CAPTULO 2.3.2.

CAMPILOBACTERIOSIS GENITAL BOVINA

RESUMEN
La campilobacteriosis genital bovina es una enfermedad venrea caracterizada por infertilidad,
mortalidad embrionaria temprana y aborto. El agente causal de esta enfermedad de transmisin
sexual es Campylobacter fetus subespecie venerealis. El reservorio natural de esta bacteria es el
prepucio de toros sanos portadores. Campylobacter fetus se divide en dos subespecies: C. fetus
subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus.
La campilobacteriosis genital bovina est causada por C. fetus subes. venerealis, que es una
bacteria con un tropismo pronunciado para el sistema genital del ganado bovino. La transmisin
del agente causal se produce normalmente durante el apareamiento natural, pero la presencia de
C. fetus subes. venerealis en el semen de toros portadores crnicos origina el riesgo de extender
la enfermedad por inseminacin artificial. Campylobacter fetus subesp. fetus se puede encontrar
en el tracto intestinal del ganado bovino y de otras especies animales. Su papel patgeno es
comparativamente menor que el de C. fetus subes. venerealis, aunque se asla con frecuencia de
fetos bovinos abortados, lo que demuestra que esta subespecie tiene importancia clnica en el
ganado. Campylobacter fetus subes. fetus persiste en novillas vrgenes despus de la infeccin
experimental durante al menos varias semanas y hasta 10 o ms meses.
La campilobacteriosis genital bovina se diagnostica a partir de muestras obtenidas de toros, vacas
o fetos abortados. El diagnstico se lleva a cabo por demostracin del microorganismo causante, o
de una respuesta inmune especfica contra l. En el caso de los toros, se pueden recoger
muestras de semen o de secreciones del esmegma prepucial. En las vacas, las muestras de
mucus se obtienen por succin, lavado vaginal o mediante el uso de tampones. Se pueden
examinar los rganos internos de los fetos abortados para investigar la presencia de la bacteria
mediante cultivo, y analizar preparaciones en fresco del contenido estomacal para observar al
microorganismo por microscopa de campo oscuro y de contraste de fases.
Identificacin del agente: El microorganismo es un bacilo Gram-negativo curvado en forma de
espirilo, de aproximadamente 1,5 m de largo por 0,5 m de ancho. Se puede cultivar por
incubacin microerfila a 37C por un mnimo de 3 das. La confirmacin del aislamiento y la
diferenciacin entre las subespecies de C. fetus se puede llevar a cabo por mtodos bioqumicos o
moleculares.
Tambin se puede utilizar inmunofluorescencia para identificar al microorganismo, pero esta
prueba no diferencia entre subespecies.
Se han descrito en la literatura pruebas especficas para C. fetus y para cada una de las dos
subespecies basadas en la reaccin en cadena de la polimerasa.
Pruebas serolgicas: La aglutinacin con mucus vaginal constituyen una prueba til para
poblaciones, aunque no son adecuadas para identificar animales individuales infectados. Los
animales deben ser seleccionados cuidadosamente para las pruebas, pues en manadas infectadas
se ven algunos animales libres de la infeccin. Despus de la infeccin, existe una fase adaptativa
antes de que se desarrollen los anticuerpos. Adems, las aglutininas tienden a desaparecer con el
estro.
El enzimoinmunoensayo es una prueba ms sensible, pero debe utilizarse como prueba
poblacional ms bien que para probar individuos.

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Captulo 2.3.2. Campilobacterioriosis genital bovina

Requisitos para las vacunas y los materiales de diagnstico: Una vacuna puede prepararse
con C. fetus subesp. venerealis o con C. fetus subesp. fetus, que comparte antgenos con C. fetus
subesp. venerealis. Esta vacuna se inactiva con formalina y se puede administrar con una
emulsin de aceite como adyuvante.

A. INTRODUCCIN
El gnero Campylobacter (antes incluido en el gnero Vibrio) (38) comprende muchas especies, de las que C.
fetus, C. sputorum, C. jejuni y C. coli pueden aislarse del ganado bovino. Existen dos subespecies de C. fetus: C.
fetus subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus. La que causa la campilobacteriosis genital bovina es C. fetus
subesp. venerealis (14, 42). Se han descrito y designado como C. fetus subesp. venerealis biotipo intermedius,
algunas variantes de C. fetus subesp. venerealis que toleran la glicina (34).
Utilizando los modelos de bandas de las protenas de clulas enteras, que aparecen mediante electroforesis en
gel de poliacrilamida (PAGE), no pueden distinguirse las dos subespecies de C. fetus (39). Mediante diferencias
antignicas, se han descrito varios serotipos de C. fetus (3, 32).
Los estudios de homologa de ADN no han podido revelar diferencias importantes entre las subespecies
venerealis y fetus (18). Sin embargo, mediante anlisis numrico de los modelos electroforticos en gel de
campo pulsante (PFGE) ha sido posible la separacin de C. fetus en dos subespecies (28). Existe un acuerdo
considerable entre los resultados de la PFGE y la identificacin basada en mtodos fenotpicos o en la reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR). El anlisis del polimorfismo de los fragmentos de restriccin amplificados
(AFLP), recientemente desarrollado, tambin diferencia entre ambas subespecies (43), como lo hace un ensayo
de PCR de reciente aparicin (21). No obstante, segn se describe en el trabajo original, por este mtodo de
PCR no se clasifican correctamente en subespecies hasta un 10% de las cepas (21), y esta observacin se ha
confirmado en un estudio posterior (43). La diferenciacin taxonmica de C. fetus en dos subespecies est
justificada debido a las diferencias clnicas y epidemiolgicas entre ellas. Epidemiolgicamente, C. fetus subesp.
venerealis es la ms importante de las dos debido a su tropismo genital. Campylobacter fetus subesp. fetus se
puede recoger del tracto intestinal del ganado bovino y de otros animales. Su papel patognico es menor
comparado con el de C. fetus subesp. venerealis, aunque C. fetus subesp. fetus se asla con frecuencia de fetos
bovinos abortados indicando que esta subespecie tiene relevancia clnica en el ganado. Campylobacter fetus
subesp. fetus persiste en novillas vrgenes despus de infeccin experimental durante al menos varias
semanas y hasta 10 meses o ms (25, 29, 35).

