Công Nghệ Sinh Học Thực Vật Phần 1 - GS.ts. Mai Xuân Lương

TRNG AI HOC A LAT
F7G
GIAO TRNH
CONG NGHE SINH HOC

THC VAT
GS.TS. MAI XUAN LNG
2005
Cong nghe Sinh hoc thc vat
-1-
MC LC
MC LC ............................................................................................................- 1 PHAN I. NHAN GIONG IN VITRO ....................................................................- 3 M AU ..............................................................................................................- 3 CHNG I. NHNG NGUYEN TAC CUA NUOI CAY MO ............................- 5 TRONG CONG TAC VI NHAN GIONG.............................................................- 5 I. GII THIEU CHUNG...................................................................................- 5 II. TAI SINH CAY CON TRONG NUOI CAY MO. ........................................- 6 1. Nhan giong t hat trong ieu kien vo trung. .............................................- 6 2. Nuoi cay phoi............................................................................................- 6 3. Nuoi cay te bao trng................................................................................- 6 III. NHAN GIONG CAY CON BANG BIEN PHAP NUOI CAY MO. ............- 7 1.Giai oan I. Kien lap va on nh mau cay. ................................................- 7 2.Giai oan 2: nhan giong.............................................................................- 9 3.Giai oan 3: hnh thanh re. ........................................................................- 9 4.Giai oan 4. Lam cho cac cay tai sinh thch nghi kh hau........................- 10 IV. S LC LCH S PHAT TRIEN CUA NUOI CAY MO THC VAT.- 11 CHNG II. PHONG TH NGHIEM NUOI CAY MO TE BAO THC VAT. - 15 I. BAO AM IEU KIEN VO TRUNG.........................................................- 15 1. Y ngha cua vo trung trong nuoi cay mo thc vat. ..................................- 15 2. Nguon nhiem tap. ..................................................................................- 15 3. Vo trung dung cu thuy tinh, nut ay va moi trng. ...............................- 15 4. Vo trung mo cay. ....................................................................................- 16 5. Vo trung ni thao tac cay va tu cay vo trung. .........................................- 17 II. CHUAN B MOI TRNG.......................................................................- 17 1. ng. ....................................................................................................- 18 2. Cac muoi khoang a lng. ....................................................................- 18 3. Cac muoi khoang vi lng. .....................................................................- 19 4.Cac vitamin..............................................................................................- 19 5. Cac chat kch thch sinh trng (phytohormone). ...................................- 20 6. Cac chat hu c khac. .............................................................................- 21 7. Chuan b cac dung dch am ac va dung dch lam viec. .......................- 21 8. Van e la chon moi trng....................................................................- 23 III. CHON VA X LY MO CAY. ..................................................................- 23 IV. PHONG TH NGHIEM NUOI CAY MO THC VAT. ...........................- 24 1.Cach bo tr phong th nghiem nuoi cay mo. .............................................- 24 2. Cac thiet b chu yeu cua phong th nghiem nuoi cay mo thc vat. .........- 24 CHNg III. CAC PHNG PHAP NUOI CAY MO ......................................- 26 I. NUOI CAY NH SINH TRNG............................................................- 26 1/ Nuoi cay nh sinh trng cay khoai tay.................................................- 27 2/ Nuoi cay nh sinh trng cay a lan.....................................................- 29 II. NHAN GIONG BANG CON NG PHAT SINH PHOI VO TNH ......- 32 III. NHAN GIONG BANG CACH TAO MO SEO (CALLUS). .....................- 34 IV. NHAN GIONG BANG NUOI CAY LAT MONG....................................- 36 -
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
-2-
V. NG DUNG KY THUAT VI GHEP TRONG NHAN GIONG. ................- 38 VI. NUOI CAY TUI PHAN ...........................................................................- 41 1.Chon vat lieu khi nguyen.......................................................................- 41 2.Tao cac to hp gen mi bang phng phap lai hu tnh. .........................- 41 3.Nuoi cay tui phan cay lai. ........................................................................- 42 VII. NUOI CAY VA DUNG HP PROTOPLAST THC VAT ................- 45 1. Tach va nuoi cay protoplast thc vat. .................................................- 46 2. Dung hp protoplast................................................................................- 48 VIII. CHUYEN GEN THC VAT .................................................................- 51 1. Agrobacterium. .......................................................................................- 51 2. Chuyen gen nh Agrobacterium.............................................................- 52 PHAN II. NHAN GIONG VO TNH TRONG VM M.............................- 54 CHNG I. YEU TO MOI TRNG CUA NHAN GIONG ...........................- 54 I. CAC YEU TO C BAN VE VI KH HAU CUA MOI TRNG NHAN
GIONG. ..........................................................................................................- 54 1.Anh sang ..................................................................................................- 54 2. Nc va o am........................................................................................- 55 3. Nhiet o. .................................................................................................- 55 4. Kh va trao oi kh. .................................................................................- 55 5. Dinh dng khoang.................................................................................- 55 II. KHAY, CHAU TRONG CAY....................................................................- 56 1.Khay phang ay. ......................................................................................- 56 2. Chau at nung. ........................................................................................- 56 3. Chau plastic. ...........................................................................................- 56 4. Chau si. .................................................................................................- 56 5. Chau giay................................................................................................- 57 6. Tui polyethylene.....................................................................................- 57 7. Khay trong bang go. ...............................................................................- 57 III. QUAN LY CAC YEU TO THO NHNG TRONG NHAN GIONG VA
SAN XUAT CAY GIONG..............................................................................- 57 CHNG II. KY THUAT NHAN GIONG MOT SO CAY PHO BIEN. ...........- 63 I. KCH THCH TAO RE. ..............................................................................- 63 II. S DUNG PHYTOHORMONE KCH THCH CANH CHIET RA RE. ...- 64 III. NHAN GIONG CAY TRONG T RE. ....................................................- 65 IV. NHAN GIONG T VAY CU ...................................................................- 69 V. NHAN GIONG T LA. .............................................................................- 70 VI. NHAN GIONG BANG PHNG PHAP CHIET CANH.........................- 72 VII. NHAN GIONG CAY O QUYEN. ........................................................- 73 VIII. GHEP CANH. ........................................................................................- 74 -
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
-3-
PHAN I. NHAN GIONG IN VITRO
M AU
Giong la mot khau rat quan trong trong san xuat nong nghiep. Cong tac
giong chu yeu bao gom cac khau thu thap nguon gen, bao quan quy gen, lai tao,
tuyen chon, th nghiem giong va nhan giong.
Nh phng phap nuoi cay mo te bao thc vat nen ngay nay phan ln cac
cong viec nay c thc hien mot cach kha thuan li va nhanh chong.
S hnh thanh va phat trien cua phng phap nuoi cay mo te bao thc vat la
ket qua cua nhng phat hien sau ay trong lnh vc sinh ly thc vat va di truyen hoc
phan t:
1. Tnh toan the (potipotency) cua mo va te bao thc vat cho phep tai sinh
c cay hoan chnh t mo, tham ch t mot te bao nuoi tach ri;
2. Kha nang tao cac cay n boi qua nuoi cay tui phan, t o tao cac dong
ong hp t tuyet oi va nh o rut ngan c chu trnh lai tao;
3. Kha nang hap thu ADN ngoai lai vao te bao thc vat va kha nang
chuyen gen e gay bien oi (transformation) thc vat do ADN ngoai lai nh cong
nghe gen (genetic engineering);
4. Kha nang nuoi cay cac te bao thc vat nh nuoi cay vi sinh vat dan en
kha nang ng dung di truyen phan t vao thc vat bac cao e phuc vu cho cong tac
tao giong;
5. Ky thuat nuoi cay protoplast va kha nang dung hp protoplast, tai sinh
cay hoan chnh t protoplast lai (cybrid);
6. Kha nang loai tr virus bang phng phap nuoi cay nh sinh trng, tao
cac dong vo tnh sach benh cac cay nhan giong vo tnh;
7. Kha nang dung choi nach, cac the choi protocorm vao nhan giong vo
tnh vi toc o cc nhanh mot so cay trong;
8. Kha nang s dung phng phap nuoi cay phoi e khac phuc hien tng
bat thu khi lai xa;
9. Kha nang bao quan cac nguon gen bang nuoi cay trong ong nghiem;
10. Kha nang ton tr cac te bao thc vat song trong thi gian dai va nhiet
o thap ma khong mat tnh toan the cua te bao.
Nuoi cay mo te bao thc vat khong ch gop phan giai quyet mot cach co hieu
qua cong tac giong cay trong ma con m ra mot chan tri mi trong nghien cu di
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
-4-
truyen thc vat, cac c che sinh tong hp thc vat, sinh ly phat trien, vai tro cua
phytohormone trong i song thc vat va nhieu van e sinh hoc c ban khac.
Nuoi cay mo te bao thc vat con la cong cu e thu nhan cac chat co hoat tnh
sinh hoc (alcaloid, steroid...) qua nuoi cay mo te bao cay thuoc quy mo ln.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
-5-
CHNG I. NHNG NGUYEN TAC CUA NUOI CAY MO

