UNIVERSIDAD NACIONAL

TORIBIO RODRGUEZ DE MENDOZA DE AMAZONAS

FACULTAD DE INGENIERA ZOOTECNISTA, AGRONEGOCIOS Y
BIOTECNOLOGA
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA ZOOTECNISTA

PRACTICA DE MADURACIONINVITRO DE OVOCITOS

INVITRO
ALUMNO : HUANCA SILVA LEISY.

CURSO

: BIOTECNOLOGA ANIMAL

PROFESOR: PhD. ILSE S. CAYO COLCA

CHACHAPOYAS PER
2016

INTRODUCCIN
I.

INTRODUCCION

A pesar de que es abundante el conocimiento de los factores que afectan la

recoleccin pos mortem de ovocitos, existe escasa literatura de los efectos de
los procedimientos de aspiracin en el nmero, morfologa y la capacidad de
desarrollo subsecuente de los complejos cumulus-ovocito recuperados. Sin
embargo existen pocas deferencias bsicas entre la recuperacin de ovocitos
post mortem e in vivo, que hacen una comparacin entre ambas, al menos
parcialmente hipottica.
Primero la manipulacin transrectal del ovario es ms complicado en la
donante viva siendo an ms trabajoso por la visualizacin indirecta del
mismo a travs de imgenes ecogrficas. Cuando ovarios de mataderos son
puncionados el operador puede examinar el ovario completamente.
Segundo, se puede esperar que diferentes fuerzas mecnicas jueguen un rol
mientras se puncionan un ovario de matadero mediante una jeringa y una
aguja, comparado con la aspiracin folicular in vivo con una presin de vaco
de aspiracin ajustable.

II.

OBJETIVOS
Que el alumno desarrolle sus capacidades y obtenga conocimientos bsicos sobre reas
de Biotecnologa reproductiva animal.
Obtener ovocitos mediante aspiracin folicular in vitro.
Aprender a realizar el procedimiento correcto de maduracin de ovocito

III. MARCO TEORICO

A. EN QU CONSISTE LA ASPIRACIN FOLICULAR TRANSVAGINAL?
Mejor conocida por sus siglas en ingls, OPU (Ovum Pick-up), la aspiracin folicular
transvaginal es una tcnica mediante la cual los ovocitos inmaduros son recolectados de los
folculos en los ovarios de una vaca viva por aspiracin guiada mediante ultrasonografa a
travs de la pared vaginal. Esta tcnica fue aplicada por primera vez en bovinos en 1988 al
adaptar para tal fin los procedimientos de bsqueda ultrasonogrfica transvaginal utilizados en
humanos y aparece como una solucin luego de intentos previos de aspiracin de folculos en
vacas vivas mediante tcnicas como la laparotoma y la laparoscopia.
MADURACIN DE OVOCITOS.
La maduracin ovocitaria es un fenmeno complejo, durante el cual el ovocito progresa desde
el estadio de profase de MI hasta el de MII (maduracin nuclear). El ovocito completa la
meiosis en respuesta al pico ovulatorio de LH, o bien, cuando es retirado del folculo para llevar
a cabo la maduracin in vitro. Un periodo de 24h es necesario para que el ovocito bovino
complete la maduracin nuclear, es decir, alcance el estadio de MII, en el que permanece hasta
el momento en que es fertilizado, que es cuando completa la meiosis y se forma los proncleos.

Adems de la maduracin nuclear, tambin es importante que exista una maduracin

citoplasmtica ya que prepara al ovocito para soportar la fertilizacin y aportar los
nutrientes requeridos para el desarrollo embrionario temprano. De manera natural, la
meiosis inicia en el ovario fetal, pero se detiene antes del nacimiento, en la profase (PI)
de la primera divisin meiotica; los ovocitos pasan entonces a la etapa reticulada, que es
un estado de reposo nuclear y que suele durar hasta que se ovula el primer ovocito en la
pubertad.

Los ovocitos en reposo o inmaduros tienen un gran ncleo denominado vescula

germinal. La meiosis avanza desde la etapa de vescula germinal o PI hasta la metafase
de la segunda divisin meiotica en la que se detiene una vez ms, dando como resultado
un primer cuerpo polar que es expulsado al espacio perivitelino. De la misma manera en
la que madura el nucleo se debe llevar a cabo la maduracin del citoplasma.