B. TCNICAS DE DIAGNSTICO
1.

Aislamiento e identificacin del agente (prueba prescrita para el comercio internacional)

La campilobacteriosis genital bovina se diagnostica bacteriolgicamente mediante el aislamiento de C. fetus en

cultivo o por inmunofluorescencia. El cultivo bacteriolgico puede llevarse a cabo directamente a partir de las
muestras, o despus del transporte y/o enriquecimiento de las muestras. La utilizacin de un medio de transporte
es esencial si las muestras no se procesan en el laboratorio en las 6 horas siguientes a la recogida. Para envos
al laboratorio, si las muestras no estn en medio de transporte, deben colocarse en un recipiente con aislamiento
(dentro de un margen de temperatura de 4-18C) y protegidas de la luz.

a)

Toma de muestras
i)

En el macho: mucus prepucial o secrecciones, y semen

En los toros, el esmegma o mucus prepucial puede obtenerse por raspado (36), por succin (con una
pipeta de Bartlett) (2), o por lavados prepuciales (10). Tambin puede tomarse de una vagina artificial
despus de recoger el semen, lavando la vagina artificial con 20-30 ml de solucin salina tamponada
con fosfato (PBS).
Para lavados prepuciales, se introducen en el saco prepucial 20-30 ml de PBS estril de
pH 7,2. Despus de un masaje vigoroso de 15-20 segundos, el lquido se recoge en un recipiente
estril, que se cierra inmediatamente y se enva al laboratorio.
El semen se recoge en condiciones tan aspticas como sea posible. Se transfiere a un tubo que se
cierra inmediatamente. Las muestras de esmegma, obtenidas por raspado o succin, y las de semen,
pueden diluirse con PBS o inocularse directamente en medio de cultivo, de transporte o de
enriquecimiento. Las muestras en medio de transporte se cierran y se envan al laboratorio en un
recipiente con aislamiento (dentro de un margen de temperatura de 4-18C) y protegidas de la luz
(13).

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ii)

En la hembra: mucus vaginal y crvicovaginal

Las muestras pueden obtenerse por frotis, succin (con pipeta de Bartlett) o por lavados de la cavidad
vaginal. El uso de un espculo estril, preferiblemente desechable, es importante para la obtencin de
muestras de buena calidad (37).
Despus de lavar la regin vulvar, la cavidad vaginal se lava con 20-30 ml de PBS estril mediante
una jeringa unida a un catter estril. El lquido se aspira y se reintroduce cuatro o cinco veces antes
de recogerlo en un recipiente estril, que se cierra inmediatamente y se enva al laboratorio. Tambin
se puede recoger lquido de lavado de la cavidad vaginal con un tampn de gasa estril mantenido en
la vagina durante 5-10 minutos despus de introducir PBS. Las muestras de mucus vaginal obtenidas
por succin pueden diluirse con PBS, o sembrarse directamente en medio de cultivo, de transporte o
de enriquecimiento.

iii)

Fetos abortados, placentas

Cuando se produce un aborto, las mejores muestras son la placenta, el contenido estomacal, los
pulmones y el hgado del feto. Se extraen bajo condiciones lo ms aspticas posibles y se envan al
laboratorio en un contenedor fro y aislado (a 4-8C).

b)

Transporte de muestras
i)

Medios de transporte y de enriquecimiento

Se dispone de varios medios de transporte y de enriquecimiento, como el de Clark (Australia), Lander
(Inglaterra), medio SBL (Francia) o medios de Foley y de Clark (utilizados en EE.UU.) (16, 20, 24).
Recientemente se ha publicado una comparacin de otros medios de transporte y de cultivo (26).
Algunos de los medios de transporte y enriquecimiento mencionados arriba contienen cicloheximida.
Debido a su toxicidad potencial, este agente antifngico no estar disponible pronto. El aislamiento de
C. fetus subesp. fetus es posible en medios con anfotericina B (1).