TRONG CONG TAC VI NHAN GIONG
I. GII THIEU CHUNG.
Kha nang kien lap va duy tr cac c quan va cac mo thc vat (phoi, nh sinh
trng, re, hoa te bao, callus, te bao tran) trong nhan giong vo trung e tai sinh
nhng cay mi t chung la ket qua cua nhng nghien cu c ban va nghien cu ng
dung trong cac phong th nghiem thc vat hoc, benh hoc va di truyen hoc t cuoi
the ky 19. Cong viec nay c goi chung la nuoi cay mo va c quan, nuoi cay trong
ong nghiem, vi nhan giong va thuat ng mi nhat la cong nghe sinh hoc.
Cac quy trnh chnh cua cong nghe sinh hoc bao gom tai sinh choi, tai sinh
cay con, tao callus va tao phoi vo tnh.
Vi nhan giong khac vi phng phap nhan giong truyen thong cho qua trnh
c chia thanh nhieu giai oan e co the kiem moi kha canh cua qua trnh tai
sinh va phat trien cay con. Moi bc cua trat t cong viec co the c thao tac
(hoac lap chng trnh) bang cach chon mau cay va kiem tra moi trng nhan
giong. Nhn sau vao cac c che sinh hoc cua moi qua trnh vi nhan giong se co the
tm thay kha nang ng dung no trong phng phap nhan giongcay con phuc vu san
xuat ai tra.
Trong chng nay se mo ta cac cong viec a neu va xac nh cac c s hnh
thai, sinh ly va di truyen cua qua trnh sinh trng va phat trien cua cay trong nuoi
cay mo.
Trc het hay cung nhau nam vng y ngha cua mot so thuat ng quan trong.
Nuoi cay mo. Thuat ng nay dung cho mot trat t cac thao tac dung e
duy tr va sinh trng cua cac mo thc vat (tao callus, te bao, te bao tran), cua cac
c quan trong nuoi cay vo trung. Ky thuat nay dung e nhan giong, cai bien
genotype (tc tao giong mi), san xuat sinh khoi cha cac san pham hoa sinh hoc,
nghien cu benh hoc thc vat, bao quan phoi va cac nghien cu khoa hoc. Tat ca
cac thao tac nay eu c goi chung la cong nghe sinh hoc.
Vi nhan giong. Thuat ng dung e am ch cong viec nhan giong thc vat
trong ong nghiem. Co 4 giai oan phat trien ac trng cua cong viec nay la kien
lap, nhan choi, tao re va lam cho cay con tai sinh thch nghi vi kh hau.
Mau cay. o la mau thc vat dung e nhan giong. Mau cay co the la oan
canh cat, lat mong, choi hoac hat.
Tao phoi vo tnh. S hnh thanh phoi t cac te bao sinh dng ch khong
phai t hp t sau khi thu phan.
Callus. S hnh thanh cac te bao khong phan hoa (thng la t cac te bao
nhu mo).
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
-6-
II. TAI SINH CAY CON TRONG NUOI CAY MO.

Phng phap nhan giong trong ong nghiem co the c s dung co hieu qua
trong hang loat kieu thao tac cho nay mam va tai sinh cay con neu co bien phap
bao ve e tranh s nhiem tap va khi nhng tr ngai mang tnh di tryen cua mau
cay c khac phuc.
1. Nhan giong t hat trong ieu kien vo trung.

Thanh cong cua phng phap nhan giong t hat at c oi vi hat hoa lan.
Hat hoa lan rat be, khong cha chat dinh dng d tr va noi chung phu thuoc vao
quan he cong sinh vi mot so loai nam ac hieu e tiep nhan chat dinh dng.
Ngi ta a tnh c khoang 30.000 hat trong mot qua Catleya. Nam 1922 Levis
Knudson thong bao ket qua nuoi cay thanh cong hoa lan trong moi trng nuoi
cay khong cong sinh co cung cap muoi khoang va ng saccharose. C s cua s
thanh cong nay la s phat hien rang calcium hypochloride co the c s dung e
kh trung be mat ma khong gay oc cho phoi ang nay mam. Quy trnh nay a rut
ngan ang ke thi gian nhan giong. Hien nay no van c s dung e cho nay
mam cac hat lai.
2. Nuoi cay phoi.

