Biossegurana em biotecnologia industrial

Parte desse material de estudo refere-se aula de Biossegurana da disciplina Biotecnologia Farmacutica
(FCF/USP). Alm disso, abordado assuntos do Captulo 13 do livro Manual de Biossegurana, 2 edio, Editora
Manole, 2012.

Introduo
Os processos biotecnolgicos vm sendo, h sculos, utilizados para produzir po, vinho,
cerveja ou alimentos com microrganismos vivos como iogurtes, queijos e embutidos. Mais
recentemente, a biotecnologia passou a ser utilizada para produo de uma grande quantidade de
outros produtos como vitaminas, antibiticos, enzimas, cidos orgnicos, exopolissacardeos,
plantas hbridas, aminocidos, anticorpos monoclonais e insulina (Lee & Ryan, 1996; Sengun &
Karabiyikli, 2011; Badel et al., 2011). Alm disso, a biotecnologia vem sendo muito estudada a fim
de enfrentar a situao de energia insustentvel e os problemas ambientais (Abatzoglou & Boivin,
2009). Os processos biotecnolgicos compreendem uma srie de etapas interligadas com uma ou
mais operao unitria. As operaes utilizadas nos processos biotecnolgicos podem ser simples,
como o preparo do meio de cultivo, ou mais complexas como a fermentao, a centrifugao e a
liofilizao. Porm, todas as etapas tm o potencial para gerar compostos que causam riscos sade
humana. Esses compostos podem ser tanto a prpria matria-prima como os microrganismos, o
produto final bruto, os subprodutos, os resduos e o produto final purificado. Os riscos de um
processo biotecnolgico podem ser reduzidos ou completamente eliminados se aplicadas as
recomendaes necessrias (Hambleton et al., 1994). Vale notar que muito comum ocorrer em
laboratrios de biotecnologia, assim como em uma planta industrial os riscos fsicos, biolgicos,
qumicos, ergonmicos e de acidente.
Para evitar a ocorrncia de acidentes na indstria biotecnolgica, alguns fatores tm de ser
levados em conta, como instrues de trabalho adequadas, superviso eficiente, cumprimento de
normas, controle de qualidade, layout e manuteno adequados, controle e tratamento de ar e

resduos, higiene pessoal, jornada de trabalho, auditorias e treinamento de pessoal (Teixeira &
Valle, 1996; McGarrity & Hoerner, 1995).
A exposio do ambiente de trabalho a microorganismos indesejveis tem incio no
laboratrio de pesquisa e continua pelo desenvolvimento, ampliao de escala e fabricao. A
biossegurana de um laboratrio de pesquisa descreve os princpios de tecnologia, prtica e
controle, que so implementados para impedir qualquer exposio a agentes patognicos e toxinas.
Alm disso, possui medidas de segurana pessoal e institucional destinadas a evitar a perda, roubo
e/ou uso indevido de organismos patognicos e toxinas. A falha em qualquer laboratrio de
biossegurana pode comprometer as operaes institucionais, alm de provocar riscos a
comunidade e o meio ambiente (Gaudioso et al., 2009). O risco exposio cresce com o aumento
da escala do processo e com a concentrao de operaes que envolvem protenas humanas ou
vetores para terapia gentica humana, sendo o principal meio de contaminao por inalao de
aerossis ou absoro pela pele (McGarrity & Hoerner, 1995). No entanto, prticas apropriadas,
equipamentos e instalaes adequadas podem reduzir os riscos significativamente. Deve-se notar
que no h forma nica e correta para atingir um nvel aceitvel de contaminao. Dependendo do
agente e do processo, uma srie de tcnicas pode ser utilizada (Fleming & Hunt, 2000).
As primeiras instalaes projetadas para cultivar microrganismos recombinantes em larga
escala so do incio da dcada de 1980 e, desde ento, tm como objetivo a produo de anticorpos
monoclonais, protenas de Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae,
Clostridium acetobutylicum e de clulas animais (Fleming & Hunt, 2000; Lee & Ryan, 1996;
McGarrity & Hoerner, 1995; Miller & Bergmann, 1993). Posteriormente, desenvolveram-se novos
tipos de instalao e, em funo disso, alguns padres e conceitos de biossegurana foram
estabelecidos por projetistas e pesquisadores e aceitos pelas indstrias (Dulley, 2007; Fleming &
Hunt, 2000; Miller & Bergmann, 1993). Esses padres tiveram sua origem nas normas estabelecidas
pelo Instituto Nacional de Sade (NIH, 1991) dos Estados Unidos e emendadas vrias vezes desde a
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primeira publicao ocorrida em 1976 (Lee & Ryan, 1996; Miller & Bergmann, 1993). Aps
algumas revises desse manual foi definida uma categoria de equipamentos que utilizavam
materiais biolgicos, denominada Boas Prticas de Ampliao de Escala (BPAE). Essa nova
categoria visava proporcionar a utilizao de novos organismos sem que se colocasse em risco o
meio ambiente (Miller & Bergmann, 1993).
Em aproximadamente 25 anos no tem revelado quaisquer riscos especficos associados com
a ampliao de escala em relao preparao comercial de produtos derivados da biotecnologia
moderna ou descarte de resduos. No entanto, as preocupaes sobre os riscos deram segurana e
regulamentao dos organismos geneticamente modificados (OGM) nos ltimos anos (Lovatt,
2002). Alm disso, para avaliar esses riscos, deve-se dispor de medidas de biossegurana baseadas
na implantao de tecnologias em todas as etapas de processo de qualquer tipo de indstria
biotecnolgica. Para isso, alm de tecnologias, preciso ter uma organizada gesto de equipe, cuja
misso impor polticas, regras e regulamentos adequados relativos ao biorisco, evitando desta
forma eventos de bioterrorismo (Knutsson et al., 2010).
Portanto, o aprimoramento de tecnologias, como BPAE, proporciona o uso seguro de novos
organismos utilizados pelas indstrias, aumentando assim, o nvel de confiana das autoridades que
regulam o processamento de biofrmacos com auxlio de recombinantes e dos procedimentos
industriais (Fleming & Hunt, 2000; Miller & Bergmann, 1993).
Este captulo descreve alguns projetos e processos bsicos da forma como eles existem em
vrias indstrias que operam com organismos recombinantes. Porm deve-se ressaltar que eles
esto sendo continuamente modificados.

NVEIS DE OPERAO
No Manual de Pesquisas Envolvendo Molculas de DNA Recombinantes do NIH (NIH
Guidelines for Research Involving Recombinant DNA Molecules) so estabelecidos, no Apndice
3

K, Seo III-B-5 (US, 1994), quatro nveis de classificao dos cultivos de organismos
geneticamente modificados em larga escala (Heinsohn et al. 2000). Esses quatro nveis so: 1. Boas
Prticas de Ampliao de Escala (BPAE); 2. Nvel de Biossegurana 1 Escala Ampliada (NS1EA); 3. Nvel de Biossegurana 2 Escala Ampliada (NS2-EA); e 4. Nvel de Biossegurana 3
Escala Ampliada (NS3-EA). O nvel mais baixo o BPAE e aumenta at o NS3-EA (Miller &
Bergmann, 1993).
Os nveis de classificao dos processos biotecnolgicos so definidos em funo do grau de
risco oferecido aos trabalhadores e ao meio ambiente. No entanto, importante ressaltar que esses
nveis de biossegurana baseiam-se nos riscos causados pelo organismo que est sendo utilizado no
processo e no pelos seus produtos (Heinsohn et al., 2000). A seguir, apresentam-se os critrios
adotados para cada nvel de classificao citado.

BOAS PRTICAS DE AMPLIAO DE ESCALA (BPAE)

Em 1986, a Organizao para Cooperao Econmica e Desenvolvimento (Organization for
Economic Co-operation and Development OECD) publicou o conceito de BPAE (Miller &
Bergman, 1993). Em julho de 1991 o INS adotou esse mesmo conceito e em 1992 ampliou-o
conforme nova publicao da OECD. Portanto, o INS recomenda a classificao BPAE para
trabalhos de pesquisa e produo em larga escala envolvendo microorganismos viveis, nopatognicos e cepas recombinantes no toxicognicas derivadas de hospedeiros que tenham uma
extensa histria de uso seguro em larga escala ou que tenham demonstrado ser de baixo risco. O
Instituto recomenda, ainda, que o termo BPAE seja aplicado aos organismos includos nos
Apndices C e K-II do Manual do INS, que tenham sido construdos para ser cultivados em larga
escala, porm com limitaes de sobrevivncia de tal forma que no causem conseqncias
adversas ao meio ambiente. Para um organismo ser considerado BPAE, ele deve apresentar as
seguintes caractersticas:
4

