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TRABAJO PRCTICO 7
Trabajo Prctico de Laboratorio N 1
PRINCIPIOS DE COLORIMETRA
Toda medicin fotocolorimtrica consiste en la determinacin de la
concentracin de una sustancia por la cantidad de color que posee
naturalmente o que puede producir luego de una reaccin cromtica,
convenientemente elegida. Este procedimiento est basado en el hecho que
toda sustancia coloreada absorbe luz de una determinada longitud de onda ().
Cuando un tomo, ion o molcula absorbe un fotn, la energa agregada
produce una alteracin del estado, y se dice que las especies estn excitadas.
La excitacin puede involucrar alguno de los siguientes procesos:
1. transicin de un electrn a un nivel mayor de energa.
2. cambio en el modo de vibracin de las molculas con enlaces covalentes.
3. alteracin de su modo de rotacin alrededor de los enlaces covalentes.
La absorcin de la energa radiante por una solucin puede describirse por
medio de una grfica de absorbancia en funcin de la longitud de onda. Esta
grfica se denomina espectro de absorcin.
Por ejemplo, para el caso de la oxihemoglobina:
Espectroscopa de absorcin
Considrese un haz de energa radiante con una intensidad inicial, Io, que
incide
sobre una celda cuadrada y pasa a travs de ella (cuyos lados son
perpendiculares al haz). La celda contiene una solucin de un compuesto que
absorbe energa radiante de una cierta longitud de onda (). La intensidad de la
energa radiante transmitida, Is, ser menor que Io. Parte de la energa radiante
ser reflejada por la superficie de la celda o absorbida por la pared de la celda
o el solvente. Por lo tanto, estos factores deben ser eliminados si se desea
considerar slo la absorcin del compuesto de inters. Esto se hace usando un
blanco que contiene todo menos el compuesto a ser determinado.
La transmitancia de un compuesto en solucin se define como la proporcin
de luz incidente que es transmitida:
Transmitancia = T = Is /Io
Usualmente esta razn se describe como un porcentaje (%T).
El concepto de transmitancia es importante porque slo puede medirse la luz
transmitida.
Cuando la concentracin de un compuesto en solucin aumenta, ms luz es
absorbida por la solucin y menos es transmitida. El porcentaje de T vara
inversamente y logartmicamente con la concentracin.
Sin embargo, es ms conveniente usar la absorbancia, A, la cual es
directamente proporcional a la concentracin.
Por lo tanto:
A = log Is/Io = log T = log (1/T)
Grficamente, si se grafica A o %T en funcin de la concentracin de la
solucin con el compuesto que absorbe energa, se obtienen los siguientes
grficos:
Ley de Lambert-Beer
La ley de Lambert-Beer o comnmente conocida como ley de Beer, establecida
en 1852 por Beer, quien postul que la reduccin de la energa radiante de un
haz de radiacin monocromtica es proporcional a la intensidad del haz y a la
cantidad de sustancia absorbente situada en su trayectoria. O sea que
establece que la concentracin de una sustancia es directamente proporcional
a la cantidad de energa radiante absorbida o inversamente proporcional al
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A = a.b.c
donde A es la absorbancia o densidad ptica; a, absortividad; b, paso de luz de
la solucin en centmetros; y c, concentracin de la sustancia de inters.
Esta ecuacin forma las bases del anlisis cuantitativo por fotometra de
absorcin o espectroscopa de absorcin. Los valores de absorbancia no tienen
unidades.
La absortividad es una constante de proporcionalidad relacionada con la
naturaleza qumica del soluto y tiene unidades que son recprocas con las de b
y c.
Cuando c se expresa en moles por litro y b en centmetros, el smbolo e,
llamado absortividad molar (o coeficiente de extincin molar), se usa en lugar
de a y es una constante para un compuesto dado a una determinada longitud
de onda, bajo condiciones especficas de solvente, pH, temperatura, etc. Tiene
unidades de L/mol.cm (o sea: M-1.cm-1). Mientras mayor es la absortividad
molar, mayor es la absorbancia para la misma concentracin en trminos de
masa de dos compuestos.