Nuoi cay phoi bao gom tach phoi t hat va cho no nay mam trong moi trng
vo trung. Cong dung chu yeu cua ky thuat nay la cu cac phoi khong the nay
mam ben trong hat trc khi qua chn. Rat nhieu cay lai gia cac loai bc au
c nhan giong bang phng phap nay rat co ket qua nhng oi khi phoi b hong
trong qua trnh phat trien (hien tng bat thu cua phoi vo tnh). Nhng dong chn
sm cua nhieu loai cay an qua co xu hng cho qua chn trc khi phoi cua chung
phat trien ay u. Trong ieu kien t nhien nhng phoi nay de b hong nhng neu
tach chung va nuoi chung trong moi trng nuoi cay thch hp th co the lam cho
chung nay mam.
ng dung th hai cua nuoi cay phoi la kch thch nay mam nhng hat chn
ang ngu e rut ngan chu trnh nhan giong.
3. Nuoi cay te bao trng.

He thong nay bao gom nuoi cay vo trung trng tach ri, noan (a thu phan
hoac cha thu phan), va thc gia noan gan ben trong te bao trng. Mac du ky thuat
nay a c s dung lan au tien e nghien cu cac van e ve cay an qua va s
phat trien cua hat, quy trnh thch hp a c s dung trong nhan giong, ac biet
la trong viec lam hoan thien bo gen.
Te bao trng cha thu tinh c tach va cay trong moi trng dinh dng
cung vi phan hoa va sau o cho thu phan trong ong nghiem. Quy trnh nay a
c s dung rat co hieu qua oi vi nhng cay co nhieu loai te bao trng. Phan
hoa co the at trc tiep vao thc gia noan e ong phan co the phat trien trc tiep
vao te bao trng.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
-7-
Te bao trng nuoi cay rat co hieu qua trong viec cu phoi khi con rat non neu
nh chung cha b tach khoi cay me. ay la ky thuat n gian hn nhieu so vi
nuoi cay phoi. Cac te bao trng co the c kh trung de dang hn va noi chung co
the sinh trng de dang trong moi trng c ban co cha muoi khoang, ng va
oi khi can them mot so phytohormone.
Ky thuat nuoi te bao trng t pho bien va co nhu cau dinh dng khoang thay
oi. oi vi a so cac loai moi trng c ban ve muoi khoang vo c va ng la
quan trong, nhng auxin co the can c s dung e kch thch sinh trng.
III. NHAN GIONG CAY CON BANG BIEN PHAP NUOI CAY MO.
Vi nhan giong phan ln cay trong bao gom 4 giai oan chu yeu c thc
hien tren cac moi trng khac nhau va chu cac bien phap kiem tra khac nhau:
-
Giai oan I: Kien lap, tc tao cac ieu kien can thiet e tai sinh cay con t
mau cay;
Giai oan II: Nhan cay giong
Giai oan III: Tao re;
Giai oan IV: Lam cho cac cay tai sinh thch nghi kh hau.
1.Giai oan I. Kien lap va on nh mau cay.

Muc tieu cua giai oan I la at thanh cong mau cay vao moi trng vo trung
bang cach tranh b nhiem tap va chuan b ay u moi trng trong ong nghiem e
tai sinh c cay con mot cach on nh. Giai oan nay bao gom cac noi dung sau:
1/ Chon mau cay. S la chon va duy tr nguon thc vat la yeu to quan trong
am bao s thanh cong cua vi nhan giong. Co 3 kha canh oi hoi phai ac biet
quan tam:
a/ ac iem di truyen va phat sinh ca the cua nguon thc vat dung e nhan
giong.
b/ Kiem tra nguon gay benh.
c/ ieu kien sinh ly cua cay cho phep s dung no trong nhan giong.
Trc het, xac nh ung ac iem di truyen la rat quan trong bi v s nham
lan giai oan nay co the lam nay sinh nhng van e phc tap va gay nen s thiet
hai ang ke ve kinh te trc khi tm c con ng chuyen sang cac giai oan
tiep theo. Trong so cac loai va giong cay trong khac nhau co s bien ong ang ke
ve kha nang tai sinh cay con trong cac ieu kien nhan giong khac nhau. Can phai
thc hien s nghien cu mot cach co he thong e co c nhng kien thc va kinh
nghiem can thiet oi vi tng loai cay. Can phai danh thi gian e xac nh nhu
cau cua nhng giong cay cha quen thuoc, mac du, noi chung, co the tm c
thong tin ve nhng giong cay o trong cac tai lieu a xuat ban.
Noi chung, nhng thc vat de nhan giong bang cac bien phap thong thng
th cung e thc hien vi nhan giong. V du cac loai thao moc va de nhan giong
thong thng va de thc hien vi nhan giong. Trong khi o cac loai cay go th kho
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
-8-
tai sinh hn nhieu va e nhan giong chung can phai tm c cac phng phap
thch hp.
Thanh cong trong vi nhan giong cac loai cay go rat phu thuoc vao ac iem
cua cay non dung e nhan giong. Vi nhan giong cay con moc t hat de hn nhieu
so vi nhng cay a trng thanh, va cac chung khac nhau cua cung mot loai cay
trong thng co cac yeu cau ac trng rieng trong vi nhan giong. Noi chung, yeu to
han che trong vi nhan giong la s hnh thanh re ch khong phai la tang sinh trng
bo re a hnh thanh. Cac thao tac nham thu nhan nhng cay giong tre hoa bao gom
s la chon nhng bo phan con tre cua phan goc cay con sinh ra t hat e tao ra
choi bat nh va phoi hp bang cach ghep nhng choi bat nh nay vi cay con sinh
trng t hat.
Muc ch cua vi nhan giong la tao c cay giong tre hoa co ay u kha nang
ra re. S tien bo ve kha nang ra re va song song vi no la nhng bien oi ve sc
khoe va hnh thai cua cay con a c ghi nhan mot so loai cay go.
2/ Kh trung mau cay. Cac yeu to gay nhiem trong vi nhan giong bao gom:
a/ Nhiem nam, nam moc, nam men va vi khuan tren be mat mau cay;
b/ Nhiem virus va cac c the tng t virus;
c/ Cac nguon benh ben trong.
Trong mot so trng hp cac yeu to gay nhiem khong ch lam c che sinh
trng va s ra re cua cay con thu nhan c trong vi nhan giong ma con duy tr
tac dung c che nay sau khi trong cay con thu nhan c ra vn m.
Cac yeu to gay nhiem hau nh co mat khap moi ni. e diet tr chung thng
hay s dung cac chat hoa hoc ma thong dung nhat la Calcium hypochloride va
Natrium hypochloride. Nhng chat nay gay tac dung oc cho vi sinh vat gay
nhiem nhng t oc oi vi cay trong c nhan giong trong ong nghiem.
3/ ieu kien sinh ly la s x ly mau cay e viec nuoi cay de thanh cong hn.
Co 3 ieu kien sinh ly quan trong la:
a/ Mau cay lay t nhng cay trong trong cac thung cha nuoi trong nha knh
vi s kiem tra moi trng chat che;
b/ Phai tao c nhng cay giong khoe manh;
c/ X ly phytohormone.
4/ Moi trng nuoi cay. Moi trng nuoi cay thng dung la moi trng na
ran co cha agar hoac cac san pham thng mai tng t, cac muoi khoang dinh
dng a lng va vi lng, nguon nang lng ma chu yeu la ng saccharose va
mot so vitamin can thiet. Ngoai ra, trong phan ln moi trng con co cha cac loai
phytohormone thuoc hai nhom auxin va cytokinin vi ty le thch hp oi vi tng
loai cay. Toc o tai sinh cay con trong cac moi trng nay tuy thuoc vao tng loai
cay trong.
5/ Dch r trong vi nhan giong. Mot hien tng khong mong muon thng xay
ra khi tien hanh vi nhan giong va hien tng dch r t mau cay thoat ra. Gay tac
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
-9-
hai nhieu nhat la cac hp chat phenol khac nhau. Khi chung b oxy hoa se lam cho
moi trng nga sang mau nau, c che s tai sinh va sinh trng cua cay con. e
han che tac hai cua loai dch r nay can phai co bien phap x ly ma chu yeu la s
dung cac chat chong oxy hoa, ke ca bo sung cac chat hap phu vao moi trng nh
polyvinylpyrrolidone hoac than hoat tnh.
6/ Lam on nh mau cay. Cac mau cay oi hoi phai c cat va cay chuyen
nhieu lan e tao ra nhng cay con ong nhat va sinh trng tot. Phan ln cay mot
nam va cay thao moc c on nh nhanh chong sau mot so lan cay, trong khi o
cay go oi hoi nhieu lan cay hn, tham ch rat kho at c tnh on nh. S kho
khan trong viec lam on nh mau cay thng gan lien vi trang thai sinh trng
cua mau cay: mau cay con non de c on nh hn. Mua vu sinh trng cua mau
cay cung lien quan vi s on nh nay.
2.Giai oan 2: nhan giong.

