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Matria 1 teste
1 Semestre - 2010/2011
3 ano - Mestrado Integrado em Engenharia Biomdica
Instituto Superior Tcnico
Baseado nas aulas e nos livros Principles of Gene Manipulation and Genomics
e Gene Cloning and DNA analysis
ndice
Potenciais benefcios da Biotecnologia/Engenharia Gentica .................................................................................. 5
Potenciais problemas e consequncias da Biotecnologia/Engenharia Gentica ...................................................... 5
Tcnicas fundamentais de manipulao gentica..................................................................................................... 5
Principais passos na clonagem de um gene .............................................................................................................. 6
Vectores de clonagem: plasmdeos e bacterifagos ................................................................................................. 6
Plasmdeos ............................................................................................................................................................. 6
Classificao de plasmdeos............................................................................................................................... 7
Gama de hospedeiros ........................................................................................................................................ 7
Bacterifagos ......................................................................................................................................................... 8
Fago ................................................................................................................................................................. 8
Fago M13 ............................................................................................................................................................... 9
Preparao de DNA ................................................................................................................................................. 10
DNA total de bactrias......................................................................................................................................... 10
DNA plasmdico lise alcalina ............................................................................................................................. 10
DNA fago ........................................................................................................................................................... 11
DNA fago M13 ..................................................................................................................................................... 11
Manipulao de DNA purificado.............................................................................................................................. 11
Nucleases ............................................................................................................................................................. 12
Polimerases.......................................................................................................................................................... 12
Enzimas que actuam nas extremidades .............................................................................................................. 13
Endonucleases de Restrio ................................................................................................................................ 13
Nomenclatura .................................................................................................................................................. 14
Tipos de endonucleases................................................................................................................................... 14
Tipos de extremidades .................................................................................................................................... 15
Digesto de restrio in vitro............................................................................................................................... 15
Construo de um mapa de restrio ............................................................................................................. 16
Ligases e ligao de DNA ..................................................................................................................................... 16
Introduo de DNA em clulas vivas ....................................................................................................................... 17
Tcnicas de introduo de DNA em bactrias ..................................................................................................... 18
Transformao ................................................................................................................................................. 18
Electrotransformao (ou electroporao) ..................................................................................................... 19
Conjugao bacteriana .................................................................................................................................... 20
2
Conjugao Triparental.................................................................................................................................... 20
Conjugao Biparental..................................................................................................................................... 21
Introduo de fagos em bactrias ....................................................................................................................... 21
Transfeco...................................................................................................................................................... 21
Introduo de DNA em organismos eucariotas ................................................................................................... 21
Introduo de DNA em Saccharomyces cerevisae........................................................................................... 21
Introduo de DNA em clulas animais ........................................................................................................... 22
Introduo de DNA em clulas vegetais .......................................................................................................... 23
PCR Polymerase Chain Reaction ........................................................................................................................... 24
Passos da PCR ...................................................................................................................................................... 24
Material necessrio ......................................................................................................................................... 24
Design de primers ............................................................................................................................................ 25
Produtos de PCR .............................................................................................................................................. 26
Vectores de clonagem para E. coli ........................................................................................................................... 27
Plasmdeos ........................................................................................................................................................... 27
Vectores de clonagem baseados no fago M13........................................................................................................ 29
Vectores de clonagem baseados no fago ............................................................................................................. 31
Bibliotecas genmicas ............................................................................................................................................. 32
Vectores de clonagem para leveduras .................................................................................................................... 32
YEps Plasmdeos epissomais de levedura ............................................................................................................. 33
Outros plasmdeos para levedura ....................................................................................................................... 33
YACs cromossomas artificiais de levedura ........................................................................................................... 34
Processo de clonagem com pYAC3: ................................................................................................................. 34
Vectores de clonagem para plantas superiores ...................................................................................................... 35
Vectores de clonagem para insectos ....................................................................................................................... 35
Obteno de clones para genes especficos ............................................................................................................ 36
Processo de preparao do cDNA: ...................................................................................................................... 36
Hibridao de Southern ....................................................................................................................................... 37
Mutagnese aleatria.............................................................................................................................................. 39
Mutantes de eliminao em bactrias ................................................................................................................ 40
Mutantes de inactivao por insero ................................................................................................................ 43
Mutantes de eliminao em S. cerevisae ............................................................................................................ 43
RNA de interferncia iRNA.................................................................................................................................... 44
Mutagnese dirigida ................................................................................................................................................ 45
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Engenharia Gentica
Potenciais benefcios da Biotecnologia/Engenharia Gentica
Diagnsticos e tratamentos mais precisos;
Melhoramento de colheitas e da sua resistncia a doenas e stress ambiental;
Produo de qumicos, enzimas, aditivos alimentares, medicamentos, polmeros, etc;
Eliminao de poluentes e resduos.
Clonagem de genes
Vectores de clonagem: molculas de DNA s quais podem ser adicionados fragmentos de DNA exgeno. Tm
capacidade de replicao so geralmente replices, tendo apenas uma origem de replicao.
Plasmdeos
Molculas de DNA circular (geralmente em cadeia dupla) que tm uma existncia independente na
clula (no fazem parte do cromossoma e replicam-se independentemente).
Existem essencialmente em bactrias (nos eucariotas s foram identificados em leveduras).
