Validacion Metodos Analiticos

M.Sc.
JUAN JOSE QUISPE VARGAS
05/11/2012
Es el establecimiento de la evidencia
documental de que un procedimiento
analtico conducir, con un alto grado
de seguridad, a la obtencin de
resultados precisos y exactos dentro de
las especificaciones y atributos de
calidad previamente establecidos.
M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS
05/11/2012
Demostrar que los mtodos son

adecuados a los anlisis propuestos en
las condiciones descritas.
La validacin es la herramienta que
permite
obtener
las
pruebas
documentales al respecto.
Trabajar con mtodos que ofrezcan
confianza y seguridad,
minimiza el
nmero de fallas y repeticiones.
05/11/2012
Conocimiento del mtodo analtico.

Cumplir con las exigencias legales
(registros, BPL), con el fin de asegurar la
calidad y eficacia del producto.
La validacin es un requisito previo de
los procesos de transferencia de
mtodos analticos.
05/11/2012
Ensayos de identificacin.
Ensayos para determinar el analito en
materia prima o en FF.
Ensayos para determinar caractersticas
farmacotcnicas (disolucin).
Ensayos de lmite de impurezas y
cuantificacin de las mismas.
Ensayos microbiolgicos.
05/11/2012
BPL.
Personal.
Instalaciones.
Equipos,
Instrumentos,
Materiales.
Productos de Referencia.
Documentacin,
etc.
Auto inspeccin.
Reactivos
procedimientos
05/11/2012
escritos,
Los mtodos de farmacopeas se

consideran oficiales.
Mtodos de Anlisis para Materias
Primas.
Se consideran vlidos. No es necesario

realizar ninguna revalidacin a la hora de
poner el mtodo en marcha en cualquier
laboratorio.
Estos mtodos han sido sometidos a ensayos
inter-laboratorio para confirmar su buen
funcionamiento.
05/11/2012
Mtodos de Anlisis para FF.

FF de composiciones diferentes a nivel
cualitativo (excipientes) y/o cuantitativo.
El mtodo se considera parcialmente
validado (con el consiguiente ahorro de
costes en el desarrollo del mtodo).
Se evala que parmetros son necesarios
validar (de acuerdo al mtodo), siendo la
exactitud y la selectividad los parmetros
ms frecuentemente afectados.
05/11/2012
Mtodos desarrollados por el laboratorio,

usados por algn tiempo, deben sufrir un
proceso de validacin.
Para validar de manera satisfactoria y sin el
uso de recursos innecesarios, es necesario
contar con mtodos lo suficientemente
robustos.
Para lo cual todo mtodo analtico no
oficial debe seguir una secuencia lgica
de fases en su desarrollo, que oriente a una
validacin exitosa.
05/11/2012
La secuencia ptima de experimentos para

el desarrollo de un mtodo, depende del
mtodo en si mismo.
El desarrollo lgico de un mtodo analtico
transcurre
con
las
siguientes
fases
secunciales:
1. Definicin
de
las
caractersticas
de
practicabilidad.
2. Estudios de robustez y estabilidad de la
muestra preparada para anlisis.
3. Puesta a punto (aptitud del sistema).
4. Caractersticas de fiabilidad.
05/11/2012
10
Se debe evaluar:
Precisin exigible.
Sensibilidad deseable.
Grado de selectividad.
Tiempo y costo.
Tamao de la muestra.
Calificacin del personal.
Tipos de equipos y/o instrumentos.
Condiciones de seguridad, etc.
05/11/2012
11
La estabilidad de la muestra preparada

para anlisis se evala durante la fase
de desarrollo del mtodo junto con la
robustez.
La estabilidad se evala de acuerdo al
tiempo requerido para su anlisis.
Si la estabilidad de la muestra afecta al
resultado en el periodo de tiempo
evaluado, se hace constar en el mtodo
de anlisis.
05/11/2012
12
Ensayos
que
garantizan
el
buen
funcionamiento del sistema en el momento de
anlisis.
El estudio de robustez se utiliza para optimizar y
evaluar la criticidad de los parmetros del
mtodo antes de validarlo.
A partir de este estudio se define la aptitud del
sistema.
La comprobacin de la aptitud del sistema
forma parte integral del mtodo y debe
realizarse cada da al inicio del anlisis para
comprobar el correcto funcionamiento del
sistema.
05/11/2012
13
La validacin en s es una fase ms del

desarrollo del mtodo analtico.
Est ltima etapa permite conocer las
caractersticas de fiabilidad del mtodo
para su aplicacin rutinaria.
Demuestran
la capacidad de un
mtodo analtico para mantener los
criterios de validacin a lo largo del
tiempo.
05/11/2012
14
Parmetros
Identificacin
Impurezas
Cuantitativo
Prueba lmite
Valoracin
disolucin
Exactitud
No
Si
No
Si
Precisin
No
Si
No
Si
Repetibilidad
No
Si*
No
Si
Precisin
intermedia
No
Si
No
Si*
Si
Si
Si
Si
Linealidad y rango
No
Si
No
Si
LD
No
No
Si
No
LC
No
Si
No
No
Robustez
No
Si
No
No*
Selectividad
05/11/2012
15
Verificacin documentada de que un

mtodo
analtico
(previamente
validado) contina siendo fiable en el
tiempo o tras realizar modificaciones al
mtodo original.
Causas de revalidacin.
Paso del tiempo.

