Processos Biotecnolgicos / Cintica Enzimtia

Enzimas

.So protenas constitudas de longas cadeias de

aminocidos unidas por meio de ligaes peptdicas,
dotadas de propriedades catalticas.
.Esto presentes em todas as clulas.
.Transformam materiais em substncias mais simples
para que possam ser assimilados pelo organismo.
Invertase

SACAROSE
C12H22O11

FRUTOSE + GLICOSE
2C6H12O6

Energia potencial

Estados ativados

Reao sem catalisador

DE0
DE1

Reao enzimtica

Incio

Fim

Reao
E+S

ES

E+P

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O stio ativo

Analogia chave-fechadura

Enzima

Substrato

E
S

+
Vista lateral

+
Vista superior

Esta representao esquemtica explica duas

propriedades importantes das enzimas:
. a especificidade
. o stio ativo

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Cintica enzimtica a um substrato

linear

Atividade enzimtica
(velocidade inicial)

1913 - Michaellis-Menten

1925 - Briggs-Haldane

Saturao em substrato.
Velocidade independe
da concentrao.

[Substrato]
Velocidade inicial - .concentrao inicial do substrato;
.parmetros relativos enzima.

Sistema simples : S

E + S

k1

ES

k-1

P
k2
k-2

EP

k3
k-3

Simplificando:

E + S

k1
k-1

ES

kP

E + P

E + P

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Michaellis-Menten X Briggs-Haldane

Sistema fechado com S e P

ES

Concentrao

Tempo

Concentrao

Se [S] >> [E] : Estado pseudo-estacionrio

S
P
d ( ES )
@0
dt

ES

Tempo

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Balano material

Balano de massa em relao a ES

k1 [E] [S] - ( kP [ES] + K-1 [ES] ) = 0
aparecimento

desaparecimento

Mas: [ET] = [E] + [ES]

(Enzima total)

k1 ( [ET] - [ES] ) [S] - (kP + k-1) [ES] = 0

[ES] =

k1 [ET] [S]
kP + k-1 + k1 [S]

Mas: A velocidade da reao enzimtica igual a velocidade

de desaparecimento do complexo [ES]
v = kP [ES]

v =

kP k1 [ET] [S]
kP + k-1 + k1 [S]

kP k1 [ET] [S]
kP + k-1
k1

v =

vmx [S]
kM + [S]

+ [S]

Michaellis-Menten

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vmx e KM

vmx

vmx
2

K
M

[S]

vmx : em altas concentraes de S ocorre a saturao de E,

E se encontra sob a forma ES. A velocidade atinge
ento seu valor mximo.

KM : corresponde concentrao de semi-saturao do

substrato, para a qual v = vmx
2

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Observaes

1) Quando KP << K-1

KM =

K-1
K1

= KD

KD a constante de dissociao do complexo ES.

2) Quando S << KM

v =

vmx [S]
KM + [S]

tem-se uma cintica de 1 ordem

v =

vmx [S]
KM

v = K1 [S]

onde: K uma constante de 1 ordem da reao global

3) Quando S >> KM

v =

vmx [S]
KM + [S]

cintica de ordem zero

v = vmx

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Porque determinar KM ?

a) Porque KM d uma idia da concentrao intracelular.

Se [S] intracelular << KM, v seria muito sensvel a
mudanas em [S], mas, se v << vmx , a maior parte
do poder cataltico de E seria perdido. No existiria
sentido manter [S] >> KM, pois v no pode ser maior
que vmx. Tambm, para [S] >> KM , v torna-se
insensvel a pequenas mudanas em [S].

b) Sendo KM uma constante para uma dada enzima,

pode-se utilizar este valor para comparar diferentes
enzimas.

c) KM indica ainda a afinidade de diferentes substratos

para uma enzima particular. Isto , o substrato que
apresenta o menor valor de KM tem a mais alta
afinidade aparente para esta enzima. O melhor
substrato aquele que tem a maior razo vmx .
KM

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Determinao experimental de uma cintica

Michaeliana

- Realizar uma srie de ensaios T(C) e pH constantes, num

meio reacional contendo o substrato da enzima. Acompanhar
o desaparecimento do substrato por espectrofotometria,
medindo a densidade tica em funo do tempo.
- Utilizar uma grande [S] para obter muitos pontos sobre a
curva v = f(S)
- Como a maior parte das reaes enzimticas influenciada
pelo produto, torna-se necessrio trabalhar com velocidade
inicial, isto , quando a [P] negligencivel no incio da
reao.

v =

[]
t

concentrao

tangente =

[S3]
[S2]
[S1]

tempo

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Determinao dos parmetros KM e vmx

a) Linearizao de Lineweaver e Burk (mais usada)

v =

1/v

KM / vmx

1
v

vmx [S]
KM + [S]
KM + [S]
vmx [S]

1 / vmx
1

1/ [S]

-1 / KM

KM

vmx [S]

1
+

b) Linearizao de Eadie Hofstee (mais precisa)

v

v =

vmx

v =
-KM
vmx / KM

v / [S]

vmx [S]
KM + [S]
vmx
KM + 1
[S]

vmx = v [

KM + 1
]
[S]

v
v = -KM [S] + vmx

Obs.: Deve-se considerar a disperso dos pontos para os valores pequenos

de [S] e v, sobretudo quando se usa calculadora.