Contm um ou mais genes responsveis por caractersticas teis s clulas (embora no contenham
genes essenciais). Podem conferir resistncia a antibiticos, factores de fertilidade, produo de compostos
xenobiticos, degradao de toxinas, etc.
Estas caractersticas so importantes quando as bactrias/clulas se encontram sob presso selectiva (i.e. meio
com antibitico). Caso contrrio apenas atrasam o crescimento do organismo devido ao peso metablico
adicional do plasmdeo tornam-se uma desvantagem.
Classificao de plasmdeos
Plasmdeos conjugativos: contm os genes tra, que sintetizam o pilus sexual das bactrias e outras estruturas
necessrias conjugao.
Plasmdeos mobilizveis: contm genes mob e so capazes de transferir cpias de si prprios (por conjugao)
para outras clulas.
Plasmdeos autotransmissveis: simultaneamente conjugativos e mobilizveis (tra+mob+).
Plasmdeos integrativos (epissomas): podem existir sob a forma circular ou integrados no cromossoma. A
integrao depende do factor F. Tm um nmero de cpias definido.
Plasmdeos no integrativos: mantm-se sempre no citoplasma, independentes do cromossoma. Tm um maior
nmero de cpias.
So os mais usados: produzem um maior nmero de cpias e no so integrados no cromossoma no se
perdem e no transferem caractersticas para o genoma da clula, o que pode ser prejudicial (i.e. proliferao
de resistncia a antibiticos).
O nmero de cpias de um plasmdeo presente numa bactria varia (desde apenas 1 at mais de 100).
Para efeitos de clonagem preferem-se plasmdeos que apresentem mltiplas cpias de modo a que se possa
obter a maior quantidade possvel da molcula recombinada.
A capacidade de plasmdeos diferentes coexistirem na mesma clula, em simultneo, prende-se com a
sua compatibilidade. Diz-se que dois plasmdeos so incompatveis se da sua interaco resulta a destruio de
um deles. Geralmente plasmdeos compatveis tm mecanismos de replicao diferentes.
Podem definir-se grupos de incompatibilidade que englobam plasmdeos incapazes de coexistir na
mesma clula. So mutuamente incompatveis.
Gama de hospedeiros
Bacterifagos
Bacterifagos so vrus que infectam especificamente bactrias. Tm uma estrutura simples que
consiste numa molcula de material gentico (geralmente DNA) rodeada por uma cpside (cpsula).
Podem ser de dois tipos:
Head and tail: DNA linear de cadeia dupla. I.e. fago : infecta E.coli.
Filamentoso: DNA circular em cadeia simples. I.e. fago M13: infecta bactrias com pilus sexual.
Fago
DNA linear, cadeia dupla. Infecta E.coli ~ 48,5 Kb
Ciclo ltico: ciclo de vida dos bacterifagos no qual, findo o processo de infeco, as clulas lisam.
1)
2)
3)
4)
Ciclo lisognico: ciclo no qual um bacterifago se insere no genoma das clulas que infecta e se mantm na
forma de pr-fago.
1)
Fago adere parede da bactria e injecta o seu DNA;
2)
DNA circulariza no interior da clula;
3)
DNA circular integrado no cromossoma e forma um pr-fago. Mantm-se no genoma por indefinidas
geraes, sem manifestar as suas caractersticas, e replicado juntamente com o genoma.
4)
Em situaes de stress o fago excisado do cromossoma, passando a estar de novo na forma circular.
Em condies normais, uma protena repressora impede que o fago (integrado no cromossoma) seja activado.
Quando uma molcula est sob stress (UV, falta de nutrientes, etc) o repressor torna-se instvel e desprende-se
do DNA, permitindo a transcrio do fago vai entrar em ciclo ltico.
5)
Clula entra em ciclo ltico e so produzidos novos fagos.
Fago M13
DNA circular, cadeia simples. Infecta bactrias com pilus sexual ~ 6,5 Kb
H medida que a clula se replica o M13 passa entre progenitores e descendentes, sendo transmitido entre
geraes.
No ocorre lise das clulas pelo que o fago M13, aps infeco de uma bactria, pode ser a replicado
indefinidamente. Pelo facto de no ocorrer lise difcil identificar quais as clulas infectadas. Pode verificar-se
um crescimento mais lento devido ao peso metablico extra acarretado pela presena do fago.
Preparao de DNA
DNA total de bactrias
Crescer as clulas em meio nutritivo apropriado; i.e. meio LB
Centrifugar e retirar sobrenadante; elimina-se o meio de crescimento
Prover lise das clulas:
Lisozima: degrada peptidoglicanos; (componentes da parede celular bacteriana)
SDS (detergente): destri os lpidos e lisa a clula; (destri a membrana celular)
Purificar os cidos nucleicos:
Mtodos enzimticos (RNAses, proteases);
Fenol (desnatura/precipita protenas);
Centrifugar forma-se uma fase orgnica e uma fase aquosa (remover esta fase);
Precipitar DNA utilizando lcoois;
Suspender DNA.
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DNA fago
Cultivar clulas inoculadas pelo fago;
Induzir ciclo ltico; para multiplicar o fago.
Centrifugar fago fica no sobrenadante; pois muito leve. O sedimento tem como constituio os
resduos das bactrias.
Remover suspenso de fagos;
Adicionar polmero de polietilenoglicol; remove a gua da superfcie do fago e permite a formao de
agregados maiores, que j precipitam quando centrifugados.
