntesis.
215
variable.
MODELO
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
galactosa (8)
Michaelis-Menten
con inhibicin
-acompetitiva por
gatactosa (9)
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
galactosa (10)
PARAMETRO
CRITERIOS
ESTADSTICOS
Ln k0
E>/R
Ln KM
+
+
>O
>O
Ln K1
EM/R
O
0
>0
Ln k<,
E~/R
Ln KM
EaM/R
LnK1
EMIR
Ln k<,
EaIR
Ln KM
EaMIR
LnK1
EaiR
Ln k0
Ea/R
Ln KM
E>M/R
O
0
O
0
O
0
>0
No pasa.
SQR: 0,75 (8)
>O
>0
+
+
>O
No pasa.
SQR: 0,75 (9)
o
>0
<0
> 0
No pasa.
SQR: 0,70 (6)
>0
>0
>0
Criterios estadsticos:
No pasa.
SQR: 0,75 (71
LnK,
Eai/R
LnKj
EMIR
Critcrios fisicos:
OBSERVACIONES
EaM/R
Michaelis-Menten
con inhibicin
mixta por galactosa
(II)
Clave:
CRITERIOS
FSICOS
Parmetro positivo
Observaciones: al valor de SQR le sigue el n> de orden de mejor a peor ajuste, entre parntesis.
216
3.51 a 3.54. Los resultados dcx vs t C~ se muestran en las figuras 3.56 a 3.64.
EXP
CoNpc(g/L)
Cgai(glL)
CONp(g/L)
tiempo(min)
0
3
6
10
15
20
30
60
90
20
Col
0,25
0
O
C02
0,25
0,3
0
C03
0,5
0
0
C04
0,5
0,15
0
COS
0,5
15
0
CO6
0,5
0
0,25
0,25
0,41
0,48
0,58
0,76
0,8
0,85
0
0,06
0,14
0,25
0,35
0,04
0,1
0,16
0,23
0,04
0,09
0,16
0,23
0
0,01
0,02
0,06
0,11
0,45
0,3
0,3
0,13
0,56
0,73
0,82
0,41
0,65
0,78
0,42
0,65
0,78
0,17
0,31
0,03
0,06
0,1
0,15
0,2
0,28
0,46
0,8
0,77
0,78
0,41
0,48
0,6
0,67
220
COS
1
0,6
0
C09
1
15
0
XONPC
0
0,06
0,15
C07
1
0
0
0,03
0,06
0,1
0,14
0,19
0,29
0,5
0,03
0,06
0,09
0,14
0,19
0,25
0,47
0,02
0,045
0,081
0,101
0,12
0,19
0,31
0,66
0,7
0,59
0,68
0,43
0,69
EXP
COJO
6
10
15
20
0,65
0.8
0,86
0,9
COt
C012
C013
0,5
0,68
0,72
0,76
0
0,2
0,41
0,63
0,78
0,86
0,9
0
0,17
0,31
0,48
0,66
0,78
0,84
C014 -
0
0,18
0,35
0,56
0,72
0,82
0,79
COIS
COl
0
0,14
0,24
0,41
0,56
0.68
0.72
0
0,09
0,19
0,3
0,41
0,54
0,63
C017
0,25
O
C018
0,5
O
tiempo(min)
0
3
6
10
15
20
C019
1
O
O
XON PC
0
0,28
0,54
0,76
0,89
0
0,46
0,71
0,82
0,95
0,98
O
0
0,18
0,32
0,51
0,7
CoNP(;(g/L)
0,25
0,25
C~ai(g/I~)
CoNp(g/L)
tiempo(niin)
O
3
0,25
0,5
0,5
0,5
0,3
0,15
15
0,5
O
0,58
O
0,59
O
0
0,81
0,81
10
15
0,84
0,89
20
0,96
0,5
15
0
0,6
0,25
O
0,39
0
0
XoN~
O
O
0,4
0,26
0
0,26
0
0,24
0
0,22
0,48
0,64
0,65
0,5
0,45
0,45
0.39
0,83
0,8
0,63
0,72
0,8
0,82
0,8
0,82
0,62
0,64
0,62
0,72
0,64
0,72
0,56
0,7
0,12
0,23
0,32
0,51
0,79
-~-
0,82
0,8
0,81
0,69
0,75
0,73
0,72
0,62
221
Capitulo 3. Cintica de
temperaturas bajas el orden neto del ONPC se aproxima a cero, mientras que, al aumentar
la temperatura, se va acercando a uno.
