Papaina

10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA
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Diseo de un proceso experimental para

la produccin de papana liofilizada
Javier Quino Favero, Nora Bernal Portilla, Juan Carlos Ycono Llanos
Ingeniera Industrial n.O 26, 2008, ISSN 1025-9929, pp. 201-229
Resumen: Se describe el diseo de un proceso tecnolgico para la obtencin de papana purificada a partir del ltex fresco del fruto verde de Carica papaya. El ltex fresco del fruto es resuspendido en buffer con agentes protectores de la actividad de la enzima cuya concentracin y condiciones de aplicacin fueron halladas de manera experimental. El extracto es centrifugado para separar la materia insoluble y la solucin clarificada es sometida a precipitacin con sulfato de amonio para obtener enzima insoluble. La enzima insolubilizada es resuspendida en agua, desalinizada en una unidad de filtracin tangencial y el agua removida por liofilizacin. El proceso permite recuperar el 80% de la protena y el 65% de
la actividad original. El producto obtenido es un polvo blanco rpidamente soluble en agua. Todas las etapas pueden ser escaladas para la produccin comercial de papana.
Palabras clave: Papana, proteasa, carica papaya
Experimental Process design for lyophilized papain production

Abstract: A process for papain (cistein papainase) extraction and purification from fresh latex obtained from unripped fruits of Carica papaya is
described. Samples of fresh collected latex were suspended in citratephosphate buffer containing reducing agents whose concentration and
application conditions were found experimentally. The extract was centrifugated and the clarified solution subjected to ammonium sulphate
precipitation. The insoluble fraction was resuspended in water, desalted
and concentrated by tangential filtration and, the remaining water removed by liophylization. The process allowed 80% recovery of the initial
protein content and 65% of the original activity, the product obtained can
be described as a white powder very soluble in water. All the steps can be
scaled-up for commercial papain production.
Keywords: Papain, protease, carica papaya.
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Quino, Bernal, Ycono
INTRODUCCIN
Las enzimas son biocatalizadores, agentes de origen biolgico que aceleran la velocidad a la cual ocurren las reacciones qumicas al disminuir los requerimientos de energa de activacin necesaria para dichas
reacciones (Cornish-Bowden, 1995). Las enzimas no se consumen en el
proceso, por lo que una molcula de enzima sigue actuando.
La catlisis enzimtica como se denomina a la accin de las enzimas es eficiente, altamente especfica, puede llevarse a cabo en condiciones relativamente suaves como temperatura ambiente y pH
neutro y permite un control muy preciso de la reaccin. Por ello, la
aplicacin de las enzimas a la industria se constituye en uno de los primeros procesos biotecnolgicos de la qumica moderna (Roberts, Turner et al., 1995).
Las enzimas han encontrado un gran nmero de aplicaciones en la
industria, una de las clases de enzimas con mayor amplitud de aplicacin son las proteasas.1 Las proteasas son enzimas que provocan la hidrlisis o digestin de otras protenas en fragmentos ms pequeos y
en ciertas condiciones pueden ser usadas para la sntesis de nuevos
compuestos de inters farmacutico (Chaiwut, Kanasawud et al.,
2007). Una de las proteasas cuyo uso se encuentra muy difundido es
la papana, en realidad una mezcla de papana y quimopapana, que
es extrada del ltex de los frutos verdes de la Carica papaya.
Las plantas de Carica papaya tienen tallo recto, de crecimiento rpido y sin ramificaciones; de siete a ocho metros de alto y con un tallo
de 20 cm de dimetro. Las hojas son suaves y se encuentran agrupadas cerca de la parte superior de la planta. Es nativa de Amrica Central y se ha distribuido en los trpicos, donde se cultiva hasta 32 grados de latitud, tanto hacia el norte como hacia el sur. En algunas zonas tropicales es prcticamente una maleza.
La papana se encuentra en el ltex y se colecta haciendo cortes sagitales en los frutos verdes, este fluye despus de hacer cortes superficiales, para coagularse en la superficie del fruto despus de algunos
minutos, en un proceso similar a lo que ocurre con las heridas (Silva,
202
Medicamentos para facilitar la digestin, manufactura de vacunas, medicacin para el

tratamiento de desplazamiento de discos intervertebrales, soluciones para limpieza de
lentes de contacto, sntesis de pptidos y medicamentos antiinflamatorios, entre otros.
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Diseo de un proceso experimental para la produccin de papana liofilizada
Garcia et al., 1997). El ltex gotea en un recipiente apropiado y es secado al sol o en horno a 55-60 grados. Los mismos frutos son cortados
nuevamente en diferentes lugares en intervalos semanales. Estos frutos son comestibles, por lo que el ltex y el fruto son utilizados. Se han
reportado rendimientos de 20 a 25 kg de papana seca por hectrea
durante el primer ao; 90 a 100 kg durante el segundo; 60 a 90 kg en
el tercero; 30 a 40 kg en el cuarto, y 20 o menos en el quinto (Morton,
1977; Duke y DuCellier, 1993).
El 2006, el Per import casi tres millones de dlares en poco ms
de 334 toneladas de diferentes tipos de enzimas (grfico 1). Por ello,
es de inters el desarrollo de mtodos de extraccin y purificacin
avanzados para producir enzimas que satisfagan la demanda interna
y que puedan a su vez encontrar un mercado externo.
Grfico 1
Importacin de enzimas en el Per en los aos 2003-2006
3.000.000
Peso neto (kg)
FOB US$
2.500.000
2.000.000
1.500.000
1.000.000
500.000
0
2003
2004
2005
2006
Fuente: Datatrade SAC.

