Interciencia

versin impresa ISSN 0378-1844

INCIv.30n.6Caracasjun.2005

EVALUACIN TOXICOLGICA DE SUELOS CONTAMINADOS CON

PETRLEOS NUEVO E INTEMPERIZADO MEDIANTE ENSAYOS
CON LEGUMINOSAS

Mara del Carmen Rivera-Cruz, Antonio Trujillo-Narca, Martha

Aurora Miranda de la Cruz y Eduardo Maldonado Chvez

Mara del Carmen Rivera-Cruz. Ingeniero Agrnomo, Colegio Superior de

Agricultura Tropical (CSAT), Crdenas, Tabasco, Mxico. Maestra y Doctorado
en Ciencias en Edafologa, Colegio de Postgraduados, Montecillo, Mxico.
Profesor Investigador, Colegio de Postgraduados, Campus Tabasco, Mxico.
Direccin: Perifrico Carlos A. Molina s/n km. 3.5, H. Crdenas, Tabasco,
Mxico. e-mail: mariari@colpos.mx
Antonio Trujillo-Narca. Ingeniero Agrnomo, CSAT, Mxico. Maestra en Ciencias
en Edafologa, Colegio de Postgraduados, Montecillo, Mxico. Estudiante de
Doctorado en Ecologa y Desarrollo Sustentable, El Colegio de la Frontera Sur,
Unidad Villahermosa, Tabasco, Mxico.
Martha Aurora Miranda de la Cruz. Estudiante de Ingeniera Qumica Petrolera.
Universidad Popular de la Chontalpa. H. Crdenas, Tabasco, Mxico.
Eduardo Maldonado Chvez. Bilogo, Universidad Autnoma de Colima, Mxico.
Estudiante de Maestra en Produccin Agroalimentaria en el Trpico, Colegio
de Postgraduados, Campus Tabasco, Mxico.
Resumen
Los estudios toxicolgicos permiten identificar las especies vegetales ms sensibles a
concentraciones bajas de contaminantes en el suelo. Las leguminosas son plantas con
rganos y respuesta fisiolgica sensibles a concentraciones bajas de petrleo en el
suelo. El objetivo del presente estudio fue evaluar y explicar la respuesta en
crecimiento, biomasa total, nmero de ndulos y en ausencia/ presencia de
leghemoglobina en los ndulos de cuatro leguminosas a diferentes concentraciones de
petrleos nuevo (recin extrado) o intemperizado (expuesto al ambiente por ms de
20 aos). Se realizaron dos ensayos de fitotoxicidad en invernadero. El primero con
plantas de chipiln silvestre (Crotalaria sp) durante 120d con arreglo factorial 15 y
diseo al azar con cuatro repeticiones por tratamiento, con concentraciones de petrleo

