Microbiologa General

1. Tema N 13 : MICROBIOLOGIA DEL AGUA

2. Propsito:
El alumno determinar la presencia de los organismos coliformes en agua por el Mtodo del
Nmero Ms Probable

3. Conceptos bsicos
Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va
fecal-oral utilizando como vehculo los alimentos y el agua, es necesario
contar con microorganismos que funcionen como indicador de
contaminacin fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y
exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de
los patgenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse
extraintestinalmente.
El grupo coliforme constituyen un grupo heterogneo con hbitat
primordialmente intestinal para la mayora de las especies que involucra, es
constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, su capacidad de
sobrevivencia y multiplicacin fuera del intestino tambin se observan en
aguas potables, por lo que este grupo se utiliza como indicador de
contaminacin fecal en agua; encontrndose que mientras mayor sea el
nmero de coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de estar frente a
una contaminacin reciente. Cuando los coliformes llegan a los alimentos,
no slo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el
grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua.
Cuando los productos alimenticios han recibido un tratamiento trmico
(pasteurizacin, horneado, coccin, etc.), estos microorganismos se utilizan
como indicadores de malas prcticas sanitarias. Para su estudio, se dividen
en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes totales el cual comprende
a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no
esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso
mximo de 48 h. a 35C 1C. Este grupo est conformado por 4 gneros
principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.El grupo
de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas
capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h de
incubacin a 44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada,
sin embargo la ms prominente es Escherichiacoli
La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse
mediante el empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con
caractersticas selectivas y diferenciales.
Escherichiacoli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra
clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entricas),
existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin

embargo, existen algunas cepas de E. coli patgenas que provocan

enfermedades diarreicas. Estas se clasifican con base en las caractersticas
que presentan sus factores de virulencia nicos, cada grupo provoca
enfermedad mediante un mecanismo

diferente. Se sabe que sus propiedades de adherencia a las clulas

epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes
situados en plsmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por
plsmidos o fagos
FUNDAMENTO La determinacin de microorganismos coliformes totales
por el mtodo del Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la
capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con produccin
de cido y gas al incubarlos a 35C 2C durante 24-48 h., Esta
determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase
confirmativa.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo
laurilTriptosa el cual permite la recuperacin de los microorganismos
daados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de
utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa
se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde
brillante(BRILLA)el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de
aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el
verde brillante. La determinacin del nmero ms probable (NMP) de
microorganismos Coliformes fecales se realiza a partir de los tubos
positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las
bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a
una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de 24 a 48 h. Finalmente, la
bsqueda de Escherichiacoli se realiza a partir de los tubos positivos de
caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y
diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y
posteriormente realizando las pruebas bioqumicas bsicas (IMViC) a las
colonias tpicas.
Tcnica de tubos mltiples.
La prueba de tubos mltiples constituye un mtodo estandarizado para la
determinacin de la densidad de bacterias indicadoras de contaminacin.
En esta prueba, rplicas de tubos de medios de cultivo especficos, son
inoculados con diluciones decimales de una muestra dada de agua. La
densidad bacteriana es calculada por medio de frmulas de probabilidad
que estiman el nmero ms
probable de bacterias para producir ciertas combinaciones de resultados
positivos (como turbidez o formacin de gas) y negativos.
Cuando se trata de agua no potable, se inoculan los tubos con cantidades
decimales del agua. La seleccin de stas va a depender de la densidad
probable de coliformes y la experiencia del analista.

Esta tcnica puede tambin ser usada para sedimentos, haciendo una
dilucin de 10" . Se pesan 50 gr de muestra (slida o semislida) y se
adicionan 450 mL de agua de dilucin y se agita por 1 2 minutos.
Los resultados del anlisis de los tubos de rplica y diluciones son
reportados en trminos de el Nmero Ms Probable (NMP).
El valor numrico de la estimacin del contenido bacteriano es determinado
por la dilucin que mostr ambos resultados positivos y negativos.
La mejor evaluacin de la calidad sanitaria del agua depende de la
interpretacin de resultados de la tcnica de los tubos mltiples o de otros
mtodos, posiblemente ms precisos y de toda la dems informacin
relativa al agua que pueda ser obtenida por reconocimiento de la zona.
La mayora de las tablas se basan en el uso de tres volmenes diferentes de
muestra en orden decimal decreciente (10, 1, 0.1, 0.01 mL etc.). Existen
tablas para diferente nmero de rplicas de cada dilucin. Las ms comunes
son de 5 y 3 rplicas por dilucin respectivamente
Slo si en los resultados aparecen tubos positivos y negativos cuando
menos en una dilucin, el nmero ms probable proporciona un estimado
significativo de la densidad bacteriana. La presicin de la estimacin del
NMP se incrementa al aumentar el nmero de replicas por dilucin.

I.