supondra que la KM aumenta con la temperatura, por lo que la afinidad de la enzima por
el sustrato disminuye al aumentar esta variable.
concentracin mucho mayor que el ONPG. Es decir, la enzima tiene mucha ms afinidad
por el sustrato que por la galactosa. Al aumentar la temperatura, la inhibicin es menor, lo
gal
inhibicin por ONP y por galactosa, cuando sta se aade a concentraciones elevadas.
222
050
0.45
0.40
0.35
030
025
020
0.15
0.10
0.05
0.00
3
10x1Q~
0.0
3.OxlO3
4.Ox
2.OxlO
CoN~ (rml/L)
Figura 3.51.
CNPG
-a varias temperaturas.
1.2
o
II
10
u 40C
c
0.6
ci
A
~ 0.4A-.
o
o
0.2-
0.0
0.00
0.02
0.04
006
0.08
0.10
012
c~0 (rrul/L)
Figura 3.52. Hidrlisis de ONPG con la enzima de Ecoli: cociente entre las velocidades
iniciales con y sin galactosa inicial vs Cg a varias temperaturasC0y~, ~>= 0.5 gIL; (t\
O gIL.
-
223
1.2-
&
1.0
0.8-
IIo
--e-Lo
06-
o
A
004
80.2o
0.0
0.0
50x104
10x10~
1.5x103
2.0x103
CONF (M)
Figura 3.53. Hidrlisis de ONPG con la enzima de E ccli: cociente entre las velocidades
iniciales con y sin ONP inicial vs CON?O a varias temperaturas.CONPG 0=0,5 gIL; C
-
0~>0
O gIL.
inhibicin conjunta por los dos productos de la hidrlisis. El ajuste de los datos de las
Tablas 3.51 a 3.54 se realiza por regresin no lineal acoplada a una tcnica numrica de
integracin (Runge-Kutta).
Los parmetros cinticos obtenidos para los modelos de la Tabla 3.2, as como el
residuo que genera cada modelo se recogen en las tablas 3.55 a 3.58. Los parmetros que
no cumplen los criterios estadsticos o fisicos del apanado 3.1.3.2 estn sombreados en
estas tablas. En la Tabla 3.59 muestra el grado de cumplimiento de los criterios
224
Pasan los criterios estadsticos los modelos 1, 2, 4, 8, 9, 12, 13, 18 y 20. Los
criterios fisicos los pasan los modelos 1, 2, 3, 4, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 18 y 20, los dems
modelos tienen energas de activacin excesivamente altas.
3.3.3.4.- Discusin
cintico debera incluir inhibicin por ONP y por galactosa, teniendo en cuenta que la
inhibicin por galactosa slo se observa a concentraciones altas de la misma.
Del ajuste de los datos experimentales de las Tablas 3.54 a 3.57 a los modelos de
las Tablas 3.2 y 3.3 se pueden seleccionar los modelos 12, 13 y 18, ya que generan los
menores residuos y pasan los criterios impuestos. Estos modelos tienen en cuenta la
inhibicin por los dos productos, lo que confirma los resultados del anlisis de las
velocidades iniciales.