En los ltimos tiempos se ha podido demostrar que la adquisicin de capacidad para

desarrollar es un proceso que comienza mucho antes del periodo periovulatorio, antes
de la ruptura de la vescula germinal. En este sentido se ha demostrado que ovocitos
contenidos en folculos antrales de ms de 5-6 mm presentan una mayor capacidad para
desarrollar respecto a aquellos contenidos en folculos de menor dimetro.
Recientemente se han desarrollado protocolos de estimulacin ovrica en bovinos
tendientes a aumentar la presencia de folculos de mayor dimetro al momento de la
puncin folicular con los que se han obtenido tasas de produccin de embriones hasta
un 80%.
Cuando los ovocitos son aspirados desde los folculos terciarios reanudan
espontneamente la meiosis y al ser cultivados in vitro continan con los procesos de
maduracin. De este modo la composicin de los medios y el ambiente controlado por
estufas de cultivo, deben brindar un ambiente adecuado para que la maduracin ocurra
en 24hs de un modo similar a lo que sucede in vivo durante ms de dos ciclos estrales
en el bovino. Las condiciones utilizadas en la mayora de los laboratorios para lograr
este ambiente, involucra el uso de medios de cultivo tales como el TCM-199

suplementado con hormonas (LH, FSH, estradiol, etc.), antioxidantes (glutatin,

cisteamina, cistina), factores de crecimiento y macromoleculas (suero, albumina), en
una atmsfera de 5% CO2 a 38,5C y humedad a saturacin.

SISTEMAS DE MADURACIN IN VITRO

Medios de maduracin Se puede utilizar diferentes medios, de soluciones salinas a medios ms
complejos como por ejemplo: TCM 199: sales, piruvato sdico, lactato sdico, aminocidos,
vitaminas, purinas,..+/- tampones: Hepes, bicarbonato sdico pH: 7.2-7.4 Osmolaridad: 285320 mOsm/kg.
SUPLEMENTOS
Estos son los encargados de proporcionar condiciones ms especficas, varan de acuerdo a cada
especie animal. Sueros: fuente de protenas, cidos grasos, VV, hormonas, factores de
crecimiento. Suero fetal bovino, suero de vaca en celo, suero de buey Hormonas: FSH, LH,
estrgenos: Epidermal Growth Factor Cistena, cistena, -mercaptoetanol: precursores del
glutatin Glutatin: su concentracin intracitoplasmtica aumenta durante la maduracin
Protege al ovocito de reacciones oxidativas Favorece la descondensacin de la cromatina
formacin del PN masculino
CONDICIONES DE CULTIVO TEMPERATURA:
La temperatura ms adecuada para el cultivo de ovocitos es de 37C. Si < 25 C: se producirn
anormalidades del huso cromosmico Si > 40 C: causara poliespermia. Atmsfera: es
estrictamente necesario utilizar una incubadora con 5% CO2, sobre todo si el medio de MIV
contiene bicarbonato. Si es posible el cultivo se debe realizar en una incubadora de CO2
humidificada. Tiempo: el tiempo de maduracin y 24 h (vaca), 26 h (oveja), 27 h (cabra), 4044h (cerda)
FACTORES QUE AFECTAN EL OVOCITO DIMETRO DEL FOLCULO.
Cuando se obtiene ovocitos procedentes de folculos pequeos (1-2 mm) estos tienen
maduracin nuclear pero son inmaduros citoplasmticamente. Ovocitos procedentes de
folculos medianos (2-5 mm) o grandes (5-8mm): poseen un porcentaje de maduracin nuclear
mayor. Dimetro del ovocito. Existe una relacin entre el tamao del folculo y el desarrollo del
ovocito, y tambin existe una relacin entre el crecimiento del ovocito y su capacidad del
desarrollo in vitro. Competencia meitica aparece cuando el ovocito alcanza el 80-90% de su

tamao pero hasta que no alcanzan su tamao mximo, no puede completar la maduracin
citoplasmtica (Thibault et al). 90 m: Incapaces de reiniciar la meiosis

IV.

MATERIALES
A. EQUIPOS

Placa trmica de calentamiento

Estereomicropscopio
Micropipetas
Bao mara
Microscopio.

B. MATERIALES
LABORATORIO:
Termo
Vaso de precipitado x 200 cc ( 01 unidad)
Solucin Fisiolgica (NaCl 0.9%) 1 litro
Jeringa de 5 ml y agujas de 18 x 1 (1 unidad por alumno).
Placas Petri de 100 mm y placa Petri de 35 mm ( 5 o 6 unidades)
Guantes quirrgicos (1 par / alumno)
Papel Toalla (01 rollo/grupo)
BIOLOGICOS:
Ovarios de vacuno recolectados post morten.
V.