Muc ch cua giai oan 2 la duy tr viec vi nhan giong trang thai on nh va
nhan c nhieu cay con theo yeu cau. Moi trng c ban cua giai oan 2 cung
giong nh giai oan 1.Toc o vi nhan giong nhanh chong san pham thng mai co
the oi hoi s toi u hoa khong nhng cac nguyen to vo c ma ca cac yeu to khac
cua moi trng. ieu. nay co the thc hien c bang cach th mot cach he thong
cac nong o khac nhau cua cac nguyen to s dung trong s phoi hp vi cac yeu to
khac.
Cac chat ieu hoa sinh trng c dung e duy tr mc o sinh trng c ban
cung nh phan ng phat trien cua cay nhan giong. Cytokinin mot so nong o co
tac dung kha manh trong viec kch thch tao choi. Noi chung, nong o toi thieu cua
cytokinin kch thch tao choi c la chon trong qua trnh nhan giong. Nong o
cao cua cytokinin van kch thch tao choi nhng co the c che qua trnh sinh trng
cua choi theo chieu dai. V vay, xac nh chnh xac nong o cytokinin la rat can
thiet. Auxin thng c dung vi nong o thap hoac khong c s dung giai
oan 2.
T le nhan giong la so cay thu c trong mot lan vi nhan giong. Noi chung, t
le nhan giong t choi bat nh ln hn so vi t choi nach. Tuy nhien, t le nhan
giong t mot so loai choi ac biet thng co the cao hn choi bat nh. V vay, t le
nhan giong cao nhat khong nhat thiet phai la ang ao c nhat e duy tr chat
lng cua cay con thu c.Tan so nhan giong co the keo dai t hai en tam tuan.
Ky thuat cay chuyen can c toi u hoa oi vi tng loai cay trong, bao gom
kch thc va tnh mua vu cua mau cay, phng phap cat va hng at mau cay
len moi trng.
3.Giai oan 3: hnh thanh re.

Chc nang cua giai oan nay la tao re cho mau cay chuyen e sau o mang
chung ra trong tren moi trng vo trung cua vn m. Viec tao re co the c
thc hien ben trong hoac ben ngoai ong nghiem va bao gom cac cach sau:
Tao re trong ong nghiem.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 10 -
a/ Cay chuyen cac ot cay sang moi trng tao re co t le phytohormone thay
oi bang cach giam hoac hoan toan khong cha cytokinin va tang auxin. Ham
lng muoi khoang thng giam i mot na.
b/ Cay chuyen cac ot cay sang moi trng tao re (thng la moi trng
nc) trong mot vai ngay va sau o cay chuyen chung sang moi trng khong cha
auxin e tao re. Mau cay co the c at di anh sang hoac trong toi oi vi vai
loai, trong moi trng co the cha cac yeu to bo sung hu ch, v du phloroglucinol.
Tao re ben ngoai ong nghiem
Nhieu he thong vi nhan giong thng mai hoac thc nghiem tranh tao re
trong ong nghiem bang cach x ly mau cay bang auxin ma at chung trc tiep vao
moi trng tao re trong ieu kien sng mu hoac co o am cao e cho chung ra re.
Phng phap nay khong nhng tao ra s di chuyen tot ep mau cay t moi trng
ong nghiem ra ieu kien ben ngoai ma con giup tiet kiem thiet b nuoi cay. Co hai
cach thc hien:
a/ X ly mau cay bang auxin (thng dung IBA) bang cach nhung nhanh
chung vao dung dch phytohormone va gan chung vao moi trng trong vn m
co o am cao;
b/ X ly mau cay bang auxin t 5 en 15 ngay nh x ly trong ong nghiem
tren agar hoac trong moi trng nc, sau o ra sach agar va at chung vao moi
trng ngoai ong nghiem.
Co s khac biet ro rang ve hnh thai gia s hnh thanh re trong ong nghiem
va ngoai ong nghiem. Cac mau cay ngoai ong nghiem co xu hng tao re bnh
thng hn ca mau cay trong ong nghiem. Sau khi chuyen ra trong vn m
nhng cay tao re trong ong nghiem co the b chet, trong khi nhng cay tao re ngoai
ong nghiem de thch nghi vi ieu kien moi trng h va co t le song sot cao.
Mot kha canh tot cua nhan giong trong ong nghiem la nhieu loai thc vat
thong thng kho ra re bang cach giam canh ngoai ong nghiem lai co the ra re khi
tien hanh vi nghan giong trong ong nghiem. ieu nay chu yeu lien quan vi trang
thai trng thanh cua cay dung lam mau cay, bi v nhng mau cay lay t khu vc
con non cua cay thng de nhan giong hn.
4.Giai oan 4. Lam cho cac cay tai sinh thch nghi kh hau.
Giai oan nay bao gom s di chuyen t ac iem d dng (can cung cap
ng) sang ac iem t dng (co kha nang quang hp) va s thch nghi cua cay
con mi tai sinh vi moi trng ngoai ong nghiem. Gi cho so cay con nay tiep tuc
sinh trng la rat quan trong v s thch nghi vi kh hau va phat trien trong ieu
kien t dng rat phu thuoc vao kha nang sinh trng tiep tuc cua cay con t sau
khi a chung ra khoi ong nghiem. Nhng cay con tai sinh trong ong nghiem can
phai gi trong ieu kien co o am cao e thch nghi dan vi ieu kien moi trng,
ac biet la lam cho chung tranh b mat nc.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 11 -
Nhng choi con hnh thanh trong qua trnh vi nhan giong co hnh thai la kha
ac biet. Kch thc la va so lp te bao tao ra la thap hn ang ke so vi nhng la
hnh thanh sau khi chuyen cay con ra vn m. Do o am cao trong ong nghiem
tren la khong phat trien lp sap bao ve vi so lng va chat lng can thiet. Ket
qua la nhng la hnh thanh trong vi nhan giong b kho rat nhanh sau khi c rut ra
khoi ong nghiem.
X ly e thuc ay toc o thch nghi vi kh hau.
Trc khi a cay ra khoi ong nghiem:
a/ Lam giam o am (khoang 35%) cua moi trng trong ong nghiem trc khi
a cay con ra ngoai. Cong viec nay co the c thc hien bang cach at chat hut
am vao ong nghiem hoac lam lanh ay ong nghiem. M nap ong nghiem t 5 en
7 ngay trc khi em cay con ra ngoai co the la mot bien phap hieu qua.
b/ Lam tang kha nang tham thau cua moi trng (thng c thc hien bang
cach bo sung them ng saccharose).
c/ S dung cac chat ieu hoa sinh trng trc khi a cay con ra ngoai co the
mang lai cac ket qua kha quan khac nhau.
Sau khi a cay ra khoi ong nghiem:
a/ Giam t t o am la bien phap x ly thong dung nhat e lam cho cay con
thch nghi vi kh hau. o am co the duy tr bang cach x ly sng mu gian on
hoac at cay con trong mang polyethylene. ay la bc rat quan trong trong qua
trnh cho cay lam quen vi kh hau.
b/ Chong thoat hi nc bang cac oc to thc vat. Cong viec nay khong c
s dung rong rai vi muc ch thng nghiep.
IV. S LC LCH S PHAT TRIEN CUA NUOI CAY MO