1. O organismo hospedeiro no pode ser patognico, deve possuir um extenso histrico de

segurana em uso industrial e no oferecer risco ao meio ambiente.
2. O vetor utilizado deve ser bem caracterizado, livre de seqncias prejudiciais, ter seu tamanho
limitado ao mximo possvel para executar apenas as funes pretendidas, ser de pouca mobilidade
e no apresentar qualquer resistncia ou comprometer controles de drogas ou de agentes causadores
de doenas em seres humanos, animais e plantas.
3. Tm de ser formulados e implementados, pela empresa ou instituio, cdigos prticos que
garantam o adequado controle de sade e segurana.
4. Tm de ser providenciadas instrues escritas e treinamento de pessoal para garantir que o
manuseio de organismos viveis com DNA recombinante sejam feitos prudentemente e o ambiente
de trabalho mantenha-se limpo e organizado.
5. Cuidar da higiene pessoal dos trabalhadores com a instalao de alguns equipamentos (pia para
lavagem de mo, chuveiro, vestirio) e roupas de proteo (uniformes, jalecos).
6. Proibir, na rea de trabalho, o consumo de alimentos e bebidas, fumo, uso de cosmticos e
pipetagem com a boca.
7. Manusear os organismos geneticamente modificados em equipamentos que garantam a segurana
pessoal.
8. O descarte de material que contm organismos recombinantes tem de ser feito de acordo com os
regulamentos previstos em lei.
9. A entrada de materiais ao sistema, a coleta de amostras, a transferncia de culturas na forma
lquida entre sistemas e o processamento de fluidos tm de ser feitos de tal forma que mantenham a
exposio dos empregados aos organismos viveis com DNA recombinante em um nvel que no
comprometa a sade e a segurana.
10. Elaborar um plano de emergncia que informe os equipamentos e as provises necessrios para
o correto manuseio de derramamentos.
5

Nvel de Biossegurana 1 Escala Ampliada (NS1-EA)

A seguir, esto as recomendaes deste nvel de biossegurana.
1. Derramamentos e acidentes que resultem em exposio pblica aos organismos que contm
molculas de DNA recombinante tm de ser imediatamente relatados ao diretor do laboratrio.
Devem ser providenciadas avaliaes mdicas e tratamentos adequados, assim como manter
registros por escrito dos fatos ocorridos.
2. Os cultivos de organismos viveis com DNA recombinante tm de ser manuseados em sistemas
fechados ou equipamentos de conteno primria projetados para reduzir o potencial de escape
desses organismos.
3. Meios de cultura lquidos no devem ser removidos de um sistema fechado ou de equipamentos
de conteno primrios sem que os organismos viveis com DNA recombinante tenham sido
inativados por um procedimento validado.
4. A coleta de amostras de sistemas fechados, a adio de materiais aos sistemas fechados e a
transferncia de meio de cultura lquido de um sistema fechado a outro tm de ser feitas de maneira
que minimizem a liberao de aerossis ou a contaminao de superfcies expostas.
5. Os gases de exausto, retirados de um sistema fechado ou de um equipamento de conteno
primria, tm de ser tratados com filtros eficientes ou por processo equivalente, como a incinerao,
para minimizar a liberao desses organismos modificados ao meio ambiente.
6. Os sistemas fechados ou outros equipamentos de conteno primria no devem ser abertos para
manuteno ou limpeza, sem que sejam esterilizados por um mtodo validado.
7. Elaborar um plano de emergncia que informe os equipamentos e as provises necessrios para o
correto manuseio de derramamentos em grandes volumes.

Nvel de Biossegurana 2 Escala Ampliada (NS2-EA)

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1. Os cultivos de organismos viveis que contm DNA recombinante tm de ser manuseados em

sistemas fechados ou equipamentos de conteno primria projetados para reduzir o potencial de
escape desses organismos.
2. Meios de cultura lquidos no devem ser removidos de um sistema fechado ou de equipamentos
de conteno primrios sem que os organismos viveis com DNA recombinante tenham sido
inativados por um procedimento validado.
3. A coleta de amostras de sistemas fechados, a adio de materiais aos sistemas fechados e a
transferncia de meio de cultura lquido de um sistema fechado a outro tm de ser feitas de maneira
que minimizem a liberao de aerossis ou a contaminao de superfcies expostas.
4. Os gases de exausto, retirados de um sistema fechado ou de um equipamento de conteno
primria, tm de ser tratados com filtros eficientes ou por processo equivalente, como a incinerao,
para minimizar a liberao desses organismos modificados ao meio ambiente.
5. Os sistemas fechados ou outros equipamentos de conteno primria no devem ser abertos para
manuteno ou limpeza, sem que sejam esterilizados por um mtodo validado.
6. A propagao e o crescimento do organismo vivel com DNA recombinante devem ser feitos em
sistema fechado com selos rotativos, ou qualquer outro acessrio mecnico, projetados para
prevenir vazamentos ou ser totalmente fechados em ambientes ventilados com sistema de exausto
e filtrao de gases.
7. O sistema fechado utilizado para propagao e crescimento de organismos viveis com molculas
de DNA recombinante e outros equipamentos de conteno primria tm de ter sensores que
monitorem a integridade do sistema durante as operaes.
8. O sistema fechado utilizado para propagao e crescimento de organismos viveis que com
molculas de DNA recombinante e outros equipamentos de conteno primria tm de ter sua
integridade testada antes do incio de qualquer operao. As informaes obtidas dos testes de
integridade tm de ser registradas e arquivadas.
7

9. O sistema fechado utilizado para propagao e crescimento de organismos viveis com

molculas de DNA recombinante e outros equipamentos de conteno primria devem estar
permanentemente identificados. Essa identificao deve ser utilizada em todos os registros dos
testes, operaes e manutenes e em todos os documentos que relatam o uso dos equipamentos
para pesquisa e produo.
10. O smbolo universal que indica Risco Qumico ou Biolgico deve ser colocado em cada sistema
fechado e equipamento de conteno primria.
11. Elaborar um plano de emergncia que informe os equipamentos e as provises necessrios para
o correto manuseio de derramamentos em grandes volumes.

Nvel de Biossegurana 3 Escala Ampliada (NS3-EA)

1. Derramamentos e acidentes que resultem em exposio pblica aos organismos que contm
molculas de DNA recombinante tm de ser imediatamente relatados Comisso de Biossegurana
para tomar as devidas providncias.
2. Os cultivos de organismos viveis com DNA recombinante tm de ser manuseados em sistemas
fechados ou equipamentos de conteno primria projetados para reduzir o potencial de escape
desses organismos.
3. Meios de cultura lquidos no devem ser removidos de um sistema fechado ou de equipamentos
de conteno primrios sem que os organismos viveis com DNA recombinante tenham sido
inativados por um procedimento validado.
4. A coleta de amostras de sistemas fechados, a adio de materiais aos sistemas fechados e a
transferncia de meio de cultura lquido de um sistema fechado a outro tm de ser feitas de maneira
que minimizem a liberao de aerossis ou a contaminao de superfcies expostas.

5. Os gases de exausto, retirados de um sistema fechado ou de um equipamento de conteno

primria, tm de ser tratados com filtros eficientes ou por processo equivalente, como a incinerao,
para minimizar a liberao desses organismos modificados ao meio ambiente.
6. Os sistemas fechados ou outros equipamentos de conteno primria no devem ser abertos para
manuteno ou limpeza, sem que sejam esterilizados por um mtodo validado.
7. Os sistemas fechados utilizados para cultivo de organismos viveis que contm DNA
recombinante tm de ser operados de tal forma que o espao acima do nvel do cultivo seja mantido
sob a menor presso possvel.
8. A propagao e o crescimento do organismo vivel com DNA recombinante devem ser feitos em
sistema fechado com selos rotativos, ou qualquer outro acessrio mecnico, projetados para
prevenir vazamentos ou ser totalmente fechados em ambientes ventilados com sistema de exausto
e filtrao de gases.
9. O sistema fechado utilizado para propagao e crescimento de organismos viveis com molculas
de DNA recombinante e outros equipamentos de conteno primria tm de ter sensores que
monitorem a integridade do sistema durante as operaes.
10. O sistema fechado utilizado para propagao e crescimento de organismos viveis com
molculas de DNA recombinante e outros equipamentos de conteno primria tm de ter sua
integridade testada antes do incio de qualquer operao. As informaes obtidas dos testes de
integridade tm de ser registradas e arquivadas.
11. O sistema fechado usado para propagao e crescimento de organismos viveis com molculas
de DNA recombinante e outros equipamentos de conteno primria devem estar permanentemente
identificados. Essa identificao deve ser utilizada em todos os registros dos testes, operaes e
manutenes e em todos os documentos que relatam o uso dos equipamentos para pesquisa e
produo.