Centrifugar e rejeitar sobrenadante.
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Nucleases
Nucleases (RNAses, DNAses): degradam cidos nucleicos atravs da quebra de ligaes fosfodisteres entre
nucletidos. Fazem hidrlise da ligao entre um grupo fosfato e um grupo hidroxilo.
Exonucleases: removem nucletidos, um de cada vez, a partir das extremidades da molcula de DNA. Encurtam
fragmentos. I.e. BAL 31.
Exonuclease III: s actua em pontas cegas e s digere uma das cadeias.
Endonucleases: quebram ligaes internas (corte aleatrio) na cadeia de DNA. Obtm-se fragmentos de vrios
tamanhos. I.e. S1, cliva cadeias simples.
DNAse I e desoxirribonuclease I: cortam cadeias simples ou duplas.
Quando se utilizam nucleases in vitro tem que se ter ateno ao tempo de incubao pois estas enzimas so
inespecficas e degradam todo o DNA indiferentemente.
DNAse I actua apenas em molculas de DNA pelo que bastante til quando se quer obter apenas RNA.
Polimerases
Polimerases sintetizam novas cadeias de DNA complementares a cadeias de DNA/RNA molde (cadeias
simples pr-existentes). A maioria necessita de um primer (iniciador) regio de cadeia dupla onde se liga a
enzima para iniciar a polimerizao.
Exemplos de polimerases usados em Engenharia Gentica:
DNA polimerase I: liga-se a pequenas zonas de cadeia simples (nicks) de molculas maioritariamente de cadeia
dupla. Sintetiza uma nova cadeia, no sentido 5 3, degradando a cadeia j existente medida que avana
acumula funo de exonuclease no sentido 5 3 (bifuncional).
Em Eng. Gentica isolou-se apenas a parte da pol I com actividade de polimerase, a que se chamou
fragmento Knelow. Evita-se o desperdcio de dNTPs devido actividade da nuclease.
Usa-se frequentemente este fragmento para sintetizar extremidades de fragmentos e transformar
extremidades coesivas em cegas, compatveis com vectores de extremidades cegas.
Polimerases deixam um nick no incio da cadeia que sintetizam. Esse nick corrigido por ligases.
Taq polimerase provm do organismo Thermus aquaticus e termoestvel (resistente desnaturao pelo
calor), sendo a sua temperatura de ~70C. por isso usada em PCR.
Tem a desvantagem de cometer 1 erro por cada 1000 nucletidos. Podem usar-se outras enzimas
termoestveis e que so proofreading. Reconhecem e corrigem erros de replicao. Tm actividade de
endonuclease 3 5. I.e.: Pfu (Pyrococcus furiosus), Pwo (Pyrococcus woosi) e Tma (Thermologa maritima).
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Transcriptase reversa utiliza moldes de RNA para sintetizar DNA. Est envolvida na replicao de vrus
(retrovrus, i.e. HIV) e utilizada na tcnica de DNA complementar (cDNA).
Permite a clonagem de genes e a sua transferncia de eucariotas para procariotas: a partir de RNA processado
(j sem intres) sintetizada uma cadeia de DNA complementar. Essa cadeia simples pode ser ento
transformada em cadeia dupla de DNA, que agora contm o gene de interesse.
Fosfatase alcalina remove grupos fosfato das extremidades 5 de molculas de DNA. utilizada, por exemplo,
para impedir que vectores de DNA digeridos por endonucleases de restrio voltem a recircularizar.
Quando um vector restringido a probabilidade deste recircularizar superior de ser inserido um fragmento
de DNA pois a insero requer duas ligaes e no apenas uma. Ao eliminar os fosfatos 5 a enzima ligase
deixa de poder actuar e o vector no recirculariza. O fragmento de DNA exgeno (no tratado) contm
extremidades com fosfato e, portanto, consegue ligar-se a uma das cadeias do vector. Na outra cadeia fica um
nick, mas ainda assim a molcula suficientemente estvel para entrar na clula hospedeira, onde os
mecanismos de reparao da mesma vo corrigir o nick.
Transferase terminal adiciona nucletidos no terminal 3 de uma molcula de DNA (actua no sentido 5 3).
muito utilizada para adicionar caudas de homopolmeros a molculas de cDNA para poderem ser clonadas em
vectores.
Clonagem com extremidades coesivas mais eficiente do que com extremidades cegas. Incuba-se o
vector e o fragmento a inserir em meio contendo a enzima transferase terminal e um tipo de nucletidos
(nucletidos complementares em cada meio). Vo ser sintetizadas caudas que funcionam depois como
extremidades coesivas complementares aumenta a eficincia de insero.
Endonucleases de Restrio
Endonucleases de restrio reconhecem determinadas sequncias de DNA e hidrolisam as cadeias nesse
local, dando origem a dois fragmentos . DNA pode ser protegido da aco destas enzimas atravs de metilao.
No actuam em RNA e so sintetizadas, provavelmente, por todas as bactrias.
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3 G C T A G C 5
Algumas enzimas reconhecem sequncias degeneradas, i.e., que contm locais onde pode existir
qualquer base.
Hinf I reconhece G A N T C. N pode ser qualquer base.
Enzimas de restrio que tm a mesma especificidade (mesmo local de restrio mas provm de
organismos diferentes) designam-se isosquizmeros.