Cambio en la muestra.
Cambio de instrumento y materiales.
Cambio de laboratorio.
05/11/2012
16
05/11/2012
17
La robustez, de un mtodo analtico, es

la medida de su capacidad para
permanecer inalterado ante pequeas
pero deliberadas variaciones en ciertos
parmetros, proporcionando idea de su
fiabilidad o estabilidad durante su
empleo de rutina.
05/11/2012
18
No debe confundirse con el trmino

Ruggedness, que es el grado de
reproducibilidad de los resultados en el
anlisis de las mismas muestras bajo una
variedad de condiciones tales como:
Diferentes laboratorios, diferentes analistas,
diferentes instrumentos, lotes de reactivos,
das, tiempos, diferentes temperaturas, etc.
05/11/2012
19
Permite conocer la estabilidad del mtodo

ante
pequeas
modificaciones
y
su
independencia frente a stas.
Permite conocer las condiciones de trabajo
ptimas en cada paso del procedimiento de
anlisis.
La robustez no se considera como un
parmetro de validacin, sino como el estudio
que permite conocer:
Las condiciones ptimas de trabajo para las

diferentes variables estudiadas.
Las variables crticas que han de ser controladas.
05/11/2012
20
Todos los mtodos sea cual sea la

tcnica empleada, son susceptibles de
ser sometidos a un estudio de robustez.
Algunos
pueden
tener
muchos
parmetros sobre los que actuar y otros
menos.
La primera etapa es analizar todo el
mtodo y definir que factores son los
que influyen en el resultado final.
05/11/2012
21
Normalmente se usan dos tipos de diseos

factoriales:
Diseos factoriales completos y fraccionados.
Diseos de Plackett Burman y Youden
Steiner.
Por razones de interpretacin estadstica,

es conveniente que el nmero de factores
a evaluar sea como mnimo de tres y de
ocho el nmero mnimo de experimentos.
05/11/2012
22
El diseo Youden Steiner es el mtodo

clsico para estudiar la robustez.
Permite
estudiar
el
efecto
de
la
modificacin de 7 factores descritos en el
mtodo mediante 8 experimentos.
Los valores nominales para cada factor en
el mtodo corresponden a las letras
maysculas (A, B, C, etc.).
Los valores alternativos estn indicados por
letras minsculas (a, b, c, etc.).
05/11/2012
23
1.
2.
3.
4.
Determinar los factores (deben ser 7) a ser

estudiadas.
Si el nmero de variables es inferior a 7, a
los factores que quedan sin variable se las
debe asignar una operacin sin influencia
analtica (dummy).
Registrar las variables y sus valores
(nominal y alternativo).
Realizar los 8 experimentos segn la matriz
de factores especificada.
05/11/2012
24
Para la determinacin de la robustez de un

mtodo analtico por HPLC, se estudiaron las
siguientes variables del mtodo.
Factor
Valor
Nominal
Factor
Valor
Alternativo
Flujo
1 ml/min
1.5 ml/min
Temperatura
40 C
25 C
Precolumna
Tipo de columna
pH
7.6
7.4
[c] de la fase mvil
70/30
65/35
Tiempo antes de la
inyeccin
1 hora
12 horas
Variable
05/11/2012
25
Exp
Factores
Resultados
A/a
B/b
C/c
D/d
E/e
F/f
G/g
s=
t=
u=
v=
w=
x=
y=
z=
05/11/2012
26
Exp
Factores
Eficiencia (N)
A/a
B/b
C/c
D/d
E/e
F/f
G/g
s=
6540
t=
6250
u=
4789
v=
4890
w=
4985
x=
5010
y=
6589
z=
6160
05/11/2012
27
Para cada factor se calcula la diferencia de

medias (V) en forma individual segn:
F a c t o r o V a r ia b le
A a
B b
C c
D d
E e
F f
G - g
D if e r e n c ia
t u v w x y z
A
4
4
s t w x u v y z
VB
4
4
s u w y t v x z
VC
4
4
s t y z u v w x
VD
4
4
s u x z t v w y
VE
4
4
s v w z t u x y
VF
4
4
s v x y t u w z
VG
4
4
V
05/11/2012
28
Resultados:
VA =
VB =
VC =
VD =
VE =
VF =
VG =
05/11/2012
29
Resultados:
VA =
68.75
VB =
89.25
VC =
148.25
VD =
1466.25
VE =
53.75
VF =
15.75
VG =
211.25
05/11/2012
30
Para decidir si un parmetro tiene

influencia significativa sobre el resultado,
es necesario conocer la variabilidad
(repetibilidad) normal de la respuesta
(N).
SI : V A s 2
Existe
diferencia
significativa
estadsticamente
05/11/2012
31
Supongamos que la repetibilidad es de

95.8, determinar si alguna variable
influye significativamente.
05/11/2012
32
Se realizo un estudio de robustez de un

mtodo analtico tomando en cuenta
las siguientes variables.
Variable
Nivel
Cdigo
Nombre
(-)
(+)
Analista
Filtracin
Con filtracin
Sin filtracin
Tiempo de anlisis
Despus de 10 minutos
Despus de 60 minutos
Blanco
Blanco correspondiente
Agua destilada
05/11/2012
33
Se usa un diseo estadstico experimental factorial

fraccionado 24-1 = 8, solo nos interesa los efectos
principales, la matriz del diseo experimental es:
Valores Codificados
A
B
C
D
Con filtracin
10 minutos
Correspondiente
Con filtracin
10 minutos
Agua (d)
Sin filtracin
10 minutos
Agua (d)
Sin filtracin
10 minutos
Correspondiente
Con filtracin
1 hora
Agua (d)
Con filtracin
1 hora
Correspondiente
Sin filtracin
1 hora
Correspondiente
Sin filtracin
1 hora
Agua (d)
Exp
Valores Reales
C
05/11/2012
Orden
34
Resultados:
Exp
AxB
AxC
AxD
Abs
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
0,796
2
3
4
5
6
7
8
0,800
0,801
0,798
0,794
0,796
0,800
0,802
(+) + (-)
(+) (-)
Efectos =
texp =
Valor P =
s=
05/11/2012
35
(0.00175) 2 (0.00075) 2 (0.00225) 2