PROCEDIMEINTO Y RESULTADOS

1.- En primer lugar se hace la respectiva recoleccin de los ovarios de camal, se los deposita en un
termo con agua atemperada a los 37C.

2.- una vez recolectado los ovarios, se lleva al laboratorio, luego se procede a ponerlos en un
vasos Baker para luego ponerles a calentar en la placa trmicas por unos 10 minutos a 38c, una
vez calentados en la placa trmica se procede al secado.

3.- Con una jeringa de 10 ml se realiza la aspiracin folicular, absorbiendo solamente el

lquido folicular

4.- El fluido obtenido de cada ovario se deposita en un tubo de recogida de 50 ml, luego ser
inmediatamente filtrado y se pasara a una placa de Petri para localizar y evaluar morfolgicamente
bajo estereomicroscopio. (Bsqueda y clasificacin de ovocitos).

Clasificaremos los COCs obtenidos en cuatro categoras, segn homogeneidad, morfologa del
citoplasma y compactibilidad de las clulas del cumulo:
Categora I: Ovocitos con ms de tres capas de clulas de cumulo compactas y con citoplasma
homogneo uniformemente granulado.

Categora II: Ovocitos mayor o igual a tres capas de clulas del cumulo y citoplasma
generalmente homogneo

Categora III: Ovocitos con una sola capa de clulas del cmulo y citoplasma de
aspecto irregular con reas oscuras.

Categora IV: Ovocitos denudados

- Categora V: Ovocitos madurados in vivo, con cumulo expandido.

5.- una vez seleccionados los ovocitos, se lleva a cultivar durante 24 horas
los ovocitos inmaduros en TCM- 199 suplementado con 10% de suero fetal,
gonadotropinas (FSH, LH), y 17 - estradiol, a una temperatura de 38,5 C

VI.

CONCLUCIONES
En conclusin, la aspiracin folicular transvaginal es un procedimiento que
permite la recuperacin repetida de ovocitos de donantes vivas, siendo una
tcnica de alta eficiencia y repetibilidad, lo que permite al combinarla con la
fertilizacin in vitro superar con creces el nmero de becerros obtenidos por
donante en un periodo fijo de tiempo en comparacin con la superovulacin.
La aplicacin de esta tcnica puede, adems, incrementar el nmero de donantes
de ovocitos entre las cuales se podr contar con hembras pre-puberales, lo que
permitira reducir el intervalo generacional y as incrementar el progreso
gentico.
Con el desarrollo de todos los procesos de produccin de embriones in vitro, se
conoci la tcnica de una manera clara y precisa y como estudiantes nos
comprometemos en seguir desarrollando la tcnica y realizar investigaciones en
la tcnica.
Se trabaj con los principales medios de cultivo para la produccin in vitro de
embriones y se conoci de una manera correcta cada una de ellas.
El mtodo descrito de produccin in vitro de embriones permite disponer de un
gran nmero de embriones bovinos en diferentes estadios de desarrollo.

VII.

BIBLIOGRAFIA
STRINGFELLOW. DA., SIEDEL. SM., Manual de la sociedad internacional de
transferencia de embriones (I.E.T.S), 3ed, Alabama USA. 2000.
FELMER R, Produccin in vitro de embriones bovinos: Suplementacin de los
medios de cultivo con suero. Arch. Med. Vet, 2006; 38(2): pp.97-104.
VERNICA A. PELEZ, Produccin In Vitro De Embriones Bovinos.
PALASZ, AT., Y DE LA FUENTE, J. Produccin de embriones bovinos: Efecto
de los medios de cultivo y de los requerimientos fisiolgicos sobre la calidad de
los embriones producidos in vitro. http://es.scribd.com/doc/6137003/9-CultivodeEmbriones-Bovinos. 2000.
PARRISH, J.J., SUSKO-PARRISH, J.L., LEIBFRIED-RUTLEDGE, M.L.,
CRITSER, E.S., EYESTONE, W.H., FIRST, N.L. Bovine in vitro fertilization
with frozen-thawed semen. Theriogenology; 25: 591-600. 1986.

VIII. ANEXOS

Entrada de la vaca para la

aspiracin

Preparacin de materiales
Muestra de la vaca 064
Muestra de la vaca 064, Mara
y ILSE
Resultados de la aspiracin
Resultado de la vaca 064,
en un bao mara
Muestra de la vaca 064, MaraMara y ILSE
y ILSE

Observacin de ovarios y
ovocitos

Clulas espermticas
Resultado de la 064, Mara y
ILSE