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Tipos de extremidades
Alu I
NNTCGANN
NNAG
CTNN
NNCT
GANN
Coesivas: enzimas cortam cada cadeia de DNA num local especfico, espaado de 2 a 4 nucletidos,
originando extremidades de cadeia simples.
NNGAATTCNN
EcoR I
NNCTTAAGNN
NNG
NNCTTAA
AATTCNN
GNN
Endonucleases com diferentes locais de restrio podem produzir as mesmas extremidades coesivas.
Permite que se restrinjam vectores e fragmentos com enzimas diferentes e que as suas extremidades sejam
complementares. No entanto, o vector recombinado obtido pode no ser reconhecido por nenhuma das
endonucleases originais.
Extremidades coesivas so mais eficientes para clonagem. A complementaridade de bases estabiliza
associaes entre fragmentos diferentes (associaes intermoleculares) mas tambm promove associaes
intramoleculares pois torna mais fcil a recircularizao de vectores.
No se sabe ao certo quantos locais de restrio existem numa molcula de DNA para determinada
enzima. Pode prever-se 1 local em cada 44 ou 46 nucletidos para sequncias de restrio de 4 ou 6 bases. No
entanto, estes valores no so exactos, sabendo-se at que o contedo GC de uma sequncia afecta o seu
reconhecimento por diferentes endonucleases. Sequncias ricas em GC tm menos probabilidade de apresentar
sequncias de restrio AT.
A frequncia de locais de restrio determina o nmero e tamanho dos fragmentos restringidos.
3)
4)
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Para determinar o nmero e tamanho dos fragmentos de restrio corre-se o preparado por um gel de
electroforese.
Pode desenhar-se um mapa de restrio onde figuram os locais de restrio de vrias enzimas. Estes
mapas permitem seleccionar as endonucleases a usar nos processos de clonagem.
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Transformao
A transformao o processo natural de captao de DNA por bactrias. Algumas bactrias (como
Streptococcus, Bacillus, Pseudomonas) so naturalmente competentes e adquirem espontaneamente
fragmentos livres de DNA presentes no meio ou, atravs de um processo activo, lisam outras clulas para
obterem o seu DNA.
A competncia apenas se manifesta quando as bactrias se encontram sob stress, como no caso da falta
de nutrientes ou presena de antibiticos. Mecanismo de sobrevivncia. Englobam DNA na esperana que
alguns dos fragmentos lhes possam conferir vantagem no ambiente adverso.
Nem todas as transformaes so estveis e, portanto, nem todos os fragmentos se mantm nas clulas
que os captam.
Fragmentos lineares tm maior probabilidade de serem degradados porque no tm origem de replicao e
podem ser reconhecidos pelos sistemas de restrio bacterianos. No entanto, se uma regio do fragmento tiver
homologia com uma regio do cromossoma pode ocorrer recombinao e o DNA exgeno incorporado no
genoma.
No caso dos plasmdeos, como estes apresentam uma origem de replicao, podem manter-se na clula
sem necessidade de se integrarem no cromossoma.
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A frequncia de transformao baixa (0,01%) e varia com o tamanho dos fragmentos: ideal para
cadeias <10Kb e praticamente nula para fragmentos >50Kb.
importante eliminar os sistemas de restrio de estirpes usadas para recombinao. Evita-se a
degradao dos fragmentos introduzidos, possibilitando a sua clonagem.
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Procedimento experimental
Recolher clulas numa fase de crescimento exponencial.
Centrifugar e recolher clulas.
Ressuspender clulas em gua estril e colocar em banho de gelo. Lavar as clulas vrias vezes com
gua estril/destilada elimina os sais presentes no meio e evita curto-circuito.
Adicionar DNA plasmdico e submeter choque. No deixar bolhas de ar na soluo para evitar curtocircuito.
Adicionar imediatamente um meio nutritivo. Para promover recuperao celular.
Seleccionar transformantes. Usar meio selectivo.
Conjugao bacteriana
A conjugao bacteriana um processo de transferncia de DNA entre clulas por contacto fsico clula-aclula atravs de um canal proteico, o pilus sexual. As protenas necessrias para a sntese do pilus so
codificadas em plasmdeos conjugativos (tra+ mob+), como o factor F+ (fertilidade), um plasmdeo natural de E.
coli. Este plasmdeo tem 2 origens de replicao:
Ori T: origem de transferncia: local reconhecido por uma enzima (endonuclease Tray) que faz um nick
no DNA de cadeia dupla e d incio ao processo de transferncia pelo mtodo do circulo rolante.
Ori: origem de replicao do plasmdeo.
O factor F um plasmdeo bastante grande pelo que foi reduzido para poder ser mais facilmente utilizado
em Eng. Gentica.
Conjugao Triparental
A conjugao triparental utiliza 3 estirpes de bactrias:
Dadora: mob+tra-, contm um gene de interesse.
Ajudante: mob+tra+ e de baixa gama de hospedeiro (plasmdeos no se replicam na estirpe receptora).
Esta estirpe apenas um intermedirio.
Receptora: onde o gene de interesse se vai replicar.
A estirpe dadora adquire o plasmdeo tra+mob+ e fica conjugativa, podendo transferir o seu plasmdeo, que
contm o gene de interesse, para a estirpe receptora.