12. O smbolo universal que indica Risco Qumico ou Biolgico deve ser colocado em cada
sistema fechado e equipamento de conteno primria.
13. Elaborar um plano de emergncia que informe os equipamentos e as provises necessrios para
o correto manuseio de derramamentos em grandes volumes.
14. Os sistemas fechados e outros equipamentos de conteno primria empregados no manuseio de
culturas de organismos viveis que contm molculas de DNA recombinante tm de estar alocados
em uma rea controlada que satisfaa s seguintes exigncias: a) ela deve conter uma entrada
separada com espao para duas portas com ar entre elas. b) as superfcies das paredes, tetos e pisos
da rea controlada devem ser de fcil limpeza e descontaminao. c) todos os equipamentos e
encanamentos de entrada na rea controlada tm de ser protegidos contra contaminao. d) os
equipamentos de lavagem de mo que sejam operados automaticamente com os ps ou cotovelos
tm de ser alocados em todas as grandes reas de trabalho e perto das sadas. e) um chuveiro deve
ser instalado prximo da rea controlada. f) a rea de controle precisa ser possuir obstculos sada
de fluidos em caso de acidentes; g) a rea de controle deve ter um sistema de ventilao capaz de
controlar o movimento do ar, que dever partir das reas de menor para as reas de maior potencial
de contaminao; h) o ar de sada da rea controlada no deve ser recirculado para outras reas nem
descarregado para a rea externa sem ser filtrado, submetido oxidao trmica ou tratado para
prevenir a liberao de organismos viveis;
15. As seguintes prticas operacionais e de pessoal tm de ser exigidas: a) a entrada de pessoal para
a rea de controle deve ser especfica para esse fim; b) as pessoas que adentram a rea controlada
precisam trocar as prprias roupas por outra vestimenta mais adequada, como jaleco, gorro, culos,
luvas e sapatos; c) na sada da rea controlada a roupa deve ser retirada, descontaminada e
encaminhada para lavagem; d) todas as pessoas que entrarem nas reas de controle no horrio de
trabalho devem ser previamente informadas das prticas operacionais, procedimentos de
emergncia e da natureza do trabalho que est sendo conduzido; e) pessoas com idade inferior a 18
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anos no devem ter autorizao para entrar na rea de controle; f) o smbolo universal de Risco
Qumico e Risco Biolgico tem de estar afixado nas portas de entrada da rea controlada e em todas
as portas internas; g) um sinal colocado na porta de entrada deve conter as informaes sobre os
agentes em uso no processo e o nome do pessoal autorizado a entrar na rea controlada; h) a rea
controlada deve estar organizada e limpa; i) proibido comer, beber, fumar e estocar alimentos na
rea controlada; j) deve-se manter um programa efetivo de controle de insetos e roedores; k) as
portas de acesso rea de controle tm de estar sempre fechadas; l) as pessoas tm de lavar as mos
ao deixar a rea de controle; m) as pessoas que trabalham na rea de controle tm de ser treinadas
para agir em casos de emergncia; n) a rea de controle deve possuir equipamentos e materiais
necessrios ao gerenciamento de acidentes que envolvam organismos geneticamente modificados;
o) aps derramamentos ou outros acidentes, a rea de controle deve ser descontaminada conforme
os procedimentos previamente estabelecidos.
Cada instituio ou empresa que trabalha com organismos geneticamente modificados, tanto
na rea de pesquisa como de produo, deve possuir uma Comisso Interna de Biossegurana
(CIBio) que revise e aprove os trabalhos a serem conduzidos com esses organismos. Ao mesmo
tempo essa comisso deve seguir as normas estabelecidas pela Comisso Tcnica Nacional de
Biossegurana (CTNBio), que regulamenta o nvel mais adequado a cada espcie recombinante
(Miller & Bergmann, 1993).
De acordo com a nova Lei de Biossegurana 11.105, de 24 de Maro de 2005, a CTNBio o
rgo responsvel em coordenar todas as atividades que envolvem OGM no pas, sendo
responsabilidade da comisso, o estabelecimento de normas de segurana e mecanismos de
fiscalizao sobre a construo, cultivo, produo, manipulao, transporte, importao e
exportao, armazenamento, pesquisa, o consumo, liberao no meio ambiente e descarte de
organismos geneticamente modificados e seus derivados (Brasil, 2005).

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De modo geral, os processos industriais empregam organismos recombinantes de baixos

nveis de risco e/ou que possuem um histrico de uso industrial classificado como BPAE. Por
exemplo, as bactrias E. coli, derivadas da cepa K-12, so muito bem caracterizadas,
completamente atenuadas, no-patognicas e aprovadas pelo FDA (Food and Drug Administration)
(McGarrity & Hoerner, 1995; Miller & Bergmann, 1993). Elas so usadas para produzir insulina e
hormnio de crescimento humano. Algumas cepas de leveduras so utilizadas para produzir
insulina humana e vacinas contra a hepatite; e clulas do ovrio de hamster chins so empregadas
na obteno de ativador de plasminognio e eritropoetina (Miller & Bergmann, 1993). As plantas
industriais que visam obteno desses produtos podem ser projetadas para operar de acordo com a
classificao BPAE, ou no mximo, NS1-EA. No entanto, a tendncia na indstria farmacutica
tem sido excessivamente conservadora quando h envolvimento de situaes de risco. Isso faz com
que muitas empresas implantem projetos indicados para processos com nveis de classificao
superiores aos que de fato sero utilizados, pois os custos adicionais so relativamente baixos
(Miller & Bergmann, 1993).
Apesar de o superdimensionamento do processo poder gerar dvidas sobre o verdadeiro grau
do risco causado pelo organismo empregado na indstria, ele apresenta a vantagem de oferecer
maior flexibilidade ao processo nos casos em que seja necessrio fazer rearranjos do layout,
implantar processos que utilizam novos organismos modificados geneticamente ou adaptar as
normas de biossegurana (Miller & Bergmann, 1993).
A primeira etapa do processo para determinar as melhores condies para alocar um projeto
e/ou processo definir seu nvel de conteno fsica. Esses nveis foram estabelecidos pelo Instituto
Nacional de Sade dos Estados Unidos descrito no Guidelines for Research Involving Recombinant
DNA Molecules (NIH, 1991). Quatro nveis de conteno foram propostos para aplicao em
trabalhos de pesquisa e processos biotecnolgicos em larga escala, como: primria, secundria,
terciria e conteno biolgica. O termo larga escala ser aplicado neste captulo para os cultivos
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que utilizam volumes superiores a dez litros (McGarrity & Hoener, 1995; Miller & Bergmann,
1993; Heinsohn et al., 2000) ou para concentrados celulares com mais de um kg (Hambleton et al.,
1994).

Conteno Primria
Conteno primria consiste na proviso de barreiras fsicas imediatas liberao de
compostos de risco e deve ser prevista no projeto de implantao do processo biotecnolgico. Um
exemplo simples de conteno primria o uso de tampas rosqueveis nos frascos e nas garrafas.
Num caso mais complexo, como o de um biorreator, a conteno primria representada pela
instalao de selos de vedao em todas as conexes e filtros nos gases de sada. Portanto, a
principal funo da conteno primria prevenir a liberao do contedo dos equipamentos e
utenslios do processo (Hambleton et al., 1994).

Conteno Secundria
A conteno secundria instalada para auxiliar no caso de falhas na conteno primria.
Ela proporciona algum tipo de reteno fsica e muitas vezes considerada uma otimizao da
conteno primria. Em funo disso, para alguns autores a conteno primria e secundria so
idnticas. Neste captulo, essa distino est sendo considerada, pois importante diferenciar o tipo
de conteno inerente aos equipamentos e utenslios dos adicionados para auxiliar suas falhas
(Hambleton et al., 1994).

Conteno Terciria
Este tipo de conteno descreve o uso de instalaes que visam prevenir a contaminao do
ambiente externo ao laboratrio ou rea de produo. Como exemplo temos a instalao de filtros

13

de ar com fluxos direcionados, tratamento de efluentes e outros procedimentos operacionais

(Hambleton et al., 1994).

Conteno Biolgica
Neste caso, os organismos so modificados geneticamente para que sobrevivam,
desenvolvam-se e transmitam suas informaes genticas, apenas em meios de crescimento bem
especficos. Essas caractersticas proporcionam um importante coadjuvante aos sistemas fsicos de
conteno, pois reduzem os riscos inerentes liberao do organismo para o meio externo
(Hambleton et al., 1994).
Sero apresentadas a seguir algumas recomendaes para uso em processos biosseguros
classificados como nvel NS2-EA (Miller & Bergmann, 1993).

Projeto Arquitetnico
A distribuio dos equipamentos em uma planta de produo feita em funo das
operaes de produo do bioproduto e pode ser dividida em: acabamento, higienizao, vesturio
, segurana, sinalizao e ventilao (Miller & Bergmann, 1993).

Acabamento
Em geral, todas as superfcies de trabalho tm de ser de fcil limpeza. As bancadas e as
superfcies dos equipamentos tm de ser impermeveis gua e resistentes aos produtos qumicos
utilizados no processo de produo. Essas exigncias levam ao amplo uso do ao inoxidvel e do
epxi em processos biotecnolgicos industriais. Quando a descontaminao ou a sanitizao feita
com hipoclorito, recomenda-se o uso do epxi em substituio ao ao inoxidvel, pois esse material
pode ser atacado quando exposto a esse reagente (Miller & Bergmann, 1993).

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A localizao dos equipamentos e do mobilirio deve permitir sua limpeza adequada.

Sugere-se que os equipamentos sejam dispostos acima do piso ou sobre plataformas mveis. De
preferncia eles no devem ficar encostados nas paredes nem em lugares muito altos. Alm disso,
todos os orifcios ou locais susceptveis ao acmulo de contaminantes precisam ser eliminados.
Quando isso no for possvel, deve-se vedar e cobrir o piso ao redor dos equipamentos como
preveno contra vazamentos e transbordamentos (Miller & Bergmann, 1993).
O piso deve ser impermevel e com uma textura que possibilite sua completa limpeza e o
trfego de pessoas quando estiver molhado. As junes entre as paredes e os pisos tm de ser
vedadas. Recomenda-se solicitar amostras dos pisos e dos materiais que revestiro as paredes, para
serem feitos testes prvios de resistncia, textura e impermeabilidade (Miller & Bergmann, 1993).
As paredes e o teto devem ter seu acabamento feito com material no poroso e resistente
umidade. Quando os equipamentos precisarem ser deslocados e, conseqentemente, danificar as
paredes, recomenda-se revesti-las com material resistente a impactos, como o PVC ou chapas de
ao inoxidvel. O teto deve ser construdo, de preferncia, de material facilmente removvel em vez
de alvenaria. Em alguns casos, isso facilitar o acesso para execuo de servios de manuteno
hidrulica ou eltrica (Miller & Bergmann, 1993).