Elaboracin propia.
La papana es obtenida del ltex del fruto verde de la Carica papaya. La Carica es un gnero que se origin en Amrica tropical y subtropical, del cual se han descrito unas 40 especies nativas desde Mxico hasta el norte de Argentina. De estas especies la Carica papaya
(papaya) es la ms diseminada en los trpicos del mundo y la fuente
principal de papana.
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En la produccin convencional de papana se realiza una serie de

incisiones a los frutos verdes de la papaya, los que empiezan a exudar
el ltex, el que es secado al sol o en hornos, previa mezcla con sulfito
de potasio para evitar la oxidacin; luego, el ltex seco ser pulverizado y vendido como papana cruda. Este proceso deteriora una cantidad importante de la enzima presente e introduce muchas impurezas.
A la fecha los principales exportadores de papana cruda son Sri
Lanka, Uganda y Tanzania (Duke, 1983).
El producto de estas exportaciones llega a pases industrializados,
como los Estados Unidos, en donde la papana cruda es sometida a
procesos de purificacin con la finalidad de aumentar su actividad, removerle impurezas, estandarizada y aplicada a procesos industriales.
La papana cruda importada a los Estados Unidos est dentro del rubro productos hortcolas miscelneos, y como puede apreciarse en la
tabla 1 el total mundial se encuentra en aumento.
Cerca del 80% de la cerveza producida en los Estados Unidos es
tratado con papana, la cual digiere los fragmentos de protena que
pueden precipitar, gracias a esta accin la cerveza se mantiene transparente cuando se enfra (Duke y DuCellier, 1993).
Los procesos destinados a la separacin de la papana del ltex, purificacin, concentracin y estabilizacin aumentan significativamente el
valor de la papana cruda y le permite ingresar a mercados y procesos
productivos ms sofisticados. La tecnologa de purificacin de papana,
an en proceso de optimizacin, le da un alto valor al producto, lo cual
demuestra su gran rentabilidad y atractivo para los inversionistas del
pas. El ltex (papana cruda) es cotizado con un valor promedio aproximado de US$35/kg, mientras que la papana purificada puede llegar
a costar US$160/100 g o ms para las preparaciones muy purificadas.
El precio del kilo de papaya pagado al productor en el ao 2002 fue de
S/.0,292 por kilogramo.2 Se estima que cada fruto produce unos 9 gramos de ltex por kilo (Monti, Basilio et al., 2000), y cada cajn de papaya comercializada podra producir 108 g de ltex.
204
Ministerio de Agricultura del Per. Cuadro 59. Precio promedio pagado al productor
(en chacra) por mes segn principales productos agrcolas y pecuarios. [en lnea] Portal Agrario. <http://www.portalagrario.gob.pe/precios/pppagprod_0212.shtml>. (Consulta: 27 de enero del 2008).
Otras
Otras
Otras
Otras
Otras
Otras
Otras
Otras
Otras
Otras
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Otras
Otras
Otras
enzimas
enzimas
enzimas
enzimas
enzimas
enzimas
enzimas
enzimas
enzimas
enzimas
enzimas
enzimas
enzimas
enzimas
3507907000
3507907000
3507907000
3507907000
3507907000
3507907000
3507907000
3507907000
3507907000
3507907000
3507907000
3507907000
3507907000
3507907000
261.463
13.176
0
0
3.828
180.762
4.155
465
51.289
518
1.347
2.161
3.105
637
2002
285.292
13.130
47
0
3.630
187.500
4.922
4.771
62.913
739
1.214
2.601
3.117
709
2003
336.087
14.334
437
107
2.471
225.125
2.799
6.995
72.747
542
1.292
3.357
5.093
786
2004
367.293
21.774
51
12
5.883
244.815
3.843
411
80.263
855
1.176
3.402
3.396
1.102
2005
Enero-diciembre
Valores en miles de dlares
418.400
28.208
50
0
5.350
277.767
4.006
2.182
89.470
641
869
3.753
5.073
1.032
2006
2007
384.941 412.546
26.072
26.457
50
50
0
0
4.978
8.406
255.148 277.300
3.732
4.133
2.176
152
82.578
85.584
554
657
846
1.012
3.406
3.243
4.536
4.322
865
1.229
2006
7,17
1,48
0,00
68,86
8,68
10,74
-93,01
3,64
18,59
19,62
-4,79
-4,72
-42,08
variacin
%
Enero-noviembre
Comparaciones
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Fuente: Foreign Agricultural Service, Departamento de Agricultura de Estados Unidos (fecha de consulta: 22 de enero del 2008).
Total mundial
Norteamrica
Caribe
Amrica Central
Amrica del Sur
Unin Europea-27
Europa (otros)
Ex Unin Sovitica
Asia este
Medio Oriente
frica subsahariana
Asia del sur
Asia del sureste
Oceana
Partidas arancelarias
rea/Pases de origen
y commodities importados
Importes de consumo
Tabla 1
Importacin a los Estados Unidos de enzimas derivadas de productos hortcolas