Medio de Clark
El medio de Clark es un medio excelente, pero su preparacin es larga y difcil, lo que limita su uso
rutinario cuando hay que procesar muchas muestras. Contiene suero bovino estril ms 5-fluorouracilo
(300 g/ml), sulfato de polimixina B (100 UI/ml), verde brillante (50g/ml), cido nalidxico (3 g/ml) y
cicloheximida (100 g/ml). La mezcla se distribuye en botellas de 10 ml con tapn de goma y una
tapadera metlica con un hueco central a travs del cual se puede insertar una aguja en el tapn. Las
botellas llenas se colocan en un bao de agua a 100C. Cuando el medio se solidifica se atraviesa el
tapn de goma con una aguja hipodrmica y se reemplaza el aire interior por una mezcla de 5% de
oxgeno, 5% de dixido de carbono y 90% de nitrgeno. Este paso se realiza dentro de una jarra para
anaerobios. El medio preparado debe mantenerse durante 1 semana en un refrigerador antes de
usarlo. Su duracin es de 3 meses a 4C.
Se inyecta aproximadamente 1 ml de la muestra problema en el medio empleando una jeringa, con la
aguja atravesando el tapn de goma. La botella se mantiene aproximadamente a 18C y se enva al
laboratorio. El tiempo de transporte al laboratorio no debe superar las 48 horas.
Cuando la botella llega al laboratorio, se incuba 4 das a 37C y despus se introducen 3 ml de
solucin salina normal. Despus de agitar vigorosamente el medio se extrae 1 ml de lquido para
pruebas posteriores de aislamiento de Campylobacter en cultivo o por inmunofluoresecencia.

Medio de Lander
Se trata de caldo de Mueller-Hinton con 5 g de carbn vegetal bacteriolgico/litro, aadido antes de la
esterilizacin. Cuando se emplea, se aade a cada litro lo siguiente en condiciones estriles: dos
botellas de "suplemento para crecimiento de Campylobacter" (Oxoid), sangre hemolizada de caballo
(70 ml), vancomicina (40 mg), sulfato de polimixina B (10.00 UI), cicloheximida (100 mg), trimetoprim
(20 mg) y 5-fluorouracilo (500 mg). El medio se distribuye en volmenes de 10 ml en recipientes de
28 ml. Pueden mantenerse por lo menos durante 2 semanas a 4C.
Este medio se inocula con muestras problema despus de pasar stas por filtros de 0,65 m de
tamao de poro. Despus de incubar a 37C durante 3 das el medio se distribuye en medios de
cultivo y de aislamiento.

Medio SBL modificado

El medio SBL, modificado por Clark (9), contiene por cada litro: agar (8 g), tioglicolato sdico (0,5 g),
glicerofosfato sdico (10 g), 1% de cloruro clcico acuoso (10 ml), hidrocloridrato de cistena (250 mg)
y solucin acuosa de azul de metileno al 0,1% (2 ml). Despus de esterilizar en autoclave, el medio se
convierte en selectivo por adicin, por cada ml, de polimixina (1 UI), novobiocina (5 g), bacitracina
(15 unidades), y cicloheximida (20 g). El medio se distribuye a continuacin en condiciones estriles
en tubos anaerbicos completamente llenos.

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Captulo 2.3.2. Campilobacterioriosis genital bovina

Los frotis de varias muestras se colocan en este medio de transporte y se envan en un recipiente con
aislamiento (a 18-30C) para que lleguen al laboratorio en 24-48 horas.

c)

Tratamiento de muestras
Cuando llegan al laboratorio, las muestras deben inocularse directamente en medio de cultivo o procesarse
si se requiere (por ejemplo, mediante filtracin por membrana para reducir la contaminacin).
i)

Muestras del tracto genital

Como el mucus vaginal puede ser muy viscoso, puede ser necesario licuarlo aadiendo un volumen
igual de solucin de cistena (solucin acuosa de hidrocloruro de cistena a 0,25 g/100 ml, pH 7,2,
esterilizada por filtracin). A los 15-20 minutos, el mucus diluido y licuado puede inocularse en el
medio de aislamiento. Si el mucus no es muy viscoso, se puede inocular directamente o diluir con el
mismo volumen de PBS, pH 7,2.
Los lavados prepuciales pueden centrifugarse a 3.500 g para concentrar la muestra. La muestra final
(reducida a 250 l) puede inocularse en el medio de cultivo (directamente o utilizando el mtodo de
filtracin).

ii)

Fetos abortados, placentas

El contenido del estmago de fetos se inocula directamente en un medio de cultivo adecuado. Los
rganos internos, o trozos de rganos, se flamean para esterilizar la superficie, y luego se
homogenizan. El homogenado se inocula en medio de cultivo.
Despus de lavar las membranas placentarias con solucin salina estril o con PBS estril para
eliminar la mayora de la contaminacin superficial, se raspan las vellosidades corinicas y el raspado
se transfiere a los medios de cultivo.

d)

Aislamiento de Campylobacter fetus

i)

Medio de cultivo para aislamiento

Actualmente hay muchos medios en uso para el diagnstico bacteriolgico de la campilobacteriosis
genital bovina (7). La mayor parte de ellos contienen cicloheximida. Debido a su toxicidad potencial,
este agente antifngico no estar disponible pronto. El aislamiento de C. fetus es posible en medios
con anfotericina B (1).
Los siguientes son ejemplos de medios:

Medio Skirrow con cicloheximida

Este medio contiene como agentes selectivos: sulfato de polimixina B (2,5 UI/ml), trimetoprim (5 g
/ml), vancomicina (10 g/ml), y cicloheximida (50 g/ml). Contiene 5-7% de un lisado de sangre
desfibrinada de caballo. Sin embargo, la adicin de sangre desfibrinada de oveja al 5-7% da buenos
resultados.