Higienizao
Os utenslios utilizados para a higiene pessoal tm de ser de fcil acesso e adequados ao
risco de exposio ao organismo geneticamente modificado. Os trabalhadores tm de lavar as mos
com um desinfetante eficiente antes de sair da rea de trabalho biossegura. Sugere-se instalar uma
simples pia de ao inoxidvel para a lavagem das mos. Para secagem, recomenda-se a instalao
de um secador com ar quente em vez de toalhas de papel (Miller & Bergmann, 1993).

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Vesturio
aconselhvel o uso de uniformes pelo pessoal operacional da indstria biotecnolgica.
Para as reas de trabalho classificadas como NS2-EA suficiente o uso de um jaleco sobre a roupa
de uso pessoal. Porm, esses jalecos tm de permanecer restritos rea de uso e no devem ser
utilizados em reas de alimentao ou escritrios. preciso, tambm, usar culos de proteo,
protetores para sapatos e cabelos. Para facilitar a troca desses equipamentos de proteo individual
deve-se ter um vestirio prximo entrada da fbrica (Miller & Bergmann, 1993).

Segurana
O acesso linha de processamento de bioprodutos deve ser restrito a empregados do setor.
Todos os locais tm de ser bem sinalizados e as entradas precisam ser controladas com cdigos ou
cartes. Recomenda-se a instalao de paredes de vidro para facilitar a visualizao da linha de
produo por visitantes. Isso evitar a entrada de pessoas estranhas ao trabalho e proporcionar
proteo contra contaminao s pessoas e aos produtos. Aconselha-se, ainda, minimizar as
atividades de manuteno industrial na linha de produo. Para isso, deve-se instalar o mximo
possvel de acessrios e equipamentos em reas adjacentes e isoladas do processo produtivo. Isso
diminuir a exposio do pessoal de manuteno e preservar o ambiente com baixo nvel de
contaminao (Miller & Bergmann, 1993).

Sinalizao
Placas com aviso de Risco Biolgico tm de ser colocadas na parte externa da rea de
produo. Alm do smbolo universal de Risco Biolgico, as placas precisam informar o nvel de
classificao biossegura, a lista de agentes em uso, o pessoal responsvel, a vestimenta exigida e um
contato em caso de emergncia disponvel. Recomenda-se indicar o setor de segurana da empresa
para contatos de emergncia. Nesse caso, o setor de segurana funciona como um centro de
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comunicao, notificao e indicao de pessoal treinado para situaes de emergncias (Miller &
Bergmann, 1993).

Ventilao
No ambiente onde se trabalha diretamente com o organismo geneticamente modificado,
denominado de primrio, deve-se manter o sistema fechado ou utilizar cmaras biosseguras como
exigido pelas operaes em reas classificadas como NS2-EA. O sistema de ventilao e o controle
ambiental tm de funcionar apenas no ambiente denominado de secundrio, ou seja, do lado externo
ao primrio (Miller & Bergmann, 1993).
As Boas Prticas de Fabricao recomendam o uso de fluxo de ar em cascata, ou seja, da
rea de produo para fora. Mas, dependendo do grau de risco, preciso considerar um projeto de
uma rea biossegura que opere com presses negativas em relao s reas vizinhas. Isso reduz a
disseminao de organismos em caso de falhas no ambiente primrio. Sugere-se instalar uma rea
de controle do ar de entrada no ambiente biosseguro. Essa rea pode incluir o local de acesso de
pessoal e de movimentao de equipamentos (Miller & Bergmann, 1993).
As normas de biossegurana para reas classificadas como NS2-EA no exigem a instalao
de filtros para suprir ou fazer a exausto do ar. Porm, elas podem ser usadas para oferecer maior
segurana na qualidade do ar de entrada da rea de trabalho (Miller & Bergmann, 1993).

EQUIPAMENTOS
Neste captulo, as etapas de um processo biotecnolgico sero divididas em fermentao e
processos de recuperao e purificao de bioprodutos. Encontra-se, tambm, na literatura o termo
em ingls upstream processing que engloba a fermentao e as etapas anteriores a ela, como
preparo de meio de cultivo e inculo. Por outro lado, os processos de recuperao e purificao de
bioprodutos, como centrifugao, rompimento celular, extrao lquido-lquido, filtrao,
17

cromatografia e acabamento final, podem ser citados, de forma mais ampla, como downstream
processing.
Segundo Hambleton et al. (1994), a maioria dos problemas de sade j citados na literatura
est associada s etapas de recuperao e purificao de bioprodutos. Isso ocorre porque essas
etapas utilizam equipamentos que operam em alta rotao (centrfugas) ou alta presso
(homogeneizadores para rompimento celular, microfiltrao e ultrafiltrao).
Os principais perigos relacionados aos processos biotecnolgicos referem-se formao,
acidental ou no, de aerossis durante as etapas do bioprocesso. A seguir esto descritas algumas
dessas etapas e as recomendaes bsicas para a conduo de um processo biosseguro (Hambleton
et al., 1994).

Fermentao
O principal risco oferecido pela fermentao o grande volume de fluido com elevadas
concentraes de microorganismos potencialmente alergnicos. No entanto, os biorreatores so
equipamentos capazes de operar a alta presso, apesar de em geral trabalharem a baixas presses,
pois as nicas fontes de entrada de energia so as dos agitadores e aeradores. Um fermentador bem
projetado deve conter um sistema de filtrao do gs de sada para evitar que os aerossis sejam
liberados para o meio ambiente. Na prtica, o nico ponto com risco potencial em um fermentador
a vlvula para retirada de amostras. Nesses casos h, no mercado, vlvulas que previnem a liberao
de aerossis para o ambiente (Hambleton et al., 1994).
O preparo, a mistura e a dissoluo dos componentes do meio de cultivo podem gerar ps
alergnicos. Recomenda-se que essa etapa do processo seja realizada em ambiente que contenha um
eficiente sistema de exausto de gases (Hambleton et al., 1994).
O primeiro sistema de fermentao projetado para cultivar bactrias patognicas foi
construdo no incio da dcada de 1970 e seus princpios bsicos de segurana so aplicados at
18

hoje. Os cultivos foram conduzidos em regime descontnuo com volume de meio igual a 20 litros e
em regime contnuo com volume de 2,5 litros e no ofereciam risco de escape de aerossis. O
fermentador foi construdo em vidro reforado com resina de polister e possua painis indicadores
de dados, possibilitando o controle do processo. Atualmente, em geral, os fermentadores so
esterilizados in situ, utilizam vapor e gua para controle de temperatura e possuem um sofisticado
sistema de controle e monitoramento do processo (Hambleton et al., 1994).
As principais caractersticas de um sistema de fermentao biossegura em larga escala
incluem o uso de barreiras com vapor nas junes com anis de vedao, selos mecnicos nos eixos
dos agitadores, mltiplos anis de vedao, encanamento para as linhas de vapor condensado,
sistema de alvio de presso direcionado para um tanque de inativao, duplo sistema de filtrao
em srie dos gases de entrada e de sada e eliminao de junes desnecessrias. Porm, o melhor
procedimento para diminuir os riscos de contaminao a inativao dos microorganismos aps a
fermentao. Ainda assim, em alguns casos continua havendo a presena de compostos alergnicos
no meio. Obviamente, essa inativao s poder ser feita se no desnaturar o produto-alvo
(Hambleton et al., 1994).

Sistemas Fechados
Os processos fermentativos, originalmente projetados como sistemas fechados para
minimizar e prevenir contaminaes externas, so eficientes na conteno de organismos
recombinantes, pois evitam seu escape para o meio externo. Um fermentador tpico contm um
sistema de filtrao esterilizante do ar de entrada e um formato que possibilita a drenagem completa
de seu contedo ao final do processo. No se devem usar acessrios rosqueveis dentro do
biorreator, pois eles precisam ser soldados. Sadas que no so utilizadas tm de ser neutralizadas
de tal forma que no se tornem um ponto morto de armazenamento de resduos (Miller &
Bergmann, 1993).
19

Cabines de Segurana Biolgica (CSB)

As Cabines de Segurana Biolgica (CSB) pertencentes classe II so usadas para
operaes em pequena escala e contm um eficiente sistema de filtrao denominado High
Efficiency Particulate Air (HEPA). Essas cmaras protegem o operador assim como o material que
est sendo manipulado. O ar gerado na CSB, se for de boa qualidade, pode ser recirculado. No
entanto, se for txico, deve ser enviado para tratamento externo (Miller & Bergmann, 1993).