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205
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En nuestro pas la disponibilidad de papaya es abundante. Existen

diversas regiones, como Hunuco, Amazonas, Ucayali, donde las condiciones climatolgicas favorecen el cultivo de la papaya. La necesidad
de recoleccin del ltex propicia la demanda de mano de obra, lo que
crea ms fuentes de trabajo para la poblacin.
El empleo de la papaya para la produccin de papana favorece el
ecodesarrollo; es decir, promueve el desarrollo de las regiones, al utilizar racionalmente los recursos naturales con estilos tecnolgicos y formas de organizacin que respetan los patrones sociales y culturales.3
2. MATERIAL Y MTODOS
2.1 Obtencin de ltex de Carica papaya
Se obtuvo ltex por incisiones longitudinales realizadas a frutos verdes de papaya (vase fotografa). La extraccin se hizo entre las 9 y las
10 de la maana, en plantas de papaya ubicadas en el distrito de San
Borja, en Lima. Las incisiones se realizaron con la ayuda de una esptula plstica. El ltex que emana de las incisiones fue recolectado en
vasos de precipitado previamente lavados con mezcla sulfocrmica y
enjuagados con agua destilada y bidestilada. Las muestras recogidas
de esa manera fueron tapadas con parafilm y almacenadas en fro en
una caja trmica con hielo para su transporte al laboratorio.
2.2 Determinacin de la concentracin de protena

La determinacin del contenido de protena en el ltex se realiz por
el mtodo de Lowry (Stoschek, 1990), utilizando como patrones albmina de suero bovino (BSA Sigma) y papana liofilizada (Sigma). El
buffer alcalino consisti en 48 ml de NaOH 0.1M, conteniendo 2 por
ciento de Na2CO3, 1 ml de tartrato de sodio y potasio al 1% y 1 ml de
CuSO45H2O al 0.5%. A 100 L de muestra se le adicionaron 2000 L
de buffer alcalino y se incub por 10 minutos a temperatura ambiente. Luego se adicionaron 200 L de reactivo Folin-Ciocalteu diluido
(Sigma) 1:1, seguido de agitacin inmediata en un vrtex.
206
Organizacin de las Naciones Unidas. Glossary of Environment Statistics, Studies in

Methods. Series F, nm. 67. Nueva York, 1997.
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Incisiones en frutos de Carica papaya para obtener ltex
Se prepar una batera de estndares con concentraciones 0.2, 0.4,

0.6, 0.8 y 1.0 mg/ml de BSA o papana. Se sigui el siguiente esquema:
Tabla 2
Protocolo para cuantificar la cantidad de protena
Blanco
Agua
Muestra
Buffer alcalino
100
Muestra/estndar
100
2.000
L
L
2000
Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente

Reactivo Folin-Ciocalteau
200
200
Incubar por 30 minutos a temperatura ambiente y leer absorbancias a 600nm
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2.3 Determinacin de la actividad enzimtica

Para la determinacin de la actividad se utiliz como sustrato de reaccin una disolucin 25 mM de benzol-arginil-paranitroanilida (Bapna) (Sarath, Zeece et al., 2001), para ello se disolvi 0.1087 g de Bapna
en 10 mL de dimetilsulfxido (DMSO). Las muestras con la enzima extrada fueron resuspendidas en buffer cido 4-morfolinoetanosulfnico
(MES) 0.01 M pH 6.20, que contena cistena o 2-mercaptoetanol
50 mM como agentes reductores incubadas por 10 minutos a 25C antes de iniciar la reaccin por adicin del Bapna 25 mM. La hidrlisis
del Bapna por la accin enzimtica se monitore de manera continua
a 410 nm en un espectrofotmetro Perkin Elmer Lambda 40. Se sigui
el siguiente esquema:
Tabla 3
Protocolo para determinar la actividad enzimtica
Blanco
Muestra/estndar
Muestra
Agua
100 L
Buffer MES 0.01M pH 6.20
1900 L
Incubar por 10 minutos a 25C
Bapna 25 mM
100 L
Leer absorbancia de manera continua a 410 nm y calcular la pendiente en
100 L
1900 L
100 L
el rango lineal.
La variacin de la absorbancia con respecto al tiempo (dA/dt) permite calcular la tasa de formacin de p-nitroanilida con respecto al
tiempo y determinar las unidades (Cornish-Bowden 1995). El clculo
de pendiente en la regin de linealidad se ejecut con la aplicacin
KinLab de Perkin-Elmer.
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La unidad se defini como la cantidad de enzima que libera un micromol de p-nitroanilida por minuto a 25C a pH 6.20. Cuando la
muestra estuvo diluida se realiz la correccin apropiada segn el factor de dilucin.
2.4 Determinacin de las condiciones de extraccin

2.4.1
Evaluacin del pH de extraccin
Para la evaluacin del pH de extraccin se realiz una extraccin con

buffer citrato-fosfato a pH 3.00, 4.00, 5.00, 6.00 y 7.00. Para ello se
efectu una dilucin 1:10 de ltex fresco en buffer.
Se tomaron alcuotas y se determin la actividad en el momento de
la extraccin (0h) y a las 24 y 120 horas. Los ensayos se realizaron por
duplicado.
2.4.2
Evaluacin del tiempo de extraccin
Se realiz una dilucin 1:10 (w/w) de ltex en buffer y se le proporcion

agitacin constante mientras la temperatura se mantuvo a 5C o a
temperatura ambiente de 25C.
Se extrajo peridicamente una alcuota de la suspensin, la cual
fue centrifugada a 5.000 g durante 10 minutos en una centrfuga Heraus Sepatech Biofugue 200.
La actividad fue determinada en el sobrenadante, adicionalmente
se determin la cantidad de protena extrada.
2.4.3
Evaluacin de la concentracin del buffer y agentes

protectores de la actividad
Se ejecut un diseo factorial completo de tres factores en dos niveles