s
3
Resultados:
Exp
AxB
AxC
AxD
Abs
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
0,796
+
+
+
+
(+) + (-)
6,387
6,387
6,387
6,387
6,387
6,387
6,387
(+) (-)
0,005
0,015
-0,003
0,007
-0,007
0,003
0,009
Efectos =
0,0013
0,0038
-0,0008
0,0018
-0,00175
0,00075
0,00225
texp =
0,7346
2,2037
-0,4407
1,0284
Valor P =
0,5033
0,0923
0,6822
0,3619
2
3
4
5
6
7
05/11/2012
0,800
0,801
0,798
0,794
0,796
0,800
0,802
s=
0,001702
36
Entonces:
t( 0.05,3) 3.182
Grf ico de Pareto para los Ef ectos Principales, Estandarizados

(response is ABSORBANCIA, Alpha = ,05)
FILT RACIN
BLANCO
ANALIST A
MPO DE ANLISIS
05/11/2012
37
Con un 95% de confianza se asegurar que ninguna

de las variables en estudio afectan de manera
significativa a los resultados.
El mtodo de anlisis propuesto posee buenas
caractersticas para poder ser validado.
Se puede predecir que el mtodo no depende del
analista y que la solucin preparada es muy estable.
La filtracin de la solucin resulto no significativa, no
hay retencin del analito en el filtro, ni
contaminacin por parte del filtro, sin embargo tiene
el mayor efecto, mantener la filtracin.
Usar como blanco agua destilada no afecta
significativamente los resultados.
05/11/2012
38
05/11/2012
39
Se prepara suficiente cantidad de una

muestra homognea y se almacena en
diferentes condiciones ambientales:
Tiempo
Condiciones
normales
Temperatura de 40
C
Luz solar
directa
Oscuridad
0 horas
0.N
-----
-----
-----
1 hora
1.N
1.T
1.L
1.O
2 horas
2.N
2.T
2.L
2.O
4 horas
4.N
4.T
4.L
4.O
20 horas
20.N
20.T
20.L
20.O
05/11/2012
40
Resultados despus de 1 hora.

Replica
Tiempo
cero
Condiciones
Normales
Temperatura
(40 C)
Luz
solar
Oscuridad
0.772
0.772
0.779
0.762
0.771
0.777
0.775
0.778
0.766
0.778
0.775
0.769
0.781
0.766
0.777
0.779
0.778
0.777
0.761
0.778
0.777
0.777
0.78
0.764
0.78
05/11/2012
41
Resultados despus de 2 horas.

Replica
Condiciones
Normales
Temperatura
(40 C)
Luz
solar
Oscuridad
0.774
0.779
0.751
0.777
0.776
0.78
0.748
0.775
0.777
0.779
0.749
0.781
0.777
0.777
0.749
0.778
0.778
0.78
0.752
0.775
05/11/2012
42

Replica
Condiciones
Normales
Temperatura
(40 C)
Luz
solar
Oscuridad
0.777
0.781
0.747
0.777
0.778
0.774
0.743
0.778
0.778
0.783
0.741
0.775
0.78
0.771
0.74
0.773
0.772
0.78
0.747
0.777
05/11/2012
43

Replica
Condiciones
Normales
Temperatura
(40 C)
Luz
solar
Oscuridad
0.777
0.776
0.738
0.779
0.778
0.77
0.739
0.779
0.78
0.775
0.741
0.778
0.777
0.774
0.735
0.777
0.775
0.776
0.738
0.773
05/11/2012
44
05/11/2012
45
05/11/2012
46
Selectividad.
Capacidad de un mtodo analtico para
medir y/o identificar simultneamente los
analitos de inters, de forma inequvoca, en
presencia de otras sustancias qumicas que
pueden estar en la muestra (precursores de
sntesis o subproductos de la misma,
impurezas,
excipientes,
productos
de
degradacin, etc.)
05/11/2012
47
La selectividad se debe determinar antes de

iniciar el estudio de cualquier otro parmetro
de validacin.
Debe conocerse en que grado la respuesta
del mtodo es nicamente proporcionada por
el analito sin interferencias de otras sustancias
relacionadas (falsos positivos).
Especificidad y selectividad.
05/11/2012
48
Ensayos de identificacin.
Demostrar que el mtodo es capaz de

discriminar entre el analito y sustancias de
composicin similar u otros productos que
pueden estar presentes en la muestra.
Ensayos de pureza.
Garantizar que el mtodo permite una

evaluacin de las impurezas y los productos de
degradacin.
Determinacin cuantitativa.
El mtodo debe evitar la interferencia de

excipientes, productos de degradacin y/o
impurezas en la respuesta proporcionada.
05/11/2012
49
Adicin de interferencias.
Prueba la selectividad de un mtodo en
anlisis de rutina como tambin para
mtodos
utilizados
en
pruebas
de
estabilidad.
Aplicacin de tcnicas confirmatorias

con muestras sometidas a estrs.
Si no se cuenta con las interferencias se
puede degradar la molcula por exposicin
a condiciones extremas de estrs.
05/11/2012
50
Muestras sometidas a estrs.