THC VAT.
Sau khi hoc thuyet te bao cua Schwan va Schleiden ra i nam 1838 nhieu
nha sinh hoc tin tng rang bang cach nuoi cay ngi ta co the tao thanh cong cac
phoi nhan tao, va t o tao cac cay con hoan chnh, t cac te bao sinh dng.
Giai oan au tien cua lch s phat trien cua nuoi cay mo te bao thc vat co
the c anh dau bang nhng th nghiem au tien cua Kotte va Robbins. Nam
1922 hai nha khoa hoc nay a bc au thanh cong trong viec dung nh sinh
trng e nuoi cay re cua mot cay hoa thao trong moi trng long co cha muoi
khoang va glucose.
Giai oan th hai c bat au nam 1934 khi White, mot nha sinh hoc ngi
My, a nuoi cay thanh cong trong mot thi gian dai au re ca chua (Lycopersicum
esculenttum) trong mot moi trng long cha muoi khoang, glucose va nc chiet
nam men, va sau o thay the nc chiet nam men bang hon hp 3 loai vitamin
nhom B la vitamin B1, vitamin B6 va vitamin PP.
Sau khi Went va Thimann phap hien chat kch thch sinh trng thc vat au
tien la IAA, nam 1939 Gautheret a s dung thanh cong chat nay va cac vitamin
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 12 -
nhom B noi tren e kch thch sinh trng mo seo cua cay ca rot va duy tr sinh
trng cua mo seo nay trong thi gian vo han tren moi trng thach.
Nam 1941 Overbeck chng minh tac dung kch thch sinh trng cua nc
da trong nuoi cay phoi cay ho ca (Dacura); va sau o, nam 1948, Steward xac
nhan tac dung cua nc da tren mo seo ca rot. Trong thi gian nay cung vi IAA
mot so auxin khac a c phat hien va tong hp thanh cong, nh NAA va 2,4D.
Nhieu tac gia nhan thay cung vi nc da 2,4D va NAA a giup tao mo seo va
phan chia te bao nhieu thc vat rat kho nuoi cay.
Nam 1954 Skook phat hien mot loai phytohormone au tien thuoc nhom
cytokinin la 6-furfuryllaminopurin (kinetin) t dch thuy phan ADN va tac dung
kch thch sinh trng cua no oi vi mo than cay thuoc la.
Viec phat hien vai tro cua IAA, NAA, 2,4D, va kinnetin cung vi phat hien
vai tro cua nc da va vitamin la nhng bc tien rat quan trong trong qua trnh
phat trien cua nuoi cay mo te bao thc vat. o la tien e ky thuat cho viec xay
dng cac moi trng nuoi cay on nh ve mat hoa hoc e thc hien cac th nghiem
va nghien cu khac nhau, dan en s phat trien nhanh chong cua ky thuat nuoi cay
mo trong giai oan tiep theo.
ac biet quan trong la phat hien cua Skoog va Miller nam 1957 ve anh hng
cua t le cytokinin/auxin trong moi trng nuoi cay oi vi s hnh thanh c quan
cua mo seo thuoc la. Khi t le nay thap mo seo co khuynh hng phat trien re;
ngc lai, khi t le nay cao th mo seo co khuynh hng tao choi. Hien tng nay
c xac nhan nhieu cay khac nhau va ong gop rat ln vao viec ieu khien sinh
trng, phat trien, phat sinh c quan cua mo te bao nuoi cay. Thanh cong cua
Skoog va Miller dan en nhieu phat hien quan trong khac, m au cho giai oan
th ba cua nuoi cay mo thc vat.
Giai oan nay c anh dau bang nhng thanh cong sau ay:
- Tach va nuoi cay thanh cong cac te bao n dang huyen phu va nuoi cay
chung trong thi gian dai (Muir, Hildebrandt va Riker, 1954 1959;, Nickell, 1956;
Bergman, 1960...) Nhieu tac gia a thanh cong trong viec tao c cay hoan chnh
t mot te bao, chng minh cho tnh toan the cua te bao thc vat. Thanh cong nay
m ra nhng trien vong mi trong viec tao ra cac dong te bao ot bien, cac dong te
bao sieu san xuat (over-production) mot san pham th cap nao o va kha nang tan
so ot bien trong di truyen ot bien thc vat bac cao;
- Thanh cong trong nuoi cay tui phan e tao cay n boi (Guha va
Maheswari, 1966 oi vi cay ca oc dc; Bourgin va Nitsch 1967 oi vi cay
thuoc la...). Ngay nay viec tao cay n boi qua nuoi cay tui phan va hat phan a
thanh cong rat nhieu cay va a ong gop vo cung to ln vao viec tang them kien
thc di truyen thc vat va thc tien chon giong.
- Phat hien cua Cooking (1960) trong viec phan huy vo cellulose cua vach te
bao thc vat, tao ra cac te bao tran (protoplast). Sau o (1970) Nagata vaTakebe
tao lai c vo cellulose cho nhng te bao tran nay va Takabe, Labid Melchers a
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 13 -
nuoi cay va tai sinh cac cay hoan chnh t protoplast. Do protoplast co kha nang
dung hp vi nhau va hap thu cac phan t ln hoac tham ch cac c quan t ben
ngoai nen viec nuoi cay thanh cong protoplast va tai sinh cay hoan chnh t chung
m ra trien vong ng dung thanh cong nay trong cong tac tao giong, chon giong.
Ngay nay hy vong nay a c thc hien, khi nhieu nhom nghien cu khac nhau
tren the gii cong bo lai thanh cong gia loai nh ky thuat protoplast, mot viec
khong the thc hien c bang lai hu tnh co ien. Ve mat ly luan, protoplast la
cong cu khong thay the c e nghien cu hien tng nhiem sac the hoa hp cua
cac te bao khac loai sau khi dung hp va vai tro cua ADN trong cac c quan t va
quan he cua chung vi ADN cua nhan te bao.
- Thanh cong trong cong nghe chuyen gen t nhng nam 1980-1982. Ngi ta
s dung cac plasmid, tc cac phan t ADN vong thng co trong cac te bao vi
khuan e chuyen tai cac gen t protoplast nay en protoplast khac. Bang cach o
ngi ta a a c cac gen ngoai lai vao te bao thc vat. Tiep sau o ngi ta
con s dung cac bien phap khac e chuyen gen trong nuoi cay protoplast nh ky
thuat s dung thiet b xung ien (electroprorator), ky thuat vi tiem (
microinjection), ky thuat sieu am (ultrasonic gen transfer), ky thuat ban gen (gene
gun) ...
- Thanh cong trong cong tac nhan giong va phuc trang giong bang phng
phap nuoi cay nh sinh trng. Ngay t 1969 Morel a nhan thay nh sinh trng
cua cac loai a lan (Cymbidium) khi em nuoi cay se hnh thanh cac protocorm.
Khi chia cat nhng protocorm nay e tiep tuc nuoi cay se hnh thanh nhng
protocorm mi. Khi e trong nhng ieu kien nhat nh, nhng protocorm nay se
tai sinh thanh nhng cay hoan chnh. Hn na, cac te bao nh sinh trng cua
thc vat cha rat t hoac hoan toan khong cha virus, do o, vi phng phap nuoi
cay nh sinh trng Morel co the phuc trang, tao cac dong vo tnh khong b nhiem
virus.
Viec ng dung nuoi cay mo thc vat trong nhan giong c Nozeran nang len
mot mc mi khi ong nhan thay s hoa tre cua cac choi nach cay nho va cay khoai
tay em nuoi cay va cay chuyen nhieu lan trong ong nghiem.
Viec ng dung nuoi cay mo trong nhan giong va phuc trang giong ngay nay
khong con han che mot vai loai cay ma a c thc hien quy mo thng mai
oi vi hang loat cay trong co y ngha kinh te nh chuoi, ca phe, co dau, san, khoai
lang, khoai tay, ma, cay an qua co mui v.v... va a co nhng ong gop to ln cho
nong nghiep the gii.
Ngay nay chung ta ang bc vao giai oan phat trien th t cua nuoi cay mo
te bao thc vat. o la giai oan nuoi cay mo thc vat c ng dung manh me vao
thc tien chon giong, nhan giong, vao viec san xuat cac chat co hoat tnh sinh hoc
va vao nghien cu ly luan di truyen thc vat bac cao. Nhng hieu biet c ban ve
i song cua mo, cua te bao tach ri trong moi trng nhan tao, ve nhu cau cua
chung oi vi nguon carbon, dinh dng khoang, vitamin, phytohormone... nhng
ky thuat c ban e tach, nuoi cay, ieu khien s phan hoa t cac bo phan khac nhau
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 14 -
cua cay trong ... la nhng tien e a c chuan b t nhng giai oan trc. ong
thi, nhieu cong nghe mi, nhieu trang thiet b hien ai a c phat minh e phuc
vu cho viec ng dung cac thanh tu cua nuoi cay mo te bao thc vat vao thc tien
san xuat.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 15 -
CHNG II. PHONG TH NGHIEM NUOI CAY MO TE BAO