para medir los efectos e interacciones de los componentes, de acuerdo
con el siguiente esquema:
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Tabla 4
Diseo factorial para evaluar los efectos del buffer y
la concentracin de cistena y 2-mercaptoetanol
Experimento
Concentracin
molar del buffer
Concentracin
mM de cistena
Concentracin mM
de 2-mercaptoetanol
0.1
0.1
0.1
0.1
0.2
0.2
0.2
0.2
0
0
50
50
0
0
50
50
0
50
0
50
0
50
0
50
1
2
3
4
5
6
7
8
Los experimentos se efectuaron por duplicado y la determinacin

de la actividad tambin se realiz por duplicado. Se hizo un anlisis
de varianza (Anova) en la aplicacin Systat. Todos los grficos se elaboraron en el programa Sigma Plot y muestran los valores promedio
desviacin estndar.
2.4.4
Precipitacin, desalinizacin y liofilizacin de la enzima
Una vez extrada la enzima en buffer suplementado con agentes reductores (cistena o 2-mercaptoetanol) la enzima fue precipitada por
adicin de sulfato de amonio en cristales al sistema de extraccin hasta una saturacin del 45%. El producto obtenido fue concentrado por
centrifugacin durante cinco minutos a 5.000 g y resuspendido en buffer hasta lograr un volumen final de 0.1 veces el volumen inicial del
volumen inicial.
La solucin obtenida se diafiltr contra agua destilada en una unidad de filtracin tangencial minimate, con la finalidad de desalinizar
el producto obtenido. La diafiltracin se llev a cabo a un flujo de 1.5
ml por minuto. La solucin desalinizada fue precongelada a -20C y
liofilizada a -45C y 0.045 mbar de presin durante 6 horas. Se obtuvo un polvo de color blanco con bastante volumen.
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3. RESULTADOS
3.1 Ensayos para determinacin de protena
Los grficos obtenidos al medir concentraciones crecientes de protena contra la absorcin medida muestran linealidad en el rango ensayado. La pendiente de las curvas es diferente para el caso de la albmina de suero bovino (BSA) y la papana. La papana proporciona mejor linealidad en el ensayo, segn se muestra en el grfico 2:
Grfico 2
Comparacin de las curvas de calibracin con papana y
albmina de suero bovino (BSA)
Determinacin de cantidad de protena por el mtodo de
Lowry: Albmina de suero bovino versus papana
0.8
0.7
BSA
Papana
BSA Regr
Absorbancia
600nm
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
[Protena] mg/mL
1.0
1.2
3.2 Recuperacin de actividad en funcin del pH

Se logr recuperar un mayor nmero de unidades cuando el pH del
buffer de extraccin fue 3.00. Se encontr que a valores de pH ms bajos (condiciones ms cidas) la recuperacin fue mayor (grfico 3).
211
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3.3 Efectos de la concentracin del buffer

Para todos los tiempos, el buffer citrato-fosfato pH 3.0 de mayor concentracin molar produjo un ms unidades recuperadas. Un mayor
tiempo de extraccin tambin produjo mayor recuperacin (vase
grfico 4).
Grfico 3
Recuperacin de unidades de enzima a diferentes pH de extraccin
Extraccin con buffer citrato-fosfato 0.01M 0.1M pH 3, 4, 5, 6 y 7
Actividad recuperada en el ltex (U/mL)
35
Buffer 0.02M 0h
Buffer 0.1M 0h
30
25
20
15
10
5
0
4
5
6
pH del buffer de extraccin
Grfico 4
Efectos del tiempo de extraccin en la recuperacin de enzima
Actividad recuperada en el ltex (U/mL)
140
120
100
80
Cantidad de unidades recuperadas por extraccin con buffer

citrato-fosfato 0.01M y 0.1M pH 3.0 segn tiempo
de extraccin de 0, 24 y 120h
Buffer citrato-fosfato 0.02M

Buffer citrato-fosfato 0.1M
60
40
20
0
212
24
120
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3.4 Experimentos factoriales

Se aplic un anlisis de varianza (Anova) a los resultados obtenidos
del experimento factorial. Se muestran los efectos individuales de la
concentracin de buffer citrato-fosfato pH 3.0, en concentracin 0.1 y
0.2M (grfico 5), la concentracin de cistena 0 y 50mM (grfico 6) y la
concentracin de 2-mercaptoetanol 0 y 50mM (grfico 7). Los efectos
encontrados fueron significativos para las variaciones en la concentracin de buffer (p=0.004) y 2 mercaptoetanol (p=0.013), mas no para las
concentraciones ensayadas de cistena (p=0.438).
Grfico 5
Efecto de la concentracin molar
de buffer en la extraccin
de papana (p=0.004)
Grfico 6
Efecto de la concentracin
de cistena (1=0mM y 2=50mM)
de cistena en la extraccin
de papana (no significativo)
222
228
219
Actividad
201
192
205
188
183
174
165
0.1
171
0.2
Buffer
2
Cisterna
Grfico 7
Efecto de la concentracin de 2-mercaptoetanol
(3=0mM y 4=50mM) en la extraccin de papana (p=0.013)
227
Actividad
Actividad
210
207
187
167
4
ME
213
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Se encontraron efectos independientes entre la concentracin de

buffer empleado y la concentracin de cistena (grfico 8) o 2 mercaptoetanol (grfico 9).
Grfico 8
Efectos combinados de la concentracin
del buffer (0.1 y 0.2M) y cistena (0 y 50 mM)
2
232.0
213.5
213.5
Actividad
Actividad
1
232.0
195.0
195.0
176.5
176.5
158.0
158.0
0.1
0.1
0.2
0.2
Buffer
Buffer
Grfico 9
Efectos combinados de la concentracin
de buffer (0.1 y 0.2M) y 2-mercaptoetanol
4
240
220
220
Actividad
Actividad
3
240
200
180
180
160
160
0.1
0.2
Buffer
214
200
0.1
0.2
Buffer
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El grfico 10 muestra que en ausencia de 2-mercaptoetanol (3) la