Se prepara las muestras a la concentracin
de trabajo terica.
Analito
Analito + Matriz
Matriz
Se determina las posibles rutas de
degradacin y metabolitos (estructura
qumica y bibliografa).
Someter
las muestras preparadas a
condiciones de estrs.
05/11/2012
51
MUESTRA
TERMLISIS
HIDRLISIS
ACUOSA
CIDA
FOTLISIS
OXIDACIN
BSICA
JOSE QUISPE VARGAS

HCl 0.1 NM.Sc. JUANNaOH
0.1
N
05/11/2012
52
05/11/2012
53
Muestra del
frmaco XX
estndar
05/11/2012
54
Muestra del
frmaco XX bajo
condiciones
forzadas
05/11/2012
55
No se observan picos en los tiempos de

retencin del componente principal y las
impurezas.
05/11/2012
56
Las impurezas conocidas deben estar separadas

entre s y del pico principal (Resolucin 1,5)

57 de 69
05/11/2012
Cromatograma de la muestra no sometida a

condiciones forzadas de degradacin

58 de 69
05/11/2012
Cromatograma de la muestra sometida a condiciones

forzadas: los productos de degradacin estn separados
del pico principal, R 1,5

59 de 69
05/11/2012
La determinacin de selectividad de un
mtodo analtico muestra los siguientes
resultados:
Replica 1
A
Analito sin excipientes
(Absorbancia)
0.782
B
Analito con excipientes
(Absorbancia)
0.771
Replica 2
0.775
0.778
Replica 3
0.770
0..777
Replica 4
0.789
0.787
Replica 5
0.778
0.782
Replica 6
0.788
0.789
N de
replicas
05/11/2012
60
Para determinar si existe diferencia

significativa entre las medias de dos
grupos de datos, se recurre a la prueba
t de student.
Antes se debe verificar:
La normalidad de la distribucin muestral

para cada grupo.
Homogeneidad de varianzas (prueba F).
05/11/2012
61
Homogeneidad de varianzas.
Planteamiento de hiptesis:
H0 sA = sB
H1 sA sB
Fexp
2
1
2
2
s s
2
1
2
2
Fexp Ftab se acepta H 0
05/11/2012
62
Resultados.
Fexp 1 .2308
F( 0.05 , 5 , 5 ) 5 .0503
Se acepta la H0, la prueba F demuestra

homogeneidad de varianzas.
Prueba t de student.
H 0 A = B
H 1 A B
05/11/2012
63
Para varianzas homogneas.

s
nn 1s 2A nb 1sB2
nA nB 2
t
s
2
A
s
2
2
B
1
1
nA
nB
gl nA nB 2
05/11/2012
64
Resultados.
t exp 0 . 0814
t ( 0 . 05
, 10 )
2 . 2281
Se acepta la H0, el mtodo analtico es

selectivo
05/11/2012
65
Para varianzas heterogneas.
x A xB
2
A
2
B
s
s
n A nB
s
s

nA nB
gl
2
2 2
2
sA
sB

n A nB
n A 1 nB 1
2
A
05/11/2012
2
B
66
05/11/2012
67
Rango.
Intervalo entre la concentracin superior e

inferior de analito para el cual se ha
demostrado la correcta precisin, exactitud y
linealidad del mtodo descrito.
Linealidad.
Es la capacidad del mtodo de producir

resultados
directa
o
indirectamente
proporcionales a la concentracin o cantidad
de analito en una muestra, dentro de un
intervalo determinado.
En algunos casos se requiere de una
transformacin matemtica de la respuesta.
05/11/2012
68
Dos tipos de estudios de linealidad:
Linealidad del Sistema, donde se realizan los

ensayos con la presencia nica del analito.
Linealidad del Mtodo, en la cual los ensayos se
realizan en presencia del analito y la matriz
correspondiente.
El rango debe definirse antes de realizar

cualquier prueba, por lo general se deriva
de las especificaciones del producto.
Debe incluir el rango de especificaciones
completo y extenderse ligeramente en
ambas direcciones.
05/11/2012
69
El rango no debe extenderse ms halla de

las concentraciones que se consideran
dentro de las posibilidades.
r equivocadamente aceptables
Concentraciones extremas podran rebasar los
lmites de linealidad
Siempre que sea posible se busca una

respuesta lineal que facilite su trazado,
interpolacin e interpretacin.
Pero si las respuestas son no lineales, pero
proporcionales a la concentracin, se usan
otros ajustes matemticos.
05/11/2012
70
Comparar la linealidad del sistema con la

linealidad del mtodo, si no corresponden, esto
evidencia un efecto de la matriz.
MULTIPLICATIVO
ADITIVO
ANALITO
05/11/2012
71
Aplicacin.
Valoracin del contenido de p.a.
Prueba de disolucin.
Cuantificacin de impurezas.
Determinacin.
1. Determinar el rango de estudio.
2. Dentro del rango se define por lo menos 5
niveles de concentracin (k = 5).
3. Realizar por lo menso 3 replicas para cada k.
4. Mnimo total de determinaciones, n = 15.
05/11/2012
72
Lo correcto es analizar las muestras de

forma aleatoria, pero, se establece como
criterio prctico analizarlas en sentido
creciente de concentracin.
Lo ideal es hacer pesadas independientes
(15 pesadas), ya que a s se elimina el
posible error sistemtico que se podra
arrastrar partiendo de una sola pesada.
No obstante, se acepta una pesada madre
y posteriores diluciones si se asegura una
precisin y exactitud en la pesada madre y
en las posteriores diluciones.
05/11/2012
73
En las pruebas de linealidad de un p.a.