THC VAT.
cac c s nghien cu va san xuat co s dung ky thuat nuoi cay mo khac
nhau tuy thuoc vao hoan canh thc te ngi ta co the xay dng cac phong th
nghiem vi cac trang thiet b vi mc o hien ai khac nhau. Tuy nhien, tat ca cac
phong th nghiem nay eu phai am bao c ba yeu cau sau ay:
-
Bao am ieu kien vo trung;

Chon ung moi trng va chuan b moi trng ung cach;
Chon mo cay thch hp, x ly mo cay thch hp trc va sau khi cay.
I. BAO AM IEU KIEN VO TRUNG.

1. Y ngha cua vo trung trong nuoi cay mo thc vat.
Moi trng nuoi cay mo thc vat rat thch hp cho nam va vi khuan phat
trien. Do toc o sinh trng cua nam va vi khuan rat nhanh so vi te bao thc vat,
nen neu trong thi gian nuoi cay ch nhiem mot vai bao t nam hoac vai vi khuan
th ch sau vai ngay hoac vai tuan toan bo be mat cua moi trng nuoi cay mo se b
nam hoac vi khuan phu ay, lam cho mau mo cay khong the tiep tuc sinh trng va
chet dan.
Thong thng mot chu ky nuoi cay mo thc vat keo dai t 1 en 5 thang, khac
vi th nghiem vi sinh vat, co the ket thuc trong vai ngay. Nh vay, mc o vo
trung trong th nghiem nuoi cay mo thc vat oi hoi rat nghiem khac.
2. Nguon nhiem tap.