Medio selectivo de Clark

Contiene peptona (10 g), cloruro sdico (5 g), extracto de carne (5 g), agar (15 g) y agua destilada
(1000 ml). Disolver los ingredientes en agua, excepto el agar, con agitacin si es necesaria. Ajustar el
pH a 7,4-7,6, despus aadir el agar y calentar a ebullicin. Esterilizar en autoclave (121C durante
15 minutos). Enfriar a 55C y aadir 10% de sangre estril desfibrinada de origen ovino o bovino, y
despus bacitracina (15 UI/ml), sulfato de polimixina B (1 UI/ml), novobiocina (sal sdica) (5 g/ml) y
cicloheximida (10 g/ml).

Medios no selectivos
Se puede utilizar cualquier medio basado en sangre (agar Columbia, agar sangre base No. 2) como
medio no selectivo suplementado con sangre de oveja o de caballo.

ii)

Inoculacin de los medios e incubacin

Cada muestra se inocula directamente en un medio selectivo o, despus de pasar por un filtro de
tamao de poro de 0,65, en un medio selectivo y/o en un medio base. El material se extiende con un
asa de siembra para facilitar el aislamiento de colonias individualizadas.
Las placas se incuban a 37C + 1C. Para el crecimiento ptimo, se requieren atmsferas
microaerbicas con 5-10% de oxgeno y 5-10% de dixido de carbono (y preferiblemente 5-9% de
hidrgeno). Las condiciones microaerbicas de crecimiento se pueden producir por diversos mtodos.
En algunos laboratorios se utiliza la evacuacin repetida de los gases de la jarra de incubacin y su
sustitucin por gases envasados. Los equipos generadores de gases estn comercializados. Los
incubadores de atmsfera variable son ms adecuados si se trata de gran nmero de cultivos.
Las condiciones de cultivo e incubacin se controlan sistemticamente utilizando cepas control de
C. fetus subesp. fetus y C. fetus subesp. venerealis. Tales controles deben incluirse en cada serie de

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aislamiento. No es necesario incluir ms de un control por da a menos que se utilicen diferentes lotes
de medio, en cuyo caso debe probarse cada lote.
iii)

Lectura de los resultados

Normalmente las colonias de C. fetus aparecen despus de 2-5 das en los medios recomendados.
El crecimiento puede ser lento, particularmente en presencia de otras bacterias contaminantes en las
muestras. Para evitar que el crecimiento de los contaminantes se superponga a colonias especficas,
se recomienda examinar diariamente el medio y subcultivar las colonias que se sospechan que
corresponden a C. fetus. Despus de 3-5 das de incubacin, las colonias miden 1-3 mm de dimetro.
Son ligeramente grisceas-rojizas, redondas, convexas, lisas y brillantes, con un borde regular. Los
cultivos deben incubarse como mnimo 6 das.

e)

f)

Confirmacin del microorganismo

i)

Morfologa microscpica: Campylobacter fetus es mvil, aunque esta propiedad puede desaparecer
despus de subcultivos. A menudo Campylobacter fetus presenta la forma de un bacilo curvado
fino, de 0,3-0,4 m de ancho y 0,5-8,0 m de largo. En estado vivo se pueden observar
simultneamente formas cortas (en forma de coma), medias (en forma de S) y largas (helicoidales con
varias espirales). Las bacterias siempre se presentan aisladas. Los cultivos viejos pueden contener
formas cocoides.

ii)

Pruebas bioqumicas: Campylobacter fetus es oxidasa y catalasa positivo.

iii)

Campylobacter fetus no crece en condiciones aerbicas.

Identificacin de Campylobacter a nivel de especie

Estas pruebas (ver Cuadro 1) deben hacerse con cultivos puros. Idealmente deben realizarse utilizando una
suspensin estandarizada, con una turbidez que no sea superior a la No. 1 de McFarland, o equivalente.
Cuadro 1. Caracteres diferenciales del gnero Campylobacter

Oxidasa

Catalasa

H2S(a)

25C

42C

Glicina 1%

NaCl
3.5%

Cefaloiina

cido
nalidxi-co

C. fetus subesp.
venerealis

V(b)

C. fetus subesp. fetus

V(b)

C. jejuni

C. sputorum biotipo
sputorum

C. sputorum biotipo
faecalis

C. sputorum biotipo
paraureolyticus

(a) = En medio de triple azcar-hierro; (b) = Aunque C. fetus no pertenece a las especies termfilas de
Campylobacter, se ha descrito el crecimiento de esta especie a 42C (12, 41);
(+) = reaccin o crecimiento positivo; () = reaccin negativa o ausencia de crecimiento de la cepa en medio apropiado en
condiciones especificadas; V = resultados variables; S = sensible; R = resistente.

i)

Prueba de crecimiento en presencia de glicina

La prueba se hace sobre cada cepa que parezca ser C. fetus (cepas sospechosas) preparando una
suspensin en tampn a pH 7,2. sta se inocula en un medio con glicina (15 ml de medio con sangre
+ exactamente 1,65 ml de una solucin acuosa de glicina al 10%), y en medio base con sangre. La
incubacin se realiza bajo las condiciones atmosfricas especificadas. En paralelo se prueban dos
cepas control (de las subespecies venerealis y fetus). Como todas las cepas son "fastidiosas",
pequeos cambios en el medio pueden ser importantes y la falta de crecimiento en glicina debe
considerarse como una prueba preliminar de que se trata de C. fetus subes. venerealis. La
reproducibilidad de la prueba es baja y se han descrito cepas intermedias (34).