que se determina a 100 g/ml, se
adopto como rango el intervalo entre
80% - 120%.
Se trabajo a 5 niveles de concentracin
(80, 90, 100, 110 y 120 g/ml) por
triplicado. Los resultados obtenidos se
muestran en la siguiente Tabla.
Determinar si el mtodo de anlisis
cumple con los requisitos de linealidad.
05/11/2012
74
[c] g/ml
Replica 1
Replica 2
Replica 3
80
6439.77
6433.33
6440.72
90
7244.74
7237.49
7245.81
100
8066.01
8093.94
8071.58
110
8858.93
8896.66
8821.48
120
9699.63
9651.66
9638.78
05/11/2012
75
Pruebas a realizar.
Regresin lineal.
Prueba de hiptesis para r y r2.
Prueba de hiptesis para la pendiente (b).
Prueba de hiptesis para la ordenada al
origen a.
ANOVA.
05/11/2012
76
x (g/mL)
y (rea)
80
80
80
90
90
90
100
100
100
110
110
110
120
120
120
6439.77
6433.33
6440.72
7244.74
7237.49
7245.81
8066.01
8093.94
8071.58
8858.93
8896.66
8821.48
9699.63
9651.66
9638.78
xy
xy
05/11/2012
77
x (g/mL)
y (rea)
xy
80
80
80
90
90
90
100
100
100
110
110
110
120
120
120
6439.77
6433.33
6440.72
7244.74
7237.49
7245.81
8066.01
8093.94
8071.58
8858.93
8896.66
8821.48
9699.63
9651.66
9638.78
6400
6400
6400
8100
8100
8100
10000
10000
10000
12100
12100
12100
14400
14400
14400
41470637.65
41387734.89
41482874.12
52486257.67
52381261.5
52501762.56
65060517.32
65511864.72
65150403.7
78480640.74
79150559.16
77818509.39
94082822.14
93154540.76
92906079.89
515181.6
514666.4
515257.6
652026.6
651374.1
652122.9
806601
809394
807158
974482.3
978632.6
970362.8
1163955.6
1158199.2
1156653.6
xy
1500
120840.53
153000
993026466.2
12326068.3
05/11/2012
78
Regresin lineal.
b
xy
x2
n
x 2
y b x
a
n
n
x y
xy
n
2
2
x
y
x 2 y 2
n
n
05/11/2012
79
Regresin lineal.
a = -11.14133333.
b = 80.67176667.
r = 0.999818604.
r2 = 0.9996.
Prueba de hiptesis para r

H0 No hay correlacin entre x e y.
H1 Existe correlacin entre x e y.
05/11/2012
80
Prueba de hiptesis para r.
texp
r n 2
1 r
Resultados:
texp = 189.27
t(0.05, n-2) = 2.16
Existe correlacin significativa entre x e y.
05/11/2012
81
Prueba de hiptesis para b.

H0 b = 0
H1 b 0
t exp
sb
sb
s2 xy
s 2 xy
2
y
ay bxy
n2
05/11/2012
82
Prueba de hiptesis para b.

sb = 0.4262239
s2xy =545.0004469
texp = 189.27
t(0.05,n-2) = 2.16
Se
rechaza
H0,
entonces
b
significativamente diferente de cero.
es
Lmites de confianza para b.
b ' b t Sb
05/11/2012
83
Lmites de confianza para b.

No deben incluir al cero.
t(0.05,n-2) = 2.16.
79.75 < b < 81.59.
Prueba de hiptesis para a.

H0 a = 0
H1 a 0
t exp
Sa
Sa Sb
2
05/11/2012
2
x
n
84
Prueba de hiptesis para a.

Sa = 43.046504
texp = 0.2588
t(0.05,n-2) = 2.16
Se acepta la H0, a no es significativamente
diferente de cero.
Lmites de confianza para a.
a ' a t Sa
05/11/2012
85
Lmites de confianza para a.

Deben incluir al cero.
t(0.05,n-2) = 2.16.
-104.14 < a < 81.86
s12 s22 ... sK2
G ex p
s m2 x i m o
s m2 x i m o
2
2
2
2
s i s 1 s 2 ... s i
05/11/2012
86
y-a
f ((y-a)/x)
Promedio f
6439.77
6433.33
6440.72
7244.74
7237.49
7245.81
8066.01
8093.94
8071.58
8858.93
8896.66
8821.48
9699.63
9651.66
9638.78
05/11/2012
87
y-a
f ((y-a)/x)
6439.77
6433.33
6440.72
7244.74
7237.49
7245.81
8066.01
8093.94
8071.58
8858.93
8896.66
8821.48
9699.63
9651.66
9638.78
6450.91
6444.47
6451.86
7255.88
7248.63
7256.95
8077.15
8105.08
8082.72
8870.07
8907.80
8832.62
9710.77
9662.80
9649.92
80.636
80.556
80.648
80.621
80.540
80.633
80.772
81.051
80.827
80.637
80.980
80.297
80.923
80.523
80.416
Promedio f
80.614
0.0503
0.0025
80.598
0.0503
0.0025
80.883
0.1478
0.0219
80.638
0.3417
0.1168
80.621
0.2672
0.0714
05/11/2012
88
Gexp = 0.5429
G(0.05,k,n-1) = 0.6838
Si Gexp < G(0.05,k,n-1), entonces se acepta la H0.
ANOVA.
Fv
Regresin
Error
Desvio
Dentro
Total
gl
1
n-2
k-2
n-k
n-1
SC
CM
Fexp
Ft
SCr
SCE
SCl
SCep
SCt
05/11/2012
89
ANOVA (SCr).
SC r
Sxx x
S xy 2
S xx
xy
Sxy xy
n
Sxx = 3000
Sxy = 242015.3
SCr = 19523801.81
05/11/2012
90
ANOVA (SCep y SCl).
SCep y
m
y y
SCec
mj
SCl SCec SCr