PROCEDIMIENTO

A.- NUMERACIN DE COLIFORMES

Mtodo norteamericano.Materiales:
1. Pipetas estriles de 5ml y 1 ml.
2. Asas de inoculacin con alambre nicrom en anillo de 3 mm.
3. Caldo Lauril sulfato triptosa, volmenes de 10 ml en tubos 16x150 mm, con durhamde 75x10 mm.
4. Caldo Verde Brillante Lactosa Bilis (BRILA), volmenes de 10 ml en tubos 16x150 mm, con durham de
75x10mm.
5. Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) en placas petri.
6. Incubadora a 35-37 C.
Procedimiento:
Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces para lograr una
distribucin uniforme de los microorganismos. Dependiendo del origen de la
muestra y el contenido bacteriano esperado preparar diluciones.

1. Transferir 10, 1 y 0.1 ml de la muestra previamente homogeneizada a tubos con 10 ml

de caldo lauril sulfato triptosa, Utilizar 3 tubos por cada muestra de 10, 1 y 0.1.
.
2. Incubar los tubos a 35-37C durante 24 a 48 horas. Si no hay turbidez puede incubarse hasta 96 horas.
3. Escoger los tubos positivos (aquellos que presentan gas y turbidez y anotar el resultado). Calcular el
NMP para Coliformes (Ver Tabla N3)

B.- NUMERACIN DE COLIFORMES TOTALES.

4. Confirmar si los organismos presentes en los tubos positivos son coliformes, transfiriendo 1-3
asadas de cada tubo positivo a otro tubo con caldo verde brillante lactosa bilis (BRILLA) o sembrando por
estra en placas de agar eosina azul de metileno (EMB)
5. Incubar los tubos o placas a 35-37C durante 24 a 48 horas.
6. Anotar el nmero de tubos positivos en caldo BRILLA (gas en el durham) y llevarlo a la tabla del NMP.
(Ver Tabla N 3)Calcular el NMP para Coliformes Totales.

B. NUMERACIN DE COLIFORMES FECALES.Mtodo 1.- (Norteamericano)

Materiales:
1. Asas de inoculacin con alambre nicrom en anillo de 3 mm.
2. Caldo Lauril sulfato triptosa, volmenes de 10 ml en tubos 16x150 mm, con durhamde 75x10mm
3. Caldo EC, volmenes de 10 ml en tubos 16x150 mm, con durham de 75x10 mm.
4. Bao de agua con agitacin a 44.5+ 0.2 C.
Procedimiento:
1. Transferir 1-3 asadas de cada uno de los tubos positivos de Caldo lauril Sulfato
TriptosaPositivos a tubos con 10 ml de caldo EC.
2. Incubar !os tubos a 44.5 0.2 C durante 24 y 48 horas.
3. Escogerlos tubos positivos (aquellos que presentan gas en el Durham) y anotar resultado,
llevar a la tabla y calcular el NMP deColiformes Fecales.

PROCEDIMIENTO PAR A ANALIZAR UNA MUESTRA DE AGUA

Muestra: Agua hielo
1.1 Prueba presuntiva
Agitar la muestra y transferir volmenes de acuerdo con el cuadro 1, a
cada uno de los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan
seleccionado. Agitar los tubos para homogeneizar la muestra.

 Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h., observar si
hay formacin de gas (desplazamiento del medio en la campana de
Durham); si no se observa produccin de gas, incubar 24 h. ms. Calcular el NMP

para Coliformes/100 ml (Ver Tabla N3)

1.2 Prueba confirmativa de microorganismos Coliformes Totales

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo de Caldo
LaurilTriptosaobtenido durante la prueba presuntiva, a tubos que contiene
10 ml de caldo de bilis verde brillante (BRILLA), con campana de Durham.
Agitar suavemente los tubos para su homogeneizacin.
Incubar a 35 2C durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez
(crecimiento) y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de
24 a 48 h.
Consultar la Tabla 3de NMP para conocer el nmero ms probable NMP
Coliformes Totales/100 mL.
1.3 Prueba confirmativa de microorganismos Coliformes fecales.
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo de Caldo LaurilTriptosa
obtenido durante la prueba presuntivaa tubos con 10 ml de caldo EC.
Agitar suavemente los tubos para su homogeneizacin.
Incubar a 44.5 0.1C en incubadora o un bao de agua con circulacin
durante 24 a 48 h.

 Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento

y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
Consultar la Tabla 3para conocer el nmero ms probable NMP coliformes
fecales/ 100 mL.

1.4 Prueba confirmativa para Escherichiacoli

Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar
por estra cruzada en agar eosina azul de metileno (EMB) para su
aislamiento.
Incubar las placas invertidas a 35C por 18-24 h.
Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfologa
colonial: Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metlico. Si no
hay colonias con morfologa tpica, probar una o ms colonias lo ms
parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estndar para
realizar las pruebas de morfologa microscpica y pruebas bioqumicas.
Incubar las placas a 35C por 18-24 h.
Hacer un frotis y teirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de
bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos.