Una vez probado que la sustancia sigue la ley de Beer a una longitud de onda
especfica (es decir, una grfica lineal de A contra c conteniendo el punto 0;0),
la concentracin de una solucin desconocida puede ser determinada midiendo
su absorbancia e interpolando su concentracin en la grfica de calibracin.
Por el contrario, cuando el %T se grafica frente a la concentracin (en un papel
milimetrado), se obtiene una relacin curva (similares a las mostradas
previamente).
La ley de Beer es una relacin matemtica ideal que contiene varias
limitaciones.
Por lo tanto, existen desviaciones de la ley de Beer, que implican variaciones
en la linealidad de la absorbancia contra la concentracin, y una de estas
causas es cuando se miden concentraciones muy elevadas de una sustancia.
Entonces la ley de Beer es aplicable slo a soluciones diluidas.
Tambin es sabido que, si dos o ms compuestos absorben a la longitud de
onda de la energa radiante incidente, cada uno con diferente absortividad, no
se cumplir la ley de Beer.
Los instrumentos que miden la absorbancia de soluciones contienen siete
componentes bsicos:
(1) una fuente estable de energa radiante;
(2) una hendidura de entrada para el enfoque de la luz;
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INTRODUCCIN
En el trabajo prctico se determinarn los parmetros cinticos de la enzima
ureasa. Esta enzima interviene en el metabolismo de la urea en
microorganismos, invertebrados y plantas. NO se encuentra en ninguna clula
humana.
La ureasa se utiliza en los laboratorios de anlisis clnicos como herramienta
para determinar la concentracin de urea en muestras de sangre (uremia) y
orina.
La concentracin de urea circulante est determinada por la produccin de
urea a nivel heptico y por la eliminacin de este metabolito a nivel renal. Si la
funcin heptica no est alterada, la uremia es uno de los parmetros utilizados
para evaluar la funcin renal, entre otros - creatininemia, clearance de
creatinina, etc.
PROCEDIMIENTOS
Todos los equipos trabajarn para analizar Productovs. Tiempo.
Cada lado de mesada trabajar con una Sustratoy calcular una velocidad
inicial (Vo) que informar al resto de la comisin.
Todos los alumnos harn el grfico de Vo vs. Sustratoy 1/Vo vs. 1/
Sustratocon los datos de toda la comisin para finalmente informar los
parmetros cinticos Vm y Km de una enzima.
ureasa
UREA + H2O
CO2 + 2 NH3
UREA
(ml)
5
4
3
2
1
0,5
0,5
0,5
0,5
0,5
REACTIVO
1
(ml)
1
1
1
1
1
Tiempo
Incubacin
(Min)
30
20
10
5
0
REACTIVO Desarrollo
2
de color
(ml)
(Min)
1
10
1
10
1
10
1
10
1
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INFORME
GRUPO DE TRABAJO (ANOTE N DE GRUPO Y LOS APELLIDOS Y
NOMBRES DE LOSPARTICIPANTES DEL ENSAYO)
RESULTADOS PROPIOS: GRFICO producto= f (t)
CONCENTRACIN
(COMPLETAR)
TUBO N
1
2
3
4
5
DE
SUSTRATO
UTILIZADO
Tiempo de Incubacin
(Min)
0
5
10
20
30
SUSTRATO=
Absorbancia
530 nm
Eje Y
(NH3)
(mM)
Eje X
Tiempo de Incubacin
(minutos)
0
5
10
20
30
RESULTADOS DE LA COMISIN:
GRFICOS Vo en funcin de (sustrato)
1 / Vo en funcin de
(1/ sustrato)
Completar la siguiente tabla (indicar las unidades).
Eje Y
Vo
Eje X
UREA
Eje Y
1/Vo
Eje X
UREA
Km =
Vmx =
ELECTROFORESIS
Se dispondrn de geles de poliacrilamida-SDS 10% ya preparados para realizar una
corrida electrofortica en condiciones desnaturalizantes.
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