de 150 (suelo testigo), 7500, 25000, 50000 (nuevo) y 79457 (intemperizado) mgkg 1
de hidrocarburos totales del petrleo (HTP), base seca. El segundo ensayo fue
durante 150d, con dormilona (Mimosa sp), guaje (Leucaena sp) y zarza (Mimosa pigra)
en un arreglo factorial 35 en un diseo al azar con cuatro repeticiones, y
concentraciones de 150, 50000, 79457, 100000 y 150000 mgkg -1 de HTP, base seca.
Hubo diferencias estadsticas significativas en todas las variables evaluadas, que se
asociaron negativamente con la presencia de petrleo en el suelo. Chipiln silvestre fue
la planta ms sensible a la exposicin al petrleo y evidenci mejor su fitotoxicidad,
por lo que podra ser utilizada como especie fitoindicadora de suelos contaminados con
petrleo. El nmero de ndulos con leghemoglobina fue el indicador ms sensible para
medir el efecto fitotxico del petrleo.
Summary
Toxicological studies enable to identify those plants with the highest sensibility to low
concentrations of soil pollutants. Leguminous plants have extremely sensible organs
and physiological responses to low concentrations of oil in the soil. The object of this
study was to assess and explain the response in terms of growth, total biomass,
number of nodules and presence/absence of leghaemoglobin in the nodules of four
different leguminous plants at four different concentrations of oil under two conditions:
new oil, recently extracted, or weathered oil, exposed to the environment for >20
years. Two phytotoxicity assays were carried out under greenhouse conditions. The
first involved wild chipiln plants (Crotalaria sp) for 120 days with a 15 factorial
arrangement and a random design with four replicates per treatment, testing oil
concentrations (in mgkg-1 of total petroleum hydrocarbons (TPH), dry weight) of 150
(control soil), 7500, 25000, 50000 (new oil) and 79457 (weathered oil). The second
assay lasted 150 days, testing plants of "dormilona (Mimosa sp), guaje (Leucaena
sp) and zarza (Mimosa pigra), in a 35 factorial arrangement, at random with four
replicates. The concentrations tested were 150, 50000, 79457, 100000 and 150000
mgkg-1 TPH, dry weight. Statistically significant differences were found in all variables,
being negatively associated to the presence of oil in soil. Wild chipiln was the most
sensitive species to oil exposure, better showing its phytotoxicity, so that it could be
used as a phytoindicative species of oil-polluted soil. The number of nodules containing
leghaemoglobin was the most sensitive indicator of oils phytotoxic effect.
Resumo
Os estudos toxicolgicos permitem identificar as espcies vegetais mais sensveis a
concentraes baixas de contaminantes no solo. As leguminosas so plantas com
rgos e resposta fisiolgica; sensveis a concentraes baixas de petrleo no solo. O
objetivo do presente estudo foi avaliar e explicar a resposta em crescimento, biomassa
total, nmero de ndulos e na ausncia/ presena de leghemoglobina nos ndulos de
quatro leguminosas a diferentes concentraes de petrleo novo (recm extrado) ou
intemperizado (exposto ao ambiente por mais de 20 anos). Realizaram-se dois ensaios
de fitotoxicidade em invernadeiro. O primeiro com plantas de "guizo-de-cascavel" ou
"xiquexique" (Crotalaria sp) durante 120 dias com arranjo fatorial 15 e desenho ao
acaso com quatro repeties por tratamento, com concentraes de petrleo de 150
(s testemunha), 7.500, 25.000, 50.000 (novo) e 79.457 (intemperizado) mgkg -1 de
hidrocarbonetos totais do petrleo (HTP), base seca. O segundo ensaio foi durante 150
dias, com Jurema de Imbira (Mimosa sp), leucena (Leucaena sp) e "malcia-de-boi" ou
"Jiquiri Grande" (Mimosa pigra) num arranjo fatorial 35 em um desenho ao acaso
com quatro repeties, e concentraes de 150, 50.000, 79.457, 100.000 e 150.000

mgkg-1 de HTP, base seca. Houve diferenas estatsticas significativas em todas as

variveis avaliadas, que se associaram negativamente com a presena de petrleo no
solo. Guizo-de-cascavel ou xiquexique foi a planta mais sensvel exposio ao
petrleo e evidenciou melhor sua fitotoxicidade, pelo que poderia ser utilizada como
espcie fitoindicadora de solos contaminados com petrleo. O nmero de ndulos com
leghemoglobina foi o indicador mais sensvel para medir o efeito fitotxico do petrleo.
PALABRAS
CLAVE
/ Crotalaria /
Leghemoglobina / Leucaena / Mimosa / Nodulacin /

Hidrocarburos/

Recibido: 10/11/2004. Modificado: 27/04/2005. Aceptado: 29/04/2005.

