Usos biotecnolgicos

de la metagenmica

Conceptos y Tcnicas de Biotecnologa

2011

La era de las -micas

Maron et al. Microbial Ecology 53, 486-493 (2007)

Objetivos de estudios metagenmicos

(i) Identificar los diversos microorganismos que
habitan en un ambiente dado

(ii) Reconstruir los caminos metablicos, para

ayudar a predecir la funcin de
microorganismos no cultivados

(iii) Hallar nuevas enzimas y compuestos bioactivos

La era de las -micas

Simon & Daniel 2011 Appl. Environ. Microbiol 77, 1153-1161

Metagenmica: estructura y funcin de

comunidades microbianas

Metagenmica: estructura y funcin de

comunidades microbianas
Drenaje cido de minas: ambiente extremo de baja diversidad
pH ~ 0.5
Temp: 40C
exceso FeS2

La variacin dentro de cada especie

complica el ensamblado de los
fragmentos de DNA
Reconstruccin de genoma casi
completo de Leptospirillum grupo II y
Ferroplasma tipo II
Otros 3 genomas parciales

Metagenmica: estructura y funcin de

comunidades microbianas

+ Inmensa cantidad de informacin sobre el potencial

metablico de microorganismos no cultivados
- La capacidad de ensamblar los fragmentos de ADN disminuye
drsticamente con la complejidad del ambiente muestreado

Metagenmica: estructura y funcin de

comunidades microbianas

Para investigar la funcin de miembros menos abundantes

dela comunidad (biosfera rara) hace falta extender la
profundidad de la secuenciacin
La biosfera rara puede tener un papel significativo en
algunas funciones que no seran capturados con estas
estrategias

Crecimiento utilizando un aceptor de

electrones insoluble

Childers et al., 2002 Nature 416, 767-769

Expresin de flagelos y pili

Childers et al., 2002 Nature 416, 767-769

Quimiotaxis

buffer quimiotaxis

Fe(III) citrato

MnCl2

Mn(IV) xido

FeSO4

Fe(III) xido
Childers et al., 2002 Nature 416, 767-769

Lovley, Nature Microbiology Reviews 1, 35 (2003)

Metagenmica como respuesta a la

demanda de nuevos genes y sus productos
La diversidad natural es la fuente principal de molculas nuevas
La explicacin est en la vasta riqueza de suelos, ocanos y
otros nichos microbianos
La metagenmica es una tecnologa clave para acceder al
potencial presente en los genomas de los microorganismos
Permite la investigacin de los genes individuales, el anlisis de
operones completos codificantes para vas biosintticas o
degradativas

Metagenmica como respuesta a la

demanda de tecnologas ms limpias
1. Detergentes
2. Alimentos
3. Agricultura
4. Procesamiento textil
5. Industria del papel
6. Industria qumica

Qu genes, qu productos?

Screening metagenmico funcional de actividades

hidrolticas dominan actualmente la literatura

Ranking multiparamtrico del

biocatalizador

Lorenz & Eck 2005 Nature Rev Microbiol 3, 510-516

Seleccin del ambiente

Ambientes naturalmente enriquecidos en el blanco

(xilanasas en intestino de insectos
No garantiza alta frecuencia de deteccin

Ambientes extremos
Biocatalizadores estables en condiciones extremas

Ambientes altamente diversos (suelos)

Mayor diversidad y mayor flexibilidad

Libraries metagenmicas

Identificacin de genes de inetrs en

libraries metagenmicas
La probabilidad de identificar un cierto gen depende de:
1.El sistema vector-husped
2.Tamao del gen
3.La abundancia del gen en el metagenoma de origen
4.La eficiencia de expresin heterloga

Aislamiento de ADN
1. El DNA debe ser extrado de un amplio rango de
microorganismos para que sea representativo de la
comunidad original
2. Se requiere DNA de alto peso molecular
3. El DNA debe estar libre de sustancias contamnantesque
interfieren con el procesamiento (restriccin, ligacin)
Mtodos directos e indirectos
Pre-enriquecimiento