adicin de cistena (1=0mM; 2= 50mM) produce un efecto negativo que
puede neutralizarse en presencia de 2 mercaptoetanol 50mM.
Grfico 10
Efectos combinados de cistena 0 y 50mM (1 y 2) y
2-mercaptoetanol 0 y 50mM (3 y 4)
4
232
207
207
Actividad
Actividad
3
232
182
157
182
157
Cistena
2
Cistena
El grfico 11 muestra los efectos combinados para los tres factores

en los cuatro niveles ensayados (Buffer Citrato-Fosfato 0.1 y 0.2M, cistena 0mM (1) y 50mM (2), 2-mercaptoetanol 0mM (3) y 50mM (4). Se
encontr una interaccin significativa entre los tres factores
(p=0.000).
Grfico 11
Efectos combinados de la concentracin de buffer 0.1 y 0.2M, cistena 0 y
50mM (1,2) y 2-mercaptoetanol 0 y 50mM (3,4)
1,4
244.0
222.2
222.2
Actividad
Actividad
1,3
244.0
200.4
178.6
156.8
200.4
178.6
156.8
135.0
135.0
0.1
0.2
Buffer
0.1
0.2
Buffer
215
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04:36
Pgina 216
2,4
244.0
222.2
222.2
Actividad
Actividad
2,3
244.0
200.4
178.6
156.8
200.4
178.6
156.8
135.0
135.0
0.1
0.2
0.1
Buffer
0.2
Buffer
3.5 Extraccin de actividad en funcin del tiempo

La curva de recuperacin de actividad y protena versus el tiempo a
baja temperatura (5C) y agitacin constante muestra un comportamiento clsico, esto es, pasado un tiempo los valores de actividad enzimtica y concentracin de protena muestran una tendencia a un
valor constante (grfico 12). Esto indica que ya no es posible lograr
una mayor extraccin de protena o una mayor recuperacin de la actividad enzimtica al aumentar los tiempos de extraccin. La extraccin
se realiz bajo agitacin constante, buffer citrato-fosfato 0.2M y pH
3.0. La relacin ltex: buffer de extraccin fue 1:10. Idntica a los experimentos de los grficos 3 y 4.
Grfico 12
Actividad recuperada frente al tiempo para ltex
de papaya mezclado con buffer bajo agitacin constante a 5 C
Buffer citrato-fosfato 0.2M; pH 3.0; 50mM 2-mercaptoetanol
216
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La extraccin a 25 muestra menores niveles de recuperacin de

actividad y prdida de la actividad en el tiempo, que se evidencia por
la disminucin del nmero de unidades recuperadas al transcurrir el
tiempo (grfico 13). Este comportamiento es marcadamente diferente
a los valores estables de actividad cuando el ensayo se realiz a 5C.
La cantidad de protena recuperada al transcurrir el tiempo es muy
similar en ambos casos (grfico 14), en consecuencia la disminucin de
la actividad obedece a la desactivacin de la enzima por la temperatura.
La extraccin con buffer citrato-fosfato 0.2M; pH 3.0; 50mM 2-mercaptoetanol y temperatura de trabajo a 5C permiti recuperar 400
U/mL de ltex en 50 minutos.
Grfico 13
Actividad recuperada durante extraccin a 5 y 25 C
Recuperacin de actividad versus tiempo de extraccin

a temperatura alta y baja
Extraccin a 25 grados Celsius
Actividad recuperada U/mL
Extraccin a 5 grados Celsius
217
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Grfico 14
Concentracin de protena extrada a 5 y 25 C
Concentracin de protena extrada en funcin del tiempo de extraccin
a temperatura ambiente y baja temperatura
La medicin de la actividad y protena recuperadas permiti calcular el valor de actividad especfica: el nmero de unidades enzimticas
recuperadas dividido entre la cantidad de protena recuperada (una
medicin de la pureza del producto). Al aumentar el tiempo de extraccin aumenta la cantidad de protena recuperada, lo mismo ocurre con
la actividad pero a un ritmo menor, es por ello que la pureza de producto recuperado disminuye (vase grfico 15). Por ello, el tiempo de
extraccin para las condiciones ensayadas se estima entre 40 y 50
minutos.
218
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Actividad especfica:
unidades proteasa/mg de protena
Grfico 15
Actividad especfica versus tiempo
3.6 Recuperacin de la enzima

El grfico muestra la recuperacin de la enzima despus de la diafiltracin (desalinizacin) y la liofilizacin del extracto obtenido con buffer citrato-fosfato 0.2M; pH 3.0; 2-mercaptoetanol 50mM.
El extracto inicial se toma como punto de partida y se le asign un
valor del 100% al valor de actividad medido ms alto. Las actividades
medidas para el diafiltrado y el liofilizado se calculan como porcentajes del mximo inicial.
Los datos muestran promedios y desviaciones estndar, cada punto
representa cuatro mediciones independientes de actividad en un
intervalo de 3 minutos. Tambin se incluye la determinacin de la
cantidad de protena recuperada.
Se logr recobrar el 80% de la protena y se retuvo el 65% de la actividad inicial. El producto obtenido es un polvo blanco muy soluble en
agua.
219
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Grfico 16
Balance de masa para el proceso de extraccin y purificacin de papana
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
% recuperado de la cantidad inicial de protena