Los derrames de petrleo originan la acumulacin de hidrocarburos en el suelo. Los

derrames pueden ocurrir por rompimiento de oleoductos, accidentes de vehculos que
transportan petrleo en tanques en las carreteras, por derrames de petrleo de los
tanques de almacenamiento o por daos a los oleoductos durante el uso de maquinaria
en reas agrcolas (Chaneau et al., 2003; Rivera-Esparza y Dendooven, 2004). En las
regiones tropicales del sureste de Mxico la contaminacin del suelo es originada por
derrames de desechos de hidrocarburos del petrleo de las presas o fosas de los pozos
petroleros, por filtracin de agua aceitosa a travs de los bordos y fondos de las
presas, por desbordamiento de las presas de los pozos petroleros y por rotura de los
oleoductos, todo lo cual aumenta debido a la corrosin de los oleoductos y a la
dispersin a travs de los escurrimientos superficiales del agua de la lluvia (Trujillo et
al., 1995; Rivera-Cruz, 2004). El petrleo produce daos en las plantas por el potencial
txico de los hidrocarburos (Pothuluri y Cerniglia, 1994), adems el contacto directo
con las plantas origina quemaduras y la reduccin de la fotosntesis debido al
recubrimiento de las hojas y tallos con petrleo (Freedman, 1995). Proporciones bajas
de petrleo en el suelo estimulan el crecimiento de plantas de algodn (Plice, 1948)
porque aumenta el contenido de carbono. La exposicin a concentraciones altas de
petrleo (Ortiz, 2001; Rivera-Cruz y Trujillo-Narca, 2004) inhibe el crecimiento
vegetativo
y
reduce
la
biomasa
vegetal
de
pastos
(Echinochloa
polystachya y Brachiaria mutica) y de ciperceas (Cyperus spp). El petrleo en el suelo
puede eliminar la vegetacin debido a sus propiedades fitotxicas (Wetzel y Werner,
1995; Chaneau et al., 1997, 2000), aunque la intensidad del dao depende del tipo de
petrleo.
El petrleo ligero es ms txico que los petrleos mediano y pesado, debido a que
tiene grandes cantidades de hidrocarburos saturados y contenidos bajos de
compuestos polares (Dorn et al., 1998). Estudios previos con la prueba LC50
identificaron que las leguminosas son ms sensibles que las gramneas y ciperceas a
la exposicin al petrleo y tienen los ndices ms altos de fitotoxicidad por efecto de la
toxicidad aguda (Rivera-Cruz y Trujillo-Narca, 2004). En el presente estudio se
propone que las leguminosas pueden ser utilizadas como bioindicadoras de la
contaminacin del suelo causada por derrames de petrleos nuevo, aquel recin
extrado de un yacimiento a travs de un pozo petrolero, o por petrleo intemperizado,
aquel expuesto a las condiciones ambientales en la superficie del suelo al menos
durante 20 aos, y que tambin pueden utilizarse para la evaluacin de la eficiencia de
la descontaminacin final de suelos de acuerdo con la normativa ambiental mexicana
(Diario Oficial, 2004). Los objetivos fueron: a) evaluar y explicar el efecto de diferentes
concentraciones de petrleos nuevo e intemperizado en el crecimiento, en la biomasa

total, en el nmero de ndulos y en la presencia/ausencia de leghemoglobina del

ndulo; b) encontrar especies fitoindicadoras de la toxicidad del petrleo en el suelo; y
c) identificar las variables ms sensibles de la planta a la toxicidad del petrleo en el
suelo.
Materiales y Mtodos
Se efectuaron tres actividades secuenciales: i) Trabajo de campo en dos reas, una con
suelo con concentracin baja de petrleo (150mgkg-1 de HTP) y posiblemente
biognico (rea 1), y la otra con suelo severamente contaminado con petrleo mediano
por derrame crnico de petrleo por roturas de oleoductos al menos durante los
ltimos 20 aos (rea 2). Se utiliz muestreo al azar para la colecta de muestras
simples de suelo de acuerdo con la normativa oficial mexicana (Diario Oficial, 2004).
Se colectaron cinco muestras simples del horizonte superficial (0,0-0,30m de
profundidad) del suelo en las dos reas. Se efectu la colecta de semillas de
leguminosas herbceas y arbustivas localizadas en el rea 2 y en sitios aledaos a
sta. ii) Anlisis de las propiedades fsicas y qumicas de los suelos, y cuantificacin de
los hidrocarburos totales del petrleo (HTP) de los suelos. iii) Ensayos de fitotoxicidad
de los petrleos nuevo e intemperizado en plantas de cuatro leguminosas (Figura 1).