ii)

Prueba de crecimiento en presencia de cloruro sdico

Se inocula una suspensin en tampn pH 7,2 de la cepa sospechosa a un medio con sangre que
contenga 3,5% de NaCl (15 ml de medio con sangre + 2,04 ml de una solucin de cloruro sdico 5 M),

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y a un medio base con sangre. La incubacin se realiza bajo las condiciones atmosfricas
especificadas. En paralelo se prueban dos cepas control.
iii)

Prueba de produccin de sulfhdrico

La prueba de sulfhdrico (H2S) se hace en medio slido de triple azcar-hierro (medio TSI) que
contiene peptona (20 g/litro), extracto de carne (2,5 g/litro), extracto de levadura (3 g/litro), cloruro
sdico (5 g/litro), citrato frrico (0,5 g/litro), tiosulfato sdico (Na2S2O3) (0,5 g/litro), lactosa (10 g/litro),
sacarosa (10 g/litro), glucosa (1 g/litro), rojo fenol (0,0024 g/litro), agar (11 g/litro) y agua destilada
(hasta 1.000 ml). Este medio se esteriliza en el autoclave a 115C durante 15 minutos despus de
distribuir en tubos. Se puede preparar segn se necesita o bien se prepara y se mantiene guardado en
condiciones normales de almacenamiento durante aproximadamente 3 semanas.
Antes de uso, licuar el medio en un bao de agua hirviendo e inclinar los tubos para obtener una
pendiente con una profundidad de 3 cm. Este medio puede guardarse bajo condiciones normales
durante 8-10 das antes de uso.

iv)

Prueba de sensibilidad a cefalotina y a cido nalidxico

La sensibilidad a cefalotina (CN) y cido nalidxico (NA) se prueba por la tcnica del disco (31). Se
preparan en el laboratorio discos conteniendo cada uno CN (30 g) o NA (30 g) empapando discos
de papel de filtro en soluciones de CN (3 mg/ml) y NA (3 mg/ml). Los discos se secan y se guardan
hasta uso.
Para la prueba, se suspenden cultivos de 72 horas de las cepas problema en PBS pH 7,2, a una
concentracin de 109 bacterias/ml. Porciones de 100 l de esta suspensin se colocan como una capa
uniforme sobre el medio base de sangre. Las placas de cultivo se secan antes de depositar el cultivo
sobre la superficie. A continuacin, se colocan encima los discos de sensibilidad, los cultivos se
incuban a 37C en atmsfera apropiada y se examinan despus de 48 y 96 horas. Una zona de
inhibicin alrededor de un disco de al menos 3 mm indica que la cepa problema es sensible a ese
antibitico. Todas las cepas de C. fetus subesp. fetus y la mayora de las de C. fetus subesp.
venerealis son resistentes a NA (27). Todas las cepas de C. fetus son sensibles a CN (27).

g)

Inmunofluorescencia
Esta prueba puede aplicarse para identificar el microorganismo por la tcnica directa o para confirmar la
identificacin de una cepa aislada. No diferencia entre diferentes especies (30).
i)

Preparacin de sueros inmunes

Se crecen cepas de Campylobacter, preferiblemente cepas estndar de colecciones de cultivo
reconocidas (C. fetus subesp. venerealis o C. fetus subesp. fetus), durante 3 das a 37C, por
separado, en medio de agar sangre y en condiciones microaerbicas. Los microorganismos se
recogen en PBS pH 7,2, y se lavan dos veces por centrifugacin. Se inoculan intramuscularmente
conejos de 3 meses con 2 ml de una suspensin de 1011 microorganismos/ml de una subespecie de
C. fetus en PBS y adyuvante incompleto de Freund. El inculo se administra en cuatro sitios, con 0,5
ml en cada sitio. Los animales se sangran antes de la inoculacin y despus a intervalos semanales.
Cuando los ttulos del suero son elevados por pruebas de inmunofluorescencia o de aglutinacin, se
inyectan intravenosamente 0,1-1,0 ml con 1010 microorganismos viables/ml. Los conejos se sangran 7
das despus y se juntan los sueros heterlogos. En un estudio reciente, se ha descrito un conjugado
preparado de IgY de pollo como alternativa a los anticuerpos de conejo (8). Se han descrito
anticuerpos monoclonales que pueden utilizarse para la deteccin inmunodiagnstica de C. fetus (6).

ii)

Preparacin de conjugados
La fraccin de IgG se separa por precipitacin con sulfato sdico. El suero se ajusta a pH 8,0 con PBS
0,1 M y se aaden 18 g de sulfato sdico anhidro por cada 100 ml. El precipitado se recoge por
centrifugacin y se redisuelve en agua destilada a su volumen original. Se re-precipita aadiendo 12 g
de sulfato sdico/100 ml. Se recoge el precipitado, se disuelve en agua destilada a la mitad de su
volumen, y se dializa frente a PBS, pH 7,2, a 4C hasta que est libre de sulfato. Se determina el
contenido en protena y se ajusta la concentracin con PBS a 1,0-1,5 g de protena por 100 ml (por
ejemplo, seroalbmina bovina). Esta solucin se ajusta a pH 9,0 con carbonato sdico 1M. Se aade
el ismero 1 de isotiocianato de fluorescena (FITC) en un volumen mnimo de carbonato sdico 0,1 M
a una concentracin final de 15 mg FITC/1,0 g de protena. Esto se agita durante 18 horas a 4C. La
mezcla se ajusta a pH 7,0 con cido clorhdrico 0,1 M y se dializa frente a PBS a 4C con frecuentes
cambios. Los restos de FITC libre se eliminan por filtracin en gel de Sephadex G25, y el producto
final se guarda a -20C o a temperatura inferior en pequeas alcuotas.