Todos los cultivos que:

Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos, no esporulados, fermenten la
lactosa con produccin de gas dentro de las 48 h. a 35C. son consideradas
como Escherichiacoli.
Para calcular el NMP de E. coli utilizar a proporcin de los tubos positivos
de la prueba confirmatoria en caldo EC.

CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS

Calcular la densidad microbiana con base en el nmero ms probable
conforme al procedimiento sealado en la tabla 1, para estimar la poblacin
de bacterias coliformes totales, bacterias coliformes fecales y
Escherichiacoli en muestras de agua.
Determinacin del nmero ms probable (NMP)
Codificar los resultados de la serie de diluciones en los tubos de la siguiente
manera: si inicialmente son inoculadas 5 porciones de 10 mL de muestra, 5
de 1 mL y 5 de 0.1 mL, y los resultados positivos fuesen espectivamente 5,

3 y 0, stos se codificarn como 5-3-0. El cdigo obtenido es buscado en la

tabla del NMP (cuadros 2 y 3) y se registra directamente el NMP en 100 mL.

4. RESULTADOS
5. DISCUSION
6. CONCLUSIONES
7. CUESTIONARIO

1. Cul es el medio de cultivo utilizado para la determinacin de Coliformes Totales y

porqu?
2. Cul es el medio de cultivo utilizado para la determinacin de Coliformes fecales y
porqu?
3. Los resultados obtenidos, pueden expresarse tal como se obtuvieron en su prctica?
Argumente sus resultados.
4. Haga un cuadro comparativo entre la tcnica de filtro de membrana y la de nmero ms
probable y mencione sus ventajas y desventajas. Investigue.
5. Cules son los lmites mximos permisibles de Coliformes. Fecales
para las descargas de aguas residuales vertidas a aguas y bienes
nacionales as como a suelo?
6. Mencionar 5 enfermedades transmitidas por el agua, indicando el
agente etiolgico correspondiente.
7. Adems de representar un riesgo para la salud pblica el vertido de
aguas residuales tratadas inadecuadamente o sin tratar a los
depsitos naturales, Qu otros efectos indeseables puede
representar?
8. Cules son los lmites mximos permisibles de Coliformes Fecales en
aguas residuales tratadas que se resan en servicios al pblico?

9. BIBLIOGRAFIA
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Analisis_Agua_NMP_22309.pdf
http://www.upemor.edu.mx/labo/tarchivos/archivos/HEAL/practica_7.pdf

ANEXOS
-Caldo lauriltriptosa (CLT).

Triptosa 40.0g
Lactosa 10.0g
Cloruro de sodio (NaCl) 10.0g
Fosfato monobsico de potasio (KH2PO4) 5.5g
Fosfato dibsico de potasio (K2HPO4) 5.5g
Lauril sulfato de sodio 0.2g
Agua para llevar a 1000 cm3
Aadir la triptosa y el cloruro de sodio al agua, calentar para disolver y
aadir el lauril sulfato de sodio. Disolver el resto de los componentes por
separado y agregarlos a los anteriores mezclando suavemente para evitar la
formacin de espuma.
-Caldo bilis lactosa verde brillante (BRILLA)
Peptona 10.0g Lactosa 10.0g
Bilis de buey (deshidratada) 20.0g
Verde brillante (1% m/m en solucin acuosa) 13 cm3
Agua para llevar a 1000 cm3
Medio EC:
Triptosa o tripticasa 20.0g
Lactosa 5.0g Mezcla de sales biliares
1.5g Fosfato dibsico de potasio (K2HPO4)
4.0g Fosfato monobsico de potasio (KH2PO4)
1.5g Cloruro de sodio (NaCl) 5.0g
Agua para llevar a 1000 cm3 Distribuir el medio de simple concentracin en
volmenes indicados en cada tubo que debe contener un tubo de
fermentacin invertido (Durham). Colocar en autoclave y esterilizar.
Disolver los componentes por separado y agregarles agitando suavemente y
esterilice. Nota: Como medio confirmativo para coliformes totales, el ms
generalizado es el caldo de bilis lactosa verde brillante (BLVB). Para
confirmar la presencia de coliformes fecales se utilizan tanto el BLVB como
el caldo EC.
Medio Eosina Azul de Metileno (EMB)

Frmula (en gramos por litro)

Instrucciones

Peptona

10.0

Lactosa

5.0

Sacarosa

5.0

Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada.

Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullicin
durante 1 o 2 minutos hasta su disolucin. Esterilizar en
autoclave a no ms de 121C durante 15 minutos.
Enfriar a 45C y distribuir agitando suavemente.

Fosfato dipotsico

Agar

Eosina

Azul de metileno

2.0

13.5

0.4

0.065

pH final: 7.2 0.2