07/10/2016

APLICACIONES DEL
CULTIVO CELULAR EN
VIROLOGIA
TM MSc(c) Steev Loyola
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
ETM Laboratorio Clnico Virologa
2016

Conceptos asociados al cultivo celular

Palabras clave:
Un pasaje celular hace referencia a un subcultivo a partir
de un cultivo primario.
Flask, placas, botellas, etc.

Qu es un cultivo celular?

En virologa, es una plataforma viva celular

permisible a un conjunto de virus capaces
de poder infectarlas.

Las lneas celulares puedes ser

clasificadas
Pueden ser categorizados en:
1. Clulas primarias: Preparadas directamente
de un tejido animal o humano. No pueden ser
subcultivadas ms de 1 o 2 veces.
2. Clulas diploides semi-continuas: Derivados
de tejido fetal. 20 50 pasajes.
3. Clulas continuas: Derivan de clulas
tumorales humanas o animales.

Qu lneas celulares son las ms

usadas en virologa?
BHK: Fibroblasto de rion de hamster dorado bebe.
MDCK: Clulas epiteliales de rion de perro Madin-Darby.
HeLa: Epitelio tumoral de cuello uterino humano.
VERO 76, Vero E6: Clulas de rin de mono verde.
C6/36: Clulas de Aedes albopictus (larva)
LLMCK-2: Clulas de mono
Hep2: Clulas epiteliales humanas derivadas de carcinoma de

laringe
BHK-21: Clulas de rin de hamster bebe
A549: Clulas epiteliales basales de carcinoma humano

alveolar basal
K562: Linfoblastos humanos de una LMC

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Cmo aslo un virus?

Qu buscar?

Tener en cuenta el tipo de muestra, antecedentes y otros datos relevantes

para de acuerdo a ello trabajar con las medidas de contencin apropiadas

Sin embargo, no todos los virus causan EC

Ventajas del cultivo celular

Complejidad media (vs ELISA, vs Pruebas

moleculares).
Produccin de virus in vitro.
Una lnea celular puede ser permisible a ms de

un virus de la misma familia, o de diversas

familias virales.
Tcnicas muy sensibles para muestras con muy
poca carga viral
(A) Single viral RNA molecules detected by FISH, prior to replication, in a cell infected with free poliovirus particles. (B) Cartoon
diagram of spatially segregated replication organelles in a cell infected with free viral particles. (C) Single viral RNA molecules
detected by FISH, prior to replication, in a cell infected with vesicles containing a population of poliovirus particles. (D) Cartoon
diagram of spatially clustered replication organelles in a cell infected with a vesicle containing a population of poliovirus particles.

Desventajas del cultivo celular

Trabajar en un BSL-2 en adelante.
Requiere de mayor infraestructura.
Demanda tiempos prolongados de incubacin en

busca del efecto citoptico.

No siempre se observa efecto citoptico.
Si se busca ampliar la deteccin a ms virus, se

necesitan ms lneas celulares.

Revisar los cultivos de forma constante.

Caso prctico:
Usando MDCK (SIAT-1)
Son clulas de rin de perro (Madin-Daby

canine kidney).
Son usadas para hacer crecer virus de influenza.
Son clulas que fueron modificadas

genticamente para expresar altos niveles de

molculas que se unen a la HA y NA.
Su modificacin, aumenta la eficiencia de
aislamiento de FLU.

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MDCK-SIAT-1 expresa altos niveles de

NeuAc2,6Gal

Caso prctico:
Usando HuH7
Son clulas de un carcinoma hepatocelular humano.
No producen, o producen muy poco IFN tipo 1 ( y ) en

respuesta a la infeccin viral.

Muestran reducida tasa de replicacin viral comparada

con MDCK, por ejemplo.

Pero, es posible ver EC con virus de la influenza,

parainfluenza, coronavirus, rhinovirus y un gran nmero

importante de cepas de adenovirus.

La Tcnica de Shell-vial modificado

La Tcnica de Shell-vial modificado

Brinda resultados ms rpidos que los mtodos

convencionales.

37C x 1h

Esta basada en la centrifugacin de la muestra hacia la

Clulas con
medio de
mantenimiento

monocapa de clulas desnuda

Retirar medio
de
mantenimiento

Centrifugar
Fuerza centrfuga

Infectar
clulas

Agregar medio
de
mantenimiento

Shell-vial con dos o ms lneas

celulares
Sistemas de amplio espectro.
Por

ejemplo, clulas para aislar RSV y

adenovirus (Hep-2 o A549) con clulas altamente
permisibles para FLU, parainfluenza y adenovirus
(PMK o MDCK).
Incluso, estos sistemas permiten ser la base para
otros sistemas de deteccin
Inmunofluorescencia
Microneutralizacin

94% de las muestras positivas fueron detectadas en 48 horas.

El mtodo tradicional demoro 6 das en encontrar un 4% ms que el mtodo rpido

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Inmunofluorescencia
Se

remueven las clulas

adheridas
al
flask
(scrapper).
Se fijan en una lmina o en
varias.
Se pueden trabajar incluso
hasta
7
reacciones
fluorescentes en una misma
lmina.

Microneutralizacin

Desarrollado en plazas de ELISA.

Principio de PRNT

Incubacin

Inoculacin
e
Incubacin

Microneutralizacin
Combina el aislamiento viral + PRNT + ELISA.
Requiere materiales de las tres plataformas.
Optimiza los recursos en el laboratorio de Virologa.
Ahorro en el volumen de material usado.
Se mejora la sensibilidad en deteccin (cultivo)
Se mejora la especificidad en la identificacin (ELISA)

Clulas
BHK21-CL15

Trabajar muestras en duplicado (PRNT y no PRNT)

Muestras
(sin
anticuerpos
especificos)

Virus
(Antgeno)

No hay reaccin
Ag-Ac

Microneutralizacin

Principio de PRNT

Principio de aislamiento viral + ELISA

Incubacin

Inoculacin
e
Incubacin

Microneutralizacin
Clulas
BHK21-CL15

OD < Punto de corte

Lector de ELISA

Reaccin
Negativa

OD > Punto de corte

Sustrato
Anticuerpo marcado
contra Ac de ratn

Muestras
(con
anticuerpos
especificos)

Anticuerpo monoclonal contra Ac

de mono (origen: ratn)

Virus
(Antgeno)

Reaccin
Ag-Ac

Reaccin
Positiva

Anticuerpo contra el virus

mAb o pAb
(origen: mono)

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Principal desventajas de una plataforma

con dos o ms lneas celulares

Microneutralizacin
Interpretacin
OD > Punto de corte
Si el OD es menor al punto de corte:
- Puede ser el control de clulas.
- Haban Ac en la muestra del paciente
que inhibieron al virus
Si el OD es mayor al punto de corte:
- Puede ser el control positivo (slo virus)
- El paciente no tena Ac contra el virus.

Estandarizacin:
No todas las clulas tienen el mismo ratio de
crecimiento/envejecimiento.
Un mayor ratio de crecimiento puede opacar a otra
lnea celular debido al porcentaje de confluencia con el
cual se trabajan los experimentos.

Ebola pregunta:
PREGUNTAS?