Co ba nguon nhiem tap chnh la:
- Dung cu thuy tinh, moi trng va nut ay khong c vo trung tuyet oi;
- Tren be mat hoac ben trong mo cay ton tai cac si nam, bao t nam hoac
vi khuan;
- Trong khi thao tac lam ri nam hoac vi khuan theo bui len be mat moi
trng.
3. Vo trung dung cu thuy tinh, nut ay va moi trng.

Dung cu thuy tinh dung trong nuoi cay mo thc vat can phai chu c nhiet
o 160-180oC khi vo trung kho va 120oC khi vo trung t. Trc khi s dung, dung
cu thuy tinh can c ra sach, e rao nc va kh trung kho trong tu say 160oC
trong 1 gi. Sau khi e nguoi c lay ra e vao cac hop giay kn cat vao cho t bui.
Nut ay: thng dung nhat la bong khong tham nc. Nut phai tng oi chat
e khong cho bui i qua, ong thi nc t moi trng khong b boc hi qua de
dang trong qua trnh nuoi cay.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 16 -
Gan ay ngi ta dung nhieu loai nut ay khac thay the nut bong, nh nut
nha (va ca bnh cay) chu nhiet, nut cao su, nut kim loai rat thuan tien cho viec
kh trung kho hay t.
Moi trng: Noi chung, moi trng c pha che trong ieu kien khong vo
trung va em hap vo trung khi a phan phoi vao cac bnh cay va a ay nut hoac
nap. Thi gian vo trung t 20 en 45 phut 120oC. Sau khi vo trung can phai lam
kho nut bong hoac nap ay. Cac dung dch me dung e pha moi trng (nh dung
dch muoi khoang, vitamin, phytohormone v.v... khong nen pha nhieu (100-200ml)
va can c bao quan trong ngan a cua tu lanh. oi vi cac chat khong chu nhiet,
co the b phan huy nhiet o 120oC can tien hanh loc vo trung (v du loc qua pheu
loc thuy tinh so 5 hay qua cac loai mang loc vo trung) trc khi c a vao moi
trng a hap vo trung.
4. Vo trung mo cay.
Mo cay co the la tat ca cac bo phan khac nhau cua thc vat. Tuy theo s tiep
xuc vi moi trng, cac bo phan nay eu cha nhieu hay t vi khuan va nam. ong
lua non khi con trong be hay mo tht qua thng t nhiem vi sinh vat, ngc lai, la,
than, ac biet la re do nam trong at nen co o nhiem vi sinh vat rat cao. V vay
oi vi cac loai mo cay khac nhau ngi ta kh trung bang cac phng phap khac
nhau.
Phng phap vo trung mo cay thong dung nhat hien nay la dung cac chat hoa
hoc co hoat tnh diet nam diet khuan. Hieu lc diet nam, khuan cua cac chat nay
phu thuoc vao thi gian x ly, nong o va kha nang xam nhap cua chung vao cac
ke ngach loi lom tren be mat mo cay, kha nang ay het cac bot kh bam tren be
mat mo cay. e tang tnh linh ong va kha nang xam nhap cua chat diet khuan,
thong thng ngi ta x ly mo cay trong vong 30 giay trong ru ethylic 70%, sau
o mi x ly dung dch diet khuan. ong thi, ngi ta them cac chat giam sc
cang be mat nh Tween 80, fotoflo, teepol... vao dung dch diet nam khuan.
Cac chat diet nam khuan thng dung va cho ket qua rat tot la calcium
hypochloride 9-10% x ly trong thi gian 5-30 phut, natrium hypochloride 9-10%
x ly trong thi gian 5-30 phut va nc brom 1-2% x ly t 2-10 phut. Ngoai ra,
hydro peroxide 10-12% x ly trong 5-10 phut va chlorua thuy ngan 0,1-1,0% x ly
trong 2-10 phut cung cho ket qua tot oi vi tng loai mo cay.
Trong thi gian x ly mo cay phai ngap hoan toan trong dung dch diet khuan.
Cac bo phan co nhieu bui at, trc khi x ly can c ra sach bang nc may.
Khi x ly xong, mau cay can c ra sach (t nhat 3 lan) bang nc cat vo trung.
Nhng phan tren mo cay b dung dch kh trung lam cho trang ra can c cat bo
trc khi at mo cay len moi trng.
Vo trung mo cay la mot thao tac kho, t khi thanh cong ngay lan au tien. V
vay, can phai kien tr tm cho c nong o va thi gian vo trung thch hp cho tng
loai mo cay.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 17 -
5. Vo trung ni thao tac cay va tu cay vo trung.

Mot trong nhng nguon nhiem tap quan trong va thng xuyen nhat la bui ri
vao dung cu nuoi cay cha moi trng trong khi m nap hoac nut bong trong khi
thao tac cay. Can ap dung nhieu bien phap khac nhau e tranh s nhiem tap nay.
Buong cay: thng la cac buong co dien tch hep, rong t 10-15 m2, co hai lp
ca e tranh khong kh chuyen ong t ben ngoai trc tiep a bui vao. Buong cay
can co san lat gach trang men, tng sn e co the lau ra thng xuyen. Mat ban
lam viec cung can lat gach trang men hay phu knh e tien lam ve sinh hang ngay.
Trc khi lam viec phai lau mat ban bang con 90%.
Trc khi a vao s dung, buong cay can c x ly hi formol bang cach
rot formol 40% ra mot so nap a petri e rai rac vai ni trong phong cho bay hi t
do. ong kn ca phong cay trong 24 gi, sau o bo formol i va kh hi formol
tha bang dung dch ammoniac 25% cung trong 24 gi.
Cac dung cu mang vao buong cay eu phai c kh trung trc: t quan ao
choang, mu vai, khau trang cua ngi cay en dao keo, kep, giay boc, bong, ong
nghiem, bnh ng nc cat v.v... Tren ban cay thng xuyen co mot en con e s
dung trong khi cay va mot so coc ng con 90% e nhung cac dung cu lam viec.
Trc khi cay, ngi cay can lau tay ky en khuyu tay bang con 90%. e
am bao mc o vo trung cao, trong phong cay can co mot en t ngoai 40W treo
tren tran. Ch bat sang en nay khi khong co ngi trong phong cay. Can giam s
chuyen ong khong kh trong buong cay en mc toi thieu, v vay can tranh ra
vao buong cay nhieu lan.
e tranh s ngot ngat trong buong cay, co the quat khong kh qua cac lp
bong thuy tinh ngan bui vi toc o nho vao buong cay.
Tu cay: Trong mot so trng hp ngi ta s dung cac tu cay ong bang go
hoac ghep bang knh. Tuy nhien, ngay nay cac loai tu cay vo trung lamine
(laminar-aie-flow cabinet) c dung kha pho bien. o la loai tu cay co thiet b
thoi khong kh a loc vo trung vao cho thao tac cay. Nh co he thong mang loc, tu
cay lamine loai tr mot cach co hieu qua nguon nhiem tap t ben ngoai va tao ieu
kien thoai mai cho ngi cay.
II. CHUAN B MOI TRNG.