Clonado
La estrategia depende del objetivo
Genes individuales vs operones completos y clusters que
codifican para vas biosintticas o degradativas?
plsmidos (<15 kb)
csmidos o fsmidos (2540kb)
BAC (100200kb)

Screening

Screening

El screening funcional es
aplicable principalmente en
biotecnologa
El screening por secuencia es
ms utilizado para la
identificacin de genes y
elucidacin de su papel dentro
de comunidades microbianas
complejas

Libraries metagenmicas:
screening funcional
Necesidad de expresin en
un sistema heterlogo

Libraries metagenmicas:
screening funcional
La actividad enzimtica se ensaya
generalmente en agar
suplementado con sustratos
+ high throughput
- seales dbiles
Ejemplo: ensayo en medio
conteniendo trioleilglicerol y rodamina
La hidrlisis del sustrato causa
formacin de un halo naranja cuando
se expone a UV

Libraries metagenmicas:
screening funcional

Suenaga et al., 2007 Environmental Microbiology 9, 22892297

Libraries metagenmicas:
screening funcional
Una categora diferente de screening
funcional est basado en
complementacin heterloga de cepas
huspedes o mutantes que requieren el
gen blanco para crecer en condiciones
selectivas.
Ventajas: simple, rpida, no hay falsos
positivos, altamente selectiva.

Ejemplo: gen codificante para la DNA polimerasa por

complementacin de una mutante polA de E.coli.
Simon et al., 2009 Appl. Environ. Microbiol. 75, 29642968

Libraries metagenmicas:
expresin en E. coli
IND

TRANSC
DEP

Seales de expresin funcionales en E coli en 32 genomas

Gabor et al. 2004 Environ Microbiol 6: 879-886

Libraries metagenmicas:
expresin en E. coli

40% de las actividades enzimticas pueden ser recuperadas por

clonado E. coli.
Gabor et al. 2004 Environ Microbiol 6: 879-886

Cmo aumentar la diversidad biosinttica

de pequeas molculas
antibact en R
metallidurans

Desarrollo de vector con amplio

rango de husped:
Agrobacterium tumefaciens
Burkholderia graminis
Caulobacter vibrioides
Escherichia coli
Pseudomonas putida
Ralstonia metallidurans

antibact
en E. coli

antibact en R
metallidurans

Pigmento
en P putida

antibact
en E. coli

Pigmento en A
tumefaciens

Wrinkle en A
tumefaciens

Pigmento en R
metallidurans

Mnima superposicin de clones

Craig et al., 2010 Appl. Environ. Microbiol. 76, 1633-1641

Libraries metagenmicas:
expresin en E. coli

Craig et al. 2011 Curr. Op. Biotechnol, 22:465472

Screening de libraries
metagenmicas: SIGEX
Fusin de gfp sin promotor al
DNA metagenmico
Se basa en que los genes
catablicos estn en operones
cuya expresin en muchos casos
es controlada por elementos
regulatorios prximos a los genes
catablicos
Uchiyama et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:8893

Screening de libraries
metagenmicas: SIGEX
1.

Construccin de library
metagenmica

2.

Eliminacin de clones
conteniendo plsmidos
expresando gfp
constitutivamente

3.

Seleccin de clones expresando

gfp en presencia del inductor

4.