SCep = 5392.941
SCl = 1692.06481
05/11/2012
91
ANOVA (SCE).
y y
SCec
2
mj
SC E SC l SC ep
SCec = 19525493.88
SCE = 7085.00581
05/11/2012
92
ANOVA.
Fv
gl
SC
CM
Fexp
Ft
Regresin
Error
Desvio
Dentro
Total
05/11/2012
93
ANOVA.
Fv
Regresin
Error
Desvio
Dentro
Total
gl
SC
1 19523801.81
13 7085.00581
3 1692.06481
10
5392.941
14 19530886.82
CM
19523801.81
545.0004469
564.0216034
539.2941
05/11/2012
Fexp
Ft
35823.5
4.667
1.046
3.708
94
ANOVA (SCE).
Si F1exp > F1tab, esto demuestra la existencia
de una pendiente diferente de cero,
entonces, la regresin es estadsticamente
significativa.
Si F2exp > F2tab, esto demuestra la linealidad
entre los resultados obtenidos.
05/11/2012
95
05/11/2012
96
La exactitud de un mtodo analtico es

el grado de concordancia o la
diferencia entre la media de los
resultados del ensayo obtenidos por el
mtodo y el verdadero valor aceptado
como correcto.
Se
conoce tambin como error
sistemtico o sesgo.
05/11/2012
97
No deben confundirse exactitud y precisin.

La precisin esta relacionada con la dispersin de
una serie de mediciones pero no da ningn
indicativo de lo cerca que est del valor verdadero.
Se puede tener mediciones muy precisas pero poco
exactas, sin embargo, para que un mtodo sea
exacto se requiere un cierto grado de precisin.
No
siempre
se
obtienen
valores
de
recuperacin cercanos al 100 %, ya que esta
depende de la matriz de la muestra, de la
efectividad del mtodo de preparacin y
extraccin, y de la concentracin del analito.
05/11/2012
98
La desviacin de la exactitud por exceso se

produce:
Cuando
existen interferencias y la selectividad del

mtodo no es adecuada, se obtienen resultados
superiores al valor verdadero.
La desviacin de la exactitud por defecto suele

producirse cuando:
La matriz de la muestra es compleja y la extraccin del
analito
requiere
varios
recuperaciones bajas.
pasos,
obtenindose
Si la exactitud obtenida es repetible (precisin

elevada) y adems es homognea en todos los
niveles de concentracin, puede aplicarse un factor
de correccin en el clculo final para compensar los
resultados.
05/11/2012
99
Aplicacin.
Determinacin cuantitativa
cuantificacin de impurezas.
de
p.a.
Determinacin.
La exactitud debe demostrarse en todo el
rango especificado para el mtodo, se
debe
realizar
como
mnimo
9
determinaciones, sobre 3 niveles de
concentracin (concentraciones nominal y
en los extremos del rango).
05/11/2012
100
Preparacin de muestras.
Se prepara la matriz. Sobre la matriz se aaden
cantidades conocidas del analito patrn a tres
niveles de concentracin dentro del rango a
estudiar.
Realizar como mnimo 3 replicas para cada

nivel (se tiene un total de 9 ensayos).
Determinar el analito en cada muestra y
calcular el porcentaje de recuperacin.
05/11/2012
101
La
exactitud
se
expresa
como
porcentaje de recuperacin en la
valoracin de una cantidad conocida
de analito aadida sobre la muestra.
%R
100
Xm = valor medio hallado.

= valor aceptado como verdadero
05/11/2012
102
Se prepararon muestras con una

concentracin terica mostrada a
continuacin:
Concentracin Terica (%)
Ensayo 1
Ensayo 2
Ensayo 3
Nivel 1
80
80
80
Nivel 2
100
100
100
Nivel 3
120
120
120
05/11/2012
103
Despus de la
encontraron
los
experimentales:
determinacin se
siguientes
valores
Concentracin Experimental (%)

Ensayo 1
Ensayo 2
Ensayo 3
Nivel 1
78,5
80,1
79,4
Nivel 2
100,5
100,2
100,7
Nivel 3
119,2
120,6
119,7
05/11/2012
104
Primero, se debe determinar si el factor

concentracin tiene alguna influencia
en los resultados. Se usa el test de
Cochran de igualdad de varianzas para
varios grupos muestrales del mismo
tamao.
2
2
2
s1 s2 ... sK
G ex p
2
m xi m o
2
i
2
m xi m o
2
2
s
2
s1 s ... s i2
05/11/2012
105
Gexp = 0.5317
G(0.05,k,n-1) = 0.8709
Si Gexp < G(0.05,k,n-1), entonces se acepta la H0.
Existe homogeneidad de varianzas, el factor
concentracin no influye en los resultados.
Recuperacin media.
% R
100
05/11/2012
106
Resultados
Ensayo 1 (%)
Ensayo 2 (%) Ensayo 3 (%)
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3
Promedio =
CV (%) =
05/11/2012
107
Resultados
Ensayo 1 (%)
Ensayo 2 (%) Ensayo 3 (%)
Nivel 1
98,1250
100,1250
99,2500
Nivel 2
100,5000
100,2000
100,7000
Nivel 3
99,3333
100,5000
99,7500
Promedio =
99,8315
CV (%) =
0,8211
05/11/2012
108
Planteamiento de hiptesis.
H0 Recuperacin media = 100
H1 Recuperacin media 100
100 %R n
texp
CV
texp = 0.6157
t(0.05,n-1) = 2.306
Exactitud adecuada.
05/11/2012
109
05/11/2012
110
Precisin.
Expresa el grado de concordancia (grado de
dispersin) entre una serie de medidas a partir de
una misma muestra homognea.
La precisin engloba diferentes tipos de estudios:
Repetibilidad,
Precisin
Intermedia
y
Reproducibilidad.
Repetibilidad.
Estudia la variabilidad del mtodo efectuando una
serie de anlisis sobre la misma muestra en las
mismas condiciones operativas (mismo analista,
mismos aparatos y reactivos, etc.), en un mismo
laboratorio y en un periodo de tiempo corto.
05/11/2012
111
Precisin Intermedia.
Estudia la variabilidad del mtodo en una
serie de anlisis sobre la misma muestra pero
en
condiciones
operativas
diferentes
(diferentes analistas, aparatos, das, etc.) y
en un mismo laboratorio.
Reproducibilidad.
Estudia la variabilidad del mtodo bajo
condiciones operativas diferentes y en
distintos laboratorios.
05/11/2012
112
El objetivo del estudio de precisin es conocer