gal
siguen la
aumentar la temperatura. Por lo mismo, se desecha el modelo 13, que predice la tendencia
contraria con la temperatura del parmetro K1 gal~
En la Figura 3.54 se analizan los residuos calculados con los valores obtenidos del
modelo 12 y los datos experimentales. La diferencia entre el valor calculado y el
experimental es menor del 10% en la mayoria de los casos y dichas diferencias se
distribuyen de forma aleatoria en tomo al cero, sin mostrar tendencia alguna, por lo que el
225
k, Ct: Ccvpc
C
C
gal
+
KM
ga/
ONP
ONP
[3.82 a]
+
CONPG
donde:
exp( 1820+428
KM
Kjg~j
78781236>~
T
expfj4l 50+12,8O~14~4O0JI
3799;1894JI
[3.82 b]
expI9~786,04
151974580
exp 42,72 14,50
1
JI
226
0.2
0.1
~o-0
-0~ 1
-0.2
20
4C
60
80
100
tC~(minmglL)
Figura 3.54.- Anlisis dc residuos comparando los datos experimentales con los valores
227
MODELO
Ln k0
MichaelisMenten simple
(2)
34,56+403
115395289
EJR
LnKMO
EaM/R
Ln K10
Eai/R
SQR
F
26 18 + 5,12
102601426
2560+6,40
95631810
Ln k0
EaR
27,19684
108565429
26,49+1123
106425439
56,294522
65 >2;V$9$
3,12
1123
MODELO
Michaelis-Menten con
inhibicin por ONPG
(3)
2,80
928
2,16
627
101174974
Ln KMO
58,56 + 3840
EOM/R
2030912612
33,45 17,80
9523 4826
Ln Ko
Eai/R
SQR
65,90 + 38 40
-37v? 4,0
2244812256
1,68
~4,Q2>iD~k4,&5~t0
1,85
1008
913
Michaelis-Menten con
inhibicin no competitiva por ONP (6)
Michaelis-Nlenten con
inhibicin mixta por
ONP (7)
11,06+448
1553+5,28
EJR
5801 1348
Ln KMO
-16,09 + 748
70881538
4,3210,32
33343086
2780+12,64
100103600
F
MODELO
Lnk
ERM/R
27542246
LnK10
15
11 441<
-582~3$742;z
Ln K10
Eai/R
SQR
F
-1,8010 bt2,0 It
1,39
911
1,63
1049
228
MODELO
Ln k0
EJR
Ln KMO
EaMIR
Ln K10
Eai/R
SQR
E
Michaelis-Menten con
inhibicin
competitiva por
galactosa (8)
Michaelis-Menten con
inhibicin acompetitiva
por galactosa (9)
30,50 + 760
38 78 + 14,20
137103950
3136 + 13,80
108903980
-4950 + 15,90
-137594550
2,15
791
114042108
27,36+760
99302156
9,39 + 876
36372624
2,09
826
Michaelis-Menten con
inhibicin no
competitiva por
galactosa (10)
Michaelis-Menten con
inhibicin mixta por
galactosa (11)
Ln K10
34,11+882
124052448
29,02 + 848
103192346
-8,14 + 7 16
28,12+744
107092080
2l,05 + 854
80342424
~38Q4t:7g9O
Eai/R
-1777tZt49
4,181023010
MODELO
Lnko
Ea/R
Ln KMo
EaM/R
Lii K10
Eai/R
SQR
E
-1,03 i9
-393;4t.539,Z
2,10
818
1,99
644
229
Ln k0
Ea/R
Ln KMO
EaM/R
Ln Kigaio
Eaj gai/It
Ln K1 ONPO
Eai ONIIR
SQR
F
MODELO
Ln k0
Ea/It
Ln KMO
EaM/R
Ln Kgao
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
ONP y competitiva
por galactosa (12)
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por ONP
y acompetitiva por
galactosa (13)
Michaelis-Menten con
inhibicin competitiva
por ONP y no
competitiva por
galactosa (14)
1820 + 4,28
21,77 + 539
2067 + 4,44
78781236
88901510
85701268
41 50 + 12,80
147614100
9786,04
37991894
3965 + 9,98
141453142
3900+12,00
140363780
151974580
38,46 + 960
137313044
-24,09+900
-63332950
37,66 + 11 90
135833700
1,18
1,20
1,11
1096
1042
1127
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
ONP y competitiva
por galactosa (15)
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
ONP y acompetitiva
por galactosa (16)
Michaelis-Menten con
inhibicin acompetitiva
por ONP y no
competitiva por
galactosa (17)
4272 + 14,50
429-k:><~
*t24S~ 10
tYiY:.jk>
SQR
F
4~~t ~~>M
t4flQ*- ~t
,sil>
.=1-:.29Q.