Aislamiento en agar de colonias

separadas

Uchiyama et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:8893

Screening de libraries
metagenmicas: SIGEX
El clon tiene que contener suficiente porcin del opern
para ser til en los subsiguientes estudios funcionales,
pero no debe tener la porcin terminal del opern que
lleve una seal de terminacin de la transcripcin
REDUNDANCIA EN LA LIBRARY
Requerimiento de la maquinaria regulatoria que reconoce
el promotor y el sustrato deben estar presentes y ser
funcionales en el husped
USO DE OTROS HUESPEDES
Hay genes que se activan por efectores que no son
sustratos
Uchiyama et al., 2005 Nat. Biotechnol. 23:8893

Screening de libraries
metagenmicas: METREX
Sistema que responde a diversas molculas y se
encuentra en organismos y ambientes diversos
Molculas que inducen quorum sensing
Proceso de comunicacin inter-celular mediado por pequeas
molcula que le permite a las bacterias sensar su propia
densidad celular
Regula muchas funciones ecolgicamente relevantes, tales
como luminescencia, virulencia y produccin de antibiticos

Screening de libraries
metagenmicas: METREX
El biosensor que detecta los clones activos est dentro de la
misma clula que el DNA metagenmico

Lynn et al. 2005 Appl. Environ. Microbiol 71, 6335-6344

El clon metagenmico BSS3 induce quorum

sensing en la cepa biosensor JB525

TLC
El plsmido BSS3 introducido en una cepa sin biosensor (A) induce la seal en
clulas cercanas (B,C y D)

1. El plsmido es responsable del fenotipo del clon original

2. El compuesto responsable de la induccin es difusible en agar
Guan et al. 2007 Appl. Environ. Microbiol. 73:36693676

Una monooxigenasa cataliza una va de oxidacin de

indol que lleva a la producccin de un compuesto que
induce QS

Guan et al. 2007 Appl. Environ. Microbiol. 73:36693676

Screening de libraries
metagenmicas: PIGEX

Uchiyama & Miyazaki 2010 Appl. Environ. Mirobiol. 76, 70297035

Produccin enzimtica de benzoato

medida como fluorescencia de GFP
Los clones positivos para
amidasa catalizan la
conversin de benzamida a
benzoato
El benzoato activa
el regulador
transcripcional
BenR, que activa el
promotor benA
se induce la expresin
del gen reportero

Uchiyama & Miyazaki 2010 Appl. Environ. Mirobiol. 76, 70297035

Screening de libraries
metagenmicas: PIGEX
1. Capacidad de distinguir entre sustrato y producto
2. Ausencia de inductores endgenos
3. Los productos generados por la amidasa deben ser
inertes in vivo para asegurar constante induccin del
sensor
96,000 clones
11 amidasas, 3 nuevas

Uchiyama & Miyazaki 2010 Appl. Environ. Mirobiol. 76, 70297035

Pocas enzimas descubiertas por metagenmica

son usadas en procesos biotecnolgicos
caracterizacin del potencial biotecnolgico de
las enzimas encontradas

Busqueda metagenmica de
enzimas lipolticas

Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645

Esterasas: rango de
sustratos

Biofilm en caera de
agua potable

suelo contaminado
+ pre-enriquecimiento

Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645

Esterasas: estabilidad al pH
y temperatura

Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645

Celulasa: estabilidad frente

a solventes
160

EstA3

140

% Actividad

120
100
80
60
40
20
0

ctrl

15% 30% 15% 30% 15% 30% 15% 30% 15% 30%
metanol
DMSO
DMF isopropanol acetonitrilo
Elend et al. 2006 Appl. Environ. Microbiol. 72, 3637-3645

Celulasa: estabilidad frente

a temperatura y pH

Voget et al. 2006 Characterization of a metagenome-derived halotolerant cellulase J. Biotechnol. 126, 26-36

Celulasa: estabilidad frente

a solventes

Voget et al. 2006 Characterization of a metagenome-derived halotolerant cellulase J. Biotechnol. 126, 26-36

Celulasa: halotolerancia y
termotolerancia
40C
3M NaCl
3M RbCl
50C

4M KCl
55C
60C

Voget et al. 2006 Characterization of a metagenome-derived halotolerant cellulase J. Biotechnol. 126, 26-36