Centrifugao
A separao da biomassa de um meio de cultivo no uma operao simples, pois as clulas
so bem pequenas, capazes de formar colides estveis, coesivas, e possuem massas especficas
muito prximas do meio que as circundam. A separao de fragmentos celulares um problema
mais difcil de ser resolvido e a escolha do mtodo de separao mais adequado limitada
(Hambleton et al., 1994).
Centrifugao uma operao unitria que emprega energia sobre uma elevada
concentrao de microorganismos a fim de separ-los de uma soluo com densidade diferente. As
centrfugas de laboratrio, quando possuem rotores e tambores selados, no geram aerossis. Mas
as centrfugas que operam continuamente em processos biotecnolgicos de larga escala podem ser
fontes de riscos, sobretudo, se a remoo do material concentrado for feita manualmente. Mesmo as
centrfugas que possuem um sistema interno para remoo do material concentrado e limpeza feita
em sistema fechado (CIP - cleaning in place) podem gerar aerossis se o equipamento no for
devidamente selado e sempre revisado (Hambleton et al., 1994).
As centrfugas de cestos so relativamente baratas e j foram bastante utilizadas pela
indstria biotecnolgica. Elas so teis para processos descontnuos de pequenos volumes, mas
exigem muito trabalho porque os slidos centrifugados tm de ser removidos manualmente. Essas
20

centrfugas podem ser empregadas para separar partculas grandes como clulas floculadas (NIT,
1991). No mercado pode-se encontrar, atualmente, uma grande variedade de centrfugas, como
aquelas projetadas para separao assptica de clulas animais e as centrfugas de discos com bicos
de ejeo que operam continuamente (Hambleton et al., 1994).

Rompimento Celular
O rompimento de clulas tem por objetivo extrair produtos intracelulares, principalmente
protenas, ou remover componentes da parede celular ou da membrana. Para isso, existem os
rompimentos fsicos (choque trmico, osmtico e ultra-som), mecnicos (moinho de bolas e
homogeneizador a alta presso), qumicos (cidos, lcalis, detergentes e enzimas) e biolgicos
(vrus). A adequabilidade e o desempenho de cada mtodo dependem da escala de produo, da
biomolcula a ser isolada, do tipo de clula a ser rompida e da tcnica de rompimento disponvel.
Os mtodos mecnicos e fsicos de rompimento celular so os mais amplamente estudados,
pois no incorporam novos compostos ao meio com o bioproduto. Porm, os mtodos no fsicos,
em geral, so de simples operao uma vez que podem ser conduzidos num tanque agitado
(Hambleton et al., 1994).
O modo de ao de vrios tipos de rompedores de clulas exige a aplicao de elevadas
presses, podendo chegar a 2.700 bar. Se o fluido submetido a essa presso entrar em contato com
selos mal regulados, fatalmente haver liberao para o meio externo de aerossis com partculas
bastante reduzidas. Possivelmente esses aerossis no contm clulas viveis, mas podem conter
materiais alergnicos ou endotoxinas (Hambleton et al., 1994).

Filtrao
A filtrao um dos processos mais comumente utilizados, em todas as escalas de
processamento, para separar partculas em suspenso presentes em um lquido. Para isso utilizado
21

um meio poroso que retm as partculas, mas permite a passagem do lquido. Existe,
potencialmente, uma grande variedade de equipamentos de filtrao disponveis no mercado para a
separao inicial de clulas. No entanto, a escolha do tipo de filtro a ser empregado em um processo
biotecnolgico restrita em funo das caractersticas dos meios fermentados. A maioria das
operaes de filtrao usadas em processos biotecnolgicos de larga escala no apresenta risco
potencial de liberao de aerossis, pois so operaes que gastam pouca energia. O nico
problema na liberao de aerossis quando se usa filtro rotativo a vcuo para processos contnuos
ou filtro-prensa na separao inicial de slidos (por exemplo, separao de biomassa) por processos
descontnuos. Geralmente, os filtros-prensa so lentos e encontrados em processos biotecnolgicos
antigos, como na indstria de bebidas fermentadas e destiladas. Os filtros rotativos a vcuo podem
ser utilizados para processos contnuos de larga escala e encontrados na indstria alimentar e
farmacutica. Comparando-se, apenas, esses dois tipos de filtro, pode-se dizer que mais fcil
operar assepticamente um filtro rotativo a vcuo com um sistema de exausto individual do que um
filtro-prensa que oferece um grande risco quando se faz a remoo do material biolgico
concentrado na forma de uma espessa camada (Hambleton et al., 1994).
Os filtros que utilizam membranas podem, tambm, ser utilizados para a separao de
clulas (microfiltrao). Porm, podem ser empregados em outras etapas do processo de
recuperao e purificao de produtos, como ultrafiltrao e osmose reversa. Ultimamente, a
filtrao tangencial tem chamado a ateno dos profissionais que trabalham com processos
biosseguros, pois liberam menos aerossis e oferecem menos riscos fsicos que a centrifugao.
Esse tipo de filtrao de fcil ampliao de escala, mas possui a desvantagem de ter um elevado
custo de instalao e de operao de troca de membranas. Tradicionalmente, as membranas
utilizadas em processos biotecnolgicos so compostas de polissulfonas e acetato de celulose.

22

Recentemente, tm sido encontradas no mercado membranas inorgnicas feitas de cermica

ou metal. Esse tipo de material, por ser resistente a temperaturas e presses elevadas, tem
despertado o interesse da indstria biossegura (Hambleton et al., 1994; Pessoa-Jr. & Vitolo, 1998).
Alm das membranas, encontra-se no mercado uma grande variedade de tipos de filtro,
como os do tipo quadros e placas, tubulares e fibras ocas. Porm, as caractersticas desses filtros
no sero abordadas aqui.

Produto Final
O manuseio do produto final pode ser a etapa mais perigosa do bioprocesso, pois ele est em
sua forma mais concentrada e ativa. O produto acabado de origem biotecnolgica encontra-se,
normalmente, na forma de p e est pronto para se converter em aerossol. O manuseio e o
processamento desses ps tm de ser feitos em um local com um sistema de exausto muito bem
projetado. Caso seja necessrio, recomenda-se a utilizao temporria de equipamentos de proteo
individual at que um ambiente apropriado seja construdo. Quando possvel, prefervel que a
fabricao e a comercializao sejam na forma lquida ou, no mximo, granulada (grnulos com no
mnimo 20m de dimetro). Essa prtica reduzir a formao de aerossis e sua posterior inalao
(Hambleton et al., 1994).
Os equipamentos de processamento do produto final, que exigem mais ateno na garantia
de um ambiente biosseguro, so os spray driers e os liofilizadores, pois so os mais eficientes
geradores de aerossis (Hambleton et al., 1994).

Gases
Os gases gerados pelo sistema de exausto tm de ser tratados para evitar a liberao de
organismos viveis ao meio ambiente. Os tratamentos sugeridos so a filtrao ou incinerao,
sendo o primeiro deles mais utilizado industrialmente (Miller & Bergmann, 1993).
23

No caso da filtrao, recomenda-se o uso de membranas filtrantes hidrofbicas com poros

de dimetro igual a 0,2m. Esse sistema deve conter, ainda, um mecanismo de checagem constante
da integridade da membrana (Miller & Bergmann, 1993).
A maior dificuldade operacional com o sistema de filtrao seu entupimento causado por
excesso de umidade ou espuma. Para combater esse problema, preciso instalar um condensador e
um ciclone antes do filtro. Esses dois equipamentos e todo o encanamento devem ser esterilizveis
para evitar contaminao do contedo do fermentador (Miller & Bergmann, 1993).
Para processos que geram pouco gs, como o cultivo de clulas, o filtro pode ser instalado
prximo sada do fermentador, pois isso simplificar a esterilizao do processo (Miller &
Bergmann, 1993).

Transferncias
As transferncias incluem a adio ou a remoo de material em um sistema fechado. Nessa
definio inclui-se, tambm, a amostragem. Para evitar a exposio de material durante as
transferncias, recomenda-se utilizar tubulaes que saem do biorreator e vo diretamente para uma
garrafa receptora (Hambleton et al., 1994; Miller & Bergmann, 1993). Aps as transferncias ou
coletas de amostras, as coneces tm de ser novamente esterilizadas para evitar contaminao do
fermentador (Miller & Bergmann, 1993).

Selos Rotativos
Para prevenir a exposio a microorganismos viveis, sugere-se o uso de selos rotativos que
tm a funo de evitar vazamentos. Na prtica, instalam-se dois selos mecnicos separados entre si
por um tubo cheio de fluido, que pode ser vapor puro ou condensado. O fluido , ento,
encaminhado diretamente para o sistema de tratamento de resduo biolgico. Caso o selo se rompa,

24

o contaminante automaticamente destrudo e eliminado do sistema. Pode-se tambm instalar uma

torneira logo abaixo do selo mecnico para indicar possveis falhas (Miller & Bergmann, 1993).

Monitoramento da Integridade do Sistema

Os sistemas fechados tm de possuir um sensor capaz de monitorar a integridade dos
processos biosseguros. As cmaras biolgicas de segurana possuem, em geral, um alarme para a
indicao de falhas no sistema de exausto. Devem, tambm, conter um manmetro com registrador
para mostrar a queda de presso no sistema de filtrao HEPA. Esse tipo de controle de fluxo de ar
pode funcionar por vrios anos, desde que seja controlado o entupimento das membranas (Miller &
Bergmann, 1993).
Os fermentadores passam por testes de resistncia a altas temperaturas antes de ser operados.
Esses testes so importantes para evitar problemas durante a etapa de esterilizao (Miller &
Bergmann, 1993).