Trabajo de campo
El estudio se realiz en un terreno de 6,25ha de un Gleysol antrquico (ISSS-ISRICFAO, 1998) localizado en las coordenadas 1804'54"N y 9402'31"O, en el ejido Jos
N. Rovirosa, municipio de Huimanguillo, estado de Tabasco, Mxico. El clima es clido
hmedo con abundantes lluvias en Verano, con 2240mm de precipitacin anual y
25,8C de temperatura media anual (INEGI, 2001). El uso del suelo en el rea 1 es
cultivo de pasto para la ganadera bovina, la especie dominante es el pasto alemn
(Echinochloa polystachya) con 95% de cobertura, y no se encontraron leguminosas. El
rea 2 tiene mayor diversidad vegetal, las especies tulillo (Cyperus articulatus),
espadao (Typha sp.) y cebolln (Cyperus sp.) son dominantes con 20, 30 y 40% de
cobertura, respectivamente. La leguminosa zarza (Mimosa pigra) tiene una cobertura
de 2%. Se realiz la colecta de suelo superficial (0,0-0,30m de profundidad) en las dos

reas. El suelo para el anlisis de los HTP se colect con barrena tipo auger de acero
inoxidable, se colectaron muestras simples y se introdujeron las muestras en frascos
nuevos de vidrio de 0,25 litros de capacidad. Las muestras se preservaron a 4C, de
acuerdo con la normativa oficial mexicana (Diario Oficial, 2002a). El suelo empleado
para los ensayos de fitotoxicidad se colect con pala recta en cada sitio y se introdujo
en recipientes metlicos. La colecta de semillas maduras de la zarza (Mimosa pigra) se
realiz de arbustos localizados en el rea 2, tambin se colectaron en reas aledaas
con suelos no contaminados semillas maduras de las leguminosas chipiln silvestre
(Crotalaria sp.), dormilona (Mimosa sp.) y guaje (Leucaena sp.).
Anlisis fsico y qumico
Se determinaron 12 propiedades fsicas y qumicas del suelo (Tabla I). Los mtodos
analticos que se reportan en la tabla son los indicados en la norma oficial mexicana
NOM-021-RECNAT-2000 (Diario Oficial, 2002b). La concentracin del petrleo
(cuantificado como HTP) se determin con el mtodo analtico EPA 418.1 (EPA, 1986),
encontrndose que el suelo del rea 1 tiene 150mgkg -1 y el suelo del rea 2 tiene
79457mgkg-1 en base seca. El suelo del rea 2 est contaminado con HTP, rebasa las
concentraciones mximas permisibles para los suelos con usos agrcola (1000mgkg 1
HTP), de conservacin (1000mgkg-1 HTP) y para uso industrial (3000mgkg-1 HTP)
segn la normativa ambiental mexicana vigente (Diario Oficial, 2002a).

Ensayos de fitotoxicidad del petrleo

De junio a diciembre del 2003 se realizaron en invernadero dos ensayos de
fitotoxicidad en instalaciones del Campus Tabasco del Colegio de Postgraduados,
localizado en H. Crdenas, Tabasco, Mxico. Los ensayos se llevaron a cabo con las
semillas recolectadas de las cuatro leguminosas, las cuales se establecieron en suelo