Actividad relativa
0
Extracto obtenido
Diafiltrado
% recuperado de la cantidad inicial de protena
Actividad relativa
Actividad relativa y cantidad de protena recuperadas

segn etapa de tratamiento
Liofilizado
El grfico 17 muestra el balance de materia para el proceso diseado sobre la base de los resultados experimentales de la purificacin de
papana a partir de ltex de Carica papaya.
Clculos preliminares
a) Buffer de extraccin pH = 3:
por 100 mL
39.8 mL de cido ctrico
10.2 mL de Na2HPO4.12 H2O
39.8 mL x 19.21 g / 1000 mL
10.2 mL x 71.7 g / 1000 mL
Se agrega 2-mercaptoetanol a 50mM

50x10-3 mol/L x 0.1 L x 78.13 g/mol = 0.39065 g para 100 mL de buff.
Entonces, para preparar 100 mL de buffer se requiere:
0.7646 g de cido ctrico
0.7313 g de Na2HPO4.12 H2O
0.39065 g de 2-mercaptoetanol
Completar con agua.
220
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b) Solucin de NH4SO4 al 40%:

Se utiliza 0.243 g/mL
c) Rendimiento en la liofilizacin = 0.5 g de papana purificada / 30
mL de lquido alimentado.
Clculos realizados para el balance de materia en base a los datos
tomados el da 11 de diciembre del 2007.
Base: 8.2856 g de ltex
Buffer de extraccin
masa = 8.2856 x 90/10 = 74.57 g
= 1.009 mL
V = 73.90 mL
Lquido con papana que sale de la centrfuga 1:
masa = 75.314 g
= 1.0112 g/mL
V = 74.4798 mL
Sulfato de amonio aL 40%
masa = 74. 4798 mL x 0.243 g/mL = 18.0986 g
Masa total inicial en la etapa de precipitacin = 75.314 + 18.0986
= 93.4126 g
Masa de lquido residual que sale de la centrfuga 2 = 88.9756 g
Masa de slidos con papana que sale de centrfuga 2 = 4.4369 g
Cantidad de agua para la dilucin = 9 x 4.4369 = 39.9321 g
Lquido inicial de la liofilizacin
Masa total = 4.4369 + 39.9321 = 44.369 g
volumen total = 40 mL
Masa de papana purificada = 0.5 / 30 x 40 = 0.67g
El diagrama muestra un balance de materia expresado en kilogramos para una base de 1 kg de ltex.
El factor de escalamiento fue: 1/8.
221
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Pgina 222
Grfico 17
Balance de masa en base a los procesos experimentales desarrollados
Extraccin y purificacin de papana a partir del fruto de papaya

balance de material para una base de 1 kilo de ltex
Papaya
Recoleccin de ltex
Ltex
1,0 kg
Mezclado
P-7
Buffer de extraccin
9,0 kg
Agitacin con enfriamiento

P-21
Centrifugado
Slidos residuales
0,91 kg
Lquido con papana

Precipitacin
Sulfato de amonio al 40%
2,18 kg
Lquidos residuales
10,74 kg
Centrifugado
Slido con papana
0,54 kg
Dilucin
Agua
4,82 kg
Papana diluida
5,35 kg
4,87 L
Agua con sales residuales
Filtracin
Agua
Liofilizacin
Papana concentrada
Agua
Papana purificada liofilizada
0,08 kg
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Estimacin de costos
Determinacin de P.U
Costo (US$)
0.050
P.U
20
0.0427
0.85
0.7646
0.7313
0.39065
0.0985
0.0542
0.0724
0.101
0.85
0.041
0.053
0.039
0.084
0.218
2.180
Agitador magntico
Agitador magntico x hr
Electricidad (kwh)
21600
0.012
400
0.3
0.019
0.004
Incubadora
Incubadora x hr
Electricidad kwh
36000
1
3000
0.3
0.083
0.300
Centrfuga
Centrfuga (x hr)
Electricidad (kwh)
36000
0.065
1500
0.3
0.042
0.020
0.872
1.308
40.8
0.08
35.58
0.11
35.69
Filtracin tangencial
Bomba peristltica
Agitador magntico
Equipo
Electricidad (kwh)
43200
0.0373
1500
0.3
0.035
0.011
Liofilizacin
Congelador
Electricidad (kwh)
Liofilizador
Electricidad (kwh)
43200
0.7
43200
0.7
6000
0.3
14693
0.3
0.139
0.210
0.340
0.210
4
4
77.193
56.140
19.298
14.035
Ltex, g1
Agua bidestilada (l)
cido ctrico, g
Na2HPO4.12 H2O, g
2-mercaptoetanol, g
Agua bidestilada, l
Costo buffer de extraccin pH = 3 por 100 mL
Por kg costo buffer pH = 3
Solucin de amonio al 40%

Sulfato de amonio
Agua bidestilada
Costo solucin de amonio al 40%
Mano de obra
Investigador, h
Auxiliar, h
Cantidad
0.05
223
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04:36
Pgina 224
Costos del proceso de purificacin de papana