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La dilucin de trabajo del conjugado se determina probando varias diluciones en PBS con frotis de un
cultivo de C. fetus, y seleccionando el doble de la concentracin ms baja que produce fluorescencia
brillante con estos microorganismos de ensayo. Por microscopa de alta resolucin, los
microorganismos fluorescentes tienen una morfologa tpica y frecuentemente se concentran en los
bordes del frotis.
iii)

Prueba de inmunofluorescencia
Las muestras se fijan a portaobjetos de vidrio, se tien con el antisuero conjugado con FITC, y se
examinan para presencia de microorganismos fluorescentes. La tincin se realiza en una cmara
hmeda a 37C durante 30 minutos. Los portaobjetos se lavan luego hasta eliminacin del conjugado
libre, se someten a dos lavados con PBS (10 minutos cada lavado), y se montan con glicerol
tamponado (80% [v/v] de glicerol: 20% de tampn fosfato 0,1 M, pH 8,0).
Los cubreobjetos se sellan para evitar el secado y los portaobjetos se examinan en un microscopio de
luz ultravioleta.

h)

Identificacin molecular de Campylobacter fetus

Se han descrito en la literatura mtodos basados en PCR para la identificacin especfica de C. fetus (21) y
de cada una de las subespecies (21, 44).

2.

Pruebas serolgicas de deteccin de anticuerpos

Las pruebas para anticuerpos incluyen la prueba de aglutinacin del mucus vaginal y el enzimoinmunoensayo
(ELISA).

a)

Prueba de aglutinacin del mucus vaginal

Esta prueba es til en manadas, pero no para identificar animales individuales infectados por C. fetus. Solo
se identifica alrededor del 50% de los animales infectados. La prueba se realiza mejor con mucus vaginal
tomado 37-70 das despus de la infeccin, pero la presencia de anticuerpos puede retrasarse hasta 3-4
meses. Algunas vacas permanecen positivas durante varios aos mientras que otras se vuelven negativas
en 2 meses. Aproximadamente el 50% de las vacas positivas son negativas a los 6 meses (15).
Las muestras tomadas por lavados vaginales se consideran diluidas 1/5 con el lavado salino. Cuando las
muestras se obtienen con tampones, el mucus vaginal se extrae con 7 ml de solucin salina fisiolgica y
se deja durante la noche a 4C. Se presiona el tampn para obtener el lquido y se utiliza como lquido
problema en la prueba de aglutinacin del mucus vaginal.
En la prueba de aglutinacin del mucus vaginal, el antgeno es un cultivo de 48 horas de C. fetus subes.
venerealis en agar con 7% de sangre fresca (de menos de 2 semanas) de oveja, que contenga
preferentemente 0,1% de cicloheximida. Este cultivo se sub-cultiva en 20-30 placas con agar sangre, o bien
se pipetea una suspensin de la bacteria en PBS estril en frascos Roux con agar sangre y se extiende
sobre la superficie del medio por agitacin suave. Los cultivos se incuban en microaerobiosis durante 2-3
das a 37C con 85% de nitrgeno, 10% de dixido de carbono y 5% de oxgeno. Las clulas se recogen y
se suspenden en suspensin salina con 0,5% de formol. Si se utilizan frascos Roux, se emplean 10 ml de
solucin salina con formol y bolas de vidrio para extraer las clulas. La suspensin se filtra por una gasa
para eliminar restos grandes, se lava tres veces por centrifugacin a 6.000 g durante 20 minutos y el lavado
final se resuspende en 0,25% de formol salino y se guarda durante 1 semana. Para titular el antgeno, se
prepara una serie de diluciones en formol salino. Cada dilucin se titula con diluciones dobles de un
antisuero bovino adecuado contra C. fetus. Cada tubo debe contener 0,5 ml de suero y 0,5 ml de antgeno.
El contenido se mezcla bien antes de incubar a 37C durante 18 horas. El ttulo del antgeno se determina
por la dilucin ms alta que origina al menos un 50% de aglutinacin con la muestra de suero positivo.
Las muestras de mucus vaginal se homogenizan con cuatro volmenes de PBS (o 5% de fenol salino)
utilizando bolas de vidrio. Si se ha practicado un lavado vaginal, las muestras son adecuadas. Una vez
homogenado, se transfieren 2 ml a un tubo de ensayo colocado en un bao de agua a 57C. Se colocan en
el mismo bao 10 ml aproximadamente de agar Oxoid No.1 fundido (20 g/litro). Cuando el contenido de los
dos tubos se ha equilibrado a 57C, se pipetean 2 ml del agar en el homogenado. La mezcla se agita
vigorosamente y se vierte rpidamente en un recipiente con tapn de rosca con una boca de 45 mm de
anchura. Cuando la mezcla se ha solidificado, se depositan 2 ml de fenol salino al 5% sobre el agar antes
de cerrar el tapn. El recipiente se incuba despus durante 18 horas a 37C para extraer el anticuerpo.
El lquido claro se aspira de la superficie del agar y se emplea como muestra de la prueba en un ensayo de
aglutinacin en tres tubos. El primer tubo se deja vaco, y en los otros se pipetean 0,5 ml de 0,5% de fenol