secado bajo sombra, molido y tamizado en malla de 0,5cm de abertura. Las semillas
de Leucaena fueron escarificadas con agua caliente, durante 15min a 50C, mientras
que las semillas de las otras tres especies no requirieron escarificacin para inducir la
germinacin. Las semillas se sembraron a 1,0cm de profundidad en el suelo testigo y
la humedad se mantuvo a capacidad de campo (30%). Los ensayos se realizaron con
plntulas de un mes de edad. El ensayo 1 se realiz durante 120d con plantas de la
leguminosa chipiln silvestre, utilizando un arreglo factorial 15 en un diseo al azar
con cuatro repeticiones por tratamiento; se evaluaron las concentraciones 150 (suelo
testigo), 7500, 25000 y 50000mgkg-1 HTP de petrleo nuevo y 79457mgkg-1HTP de
petrleo intemperizado, en base seca. Se utiliz solamente esta concentracin de
petrleo intemperizado porque existen extensas reas afectadas por derrames crnicos
con esta concentracin promedio. El ensayo 2 se realiz durante 150d con plantas de
las leguminosas dormilona (Mimosa sp.), guaje (Leucaena sp.) y zarza (Mimosa pigra).
Se aplic un arreglo factorial 35 y un diseo completamente al azar con cuatro
repeticiones por tratamiento. Se ensayaron las concentraciones de 150 (suelo testigo),
50000, 100000 y 150000mgkg-1 HTP de petrleo nuevo y 79457mgkg -1 HTP de
petrleo intemperizado, en base seca. Las concentraciones de petrleo nuevo en los
dos ensayos se prepararon con suelo testigo (150mgkg -1 HTP) y las concentraciones
se calcularon en base seca relacin peso-peso. El petrleo nuevo se diluy en
diclorometano (Merck) que se adicion en el suelo en relacin de volumen 1:1 y se
mezcl hasta lograr homogeneidad, dejando pasar posteriormente 24 horas para
permitir la volatilizacin del diclorometano.
El procedimiento de dilucin utilizado se realiz de acuerdo con el protocolo N 208 de
la Organizacin para la Cooperacin y Desarrollo Econmico (OECD, 1984), que se
refiere a pruebas de toxicidad aguda en plantas. Se utilizaron recipientes de vidrio
mbar con capacidad de 1,8 litros y cada recipiente fue una unidad experimental. Se
trasplantaron en cada recipiente dos plntulas de 8cm de altura, 15d despus se
elimin una y qued una plntula en cada unidad experimental. Se aplic riego cada
24h y la humedad se mantuvo a capacidad de campo (30%). Las variables evaluadas
fueron crecimiento vegetativo (altura) medida cada 30d; biomasa seca total (secada
en estufa a 70C durante 48h), nmero de ndulos y la presencia/ausencia de
leghemoglobina en los ndulos. Estas tres variables se midieron a los 120d en chipiln
silvestre, que tiene un ciclo vegetativo ms corto, y a los 150d en dormilona, guaje y
zarza. La cosecha de la biomasa y el estudio de los ndulos se realiz el 9 de diciembre
del 2003. La presencia de ndulos viables (con leghemoglobina) se determin de
manera visual (presencia de color marrn-rojizo) segn Weaver y Frederick (1982).
Anlisis estadstico
Se aplic el procedimiento GLM para el anlisis estadstico y se utiliz la prueba de
Tukey para determinar diferencias estadsticas de las medias de los tratamientos
(p<0,05). Asimismo se aplic anlisis de correlacin (SAS, 1989).
ndices de fitotoxicidad
El ndice de fitotoxicidad representa la respuesta de la planta a la exposicin al
petrleo presente en el suelo. El mtodo para el clculo de los ndices relativo de
fitotoxicidad (IRF) y absoluto de fitotoxicidad (IAF) ha sido reportado por Rivera-Cruz y
Trujillo-Narca (2004). Los IRF y los IAF ms grandes representan mayor efecto
fitotxico, los ms pequeos significan menor efecto fitotxico.

Resultados y Discusin
Crecimiento vegetativo
El crecimiento vegetativo de las cuatro leguminosas mostr diferencias estadsticas
significativas (p<0,05) entre las medias de los tratamientos (Tabla II). La altura de la
planta fue severamente afectada por las tres concentraciones ms altas de los
petrleos intemperizado (79457mgkg-1 HTP) y nuevo (100000 y 150000mgkg -1 de
HTP). La mayor reduccin en la altura se present en las leguminosas dormilona y
zarza, donde las plantas no lograron sobrevivir al efecto de la concentracin ms alta
de petrleo (150000mgkg-1HTP; Tabla II); en cambio la planta de guaje
(Leucaena sp.) fue menos sensible a la exposicin de la concentracin ms alta de
petrleo nuevo, ya que sobrevivi a su efecto y creci un poco al pasar de 8cm de
altura al momento inicial a 13cm despus de 120d de exposicin.