Usa-se meio selectivo que s permite a sobrevivncia da estirpe receptora. i.e. meio PIA, E. coli no
sobrevive, Pseudomonas sobrevive. (LAB1)
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Conjugao Biparental
A conjugao biparental utiliza apenas duas estirpes de bactrias:
Dadora: tem gene tra+ no cromossoma e plasmdeo de interesse com gene mob+.
Receptora: no tem gene tra+ e recebe o plasmdeo de interesse por conjugao com a estirpe dadora.
Se a conjugao for feita sobre uma membrana em vez de ser em suspenso obtm-se resultados mais rpidos
porque a proximidade entre as bactrias facilita a formao dos tubos de conjugao.
Micro-injeco: utilizado apenas em clulas eucariotas grandes e um mtodo invasivo mas rpido.
Uma soluo de DNA de interesse injectada directamente no ncleo da clula por meio de uma agulha ou
pipeta muito fina.
Bombardeamento de partculas (biolstica): esta tcnica foi inicialmente desenvolvida para clulas
vegetais e consiste no bombardeamento, a alta velocidade, de microprojecteis partculas de ouro ou
tungstnio revestidas com o DNA que se quer introduzir na direco das clulas. O DNA exposto adere
superfcie das clulas-alvo e difunde-se atravs da membrana chegando eventualmente ao ncleo e integrandose.
Ultrassons: os ultrassons so usados para abrir poros na membrana celular e permitir a entrada de DNA.
Tem que se ter ateno frequncia utilizada pois para frequncias demasiado altas as clulas acabam por lisar.
Electrotransformao: corrente elctrica usada para abrir poros na membrana celular. Quando
comparada com a electrotransformao de bactrias, para clulas animais o pulso aplicado dever ser mais
longo e de menor intensidade (devido dimenso das clulas).
Lipossomas: o DNA de interesse inserido em vesculas lipdicas (lipossomas) que se fundem com a
membrana das clulas e permitem a captao de DNA e a sua libertao no citoplasma. DNA entra
eventualmente no ncleo. Criar lipossomas: adicionam-se lpidos a uma soluo de DNA e criam-se micelas
espontaneamente. Algumas dessas micelas vo conter o DNA que queremos introduzir.
A transduo a introduo de DNA em clulas por meio de um vrus. O DNA exgeno adicionado ao
genoma completo do vrus ou usado para substituir um ou mais genes virais, sendo depois introduzido nas
clulas atravs dos mecanismo naturais de infeco viral.
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Passos da PCR
Desnaturar DNA por aumento da temperatura (at 94-95C).
Hibridao dos primers a temperatura de annealing (50-65C) temperatura utilizada depende das
caractersticas dos primers.
Extenso das cadeias, a 72C, pela enzima Taq polimerase termoestvel e provm do organismo
Thermus aquaticus. No proofreading. Repetem-se 25 a 30 ciclos.
Extenso final permite a sntese de cadeias que possam ter ficado incompletas.
Em cada ciclo so sintetizadas o dobro das cadeias iniciais. Por cada molcula dupla de DNA so
sintetizadas duas molculas. No final da reaco tm-se 2n-2 fragmentos (n o nmero de ciclos e a base 2
provm do facto de nos primeiros dois ciclos serem obtidas duas molculas longas) de DNA alvo.
Material necessrio
H20
dNTPs
Primers
DNA alvo
Taq polimerase
Tampo (enzima)
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Design de primers
Os primers so o ponto-chave para o sucesso da PCR. Se os primers forem mal escolhidos pode no se
obter qualquer produto de PCR ou pode obter-se um ou mais fragmentos errados.
Os primers devem flanquear a regio do DNA que se quer amplificar e serem complementares cadeia
para a qual serviro de molde durante a replicao.
Primer codificante: permite a sntese da cadeia superior, no sentido 5 3. Lido directamente na sequncia
alvo. Primer codificante upper primer.
Primer no-codificante: permite a sntese da cadeia complementar, tambm no sentido 5 3. Complementar
regio final da cadeia alvo que surge com a ordem dos nucletidos invertida.
Primer codificante
5
GTAGCCTAATCCGGATCGT TAGCCTGCAA
CATCGGATTAGGCCTAGCAATCGGACGTT
Para garantir a eficincia da reaco de PCR os fragmentos amplificados no devem ser inferiores a 1Kb
nem superiores a 3Kb, embora seja possvel utilizar fragmentos com at 10Kb. Amplificao de fragmentos
maiores requer mtodos especiais.
Um dos primeiros aspectos a ter em conta aquando da escolha de primers o seu tamanho. Primers
demasiado pequenos podem hibridar com vrias zonas e dar origem a produtos indesejados.
8-mer (primer com 8 nucletidos) pode hibridar, estatisticamente, em 46000 locais do genoma humano. J um
17-mer espera-se que apenas encontre uma sequncia complementar em todo o genoma menos provvel
que origine produtos inespecficos.
No entanto, primers demasiado longos tambm no so aconselhveis porque levam mais tempo a
hibridar e diminuem a eficincia da PCR. Na prtica no se utilizam primers com mais de 30 nucletidos. No s
devido diminuio da eficincia da reaco mas tambm porque so muito mais caros de sintetizar.