-454 + 6,32
Eaigai/R
5021880
Ln K1 ONP O Z~?~0I~I7
EaioN>/R
-77it~ ~:~0
>~0L O~ It Z~ 1O~
144~M~>< ~0d o~
777FIo=J1?5~
-1282 + 5,40
-30191636
S~iZ$76,
~s
-5146 t~Z4D
zi:4~~r~-p~w
4>7~W, JZ2,1V34t~
-I 42104 4810
1,11
1141
1,22
1035
1,10
1149
230
Lii k0
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
ONP y competitiva
por galactosa (18)
Michaelis-Menten con
Michaelis-Menten
inhibicin no
con inhibicin no
competitiva por ONP y competitiva por ONP
acompetitiva por
y no competitiva por
galactosa (19)
galactosa (20)
36;O.$ 474;1
Ea/R
11,49 + 5 10
58281500
40,83 11,98
141445256
Ln M0
-16,58+720
3t1t17~3
26,9612,20
2975 2142
12,91+664
-29371942
-56,59 + 1822
-154845742
1,08
1171
9,99494,99iO~
9538 3240
-12,92+602
-30041798
-15,61 6,62
-2733 1982
1,27
981
EaM/R
LflKigaio
Eaigai/It
Ln KIONPo
E01 Q~p/R
SQR
E
-1531654
-26321956
-34~83I8,20
+02 W~t>4~98
1,32
935
231
Orden 1(1)
Michaelis-Menten
simple (2)
PARAMETRO
Lnk0
E>/R
Ln k()
EJIR
Ln KM
E>M/R
Michaelis-Menten
con inhibicin por
ONPG <3)
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
ONP (4)
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
ONP (5)
Mchaebs-Menten
con inhibicin no
competitiva por
ONP(6)
CRITERIOS
ESTADSTICOS
>0
>0
+
+
>0
Ln k0
EaIR
Ln KM
E>~/R
LnK1
EMIR
Ln k<>
E}P.
Ln KM
EaMIR
LnK1
E>11R
Ln k0
E>IR
Ln KM
E>M/R
LnK1
EaIR
Ln k0
E>/R
Ln KM
EaMIR
LnK[
>0
>0
>0
Pasa.
SQIZFI,68 (12)
> O
>0
+
+
>0
No pasa.
SQRA,85 (13)
>O
+
+
>0
No pasa.
SQRI,63 (11<>)
E>M/R
LnK!
Criterios estadisticos:
No pasa.
SQR~2,16 (18)
Pasa.
SQR=3,12 (20)
Pasa.
SQR2,80 (19)
>0
Ln k0
E11IR
Ln KM
LnK1
FaIR
OBSERVACIONES
<0
Michaelis-Menten
con inhibicin
mixta por ONP
<7)
CRITERIOS
FSICOS
>0
No pasa.
SQR1,38 (10)
>0
>0
O
0
<0
Observaciones: al valor de SQR le signe el n<> de orden de mejor a peor ajuste> entre parntesis.
232
variable.
MODELO
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
galactosa <8)
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompetitiva por
galactosa (9)
Michaelis-Menten
con inhibicionno
competitiva por
galactosa <10)
Michaelis-Menten
con inhibicin
mixta por galactosa
<11)
PARAMETRO
Ln k0
CRITERIOS
FSICOS
IR
Ln KM
E>~IR
Ln K1
B>JIR
Ln k0
E>/R
Ln KM
E>MIR
Ln K1
EMIR
Ln k0
E>/R
Ln K~
>0
+
+
. 0
>
+
+
>0
> O
<0
+
+
>0
>0
Ln k0
li,IR
Ln KM
>0
IR
LnKIONP
l1>~ ()NPIR
No pasa.
SQR~2,l0 (17<)
+
+
E>1 gal
Pasa.
SQR=2,15 (16)
LnK1
Ln K1 gal
No pasa.
SQR=2,09 <15<>)
Ln ko
E>/R
Ln KM
E>M/R
OBSERVACIONES
E>~IR
l%IR
Michaelis-Menten
con inhibicin
competitiva por
ONP y competitiva
por galactosa <12)
CRITERIOS
ESTADSTICOS
No pasa.
SQRil 99 (14>)
<0
.~..