El chipiln silvestre fue expuesto por menos tiempo (120d) que las otras tres especies
(150d) porque tiene un ciclo vegetativo ms corto. Tambin presenta la misma

respuesta an bajo la menor concentracin de petrleo y fue la especie ms sensible al

petrleo en el suelo. El patrn de crecimiento de las cuatro leguminosas en suelo
testigo fue de tipo sigmoidal (Salisbury y Ross, 2000) con pendiente acentuada (Figura
2). Aunque con menor pendiente, igual respuesta evidenci el tratamiento con
50000mgkg-1 HTP en guaje y zarza, lo que sugiere que poseen mecanismos de
adaptacin para condiciones de suelos contaminados con petrleo. La planta de chipiln
silvestre (Figura 2d) redujo su crecimiento seis veces por efecto de 7500mgkg -1 HTP,
el dao fue absoluto por el efecto de la concentracin 50000mgkg -1 HTP, que elimin
la planta. Hernndez (1997) encontr que las plantas de frijol negro (Phaseolus
vulgaris) son susceptibles al queroseno y su desarrollo fue afectado a medida que
aument la concentracin de queroseno. Esta respuesta fitotxica fue similar a la
obtenida en los ensayos con pastos (Brachiaria mutica y Echinochloa polystachya) y
con dos ciperceas (Cyperus spp.) realizados por Rivera-Cruz y Trujillo-Narca (2004)
hasta con 150000mgkg-1 HTP.

Produccin de biomasa total

La mayor produccin de biomasa seca total en las cuatro leguminosas se encontr en
el suelo testigo (Tabla II). Las medias de los tratamientos tuvieron diferencias
estadsticas significativas (p<0,05). La especie ms sensible fue el chipiln silvestre que
disminuy 6 veces la produccin de biomasa por el efecto de 7500mgkg -1HTP. Las dos
especies ms tolerantes fueron las leguminosas guaje y zarza donde la concentracin
50000mgkg-1 HTP redujo la biomasa total en 31 y 25%, respectivamente. El efecto fue
directamente proporcional con el aumento de la concentracin de petrleo. Debido a la
mayor sensibilidad de la planta de chipiln silvestre, cuya biomasa disminuy en
concentraciones de 7500mgkg-1 HTP de petrleo crudo, sta puede ser utilizada como
especie indicadora de concentraciones bajas de hidrocarburos en el suelo. La
produccin de biomasa de plantas de frijol negro (Phaseolus vulgaris) tambin
disminuy significativamente con el incremento de un complejo de hidrocarburos
(Hernndez, 1997).
Nodulacin
El nmero de ndulos tuvo diferencias estadsticas (p<0,05) por el efecto del petrleo.
La nodulacin fue inhibida en las cuatro leguminosas, la disminucin del nmero de los
ndulos aument con la mayor concentracin de petrleo (Tabla II). La especie ms
sensible fue el chipiln silvestre, que no form ndulos cuando fue expuesta a
500000mgkg-1 HTP. El guaje fue la especie ms tolerante a la exposicin del petrleo,
ya que form ndulos en concentraciones altas de petrleo nuevo (100000mgkg 1
HTP) e intemperizado (79457mgkg-1 HTP). La zarza, aunque tuvo menor infeccin de
rizobios, tambin fue tolerante al petrleo y la reduccin de los ndulos fue menos
acentuada que en las otras tres leguminosas. Se ha reportado (Alexander, 1994; Atlas
y
Bartha,
2002)
que
bajo
condiciones
favorables
en
el
suelo
la
bacteria Rhizobium puede invadir los pelos radicales, que sufren una deformacin o
enroscamiento bajo la influencia de algunos productos bacterianos. De esta manera
puede iniciar la formacin de ndulos y desarrolla la actividad fijadora de nitrgeno a
travs de los bacteroides de Rhizobium (Conn et al., 2002). Las clulas de los ndulos
donde residen los bacteroides contienen un pigmento llamado leghemoglobina, que se
une reversiblemente al oxgeno. La leghemoglobina oxigenada transporta el oxgeno en
condiciones de baja tensin de oxgeno libre a los sitios de fosforilacin oxidativa en el
bacteroide, donde se utiliza durante la produccin de ATP (Conn et al., 2002).
Las condiciones del suelo tienen un efecto marcado sobre los rizobios, pudiendo afectar
tanto la supervivencia como la capacidad de infeccin de los pelos radicales (Alexander,
1994). Algunos rizobios son sensibles a pH bajo y no pueden establecer infecciones en
suelos cidos. Esta restriccin no influy en la formacin de ndulos de las cuatro
leguminosas en el suelo sin petrleo a pesar de que el pH es fuertemente cido y que
el contenido de nitrato es bajo (Tabla I). Suominen et al. (2000) tambin identificaron
la misma respuesta en suelos contaminados con benceno, tolueno y xileno, y
encontraron que concentraciones mayores de 500ppm de m-toluato en el suelo
bloquean la formacin de ndulos en la leguminosa Galega orientalis. Experimentos
efectuados por Wetzel y Werner (1995) con plantas de alfalfa (Medicago sativa),
revelan que los hidrocarburos aromticos policclicos reducen la nodulacin antes de
que ocurran daos visibles en la planta, y afectan la vitalidad del macrosimbionte y del
microsimbionte. Adam y Duncan (2003) realizaron estudios de fitorremediacin con
plantas de Vicia sativa en suelo contaminado con diesel; el nmero de ndulos por
planta fue significativamente reducido en suelo contaminado con diesel, pero los