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

483

Captulo 2.3.2. Campilobacterioriosis genital bovina

salino. Luego se ponen 0,5 ml de la muestra problema en el primer y segundo tubo. Se mezcla el contenido
del segundo tubo y se transfiere 0,5 ml al tercer tubo. Se mezcla el contenido del tercer tubo y se eliminan
0,5 ml. A continuacin, se aade a cada tubo 0,5 ml de una dilucin estandarizada del antgeno y se
mezcla bien. Despus de incubar a 37C durante 18 horas, las pruebas se observan con luz oblicua sobre
un fondo negro. Cada dilucin se valora como sigue:
Agua clara
75% claridad
50% claridad
25% claridad
No claridad

=
=
=
=
=

++++
+++
++
+
-

Se debera realizar al mismo tiempo una titulacin de un control positivo utilizando el mismo mtodo que
para determinar el ttulo de un antgeno frente a un antisuero positivo conocido. El antgeno se utiliza a la
misma dilucin estandarizada frente a diluciones del suero positivo. Los resultados se pueden validar si se
obtiene el ttulo esperado utilizando las muestras de control positivo.
Un resultado positivo es aquel en el que se produce el 50% de aglutinacin en el tercer tubo (dilucin 1/80),
o despus si se usan ms de tres tubos. La reaccin es dudosa si hay menos evidencia de aglutinacin. Se
considera que la prueba del mucus es til para el diagnstico de la campilobacteriosis genital, pero debe
resaltarse que la interpretacin de los resultados ha de hacerse a nivel poblacional. Para utilizar mejor la
prueba es necesario seleccionar con cuidado los animales, ya que incluso en poblaciones con una extensa
infeccin es probable que algunos animales escapen a la infeccin. Hay un perodo variable de adaptacin
entre la infeccin y el desarrollo de una prueba de aglutinacin positiva, y en la fase del estro las aglutininas
tienden a desaparecer del mucus parcialmente o por completo, aunque pueden presentarse a altas
concentraciones en otras fases del ciclo. En cualquier caso, los ttulos de aglutinacin tienden a
desaparecer con el tiempo.

b)

Enzimoinmunoensayo
Se dispone de un ELISA para detectar anticuerpos secretorios IgA especficos de antgeno en el mucus
vaginal despus de el aborto debido a C. fetus subesp. venerealis (17, 19). Estos anticuerpos son
duraderos, y su concentracin permanece constante en el mucus vaginal durante varios meses (22).
El muestreo inicial puede realizarse despus del primer perodo involucional (normalmente 1 semana
despus del aborto) cuando el mucus se hace ms claro.
Se ha descrito recientemente un ELISA para detectar la respuesta srica humoral de IgG despus de la
vacunacin (33).

Preparacin de antgeno y antigenizacin

Se crece Campylobacter fetus subesp. venerealis en agar con 7-10% de sangre en condiciones
microaerbicas a 37C durante 3 das. Las placas se analizan para pureza y se transfieren colonias a 0,5%
de formol salino durante 1 hora, se centrifuga a 17.000 g, se lava dos veces con PBS, pH 7,5, y se
resuspende a continuacin en tampn carbonato 0,05 M, pH 9,6. La absorbancia final se ajusta a 0,21 a
610 nm. Se dejan durante la noche a 4C placas de poliestireno para microtitulacin de fondo plano
antigenizadas con 10 l de antgeno, que se guardan luego a -20C. Antes de uso, las placas se lavan dos
veces con agua destilada y despus se elimina la humedad de ellas con cuidado.

484

Procedimiento de la prueba

i)

Se aade a cada pocillo el mucus vaginal diluido (100l) y la placa se incuba durante 2 horas a 37C.

ii)

Se lavan las placas como antes y se aaden 100 l de IgA anti-bovina de conejo.

iii)

Despus de una incubacin de 2 horas a 37C, se lavan las placas y se aaden a cada pocillo 100 l
de IgG anti-conejo de cabra conjugada a peroxidasa de rbano.

iv)

Despus de otras 2 horas de incubacin a 37C, se lavan las placas y se aaden 100 l de substrato
(cido 5 amino-saliclico [0,8 mg/l], pH 6,0, activado inmediatamente por la adicin de 2% de perxido
de hidrgeno [H2O2]).

v)

Las placas se dejan a temperatura ambiente durante 30 minutos y se detiene la reaccin aadiendo
50 l de hidrxido sdico (NaOH) 3 M. La absorbancia se mide en un lector ELISA a 450 nm.

Manual de la OIE sobre animales terrestres 2004

Captulo 2.3.2. Campilobacterioriosis genital bovina

vi)

Interpretacin de los resultados: cada muestra se prueba en duplicado, y en cada placa se incluye
controles positivos y negativos. Las medidas de absorbancia de las muestras problema se corrigen
para las medidas de absorbancia de los controles positivos y negativos segn la frmula siguiente:
Absorbancia muestra- Absorbancia control negativo
Resultado = ________________________________________________
Absorbancia control positivo - Absorbancia control negativo

100

La prueba se considera positiva si el resultado es superior a 40. Los animales vacunados no

reaccionan al ELISA con IgA ya que su mucus vaginal solo contiene anticuerpos de isotipo IgG.