Identificao do Sistema
As Boas Prticas de Fabricao recomendam que todos os equipamentos de um processo
industrial sejam identificados. Alm disso, tm de ser feitos todos os registros de uso e manuteno.
No caso de plantas biosseguras esse cuidado fundamental (Miller & Bergmann, 1993).
As etiquetas de identificao dos equipamentos tm de ser facilmente visveis, permanentes
e informar as condies de trabalho. Etiquetas plsticas tm de ser evitadas, pois no resistem a
superfcies quentes. Cada equipamento deve possuir um livro de registro prprio ou uma base de
dados armazenada em computador que deve documentar os usos, os testes, as manutenes e as
alteraes do sistema (Miller & Bergmann, 1993).

25

Validao
As Boas Prticas de Fabricao recomendam a validao dos sistemas envolvidos na
obteno de produtos para uso em humanos. A validao de utenslios, de equipamentos e de
processos complexa e no ser abordada neste captulo. No entanto, deve-se planejar um
programa de validao durante a fase do projeto de uma planta biossegura (Miller & Bergmann,
1993).

Tratamento de Resduos
Os despejos que contm organismos recombinantes, pertencentes classe NS2-EA, tm de
ser inativados por um procedimento previamente validado, antes de liber-los do sistema fechado.
As duas tcnicas mais freqentemente usadas para a inativao dos efeitos biolgicos so inativao
trmica e qumica (Miller & Bergmann, 1993). Este item aborda, tambm, o mtodo de inativao
descontnuo e contnuo, alm de alguns detalhes de projetos que so necessrios para a operao
adequada do sistema de tratamento de resduos biolgicos (Miller & Bergmann, 1993).

Inativao Trmica
A inativao trmica a mais freqentemente utilizada pelas plantas biosseguras que
operam em larga escala. Nessa tcnica, o resduo biolgico aquecido e mantido a uma temperatura
suficiente para garantir a inativao do organismo recombinante. H na literatura um grande volume
de informaes a respeito de inativao trmica de organismos, pois esse procedimento
amplamente aplicado na indstria farmacutica e alimentar. Na prtica, os ciclos de inativao
trmica podem ser projetados como uma operao de esterilizao (Miller & Bergmann, 1993).

26

Inativao Qumica
Este tipo de inativao pode ser feito com auxlio de compostos muito eficientes como o
hipoclorito. No entanto, de uso restrito a operaes com pequenos volumes de resduos bioativos.
A principal desvantagem deste processo a adio de novos compostos qumicos ao resduo
industrial, pois podem ser corrosivos e gerar outros tipos de problema (Miller & Bergmann, 1993).

Sistemas Descontnuos
O projeto de tratamento de resduos biolgicos em sistema descontnuo pode ser feito no
prprio fermentador utilizado para obteno do produto principal, desde que ele no seja degradado
nem cause impacto negativo sobre as operaes de recuperao (Miller & Bergmann, 1993).
Os processos descontnuos so mais flexveis que os contnuos, sendo indicados para
aplicao em plantas-piloto ou em equipamentos multipropsitos. Mas os processos descontnuos
para tratamento de resduos exigem maior investimento de capital e mais espao. No sistema
descontnuo tpico de inativao trmica, o resduo biolgico drenado, por gravidade, do
equipamento localizado no piso superior para um dos dois vasos coletores. Um coletor serve para
receber o resduo at que, ao atingir um nvel predeterminado, a vlvula se fecha e o resduo passa
a ser enviado automaticamente para o segundo coletor. A inativao trmica do coletor cheio de
resduo inicia-se aps acionamento do misturador e a injeo de vapor at que se atinja a
temperatura recomendada (por exemplo, 121 oC por 30 minutos). Aps o ciclo de inativao, o
contedo do coletor resfriado, com gua industrial, at a temperatura de 60oC e encaminhado para
o processo de tratamento de resduo aquoso. Aps ser totalmente drenado, o coletor passa a
aguardar uma nova batelada de resduo para inativao (Miller & Bergmann, 1993).

27

Sistema Contnuo
A inativao biolgica por processo contnuo mais tpica nas plantas de produo com
caractersticas do resduo uniformes e previsveis. Nesse caso o biorresduo pode ser aquecido
usando um trocador de calor com tempo de residncia suficiente para garantir a esterilizao in-line.
Os processos contnuos tendem a ser menos flexveis que os descontnuos, mas requerem menor
investimento de capital e menos espao (Miller & Bergmann, 1993).

Outros Detalhes de Projeto de Inativao Biolgica

Nos projetos dos sistemas de inativao biolgica, algumas particularidades tm de ser
consideradas, de acordo com Miller & Bergmann (1993), como:
1. Capacidade adequada: no desprezar qualquer tipo de resduo e utilizar um fator de segurana
ao projeto apropriado para que a planta de produo no fique limitada.
2. Materiais apropriados: dar preferncia ao ao inoxidvel 316L para sistemas soldados. Outros
materiais menos comuns podem ser necessrios, principalmente se o processo for de inativao
qumica.
3. A instrumentao deve ser suficiente para controlar e documentar a inativao biolgica.
4. Pontos de perdas: eliminar pontos mortos nos equipamentos e no processo.
5. Controle de odor: se a indstria for localizada perto de zona residencial, deve-se providenciar
um sistema de limpeza ou de absoro dos gases de exausto.
6. Riscos qumicos: deve-se providenciar um sistema de neutralizao ou outro tipo de tratamento
dos resduos qumicos gerados.

Autoclave
Para a descontaminao de resduos slidos ou de pequenos equipamentos, necessria uma
autoclave. Esse equipamento no deve ser utilizado para outras finalidades da indstria. preciso
28

atentar para os fluxos de materiais da produo e dos resduos para evitar contaminao cruzada.
Para isso, recomenda-se o uso de autoclaves com portas duplas (Lee & Ryan, 1996). As autoclaves
tm de ser convenientemente alocadas para minimizar a distncia entre processamento e os pontos
de descontaminao (Miller & Bergmann, 1993).

Derramamentos
Os processos biolgicos requerem o desenvolvimento de um plano de ao contra
derramamentos de produto. Esse plano deve conter procedimentos de evacuao, reteno do
material derramado, descontaminao e limpeza (Miller & Bergmann, 1993).
Sugere-se alocar um kit de ao em uma rea segura adjacente s operaes com produtos
biolgicos. Tipicamente, esse kit contm equipamentos de proteo individual como botas, jalecos,
luvas e mscaras, alm de equipamentos para recuperao dos materiais derramados, como rodos,
esponjas, panos de cho e baldes. Deve-se ter, tambm, algum material para descontaminao
qumica emergencial. Um grupo de trabalhadores do local precisa ser treinado para utilizar
corretamente os componentes do kit de ao, em casos de emergncia. Se possvel, deve-se instalar
uma barreira para reteno de derramamentos ao redor dos grandes equipamentos. Essa barreira
deve ser capaz de reter o maior volume possvel de processamento do equipamento e ainda
possibilitar a adio de produtos qumicos para a inativao biolgica. A experincia prtica indica
que o volume da barreira deve ser de 1,5 a 2,0 vezes a capacidade mxima de processamento do
equipamento (Miller & Bergmann, 1993).
A drenagem do material derramado deve ser fechada e conectada com o sistema de
tratamento de resduos. Esse cuidado possibilita o envio adequado do material para inativao. Para
isso necessrio instalar um sifo com altura para evitar o retorno de aerossis formados nas reas
de tratamento de resduos. A instalao de uma vlvula de checagem na linha de drenagem
assegurar que no haja retorno de resduo biolgico para a rea de produo (Lee & Ryan, 1996)
29

INTEGRAO: PROCEDIMENTO Versus TREINAMENTO

Os processos biotecnolgicos montados para serem seguros s atingem seu objetivo se
forem operados de forma segura. Alm de preparar um processo validado, deve-se criar um
eficiente programa de treinamento de pessoal de tal forma que os procedimentos de segurana
sejam executados corretamente. Caso contrrio, o sistema estar em constante risco. Os processos
biosseguros dependem de trs aes bsicas: projeto, procedimento e treinamento. Se uma dessas
aes for mal aplicada, todo o programa de biossegurana entra em colapso (Miller & Bergmann,
1993).