A temperatura de ligao dos iniciadores tambm muito importante. Deve ser suficientemente alta
para que hibridaes no perfeitas sejam instveis mas no deve ultrapassar a temperatura de fuso dos
primers (Tm), qual eles se mantm sempre dissociados do DNA. 1-2C abaixo da Tm considerada a
temperatura ideal de ligao.
Os primers devem ainda ser desenhados de modo a que os primers codificantes e no-codificantes
tenham temperaturas de ligao semelhantes. Pode jogar-se com o tamanho dos primers.
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Nem sempre se conhece a sequncia do DNA que se quer amplificar pelo que tm que se desenhar os
primers recorrendo sequncia de aminocidos da protena codificada por esse mesmo DNA.
Comparam-se protenas de vrios organismos e identificam-se as zonas consenso (tm os mesmos
aminocidos) e os genes homlogos. A partir da sequncia de aminocidos obtm-se a sequncia de nucletidos
possveis (tem de se ter em conta a degenerescncia do cdigo gentico) e podem ento desenhar-se os
primers.
Nos locais em que podem estar presentes vrias bases utilizam-se bases degeneradas (que emparelham
com qualquer nucletido), como a inosina. Aos primers assim formados d-se o nome de primers degenerados.
Produtos de PCR
Os produtos de PCR so usados principalmente para 3 fins:
Electroforese em gel;
Clonagem;
Sequenciao.
A clonagem de um produto de PCR no to simples como pode parecer pois a Taq polimerase adiciona
um nucletido, geralmente adeninas, extremidade 3 de cada cadeia que sintetiza, dando origem a fragmentos
de extremidades no cegas.
Para ultrapassar este facto, pode usar-se uma exonuclease para remover as bases extra, mas difcil
prevenir que o DNA de interesse no seja tambm digerido. Pode tambm utilizar-se um vector que tenha
projeces de timina, de modo a que estas emparelhem com as adeninas do fragmento de PCR.
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No entanto, uma das solues mais utilizadas o design de primers que j incluem locais de restrio na
regio 5. Desde que a extremidade 3 do primer tenha cerca de 70% de complementaridade, o primer hbrida
com a molcula de DNA alvo inicial, permitindo que a regio de restrio seja copiada para os produtos finais de
PCR. Esses produtos podem depois ser restringidos e ligados a vectores com extremidades coesivas.
Vectores de Clonagem
Vectores de clonagem para E. coli
Plasmdeos
Nomenclatura:
pBR322
p: plasmdeo
BR: laboratrio onde foi construdo, cientistas que o desenvolveram
322: distino entre plasmdeos do mesmo laboratrio
pBR322 foi um dos primeiros plasmdeos a serem construdos e apresenta algumas caractersticas muito teis:
pequeno (4363 bp) permite clonagem de fragmentos com 6Kbp e clonado facilmente.
Tem duas marcas de seleco (resistncia a ampicilina e tetraciclina) cada uma com um local de
restrio nico.
Tem vrios locais de restrio nicos que permitem clonar genes com vrios tipos de extremidades
coesivas.
Tem um nmero de cpias razoavelmente elevado e que pode ser aumentado na presena de um
inibidor da sntese proteica, o cloranfenicol (at 1000-3000 cpias).
No entanto, este plasmdeo conjugativo, o que pode no ser muito benfico devido transferncia
indesejada de genes entre espcies.
O plasmdeo pBR322 foi construdo a partir de 3 plasmdeos naturais de E. coli que forneceram:
R1: ampR
R6.5: tetR
pMB1: ori
A seleco de transformantes utilizando-se pBR322 pode ser feita atravs da resistncia ampicilina ou
tetraciclina.
Suponhamos que restringimos o vector com BamHI e introduzimos o gene de interesse na regio que
codifica o gene tetR. As clulas transformantes vo possuir apenas resistncia ampicilina, mas este antibitico
no pode ser usado unicamente para a seleco porque tambm o vector tem ampR. Para ultrapassar este
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problema fazem-se dois riscados de colnias transformantes em placas contendo meio nutritivo e amp ou tet.
As colnias que no crescerem em meio com tetraciclina so as que desejamos e podemos isol-las a partir do
meio apenas com ampicilina.
Amp
(1)
Tet
(2)
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A seleco de recombinantes em pUC8 envolve o gene LacZ. Este gene codifica a sntese da protena galactosidase, envolvida na degradao da lactose em glucose e galactose.
Algumas estirpes de E. coli tm o gene LacZ modificado no seu genoma e s so capazes de metabolizar
a lactose na presena de plasmdeos, como o pUC8. Em Eng. Gentica utilizam-se estas estirpes para seleccionar
recombinantes, juntamente com um composto anlogo lactose, a X-gal, mas que adquire a cor azul quando
degradado pela -galactosidase, permitindo a identificao de colnias.
A insero de um gene no vector pUC8 inactiva o gene LacZ, o que significa que colnias recombinantes
cultivadas em meio com X-gal no vo ficar azuis. A seleco pode ento ser feita num meio nutritivo com
ampicilina (sobrevivem apenas as clulas transformantes) e X-gal (as colnias brancas so as recombinantes).
Agar + X-gal + IPTG
Recombinantes
No-recombinantes
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Bibliotecas genmicas
Vectores e outros vectores de elevada capacidade permitem a criao de bibliotecas genmicas. Estas
bibliotecas consistem num conjunto de clones recombinantes que contm todo o DNA de um organismo, sendo
muito teis para estudar genes individualmente. Podem ser guardadas durante muitos anos e partilhadas entre
laboratrios.