ndulos fueron ms grandes y desarrollados que los correspondientes a las plantas en

suelos sin diesel. Hernndez (1997) encontr que el queroseno reduce el nmero de
ndulos de plantas de frijol negro (Phaseolus vulgaris), e identific que a los 55 das
despus de la siembra la concentracin de 2500mgkg -1 de queroseno origin una
reduccin de 10 veces en el nmero de ndulos respecto a las plantas establecidas en
suelo testigo. Las plantas presentaron un estado similar al estrs hdrico que origin la
formacin de pocos ndulos, la toxicidad y la induccin de un estado de hidrofobia en
las races origina efectos similares a los del estrs hdrico. A los 91 das despus de la
siembra no hubo nodulacin en los diferentes tratamientos porque las plantas se
encontraban en la fase de senescencia. Los resultados de Hernndez (1997) difieren
con los de las cuatro leguminosas ya que todos los tratamientos sin petrleo formaron
numerosos ndulos (Tabla II) a pesar que haban fructificado. Este resultado es
positivo porque aumenta el periodo de fijacin biolgica de nitrgeno.
Leghemoglobina
Las clulas de los ndulos donde residen los bacteroides contienen un pigmento
llamado leghemoglobina, que se une reversiblemente al oxgeno. La leghemoglobina
oxigenada transporta el oxgeno en condiciones de baja tensin de oxgeno libre a los
sitios de fosforilacin oxidativa en el bacteroide, donde se utiliza durante la produccin
de ATP (Conn et al., 2002). Los ndulos sanos en las leguminosas tienen color marrnrojizo debido a la presencia de iones de hierro y molibdeno en la leghemoglobina, que
es una molcula presente en gran abundancia en el tejido central de todos los ndulos
fijadores de nitrgeno (Madigan et al., 1999; Atlas y Bartha, 2002). La exposicin de la
planta al suelo con petrleo produjo daos cualitativos y cuantitativos en los ndulos
de las cuatro leguminosas, con diferencias estadsticas significativas (p<0,05). Con
excepcin del suelo no contaminado (testigo), el petrleo en el suelo redujo el tamao
de los ndulos y tambin la presencia de la leghemoglobina en el ndulo (Tabla II).
Todos los ndulos de las leguminosas chipiln silvestre, dormilona y zarza establecidos
en suelo no contaminado tuvieron leghemoglobina, fueron sanos y con capacidad para
realizar el proceso de nitrificacin; en cambio en el guaje (Leucaena sp.) el nmero de
ndulos sanos con leghemoglobina disminuy en 34% (116 a 77 ndulos). El efecto del
petrleo en el ndulo fue drstico por el aumento de la concentracin. Los ndulos
localizados en los pelos radicales de la leguminosa zarza establecida en suelo con
50000mgkg-1 HTP (Tabla II) fueron afectados por el petrleo, ninguno tuvo el color
rojo-marrn tpico de un ndulo sano; el interior del ndulo fue color blanco, lo que
indica la ausencia de iones de hierro. Las concentraciones mayores de petrleo nuevo
(100000 y 150000mgkg-1) y de petrleo intemperizado (79457mgkg-1 HTP) originaron
daos ms severos en el ndulo. Tampoco se encontr el color rojo-marrn en el
interior del ndulo, ocurri disminucin del tamao del ndulo hasta cinco veces
respecto al tamao del ndulo en suelo sin petrleo; la diferenciacin morfolgica del
ndulo fue inhibida y todos los ndulos evidenciaron fuertes daos necrticos.
ndices relativos y absolutos de fitotoxicidad
La nodulacin fue la variable ms afectada por el petrleo en las cuatro leguminosas
tras la exposicin durante 120 y 150 das (Tabla II). Los ndices relativos de
fitotoxicidad de chipiln silvestre (Figura 3a) y de dormilona y zarza (Figura 3c) fueron
mayores en los tres suelos ms contaminados con petrleo nuevo (50000, 100000 y
150000mgkg-1 HTP), mientras que en el suelo con petrleo intemperizado
(79457mgkg-1 HTP), la nodulacin fue completamente inhibida. Estos resultados
confirman que la formacin de ndulos puede ser un indicador confiable utilizado en la