BIOSSEGURANA DE BACTRIAS LTICAS

Introduo
A base da moderna biotecnologia de alimentos foi j iniciada durante a segunda metade do
sculo XIX com os primeiros desenvolvimentos fundados na microbiologia, incluindo assim, a
descrio de fermentao cido-ltica por Louis Pausteur em 1857, alm do desenvolvimento da
primeira cultura pura denominada Bacterium lactis, posteriormente conhecida como Lactococcus
lactis por Lister em 1857 (Shah, 2007). Em 1885, Escherich foi o primeiro cientista a reconhecer a
importncia de examinar as bactrias de origem fecal, e conseqentemente entender a fisiologia da
digesto, patologias e terapias relativas s doenas intestinais de origem microbiolgica. Em 1900,
dois microbiologistas, Tissier e Moro, relataram bactrias isoladas de fezes de bebs lactantes. No
entanto, muitos destas bactrias isoladas apareceram sob formas bifurcadas, as quais foram
denominadas de Bacillus bifidus (Vasiljevic & Shah, 2008). Nesse mesmo perodo Ilya
Metchnikoff, Prmio Nobel em 1908, observou que os camponeses blgaros tinham uma
expectativa de vida de 87 anos, o qual era excepcional para a poca, e alm do mais, quatro de cada
mil habitantes viveram at os 100 anos de idade. Metchnikoff percebeu que uma das grandes
30

diferenas do estilo de vida dos blgaros, em comparao com a dieta contempornea, foi um
grande consumo de leite fermentado. A partir dessa observao, foi isolada uma espcie de
lactobacilos denominada Lactobacillus bulgaricus (Metchnikoff, 2004).
O importante papel das bactrias cido-lticas (LABs) na fermentao ilustrado pelas
contribuies na acidificao da matria-prima, como exemplo do leite, produzindo cido ltico
como maior produto do metabolismo. Alm disso, algumas culturas produzem cido actico, etanol,
aromas (diacetil e acetona), bacteriocinas, exopolissacardeos e importantes enzimas (proteases),
aumentando assim, a vida-de-prateleira e segurana microbiolgica do produto fermentado,
melhorando deste modo, a textura e caractersticas sensoriais do produto (Leroy & Vuyst, 2004)
No entanto, as bactrias lticas no so somente importantes para a fermentao de
alimentos, mas tambm como probiticos, ou seja, microrganismos vivos que quando
administrados em quantidades adequadas, conferem benefcios a sade do hospedeiro (FAO/WHO,
2002).
Em decorrncia desse conceito, as indstrias de produtos lcteos foram rapidamente
revitalizadas pela introduo de produtos, no somente de alto valor nutritivo e sabor agradvel,
mas tambm de produtos que tm capacidade de exercerem efeitos positivos sade do consumidor
(Casiraghi et al., 2007). Com o objetivo de potencializar esses efeitos benficos, alguns ingredientes
no digerveis (como inulina e lactulose) denominados prebiticos, tm recebido considervel
ateno, principalmente por causa de sua habilidade em estimular a crescimento e atividade de
bactrias probiticas (Oliveira et al., 2011).
Em vista da grande quantidade de biomassa de LABs consumida a cada ano, consideraes
em relao biossegurana destas bactrias tomam grande importncia. At recentemente, a
biossegurana destes microrganismos no tem sido questionada, e relatos de efeitos prejudiciais dos
mesmos tem sido muito raros, com exceo de enterococos e streptococos patognicos. Casos de
infeces, causados por lactobacilos e bifidobactrias, so raros e representam 0.05 a 0.4% dos
31

casos de endocarditis ou bacteremia (Borriello et al., 2003), mas que causaram uma taxa de
mortalidade de 25% aproximadamente devido principalmente a ausncia de um diagnstico precoce
e tratamento adequado (Cannon et al., 2005). Muitas bactrias lticas que tm causado infeces em
humanos pertencem s espcies de Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium, mas notou-se em
Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus paracasei, Leuconostoc
pseudomesenteroides entre outros tm tambm sido associadas a infeces humanas (Franz et al.,
2003; Cannon et al., 2005).

Resistncia antibitica de LABs

Os antibiticos so importantes instrumentos utilizados pelas indstrias biotecnolgicas para
combater infeces bacterianas; no entanto, as bactrias so microrganismos altamente adaptveis e
capazes de desenvolver resistncia aos antibiticos. Recentemente, as bactrias lticas (LABs)
podem atuar como reservatrios de genes de resistncia a antibiticos, semelhantes quelas
encontradas em microrganismos patognicos. A principal ameaa, associada s bactrias lticas,
que estas podem transferir genes de resistncia s bactrias patognicas, inclusive, genes que
conferem resistncia tetraciclina, eritromicina e vancomicina foram detectados e caracterizados
em Lactococcus lactis, enterococos e, recentemente, em espcies de Lactobacillus isoladas de
carnes e produtos lcteos fermentados (Mathur & Singh, 2005).
De qualquer forma, vale enfatizar que a transferncia dos genes de resistncia antibiticos
no to simples, ou seja, depende da natureza do material gentico (plasmdeos, transposons), da
natureza e concentraes das espcies doadoras e receptoras, assim como das interaes e
condies ambientais, ou seja, a presena de um antibitico pode facilitar o crescimento de
mutantes resistentes aos compostos antimicrobianos (Marteau, 2001). Portanto, as culturas
probiticas devem ser submetidas a testes de resistncia aos antibiticos naturais, impedindo assim,
a transferncia indesejvel de resistncia a outras bactrias endgenas.
32

Em bactrias lticas, isoladas de infeces humanas, espcies de Enterococcus so

particularmente

conhecidas

por

apresentar mltiplas resistncias a

antibiticos,

como

cefalosporinas, -lactmicos, sulfonamidas, clindamicinas e aminoglicosideos e glicopeptideos, tais

como vancomicinas (Leclercq, 1997).
Recentemente, novos antibiticos, como Linezolid, oxazolidinone e daptomicina tm sido
desenvolvidos para serem usados em enterococos resistentes a vancomicina (Biedenbach et al.,
2010; Nannini et al., 2010). Obviamente, o desenvolvimento de resistncia antimicrobiana
dinmico e, portanto apenas uma questo de tempo at mutantes de Enterococcus tornam-se
resistentes a estes novos antibiticos.
Muitas espcies de Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, e Pediococcus
so resistentes a metronidazol, cefalosporinas e oxacilinas. Por outro lado, Lactobacillus e
Lactococcus so geralmente sensveis aos inibidores da sntese da parede celular, como as
penicilinas e antibiticos -lactmicos (Ammor et al., 2007; Temmerman et al., 2003). Com base
nos dados sobre a resistncia, comentados acima, geralmente recomendado que as infeces
causadas por LABs sejam tratadas por combinaes de diferentes antibiticos, aumentando assim, a
eficcia do tratamento teraputico.

Propriedades de virulncia das bactrias lticas

importante salientar que o termo virulncia entre bactrias lticas no deve ser
associado com o termo usado para os microrganismos patognicos de origem alimentar, tais como
Clostridium botulinum, Staplylococcus aureus, Listeria monocitogenes e Bacillus cereus.

No

entanto, considerveis progressos tm sido feitos nos ltimos anos no que diz respeito infeco
por enterococos (Franz & Holzapfel, 2004). Alguns autores relataram que Enterococcus spp. so
capazes de aderirem e invadirem clulas eucariticas promovendo assim, a colonizao e invaso
33

de tecidos do hospedeiro. Alm disso, esses microrganismos podem resistir aos mecanismos de
defesa proporcionando, desta forma, alteraes patolgicas diretas, atravs da produo de toxinas,
e indiretas, causando inflamaes (Eaton & Gasson, 2001; Franz et al., 2003; Franz & Holzapfel,
2004). No entanto, estudos recentes relataram que genomas de LABs foram seqenciados, e
informaes a respeito dessas potenciais virulncias podem ser identificadas por estas seqncias
genmicas (Kleerebezem et al., 2003; Pridmore et al., 2004).
importante frisar que uma srie de iniciativas tem sido recentemente lanada por vrias
organizaes em todo o mundo para resolver os problemas de biossegurana relativos a bactrias
lticas e at mesmo probiticas.

Concluses
Desde o surgimento da indstria biotecnolgica e de organismos geneticamente
manipulados, uma das maiores preocupaes da indstria biotecnolgica tem sido a biossegurana.
Porm, a maior parte da ateno tem sido direcionada para os organismos, e no para os processos,
uma vez que h disponveis diversos manuais com normas para manipulao segura e conteno de
organismos geneticamente modificados. A fermentao , em geral, apenas uma das etapas do
processo biotecnolgico. Como ela no opera sob elevadas presses, rotaes e temperaturas, uma
anlise criteriosa de seu projeto de construo e de instalao ir evitar problemas futuros com a
biossegurana na indstria. No entanto, o mesmo no pode ser dito das operaes envolvidas no
processo de recuperao e purificao de bioprodutos. Por isso, os cuidados com a seleo,
aquisio, instalao, operao e controle dos equipamentos envolvidos nessa etapa do processo e
treinamentos de prticas biolgicas biosseguras tm de ser redobrados. Portanto, fundamental
formular normas e padres rigorosos de trabalho para que desta forma, sejam evitados eventos de
bioterrorismo.