Bibliotecas genmicas de eucariotas so feitas a partir de sequncias s quais j foram eliminados os
intres clona-se a partir do RNA.
O nmero de clones necessrio para fazer uma biblioteca genmica pode ser calculado pela frmula:
Pequeno (6Kbp).
70-200 cpias por clula.
Tem origem de replicao.
No tem marca de seleco um problema.
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Tem um local de restrio para a endonuclease SnaBI. TRP1, URA3 e SUP4 so teis para a seleco de
recombinantes.
Processo de clonagem com pYAC3:
Restrio do vector com BamHI (coesivo) e SnaBI (cego).
Obtm-se 3 fragmentos:
Fragmento flanqueado por locais de restrio BamHI descartado.
Brao esquerdo contm TEL, TRP1-ori-CEN4.
Brao direito contm URA3 e TEL.
O gene SUP4 fica dividido entre os dois braos.
Ligao do fragmento de DNA deve ter extremidades coesivas.
Seleco: auxotrofia dupla e cor.
Podem ocorrer diversos tipos de ligao:
Brao esquerdo + brao direito + gene: recombinantes sobrevivem a meio mnimo para triptofano e
pirimidinas e tm cor branca.
(YACs so instveis e podem sofrer recombinao homloga entre si)
11,4 Kb
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Para clonar genes de interesse utilizam-se vectores que contm dois elementos P:
Um deles tem a transposase interrompida pelo DNA que se quer inserir na clula.
O outro tem a transposase intacta mas no tem repeties invertidas no pode ser transferido.
O vector introduzido nas clulas alvo por microinjeco. A transposase sintetizada e a sequncia
transferida para o genoma a que contm o gene de interesse.
Um plasposo um transposo que tem uma origem de replicao.
Identificao a partir de uma biblioteca genmica atravs do uso de sondas Hibridao de Southern.
Numa biblioteca genmica de eucariotas utiliza-se cDNA clonado em plasmdeos, YACs, BACs, etc. Devido
presena de intres recorre-se ao transcritema e no ao genoma das clulas. Deve ter-se tambm em ateno o
facto de clulas diferentes expressarem diferentes genes.
Para seleccionar um gene cuja protena no sintetizada no fgado utilizam-se clulas hepticas e no quaisquer
outras.
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RNase + PolI
mRNA
5 AUCGCCAAUAAAA 3
DNA
3 TAGCGGTTATTTT 5
cDNA
5 ATCGCCAATAAAA 3
3 TAGCGGTTATTTT 5
Como a expresso dos vrios genes de eucariotas no uniforme, para alguns vo obter-se clones mais
abundantes do que para outros.
A identificao de um clone contendo o gene de interesse pode ser feita atravs de hibridao de cidos
nucleicos, nomeadamente pelo mtodo de Hibridao de Southern.
Hibridao de Southern
Extraco de DNA;
Desnaturao do DNA atravs de uma base (NaOH) no se desnatura por temperatura porque o gel de
electroforese iria derreter. Antes da desnaturao pode fazer-se uma depurinao com HCl.
temperatura
A sonda vai competir com o DNA heterlogo e ligar-se apenas s regies onde h homologia (zonas onde
compete com o DNA de pr-hibridao). A hibridao deve ser realizada a uma temperatura suficientemente
alta para no permitir ligaes inespecficas mas no demasiado elevada para que possa ocorrer, de facto,
alguma ligao.
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Hibridar.
Pr-hibridao, hibridao e lavagens. Igual ao processo descrito anteriormente.
Random priming: utilizam-se hexaoligonucletidos aleatrios como primers para sintetizar uma cadeia
complementar. Pelo menos um dos dNTPs adicionados ao meio deve estar marcado radioactivamente.
Usa-se o fragmento de Knelow.
A deteco dos fragmentos com sonda, aps hibridao, feita por autoradiografia.
Marcao no-radioactiva inclui vrios mtodos, por exemplo:
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Mutagnese e Interferncia
Mutagnese e interferncia podem ser feitas por vrios mtodos e em diferentes tipos de organismos:
Bactrias:
Mutagnese aleatria transposo.
Eliminao de genes.
Inactivao por insero.
Levedura:
Mutantes de eliminao simples ou duplos.
Eucariotas:
siRNA (RNA de interferncia).
Mutagnese dirigida.
A eliminao/inactivao de genes pode ser utilizada para criar estirpes mutantes para hospedeiros de
clonagem ou para estudar a aco de um determinado gene.
Mutagnese aleatria
A mutagnese aleatria faz uso de transposes e plasposes.
Transposes so elementos mveis do DNA, com dimenso de 1 a 10Kbp, que podem ser inseridos em diversos
locais do genoma por recombinao no homloga, dando origem a um novo rearranjo dos genes (podem ficar
no funcionais).
Apresentam 3 regies fundamentais:
Transposase: enzima que corta o transposo nas sequncias invertidas e cliva o DNA alvo em locais
aleatrios.
Os restantes passos da transcrio so feitos por enzimas do organismo hospedeiro.
Marcas de seleco: genes, por exemplo de resistncia a antibiticos, que permitem a seleco das
molculas que contm o transposo.