Mezclado y agitacin con enfriamiento
Ltex, g
Buffer de extraccin, g
Depreciacin del equipo(hr) - agitador
Electricidad (kwh) - agitador
Depreciacin del equipo(hr) - incubadora
Electricidad (kwh) - incubadora
Investigador
Auxiliar
Costo proceso 1 mezclado y agitacin
con enfriamiento ($)
Cantidad procesada
Costo unitario proceso 1 mezclado y
agitacin con enfriamiento ($)
Factor de escalamiento
Centrifugado
Costo proceso 1 mezclado y agitacin
con enfriamiento ($)
Depreciacin del equipo - centrfuga, h
Electricidad (kwh) - centrfuga, kwh
Investigador, h
Auxiliar, h
Costo proceso 2 centrifugado, US$
Slidos residuales, kg
Cantidad procesado, kg
Costo unitario proceso 2 centrifugado, US$
Costo del proceso, US$
224
Cantidad
1.000
9.00
0.83
0.83
0.67
0.67
1.0
1.0
Costo (US$)
0.05
19.62
0.02
0.25
0.06
0.20
19.30
14.04
53.52
10.000
5.352
120.69
10.00
0.50
0.50
0.50
0.50
5.35
0.04
0.02
19.30
14.04
53.52
0.02
0.01
9.65
7.02
70.22
4.00
7.72
35.69
0.02
0.00
19.30
14.04
70.22
77.80
0.00
0.00
3.86
2.81
154.69
13.726
0.04
0.020
19.30
14.04
154.69
0.00
0.00
2.89
2.11
0.91
9.090
7.725
120.69
16.70
Precipitacin
Sulfato de amonio al 40%, g
Depreciacin del equip - agitador, h
Electricidad (kwh) - agitador, Kwh
Investigador, h
Auxiliar, h
Costo proceso 3 de precipitacin
Costo unitario proceso 3 precipitacin
Costo del proceso
11.270
13.726
120.65
84.47
Centrifugado
Costo unitario proceso 3 precipitacin, US$/kg
Depreciacin del equipo (hr) - centrfuga, h
Electricidad centrfuga, Kwh
Investigador, h
Auxiliar, h
11.270
0.083
0.083
0.15
0.15
P.U
0.05
2.18
0.02
0.30
0.08
0.30
19.30
14.04
9.09
2.18
0.17
0.17
0.2
0.2
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04:36
Pgina 225
(continuacin)
Costo proceso 4 centrifugado
Slidos residuales, kg
Costo unitario proceso 4 centrifugado, US$
Dilucin
Agua de dilucin, l
Depreciacin del equipo - agitador, h
Electricidad - agitador, Kwh
Investigador, h
Auxiliar, h
Costo proceso 5 dilucin
Costo unitario proceso 5 dilucin
Costo del proceso, US
Filtracin tangencial
Costo proceso 5 dilucin
Agua de desalinizacin
Depreciacin del equipo - filtracin tangencial, h
Electricidad - filtracin tangencial
Investigador, h
Auxiliar, h
Costo proceso 6 filtracin tangencial
Costo unitario proceso 6 filtracin tangencial
Liofilizacin
Costo proceso 6 filtracin tangencial, US$
Depreciacin del equipo - precongelador, h
Electricidad - precongelado, Kwh
Depreciacin del equipo - liofilizacin, Kwh
Electricidad (kwh) - liofilizacin
Investigador, h
Auxiliar, h
Costo proceso 7 liofilizacin, US$
Papana liofilizada, kg
Costo unitario proceso 7 liofilizacin, US$
Rendimiento en la liofilizacin
Costo del proceso de liofilizacin,US$
159.69
10.74
0.54
295.73
121.71
5.01
US$
9.27
0.54
4.82
0.25
0.25
0.3
0.3
295.73
0.08
0.019
0.004
19.30
14.04
5.36
31.74
120.70
10.41
US$/kg
1.94
5.360
5.360
1.000
1.000
1.50
1.50
31.74
0.85
0.03
0.01
19.30
14.04
5.360
41.93
120.81
54.62
US$
10.19
5.360
1.00
1.00
10.00
10.00
2.00
5.00
41.93
0.139
0.210
0.340
0.210
19.30
14.04
159.69
0.41
0.00
0.00
5.79
4.21
170.10
170.10
4.58
0.03
0.01
28.95
21.05
224.73
224.73
0.14
0.21
3.40
2.10
38.60
70.18
339.35
0.08
4241.86
0.0149
120.81
114.62
US$/kg
1432.7747
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4. DISCUSIN
Para cuantificar la cantidad de protena se realiz el ensayo de Lowry.
En este tipo de determinacin se usa con frecuencia la albmina de
suero bovino (BSA) como estndar para realizar una curva de calibracin. Dado que en este tipo de mtodos colorimtricos diferentes protenas dan como resultado diferentes valores de absorbancia, es mejor
utilizar la protena de inters papana en la construccin de las
curvas de calibracin (Stoschek, 1990). El grfico 2 ilustra estas diferencias importantes en la respuesta, en especial en los lmites altos de
la determinacin.
El ltex colectado al hacer incisiones en los frutos verdes de Carica
papaya se mezcl con buffer fosfato-citrato (Stoll y Blanchard, 1990)
0.02M en una proporcin 1:10 a valores de pH, que comprendieron
desde el pH 3 hasta el pH 7. Para evaluar la actividad recuperada se
tom una alcuota de cada extracto y se llev a pH 6.20 para determinacin de la actividad (segn protocolo descrito en la tabla 3). La mxima actividad recuperada se produjo a pH 3.0 a las 0, 24 y 120 horas
de haber realizado la extraccin. El resultado se explica porque la papana se encuentra inactiva a pH 3.0 y no se produce la autolisis o autodigestin de la papana por la propia papana (Greenberg y Winnick,
1940); adicionalmente a este efecto de desactivacin reversible se suma el efecto que los iones fosfato y citrato tienen sobre la papana: favorecen la activacin aunque esta no se encuentre al pH ptimo (Kimmel y Smith, 1954). El grfico tambin indica que perodos ms largos
de extraccin brindan mayor recuperacin de la actividad.
La obtencin de enzimas a partir de extractos vegetales requiere
ambientes reductores (Gegenheimer, 1990), mxime si la enzima de
inters necesita agentes que prevengan la oxidacin (Baines y Brocklehurst, 1979; Monti, Basilio et al., 2000). Por ello, se evaluaron los
efectos de dos agentes reductores comnmente usados en la extraccin
de enzimas (Nitsawang, Hatti-Kaul et al., 2006): cistena y 2-mercaptoetanol en un diseo factorial de 2 niveles y 3 factores. El tercer factor fue la concentracin de buffer de extraccin, con una fuerza inica
superior mayor (0.1 y 0.2M) para aumentar la compatibilidad con las
concentraciones de solutos halladas en el ltex (Gegenheimer, 1990).
Se encontraron diferencias significativas que favorecieron al 2-mercaptoetanol sobre la cistena y tambin al buffer de extraccin 0.2M
sobre la concentracin 0.1M.
226
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La aplicacin de cistena, 2 mercaptoetanol o ambos es rutinaria en