vmx

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Inibio enzimtica

A atividade enzimtica seguidamente influenciada positiva

ou negativamente pela presena de diversas substncias.
Um estudo detalhado da cintica de inibio implica, na
determinao de v em funo de [S] , na presena de uma
concentrao varivel de inibidor.
Existem dois tipos de inibio enzimtica:
. competitiva
. no-competitiva

Inibio competitiva
K1

K-1

KI

vmx [S]
v=

[1+

[I]
KI ] KM + [S]

KP

E + P

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Inibio competitiva

vmx

Sem [ I ]

Com [ I ]

[S]

1/v

Com [ I ]

Sem [ I ]

1 / vmx
-1 / KM

Determinao experimental de KI
1/v

-KI

[I]

1 / [S]

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Exemplo de inibio competitiva

O succinato pode ser desidrogenado em fumarato na presena

da enzima succinato desidrogenase:
COO -

SDH

CH2

COO -

CH2

C
-OOC

COO -

Certos cidos dicarboxlicos se comportam como inibidores

competitivos desta enzima:
COO -

COO -

COO -

CH2

COO -

CH2

COO -

Malonato

Oxalato

C = O
COO -

Oxaloacetato
Esta similaridade estrutural entre a molcula do substrato
verdadeiro e os inibidores, devido presena de grupos
carboxlicos, reconhecidos ao stio ativo da enzima, confirma
a hiptese da complementariedade substrato - stio ativo.

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Inibio no-competitiva

K1

KP

E + P

K-1

KI

KI

vmx [S]
v=

[1+
vmx

[I]
KI ] (KM + [S] )

Sem [ I ]

Com [ I ]

[S]

1/v

Com [ I ]

1 / vmx
-1 / KM

Sem [ I ]

1 / [S]

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Inibio pelo produto (retroinibio)

Exemplos: . a - amiloglicosidase - pela glicose

. invertase - pela glicose e frutose
. b - amilase - pela maltose

E1

E2

E3

E4

E5

Inibio de E1 pelo produto final F

Caracterizao experimental da cintica de inibio

Si

Pi

1/v

vi

-KI

[P]

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Inibio pelo substrato

1/v

[S]

1 / [S]

Fixao do substrato sobre um stio secundrio

Exemplos: . invertase inibida em fortes concentraes de sacarose.
. penicilina acilase inibida em fortes concentraes de
benzil penicilina.
vmx [S]
v =

KM + [S] + ( [S]2 / KI )

Reao reversvel
Exemplos: . isomerizao da glicose em frutose
. converso do cido fumrico em mlico
vS [S]
v =

KM + [S]

vP [P]
-

KP + [P]

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Cintica enzimtica de dois substratos

A + B
Exemplo: a - cetoglutarato
+
L - aspartato

P + Q

aspartato
aminotransferase

L - aspartato
+
oxaloacetato

. Anlise cintica mais complexa

. Determinao experimental de vmx e KM

Reaes de Troca Simples

a) Aleatrio (sem ordenao)

b) Ordenado
A enzima liga-se, numa ordem
determinada, a cada substrato para
formar um complexo ternrio que
evolui em direo aos produtos da
reao.

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Reaes de dupla-troca (ping-pong)

Um substrato se fixa e o produto correspondente liberado. Um

segundo substrato se fixa e um segundo produto liberado. Uma
outra molcula do primeiro substrato se fixa e assim por diante.

v =

vmx
KMA
KMB
1+
+
[A]
[B]

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atividade

Influncia do pH

10

pH
Faixas de pH timo de algumas enzimas:
a - amilase ............................... 5,3 - 5,9
glucoamilase ............................ 4,5 - 5,0
glucose-oxidase ............................ 5,5
colagenas .................................. 7,5 - 7,4

Uma expresso cintica corrente :

vmx [S]
v =

H+
K2
(1+
+
K1
H+

) (KM + [S] )

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Tcnica da medida da atividade enzimtica

pH - start
6,30

microbureta

Motor

eletrodo de
pH

Registrador

. espectrofotometria
. fluorimetria
. mtodos eletroqumicos

Reao enzimtica

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Expresso da atividade enzimtica

Quantidade de substrato transformada em produto por

unidade de tempo, em condies definidas de pH, tempetatura, etc.

A atividade enzimtica expressa em unidade (U): 1U

corresponde transformao de 1mmol de substrato por minuto.
A atividade especfica definida como o nmero de
unidades por mg de enzima (ou de protena se a preparao no
pura).

Quando se conhece a massa molar da enzima, pode-se

exprimir sua atividade molecular, ou seja, o nmero de molculas
de substrato transformadas por minuto e por mol de enzima.

O TURNOVER NUMBER igual a razo da quantidade

molecular sobre o nmero de stios catalticos presentes em cada
molcula. Este nmero varia segundo as enzimas de 102 a 106.

O Katal, unidade oficial de medida da atividade

enzimtica (S.I.), a quantidade de enzima que transforma um mol
de substrato por segundo. Na verdade se utiliza mKatal, hKatal,
picoKatal.
1U = 16,67 hKatal