>0
Pasa.
SQR=l,l8 (5)
+
.4.
>O
>0
+
+
233
Michaelis- Menten
con inhibicin
competitiva por
ONPy no
competitiva por
galactosa (14)
PARAMETRO
Ln k0
CRITERIOS
ESTADSTICOS
CRITERIOS
FSiCOS
E3IR
Ln KM
E>M/R
Ln K gal
E>1 gaIR
LnKIONP
E>1 ONPIR
Ln k<>
E>/R
Ln KM
>0
OBSERVACIONES
Pasa.
SQR~1,2O (6)
>0
<0
>0
E>MIR
Ln
K1 ~>
E> g>iIR
+
+
+
LnK[ONP
>0
No pasa.
SQRI,11 (4)
>0
>0
E>
Michaelis-Menten
con inhibicin
aconipetitiva por
ONP y competitiva
por galactosa (15)
Michaelis-Menten
con inhibicin
acompettiva por
ONP y acompettva
por galactosa (16)
Clave:
1 ONPIR
Ln k0
E>IR
Ln KM
E.>M/R
Ln K1 gal
EaigaiIR
>0
LnKIONP
No pasa.
SQR>l,l 1(3<>)
E> ONPIR
+
+
Ln k0
E>IR
Ln KM
E>MIR
Ln K1 gal
E>1 g;/R
LUK?ONP
EM ONPIR
No pasa.
SQRI,22 (7)
+
+
+
< O (valor altsimo)
Criterios fisicos:
Criterios estadsticos:
Observaciones: al valor de SQR le sigue el no de orden de mejor a peor ajuste, entre parntesis.
234
enzimas en disolucin
variable.
MODELO
Michaelis-Menten
con inhibicin acompetitiva por
ONP y no
competitiva por
galactosa (17)
PARAMETRO
Ln k0
CRITERIOS
ESTADSTICOS
-1-
E>/R
Ln KM
EmNI/R
Lii K, gal
LEa gaiIR
Ln K1 (INI>
<0
<0 (valor altsimo)
OBSERVACIONES
No pasa.
SQR-tlO (2<>)
E>1 ONPIR
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
ONP y competitiva
por galactosa (18)
Ln k~
E>IR
Ln KN4
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
ONP y acompetitva
por galactosa (19)
Ln k1,
E>/R
Ln KM
E>MIR
Ln K1 gal
Michaelis-Menten
con inhibicin no
competitiva por
ONPyno
competitiva por
galactosa (20)
Ln k11
E>IR
Ln K<><
E>~IR
I.n K41
ltIR
Ln K~,
E>421R
Clave:
CRITERIOS
FSICOS
>0
Pasa.
SQIUl,08 (1<>)
$4o pasa.
SQRl,32 (90)
E>511R
Ln K1 ~
>0
No pasa.
SQR,27(80)
>0
-1
<o
+
1-
<0
Criterios fisicos:
235
observa que el tampn utilizado slo afecta a la enzima de E ccli, por lo que se puede
deducir que la interaccin de esta enzima con el ONPG es algo diferente a la de la
241
puede ejercer un mayor efecto de apantallamiento que dificulte la interaccin sustratoenzima. Como el pH ptimo es mayor en el tampn HP que en el tampn BM, parece
que hay que disminuir el nmero de cargas positivas globales en el medio en el caso
del HP para que la atraccin entre la enzima y el sustrato sea mxima. Parecen ser las
cargas positivas del medio las que bloquean la interaccin. Hay que recordar que la
galactosa del ONPG tiene una ligera carga positiva y que es la parte de la molcula
que se hidroliza que est ms ligada a la enzima.
actividad es debido a la interaccin de los H3O~ con los aminocidos que forman el centro
activo de la enzima.