Pocas enzimas descubiertas por metagenmica

son usadas en procesos biotecnolgicos
expresin de la protena pura en cantidades suficientes
a un costo razonable

bulk: barata y eficiente

Industria farmacutica: tiempo de llegada al mercado

Libraries metagenmicas:
screening por secuencia

Libraries metagenmicas:
screening por secuencia
La aplicacin de estrategias
basadas en secuencias implica el
diseo de sondas de DNA o
primers derivados de regiones
conservadas de genes ya
conocidos o familias de protenas
Un suelo supresivo contra
enfermedades causadas por
hongos patgenos como fuente
de quitinasas
Library metagenmica
Extraccin directa de suelo

Metagenmica sinttica

Uso en industria qumica, agroqumica, precursores de

sntesis de hidrocarburos

MHT
cloruro
cloruro de metilo

S-adenosil-L-metionina (SAM)
(SAM)
S-adenosil-L-metionina

S-adenosil-L-homocistena

Screening de MHT
en base de datos
Construccin de library metagenmica sinttica
Screening en E coli
Slo un gen anotado como HMT
Solo 55% anotados como MT
Batis maritima

89 genes homlogos a MHT

61 bacterias
14 plantas
13 hongos
1 arquea

Especificidad de sustrato

Produccin de MHT en
levaduras

Transferencia a S cerevisiae
direccionado a vacuola

Respuesta del husped a la

toxicidad del producto

Produccin de MHT en
levaduras
inhibicin

Crecimiento de
S cerevisiae
c/carboximetil
celulosa

Crecimiento de
A fermentans
en cocultivo

Produccin de MHT a
partir de biomasa vegetal
Co-cultivos inoculados a baja densidad, crecidos 36 h con el material
(20 g/L) como nica fuente de C. Se agreg ioduro de sodio y se midi
la produccin de CH3I por GC-MS

Libraries metagenmicas:
screening por secuencia

Pocas enzimas descubiertas por metagenmica

son usadas en procesos biotecnolgicos
baja frecuencia de clones que son positivos en las
bibliotecas metagenmica

SIP-Metagenmica
genes codificantes para la
glicerol deshidratasa
dependiente de coenzima B12
Frecuencia de deteccin:
2.1X - 3.8X mayor

Schwartz et al. 2005 World J Microbiol Biotechnol 22, 363-368

SIP-Metagenmica

Bsqueda de metano monooxigenasa:

2300 clones en BAC
Mapa gentico de ORFs identificados en el clon GSC357 (15.2 kb)

Dumont et al. 2006 Environmental Microbiology (2006) 8, 12401250

SIP-Metagenmica
Es una forma de caracterizar
miembros ecolgicamente
relevantes de una comunidad, y
sus funciones metablicas,
aunque no sean numricamente
dominantes

Bsqueda de metano monooxigenasa:

250,000 clones en fsmidos

Ricke et al. 2005 Appl. Environ Microbiol 71, 74727482

Bsqueda de bifenilo dioxigenasa:

1562 clones en csmidos
bphA: bifenilo dioxigenasa

Sul et al. 2009 Appl. Environ Microbiol 75, 55015506

DNA-SIP/metagenmica

Pocas enzimas descubiertas por metagenmica

son usadas en procesos biotecnolgicos
acceso a expertise en bioinformtica (manejo de
datos, ensamblado, etc)

Pocas enzimas descubiertas por metagenmica

son usadas en procesos biotecnolgicos

En bases de datos hay un enorme nmero de protenas no

caracterizadas, a las que se deben sumar genes an no
descubiertos, que estn presentes en ambientes naturales
La prediccin funcional basada en estructuras podr ser
un mecanismo para obtener nuevas enzimas

MetaGene: Noguchi et al. 2006 Nucleic Acids Research 34, 56235630

Bibliografa adicional

Metagenomics. Methods
and Protocols W.R. Streit
& R. Daniel, Eds
Humana Press, 2010