la variabilidad del mtodo de ensayo.
Esta variabilidad se debe a errores aleatorios
inherentes a todo mtodo de ensayo.
Los factores que pueden influir sobre los
resultados no pueden ser siempre controlados
(analista, equipo, reactivos, tiempo, etc.), de
ah la importancia del estudio de precisin.
La precisin de un mtodo analtico se expresa
con el coeficiente de variacin (CV) de una
serie de medidas.
05/11/2012
113
Aplicacin.
Para las determinacin cuantitativa
principios activos y cuantificacin
impurezas.
Determinacin.
05/11/2012
114
de
de
Repetibilidad Instrumental.
Estudia la variabilidad debida nicamente al
instrumento.
1. Se prepara suficiente cantidad de una
muestra a concentracin nominal que
contenga slo el analito.
2. Se realiza por lo menos 10 medidas
consecutivas
de
la
misma
muestra
(respuestas del instrumento).
3. Se determina el coeficiente de variacin
(CV) de las 10 medidas.
05/11/2012
115
Repetibilidad del Mtodo.

Determina la repetibilidad de todo el proceso
de anlisis (desde la pesada, preparacin de la
muestra hasta el resultado final del anlisis).
1. Se prepara por lo menos 6 muestras por
separado, a la concentracin nominal, a partir
de una muestra (analito + matriz) nica
homognea.
2. Se realiza las medidas correspondientes y se
determina el coeficiente de variacin (CV).
05/11/2012
116
Precisin intermedia.
Tiene
como
objetivo
determinar
la
variabilidad del mtodo efectuando una
serie de anlisis sobre la misma muestra, en
un mismo laboratorio pero en condiciones
operativas diferentes (da, analista e
instrumento).
Se prepara muestras independientes a
concentracin nominal (100 %)
por
triplicado, segn la siguiente matriz.
05/11/2012
117
Instrumento
Analista
Analista X
A
Analista y
Analista x
B
Analista y
Da 1
Da 2
Da 3
Anlisis 1
Anlisis 2
Anlisis 3
Anlisis 1
Anlisis 2
Anlisis 3
Anlisis 1
Anlisis 2
Anlisis 3
Anlisis 1
Anlisis 2
Anlisis 3
Anlisis 1
Anlisis 2
Anlisis 3
Anlisis 1
Anlisis 2
Anlisis 3
Anlisis 1
Anlisis 2
Anlisis 3
Anlisis 1
Anlisis 2
Anlisis 3
Anlisis 1
Anlisis 2
Anlisis 3
Anlisis 1
Anlisis 2
Anlisis 3
Anlisis 1
Anlisis 2
Anlisis 3
Anlisis 1
Anlisis 2
Anlisis 3
05/11/2012
118
La evaluacin estadstica de la precisin

se basa en la comparacin de los CV%
con datos estndar obtenidos de tablas.
Intervalo de
Aceptacin (%)
98.5 101.5
97.0 103.0
95.0 105.0
90.0 110.0
85.0 115.0
75.0 125.0
CV (%) de
Repetibilidad Mtodo
0.58
1.16
1.94
3.88
5.81
9.69
CV (%) de Repetibilidad
Instrumental
0.41
0.82
1.37
2.74
4.11
6.85
C V % Mtodo C V % Sistem a 2
05/11/2012
119
Los resultados del estudio de repetibilidad

instrumental para un p.a. con intervalo de
aceptacin de 95 105% son:
19.06 g/ml (100%)
Absorbancia a 511 nm
0.778
0.776
0.776
0.775
0.779
Promedio =
s=
CV (%) =
0.779
0.776
0.780
0.777
0.777
05/11/2012
120
La repetibilidad del mtodo para un p.a. con

intervalo de aceptacin de 95 105% son:
19.06 g/ml (100%)
0.778
0.777
0.771
0.791
0.782
0.787
Promedio =
s=
CV (%) =
05/11/2012
121
Los resultados de precisin intermedia para el p.a.