la extraccin de las enzimas de clase similar a la papana (cistena
proteasas). Los resultados encontrados bajo las condiciones de extraccin utilizadas indican que la presencia de cistena tiene un efecto negativo que no es significativo en la recuperacin de la actividad.
Visto que la extraccin no se realiz con agitacin constante se repitieron las condiciones de extraccin con buffer citrato-fosfato 0.2M,
pH 3.0 y 50mM 2-mercaptoetanol y se proporcion agitacin constante a 5C.
La curva de recuperacin de actividad frente al tiempo aumenta de
manera constante y el valor de actividad se estabiliza en el tiempo, lo
mismo sucede con la cantidad medida de protena extrada. Los valores de actividad recuperada (grfico 12) son 4 veces ms altos que lo
logrado en los ensayos iniciales de extraccin. Para el caso de la extraccin a condiciones similares pero a 25C la extraccin de protena
sigue una curva similar, sin embargo, la actividad recuperada es menor y cae con el tiempo: las bajas temperaturas estabilizan la estructura de las enzimas y permiten una mejor recuperacin (Fido, Clare
Mills et al., 2004).
El extracto fue desalinizado y liofilizado para obtener un polvo de
color blanco soluble en agua.
La integracin de las diversas etapas, segn se describe en el grfico 16, permite obtener 80 g de papana a partir de 1 kg de ltex fresco. El estimado de costos indica que la produccin de 1 kg de papana
purificada tendra un costo de US$4.241,86; el gramo de papana purificada y liofilizada se encuentra en un rango que oscila entre US$10 y
US$60, dependiendo de la pureza de la preparacin y del uso que se le
dar al producto.
5. CONCLUSIONES
Se ha logrado disear un proceso de produccin de papana a partir de ltex fresco de Carica papaya. El proceso tiene cuatro etapas:
extraccin, precipitacin, desalinizacin y liofilizacin.
La extraccin de papana de ltex fresco del fruto verde de Carica
papaya requiere buffer citrato-fosfato pH 3.0, 0.2M, 50mM de
2-mercaptoetanol con relacin 1:10 (ltex:buffer) y agitacin constante a 5C.
227
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La enzima extrada se precipita con sulfato de amonio a una saturacin del 45% y se desaliniza por diafiltracin en un sistema de filtracin tangencial.
Al final de la liofilizacin se recupera el 80% de la protena total y
el 65% de la actividad original.
El producto obtenido es soluble en el agua y puede ser estandarizada su comercializacin para aplicaciones en la industria de alimentos.
El proceso descrito permite obtener 80 g de papana por kg de ltex
fresco.
La produccin de 1 kg de papana purificada y liofilizada tiene un
costo estimado de US$4.241,86.
BIBLIOGRAFA
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10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA

Diseo de un proceso experimental para

Palabras clave: Papana, proteasa, carica papaya

Experimental Process design for lyophilized papain production

Keywords: Papain, protease, carica papaya.

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Medicamentos para facilitar la digestin, manufactura de vacunas, medicacin para el

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Peso neto (kg)

Fuente: Datatrade SAC.

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En la produccin convencional de papana se realiza una serie de

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En nuestro pas la disponibilidad de papaya es abundante. Existen

2.2 Determinacin de la concentracin de protena

Organizacin de las Naciones Unidas. Glossary of Environment Statistics, Studies in

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Incisiones en frutos de Carica papaya para obtener ltex

Se prepar una batera de estndares con concentraciones 0.2, 0.4,

Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente

Incubar por 30 minutos a temperatura ambiente y leer absorbancias a 600nm

Ingeniera Industrial n.O 26, 2008

10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA

Quino, Bernal, Ycono

2.3 Determinacin de la actividad enzimtica

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Diseo de un proceso experimental para la produccin de papana liofilizada

2.4 Determinacin de las condiciones de extraccin

Evaluacin del pH de extraccin

Para la evaluacin del pH de extraccin se realiz una extraccin con

Evaluacin del tiempo de extraccin

Se realiz una dilucin 1:10 (w/w) de ltex en buffer y se le proporcion

Evaluacin de la concentracin del buffer y agentes

Se ejecut un diseo factorial completo de tres factores en dos niveles

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Los experimentos se efectuaron por duplicado y la determinacin

Precipitacin, desalinizacin y liofilizacin de la enzima

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3.2 Recuperacin de actividad en funcin del pH

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Quino, Bernal, Ycono

3.3 Efectos de la concentracin del buffer

Actividad recuperada en el ltex (U/mL)

Cantidad de unidades recuperadas por extraccin con buffer

Buffer citrato-fosfato 0.02M

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