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Referncias Bibliogrficas

1. ABATZOGLOU, N. & BOIVIN, S. A review of biogas purification processes. In:

Biofuels, Bioproducts and Biorefining. v.3, pp.42-71, 2009.
2. AMMOR, M.S.; FLOREZ, A.B.; MAYO, B. Antibiotic resistance in non-enterococcal
lactic acid bacteria and bifido-bacteria. In: Food Microbiology. v. 24, 559-570, 2007.
3. BADEL, S.; BERNARDI, T.; MICHAUD, P. New perspectives for Lactobacilli
exopolysaccharides. In: Biotechnology Advances, v. 29, pp. 54-66, 2011.
4. BIEDENBACH, D.J.; FARRELL, D.J.; MENDES, R.E.; ROSS, J.E.; JONES, R.N.
Stability of linezolid activity in an era of mobile oxazolidinone resistance determinants:
results from the 2009 Zyvox Annual Appraisal of Potency and Spectrum program. In:
Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. v.68, 459-467, 2010.
5. BORRIELLO,

S.P.;

HAMMES,

W.P.;

HOLZAPFEL,

W.;

MARTEAU,

P.;

SCHREZENMEIER, J.; VAARA, M.; VALTONEN, V. Safety of probiotics that contain

Lactobacilli or Bifidobacteria. In: Clinical Infectious Diseases. 36, 775-780, 2003.
6. BRAINS, W. Biotechnology from A to Z. Oxford: Oxford University Press, 1994.
7. BRASIL. Lei de Biossegurana 11.105, de 24 de Maro de 2005. Regulamenta os incisos II,
IV e V do1 do art. 225da Constituiao Federal, estabelece normas de segurana e
mecanismos de fiscalizao de atividades que envolvam organismos geneticamente
modificados OGM e seus derivados, cria o conselho nacional de Biossegurana CNBS,
reestrutura a comisso Tcnica Nacional de Biossegurana CTNBio. Dirio Oficial da
Republica Federativa do Brasil, Brasilia, 24/03/05, 2005.
8. CANNON, J.P.; LEE, T.A.; BOLANOS, J.T.; DANZIGER, L.H. Pathogenic relevance of
Lactobacillus: A retrospective review of over 200 cases. In: European Journal of Clinical
Microbiology & Infectious Diseases. v.24, 31-40, 2005.
35

9. CASIRAGHI, M.C.; CANZI, E.; ZANCHI, R.; DONATI, E.; VILLA, L. Effects of a
synbiotic milk product on human intestinal ecosystem. In: Journal of Applied Microbiology
v.103, 499506, 2007.
10. DULLEY, R.D. Biossegurana: Muito alm da biotecnologia. In: Revista de Economia
Agrcola, v.54, n. 2, pp. 27-41, 2007.
11. EATON, T.J.; GASSON, M.J. Molecular screening of Enterococcus virulence
determinants and potential for genetic exchange between food and medical isolates. In:
Applied and Environmental Microbiology. v.67, 1628-1635, 2001.
12. FAO/WHO, Guidelines for the evaluation of probiotics in food, Joint FAO/WHO working
group report on drafting guidelines for the evaluation of probiotics in food, London, ON,
Canada, April 30th and May 1st, 2002.
13. FLEMING, D.O. & HUNT, D.L. Biological safety: principles and practices. 3 rd ed.,
Washington, ASM Press, 2000.
14. FRANZ, C.M.A.P.; STILES, M.E.; SCHLEIFER, K.H.; HOLZAPFEL, W.H. Enterococci
in foods A Conundrum for food safety. In: International Journal of Food Microbiology.
v.88, 105-122, 2003.
15. FRANZ, C.M.A.P.; & HOLZAPFEL, W.H. The genus Enterococcus: Biotechnological and
safety issues. In The Lactic Acid Bacteria: Microbiology and Functional Aspects, 3rd ed. Ed.
S. Salminen, A. von Wright, and A. Ouwehand, 199-247. New York: Marcel Dekker, 2004.
16. GAUDIOSO, J.; GRIBBLE, L. A.; SALERNO, R. M. Biosecurity: Progress and
Challenges. In: Journal of the Association for Laboratory Automation. v.14, pp. 141-47,
2009.
17. HAMBLETON, P.; MELLING, J.; SALUSBURY. Biosafety in industrial biotechnology.
Londres: Chapman & Hall, 1994.

36

18. HEINSOHN, P. A.; JACOBS, R. R.; CONCOBY, B. A. Biosafety reference manual.

Fairfax, AIHA Publications, 2000.
19. KLEEREBEZEM, M.; BOEKHORST, J.; VAN KRANENBURG, R. MOLENAAR, D.;
KUIPERS, O.P.; LEER, R.; TARCHINI, R.; PETERS, S.A.; SANDBRINK, H.M.; FIERS,
M.W.E.J.; STEKEMA, W.; KLEIN LANKHORST, R.M.; BRON, P.A.; HOFFER, S.M.;
NIEROP GROOT, M.N.; KERKHOVEN, R.; DE VRIES, M.; URSING, B.; DE VOS,
W.M.; SIEZEN, R.J. Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS 1.
In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.
v.100, 1990-1995, 2003.
20. KNUTSSON, R.; VAN ROTTERDAM, B.; FACH, P.; DE MEDICI, D.; FRICKER, M.;
LFSTRM, C.; GREN, J.; SEGERMAN, B.; ANDERSSON, G.; WIELINGA, P.;
FENICIA, L.; SKIBY, J.; SCHULTZ, A.C.; EHLING-SCHULZ, M. Accidental and
deliberate microbiological contamination in the feed and food Chains - How biotraceability
may improve the response to bioterrorism. In: International Journal of Food Microbiology,
2010. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2010.10.011.
21. LECLERCQ, R. Enterococci acquire new kinds of resistance. In: Clinical Infectious
Diseases. v.24, S80-S84, 1997.
22. LEE, S. B. & RYAN, L. J. Occupational health and safety in the biotechnology industry a
survey of practicing professionals. In: American Industrial Hygiene Association Journal.
v.57, pp.381-6, 1996.
23. LEROY, F.; & DE VUYST, L. Lactic acid bactria as functional starter cultures for the
food fermentation industry. In: Trends in Food Science & Technology. v.15, 67-78, 2004.
24. LOVATT, A. Applications of quantitative PCR in the biosafety and genetic stability
assessment of biotechnology products. In: Reviews in Molecular Biotechnology, v.82, pp.
279-300, 2002.
37

25. MARTEAU, P. Safety aspect of probiotic products. In: Scandinavian Journal of

Nutrition. 45, 2224, 2001.
26. MATHUR, S.; & SINGH, R. Antibiotic resistance in food lactic acid bacteria - a review.
In: International Journal of Food Microbiology. v. 105, pp.281-295, 2005.
27. McGARRITY, G. J. & HOERNER, C. L. Biological safety in the biotechnology
industries. In: Fleming, D. O.; Richardson, J. H.; Tulis, J. J.; Vesley, D. Laboratory safety.
Principles and practices. Washington, ASM Press, 1995.
28. Metchnikoff, I. I. The prolongation of life: Optimistic studies (reprinted edition 1907).
New York, NY, USA: Springer, 2004.
29. MILLER, S. R. & BERGMANN, D. Biocontainment design considerations for
biopharmaceutical facilities. In: Journal of Industrial Microbiology, v. 11, pp.223-34, 1993.
30. NANNINI, E.; MURRAY, B.E.; ARIAS, C.A. Resistance or decreased susceptibility to
glycopeptides, daptomycin, and linezolid in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.
In: Current Opinion in Pharmacology. v. 10, pp. 516-521, 2010.
31. NATIONAL INSTITUTE OF HEALTH (NIH). Recombinant DNA Research: Actions
Under the Guidelines; Notice. Federal Register Part III, vol. 56, no 138, pp. 33174-183.
Julho de 1991.
32. OLIVEIRA, R.P.S.; FLORENCE, A.C.R.; PEREGO, P.; OLIVEIRA, M.N.; CONVERTI.
A. Use of lactulose as prebiotic and its influence on the growth, acidification profile and
viable counts of different probiotics in fermented skim milk. In: International Journal of
Food Microbiology. v.145, pp. 2227, 2011.
33. Organization for Economic Co-operation and Development: Recombinant RNA Safety
Considerations. Paris: Organization for Economic Co-Operation and Development, 1986.
34. PESSOA-Jr., A. & VITOLO, M. Evaluation of cross-flow microfiltration membranes using
rotary disc-filter. In: Process biochemistry, v. 33, no 1, pp.39-45, 1998.
38

35. Pridmore, D.R.; Berger, B.; Desiere, F.; Vilanova, D.; Barretto, C.; Pittet, A.C.; Zwahlen,
M.C.; Rouvet, M.; Altermann, E.; Barrangou, R.; Mollet, B.; Mercenier, A.; Klaenhammer,
T.; Arigoni, F.; Schell, M.A. (2004). The genome sequence of the probiotic intestinal
bacterium Lactobacillus johnsonii NCC 533. Microbiology 101, 2512-2517.
36. SENGUN, I. Y. & KARABIYIKLI, S. Importance of acetic acid bacteria in food industry.
In: Food Control, v. 22, pp.647-56, 2011.
37. SHAH, N.P. Functional cultures and health benefits. In: International Dairy Journal. v.17,
12621277, 2007.
38. TEIXEIRA, P & VALLE, S. Biossegurana. Uma abordagem multidisciplinar. Rio de
Janeiro: Fiocruz, 1996.
39. TEMMERMAN, R.; POT, B.; HUYS, G.; SWINGS, J. Indentification and antibiotic
susceptibility of bacterial isolates from probiotic products. In: International Journal of Food
Microbiology. v.81, 1-10, 2003.
40. VASILJEVIC, T.; & SHAH, N.P. Probiotics - From Metchnikoff to bioactives. In:
International Dairy Journal. v.18, 714 728, 2008.
41. WORLD HEALTH ORGANIZATION, Laboratory Biosafety Manual, 3rd ed, Geneva,
2004.

39