son:
Analista
Analista X
Analista y
9.53 g/ml (50%)
Da 1
Da 2
Da 3
0.787
0.795
0.769
0.771
0.802
0.778
0.782
0.796
0.768
0.777
0.785
0.771
0.77
0.806
0.777
0.781
0.782
0.782
05/11/2012
122
La precisin intermedia es aceptable si

su CV% es menor al doble del CV% del
mtodo.
05/11/2012
123
05/11/2012
124
Lmite de Cuantificacin.
Es la mnima cantidad de analito presente
en la muestra que se puede cuantificar,
bajo
las
condiciones
experimentales
descritas con una adecuada precisin y
exactitud.
Lmite de Deteccin.
Es la mnima cantidad de analito en la
muestra que se puede detectar aunque no
necesariamente
cuantificar
bajo
las
condiciones experimentales.
05/11/2012
125
Entre el LC y LD se encuentra un rango de

concentraciones en el que, si bien no
puede cuantificarse el analito con
razonable certeza, si puede detectarse sin
incurrir en falsos positivos.
No deben confundirse con la sensibilidad,
Sensibilidad. Capacidad de un mtodo para
discriminar
pequeas
diferencias
en
concentracin o masa del analito.
La sensibilidad es la pendiente de la curva de
calibracin obtenida al representar la respuesta
frente a la concentracin.
05/11/2012
126
Aplicacin.
El LD, en la evaluacin de impurezas mediante
ensayos lmite.
El
LC,
en mtodos destinados a la
determinacin cuantitativa de impurezas.
Para mtodos de anlisis que se empleen en la
determinacin de impurezas o trazas de p.a.
Permite un mejor conocimiento del mtodo,
saber cuales son los LD y LC es til en el ensayo
de disolucin, determinacin de trazas de p.a. y
en la validaciones de limpieza.
05/11/2012
127
El mtodo propuesto esta basado en la

extrapolacin de la recta de calibrado
a concentracin cero.
Se trata de un procedimiento aplicable
a mtodos analticos Instrumentales que
proporcionan resultados numricos.
El procedimiento a seguir se describe a
continuacin.
05/11/2012
128
Se determinar la pendiente (b) de la curva

de
calibrado
(Concentracin
vs.
Respuesta) en el rango apropiado.
Determinar
una
nueva
curva
de
calibracin a bajas concentraciones.
Se prepara 3 muestras a concentraciones
que se suponen cercanas al LC.
Se
realiza
3
replicas
para
cada
concentracin y se las analiza en las
condiciones descritas en el mtodo.
05/11/2012
129
Pico B
LC
Pico A
LD
Lnea basal
ruido
Cromatograma que muestra el ruido de lnea base

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE130
VARGAS
de 69
05/11/2012
La curva de calibracin (rango 2.4 13.6 g

inyectados) de un mtodo analtico es
representada por la siguientes ecuacin.
y 857.6 x 27.9
Se efectan 3 mediciones por triplicado en

la zona inferior de la curva para el clculo
de los LD y LC.
Las reas halladas son:
05/11/2012
131
x (g iny.)
0,25
0,25
0,25
0,5
0,5
0,5
0,75
0,75
0,75
y (Area)
242
254
230
460
465
447
671
667
679
05/11/2012
132
Ybl 10 Sbl
LC
b
Ybl 3 Sbl
LD
b
Ybl = Seal ruido.

Sbl = Desviacin estndar de la seal ruido.
b = Pendiente de la recta del estudio de
linealidad
05/11/2012
133
Resultados de regresin lineal a bajas

concentraciones.
y 860.67 x 26.89
Ybl = a (ordenada al
concentraciones).
Ybl = 26.89 (seal ruido).
05/11/2012
origen a bajas
134
Desviacin estndar de la seal ruido

(Sbl).
x (g)
0.25
0.25
0.25
0.5
0.5
0.5
0.75
0.75
0.75
y (Area)
242
254
230
460
465
447
671
667
679
Area Media
05/11/2012
135
Desviacin estndar de la seal ruido

(Sbl).
x (g)
0.25
0.25
0.25
0.5
0.5
0.5
0.75
0.75
0.75
y (Area)
242
254
230
460
465
447
671
667
679
Area Media
242
12
0.25
457.3333333 9.291573243
0.5
672.3333333 6.110100927
0.75
05/11/2012
136
Regresin lineal (Concentracin

Desviacin Estndar).
vs.
y 11.78 x 15.02
Sbl
= a (ordenada al origen de
concentracin vs. Desviacin estndar).
Sbl = 15.02 (s de la seal ruido).
05/11/2012
137
Ybl 3 Sbl
LD
b
LD = 0.084 g.
Ybl 10 Sbl
LC
b
LC = 0.206 g.
05/11/2012
138

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JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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Demostrar que los mtodos son

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

Conocimiento del mtodo analtico.

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

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M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

Los mtodos de farmacopeas se

Se consideran vlidos. No es necesario

Mtodos de Anlisis para FF.

Mtodos desarrollados por el laboratorio,

La secuencia ptima de experimentos para

La estabilidad de la muestra preparada

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

La validacin en s es una fase ms del

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

Verificacin documentada de que un

Paso del tiempo.

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

La robustez, de un mtodo analtico, es

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

No debe confundirse con el trmino

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

Permite conocer la estabilidad del mtodo

Las condiciones ptimas de trabajo para las

Todos los mtodos sea cual sea la

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

Normalmente se usan dos tipos de diseos

Por razones de interpretacin estadstica,

El diseo Youden Steiner es el mtodo

Determinar los factores (deben ser 7) a ser

Para la determinacin de la robustez de un

[c] de la fase mvil

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M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

Para cada factor se calcula la diferencia de

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

Para decidir si un parmetro tiene

Supongamos que la repetibilidad es de

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

Se realizo un estudio de robustez de un

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

Se usa un diseo estadstico experimental factorial

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

(0.00175) 2 (0.00075) 2 (0.00225) 2

M.Sc. JUAN JOSE QUISPE VARGAS

Grf ico de Pareto para los Ef ectos Principales, Estandarizados

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Con un 95% de confianza se asegurar que ninguna

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Se prepara suficiente cantidad de una

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Resultados despus de 1 hora.

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Resultados despus de 2 horas.