Um transposo insere-se aleatoriamente em vrias regies do genoma, podendo interromper regies
promotoras ou codificantes. til quando no se sabe exactamente qual o gene de interesse ou quando se quer
fazer um banco de mutantes. Identificam-se as colnias com o fentipo pretendido e de seguida tenta
identificar-se o gene afectado.
Um transposo pode ser inserido num vector para E. coli, onde replica, e depois ser transferido para
outro tipo de clulas. A, o transposo vai, eventualmente, inserir-se no genoma e silenciar um gene. No
entanto, como o plasmdeo no possui origem de replicao para o organismo hospedeiro diz-se um plasmdeo
suicida.
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Um plasposo um transposo que contm uma origem de replicao para bactrias entre as
sequncias invertidas, podendo ser convertido num plasmdeo.
pTnMod-OKm um plasposo muito utilizado que replica s em E. coli e mob+.
Na mutagnese aleatria, uma vez identificadas as colnias (cultivadas em meio selectivo) que
apresentam o fentipo pretendido, necessrio recuperar a regio onde o transposo/plasposo se inseriu e
identificar o gene mutado. Para tal procede-se do seguinte modo:
Clonam-se os vrios fragmentos obtidos e inserem-se em E. coli. No se usa um vector. Recircularizamse s os fragmentos por interveno de uma ligase. Apenas alguns fragmentos vo ter o transposo.
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1)
Pode usar-se vectores suicidas: replicam em E. coli (permitem amplificao do vector) mas no no
organismo onde se quer fazer a eliminao. Como os vectores so suicidas, sabemos que vo ter de se integrar
no genoma ou ento vo ser destrudos.
Espera-se que ocorra recombinao homloga entre o vector e a zona do genoma que contm os genes
clonados. O genoma passa a ter o vector e, portanto, a bactria pode ser seleccionada.
2)
3)
O stress ambiental aumenta a frequncia de recombinao e mais provvel que ocorra a recombinao que
queremos.
Recombinao dupla: o genoma vai recombinar consigo prprio, podendo ou no eliminar o gene E1.
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4)
gusA, uma das marcas de seleco do vector utilizado, codifica uma protena que degrada o X-gluc e lhe confere
a cor azul.
Os recombinantes simples tm o vector inserido no genoma e, portanto, degradam o X-gluc, dando origem a
colnias azuis.
Os recombinantes duplos perderam o vector e vo dar origem a colnias brancas.
5)
Realizar hibridao de Southern ou PCR para distinguir as estirpes de eliminao das estirpes selvagens.
3)
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43
Design de primers que contenham regies que flanqueiam a cassete e 40 nucletidos do gene alvo.
Fazer PCR e inserir produto de amplificao directamente em S. cerevisae.
Esta tcnica difere da eliminao em bactrias pois no preciso clonar fragmentos em E. coli e podem usar-se
fragmentos lineares.
3)
4)
A recombinao ocorre na presena do plasmdeo pSM47 e a cassete KanMX4 eliminada. Pode ento
proceder-se eliminao de outros genes.
pSM47 codifica a recombinase Cre, responsvel pela recombinao, e bastante instvel, sendo eliminada aps
algumas replicaes.
As leveduras so organismos dimrficos (podem estar na forma haplide ou diplide) e quando se quer
eliminar um gene essencial (que no pode ser eliminado) trabalha-se com as leveduras na forma diplide.
Para testar se um gene essencial procede-se sua eliminao numa levedura diplide. Fora-se a entrada em
meiose e vo obter-se 4 clulas, das quais apenas 2 tm o gene. Se todas sobreviverem o gene no essencial.
Na prtica o gene transcrito na mesma, mas no h sntese de nenhuma protena, pelo que como se
o gene estivesse silenciado.
siRNA (small interfering RNA) so utilizados em Eng. Gentica para silenciar genes.
In vitro, sintetizam-se pequenos dsRNAs, com extemidades coesivas de timina. Introduz-se o RNA nas
clulas e forma-se o complexo RISC, que vai reconhecer e degradar os transcritos do gene que pretendemos
silenciar.
No h formao do complexo DICER porque j se fornecem dsRNAs suficientemente pequenos. Este processo
de silenciamento transitrio pois s funciona enquanto os dsRNAs no forem todos degradados. Contudo
costuma persistir o tempo suficiente para se analisarem as alteraes no fentipo em estudo.
Mutagnese dirigida
A mutagnese dirigida utiliza-se para introduzir pequenas mutaes na sequncia codificante de um
gene.
Pode usar-se o fago M13 para introduzir uma mutao pontual. Sintetiza-se um oligonucletido que
contm a mutao pretendida e este vai hibridar com o DNA de cadeia simples do fago. Aps replicao temos
uma cadeia mutada e outra no.
Para evitar que a cadeia mutada (que no est metilada) seja corrigida, eliminam-se os sistemas de
reparao do hospedeiro. A probabilidade de se obter uma cadeia mutada agora de 50:50.
Pode tambm recorrer-se a PCR para amplificar plasmdeos com mutao (j no preciso usar o M13).
Sintetizam-se 2 primers, ambos com a mutao, e amplifica-se. No final da reaco incuba-se o produto com
DnpI, uma endonuclease de restrio que s reconhece DNA metilado, e eliminam-se as cadeias originais (no
mutadas).
Normalmente usam-se primers 30-40 mer e a mutao deve estar no meio.
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