C. REQUISITOS PARA LAS VACUNAS Y LOS MATERIALES DE DIAGNSTICO

Las vacunas con Campylobacter fetus subesp. fetus confieren inmunidad contra C. fetus subesp. venerealis
porque ambas cepas comparten antgenos comunes (5). Se reconocen dos grupos de antgenos de C. fetus: los
antgenos flagelares "H" que son termolbiles y los antgenos somticos "O" que son termoestables. Adems,
est presente un antgeno capsular "K" (23). La vacuna debe incorporar estos antgenos. Se trata de vacunas en
emulsin de aceite con una o ms cepas que se han inactivado con formaldehdo. Tambin se han descrito otras
preparaciones de vacunas (11).
La adicin al producto biolgico de una segunda cepa de C. fetus subesp. venerealis es una prctica comn. Es
importante la presencia de cuatro o cinco inmungenos proteicos sensibles al calor que son compartidos por
muchas cepas de C. fetus subesp. venerealis y C. fetus subesp. fetus. Debe confirmarse la presencia de tales
inmungenos (4).
En poblaciones infectadas, todos los animales para reproduccin, incluyendo los toros, vacas y terneras, se
vacunan despus del diagnstico de campilobacteriosis genital bovina. Al tiempo de la segunda vacunacin, se
recomienda un tratamiento adicional con antibiticos para toros infectados, ya que la vacuna no siempre es
eficaz para acabar con infecciones establecidas.
Los toros y novillas del ao siguiente se vacunan, y los toros del tercer ao en adelante se vacunan anualmente.
En poblaciones no infectadas solo se vacunan los toros, una vez al ao.

1.

Control de inculos

a)

Caractersticas del inculo

El inculo consiste en un lote grande y homogneo de un cultivo de C. fetus subesp. fetus o de C. fetus
subesp. venerealis que se ha caracterizado cuidadosamente e identificado en cuanto a pureza, conservado
en pequeas alcuotas.

b)

Mtodo de cultivo
El crecimiento inicial del inculo tiene lugar en medio slido. ste consiste en un medio basal al que se
aade 0,16% de Bacto agar. El medio basal se compone de 2,8% de caldo de Brucella, 0,5% de extracto de
levadura, 1,2% de succinato sdico, y 0.001% de cloruro clcico. El cultivo inicial se mantiene 3 das a 37C
en una atmsfera de 5% de CO2, 5% de O2 y 90% de N2. El cultivo se pasa a tubos adicionales con medio
semislido y se incuba durante 48 horas. El material resultante se utiliza para produccin de vacuna.

c)

Validacin como vacuna

El inculo debe estar libre de organismos contaminantes. La pureza del inculo debe comprobarse por un
mtodo de cultivo apropiado.
No resulta prctico probar la eficacia en condiciones de laboratorio. Se determina en el campo por
observaciones epidemiolgicas.
La vacuna debe mantenerse a 4C.

2.

Mtodo de produccin

El material de siembra se cultiva en medio lquido formado por medio basal al que se aade 0,025% de
tioglicolato sdico. Estos cultivos se incuban durante 24 horas a 37C con agitacin a 80 rpm. Se recogen los
lquidos y se aade formaldehdo a una concentracin final de 0,2%.

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Captulo 2.3.2. Campilobacterioriosis genital bovina

La vacuna se mezcla con un adyuvante de emulsin de aceite para alargar el perodo de inmunidad.

3.

Control del proceso

Se debe comprobar la identidad del microorganismo por cultivo e identificacin, as como la ausencia de
microorganismos contaminantes.

4.

Control de lotes

a)

Esterilidad
Las pruebas para esterilidad y ausencia de contaminacin del material biolgico se pueden encontrar en el
captulo I.1.5.

b)

Inocuidad
El proceso de inactivacin debe ser completo. Esto se comprueba inoculando el equivalente de una dosis
en el mismo medio y bajo las mismas condiciones que las utilizadas en el proceso de produccin. Este
cultivo se incuba 72 horas en las mismas condiciones, despus de las cuales no debe haber evidencia de
crecimiento bacteriano. El producto final debe estar libre de contaminantes bacterianos y fngicos viables,
utilizando mtodos adecuados de cultivo.
Se inoculan dos cobayas con 2 ml del producto, intramuscular o subcutneamente. No debe haber una
reaccin adversa atribuible a la vacuna durante un perodo de observacin de 7 das despus de la
inoculacin.

c)

Potencia
La potencia de la vacuna puede medirse por seroconversin en conejos. Se miden sus ttulos sricos
mediante inmunofluorescencia o por la prueba de aglutinacin en tubo. Se vacunan subcutneamente, con
la mitad de la dosis utilizada en el ganado bovino, cinco conejos que sean serolgicamente negativos a una
dilucin 1/100 del suero, en dos ocasiones separadas por 14 das. Como mnimo, el suero de cuatro de los
cinco ratones, recogido 14 das despus de la segunda vacunacin, debe mostrar un incremento en el ttulo
de al menos cuatro veces.

5.

Pruebas sobre el producto final

a)

Inocuidad
Ver Seccin C.4.b.

b)

Potencia
Ver Seccin C.4.c.

Agradecimiento

Partes de este captulo derivan del captulo sobre campilobacteriosis genital bovina de ediciones previas de este
Material o estn basados en l.

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