evaluacin ecotoxicolgica de suelos contaminados (Wetzel y Werner, 1995). Los

ndices absolutos de fitotoxicidad de las cuatro leguminosas (Figuras 3b y d) muestran
que el efecto del petrleo en el crecimiento y en la formacin de la biomasa vegetal es
directamente proporcional con el incremento de la concentracin de petrleo. El chipiln
silvestre fue la especie ms sensible, ya que las concentraciones de 50000mgkg -1 de
petrleo nuevo y 79457mgkg-1 de petrleo intemperizado inhibieron el crecimiento
vegetativo y consecuentemente la formacin de biomasa (Figura 3b). Las leguminosas
dormilona, guaje y zarza fueron ms tolerantes al petrleo; la inhibicin del
crecimiento y de la acumulacin de biomasa fue mayor por el efecto de la exposicin
de 150000mgkg-1 de petrleo nuevo. La inhibicin absoluta del crecimiento, de la
formacin de tejido y de la nodulacin ocurri en las cuatro leguminosas, dado que no
sobrevivieron las plantas al efecto del petrleo. La muerte de la planta no permiti el
clculo de ambos ndices y el valor calculado se reporta en laFigura 3 con el smbolo .

Conclusiones
1. El crecimiento vegetal, la biomasa, el nmero de ndulos y la formacin de
leghemoglobina dentro del ndulo fueron inhibidos por el efecto de los petrleos nuevo
e intemperizado en el suelo. Las mayores concentraciones de petrleo produjeron
mayores efectos fitotxicos.
2. La falta de nodulacin, la mnima diferenciacin morfolgica de los ndulos, la
necrosis severa de los ndulos y la ausencia de leghemoglobina fueron promovidas por
concentraciones 50000mgkg-1 de hidrocarburos totales del petrleo (HTP). Esto no
ocurri en la leguminosa guaje (Leucaena sp.), la cual, aunque disminuy
severamente, fue tolerante a 100000mgkg-1 HTP.
3. La leguminosa chipiln silvestre (Crotalaria sp.) fue la especie ms sensible a la
exposicin a concentraciones7500mgkg-1 HTP y evidenci mejor la fitotoxicidad
originada por el petrleo en el suelo, por lo que podra ser utilizada como especie
fitoindicadora de suelos contaminados con petrleo.
4. Los indicadores ms sensibles para medir el impacto toxicolgico del petrleo en el
suelo son el nmero de ndulos y la presencia o ausencia de la leghemoglobina dentro
del ndulo.
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