242
actividad a tiempos de exposicin mayores. Este hecho parece indicar que hay cierta
activacin trmica de la enzima cuando se incuba a esa temperatura, relativamente
moderada, lo que podra explicarse si la enzima pasara de una conformacin plegada
y estable a otra desplegada, ms activa pero ms inestable, que luego degenerara en
una conformacin inactiva. A 50C, da la impresin de que la enzima se estabiliza
cuando su actividad se ha reducido al 50%, lo que est de acuerdo con los resultados
de otro autor (Wadiak y Carbonel, 1975). Parece que la enzima llegue a una segunda
243
030
- _____________________________________
025-
.r
~020-
-g
y-
<u
~X-
~015
Kft~lls,RM
e- Kfragflis,EP
S~<- Eozti,BM
Fccii,BP
y,
,..4<
.<
010-
0-05e
y
0.00
5
pH
pH
Figura 3.64.- Efecto del pH en las reacciones de hidrlisis de lactosa y ONPG por 1~galactosidasas de K. fragilis y de E. cali.
Lactosa: T=40C; Caco~50 g/L; CE=<7 mg/L
ONPG: T=25C; CONFO o~50 g/L; CE=0,7 mg/L
244
10
100-
90 -
9
700)
E
60-
50-
40-
0
~
30-
~20i
10-
temj~=0
O
y
tempa=23 b <k
Iraguls)
pH
100-
800)
E
0)
<6)
60 -
tu
40 -
.<
ci
u K fragils 4000
u H
20
ee
o
0
100
200
300
400
500
t(min)
245
3.4.2.- Modelo
enzima de E. ccli.
246
Tabla 3.60.- Resumen de modelos cinticos para la reaccin de hidrlisis de lactosa con
[3-galactosidasas de K. fragilis y de E. ccli.
Fuente de
la enzima
Modelo
1=1fragilis
exp~l1,30l,55~
~~z9
7t441j
k, Q
1+ C~1>,
K1,
ex428,54+l223~.l
~~--_____
g4)
E. ccli
Kjgai
Cga<
KA! + cuj + ~
exp24>58
1396~9001623)
=cx~l37l
le,
p~,
7239180)
0,60
-)
48941840
KM
expyl 1,325,94
(
1007596
Kjg~ =exPyl>32 1,28
En la Tabla 3.60 se comparan los modelos cinticos seleccionados para las dos
enzimas en la reaccin de hidrlisis de lactosa.
inhibicin competitiva por galactosa, lo que est de acuerdo con el mecanismo ping-pong
que se presenta en las fl-galactosidasas, considerando que la enzima queda unida al
galactsido y que ste sale posteriormente al grupo aglicn, pudiendo competir con las
molculas de sustrato. Con la enzima de E. ccli se observa inhibicin por glucosa de tipo
ccli es mayor que en Lactozym, por lo que una disminucin de temperatura afecta ms a
la actividad de la primera enzima. La constante KM vara dc forma ms brusca con la
temperatura en Lactozym, por lo que la enzima pierde rpidamente afinidad por la lactosa
segn aumenta la temperatura. La constante K~ con Lactozym varia de la misma forma
que KM con la temperatura, lo cual es lgico, ya que la galactosa y la lactosa deberan
unirse de forma similar al centro activo, segn el mecanismo propuesto para la accin de
247
reaccin es muy parecido, inhibiendo a concentracones similares a las del sustrato con
las dos enzimas (Figuras 3.25 y 3.54).
algo diferente. En la de E. ccli, el ONP puede fijarrse fuera del centro activo y
248
Tabla 3.61.- Resumen de modelos cinticos para la reaccin de hidrlisis de ONPG con
13-galactosidasas de K. fragilis y de E. ccli.
Fuente de
la enzima
Kjtagilis
Modelo
<
*2
cxp(34,oo3,2oVl04~2j
s ~>
yA
A,<)
K i(>1~
y
K Al
Kgqj
1
2883
l7O4>~
ex16,296,14
y- )
(
80853982>1
~ = expt35,86+14 23+
7 E. ccli
A, ~ c C> c(0W,
1+
-~
+ (WNP<;
K1>,,,, K,0>. )
78781236
le2
K
A/
ex l820f-428-~-JAlcnffl
147614100
cx
12,80
lJyH-1~)U*
7
exp(9>786,043799l894j~j
(
1 l974580~
K/Q\... ~=exPy42~72l4~50
7
)
249
Lactozym, lo que indica una brusca disminucin de la inhibicin por ONP con el aumento
de la temperatura.
250