Thanh phan moi trng nuoi cay mo thc vat thay oi tuy thuoc loai, bo phan
nuoi cay, muc ch nuoi cay va nhieu yeu to khac. Tuy vay, tat ca cac moi trng
nuoi cay bao gi cung gom 3 thanh phan:
-
ng lam nguon carbon,
Cac muoi khoang a lng,
Cac muoi khoang vi lng
Cac vitamin,
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc

-
- 18 -
Cac phytohormone.
Ngoai ra, ngi ta con thng them vao moi trng nuoi cay mot so chat hu
c thanh phan hoa hoc xac nh (aminoacid, EDTA...) hoac khong xac nh (nc
da, nc chiet nam men...)
1. ng.
Trong nuoi cay mo, nguon carbon e mo, te bao thc vat tong hp nen cac
chat hu c giup te bao phan chia, tang sinh khoi cua mo khong phai do quang hp
cung cap ma do ng trong moi trng. Hai dang ng thng s dung nhat la
saccharose va gucose, nhng saccharose c dung pho bien hn.
Tuy theo muc ch nuoi cay, nong o saccharose bien oi t 1-6% (w/v),
thong dung nhat la 2%, tng ng vi 58,4mM.
Trong trng hp nuoi cay te bao quang hp nong o ng co the giam
xuong hoac bohan.
2. Cac muoi khoang a lng.

Nhu cau muoi khoang cua mo te bao tach ri khong khac nhieu so vi cay
trong trong ieu kien t nhien. Cac nguyen to a lng can phai cung cap la nit,
phospho, kali, magie, sat.
Nguon nit: Mo te bao thc vat trong nuoi cay co the s dung cac dang nit
khoang nh amon va nitrat, ong thi co the s dung cac dang nit hu c nh
aminoacid. Ty le giua nit dang amon va nitrat thch hp tuy theo loai cay va trang
thai phat trien cua mo.
Nitrat c cung cap di dang muoi canxi nitrat (Ca(NO3)2,4H2O), kali nitrat
(KNO3), natri nitrat (NaNO3) hoac amon nitrat (NH4NO3). Amon cung cap di
dang muoi amon sulphat (NH4)2SO4 hoac amon nitrat NH4NO3. Trong mot so t
trng hp co the c cung cap dang ure. Tong nong o cua NO3- va NH4+ trong
moi trng thay oi t 3 en 6mM, thong thng khoang 2mM.
Nguon phospho: Hai dang phospho thng dung nhat la NaH2PO4.7H2O va
KH2PO4. Nong o phospho trong moi trng bien thien t 0,15 en 4,00mM,
thng dung khoang 1,00mM.
Nguon kali: Ngi ta thng cung cap kali cho mo nuoi cay di dang kali
nitrat KNO3, kali chlorua KCl,kali phosphat KH2PO4. Nong o K+ trong moi trng
bien thien t 2 en 25 mM, trung bnh khoang 10mM.
Nguon canxi: Canxi c cung cap di dang muoi canxi nitrat
Ca(NO3)2.4H2O), canxi chlorua CaCl2.6H2O hoac CaCl2.2H2O. Nong o Ca2+ trong
moi trng t 1,0 en 3,5mM, trung bnh la 2,0mM.
Nguon magie: Magie c cung cap di dang magie sunphat MgSO4.7H2O,
vi nong o trong moi trng khoang 0,5 3,0mM.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 19 -
Nguon sat: Nhng moi trng co ien dung sat dang chlorua sat
FeCl2.FeCl3.6H2O, sulphat sat FeSO4.7H2O, Fe2(SO4)3, citrat sat Fe(C4H4O6). Hien
nay hau het cac phong th nghiem eu dung sat dang chelat ket hp vi Na2ethylen diamintetraacetat (EDTA). dang nay sat khong b ket tua va giai phong
dan ra moi trng theo nhu cau cua mo thc vat.
3. Cac muoi khoang vi lng.

Nhu cau muoi khoang vi lng cua mo thc vat trong nuoi cay mo la lnh vc
con t c nghien cu. e an toan, ngi ta cung cap hau het cac nguyen to vi
lng can thiet oi vi cay cho mo nuoi cay trong moi trng nhan tao, v vay s
cung cap nay co tnh chat kinh nghiem chu ngha, trong nhng trng hp cu the co
the la khong can thiet.
Cac vi lng thong dung c gii thieu trong bang 1.
Bang 1. Cac vi lng thong dung

Ten vi lng
Nong o M
Dang s dung
Mangan (Mn)
MnSO4.4H2O
15 100
Bo (B)
H3BO3
6 100
Kem (Zn)
ZnSO4.7H2O
15 30
ong (Cu)
CuSO4.5H2O
0,04 0,08
Molypden (Mo)
(NH4)6Mo7O24.4H2O, NaMoO4.2H2O
0,007 1,0
Coban (Co)
CoCl2.6H2O
0,1 0,4
Iot (I)
KI
2,5 20,0
4.Cac vitamin.
2).
Cac vitamin sau ay thng c dung trong cac moi trng nuoi cay (bang
Bang 2. Cac vitamin thng c dung trong cac moi trng nuoi cay mo.
Ten vitamin
Myo-inozitol
Nong o s dung (mg/l)

100
Acid nicotinic (Niacin, vitamin PP)
0,5 1,0
Pyridoxine HCl (vitamin B6)
0,05 0,5
Thiamine HCl (vitamin B1)
10 - 50
Panthotenat canxi
GS.TS. Mai Xuan Lng
15
Khoa Sinh hoc
- 20 -
Riboflavine (vitamin B2)
15
Biotin
0,1 1,0
Acid folic
0,1 1,0
Cac vitamin thng dung c pha trong hon hp cac dung dch me co nong
o cao gap 500 hoac 1000 lan dung dch lam viec va c bao quan nhiet o di
0oC. Nen chia san dung dch me vitamin ra nhieu lo nho, moi lo u dung cho mot
hoac vai lt moi trng va bao quan trong ngan a tu lanh.
5. Cac chat kch thch sinh trng (phytohormone).

3.
Cac phytohormone thng dung trong nuoi cay mo c trnh bay trong bang
Ten phytohormone
Nong o s dung (mg/l)
2,4D (Dichlorophenoxyacetic acid
0,2 5,0
- NAA (- Naphtylacetic acid)
0,1 - 5,0
-IAA (-Indolacetic acid)
5 20
IBA (Indolbutyric acid)
15
Kinetin (6-Furfurylaminopurine)
0,1 2,0
BA (6-BAP) (6-Benzylaminopurine)
0,1 2,0
2-iP (N6,-Dimethylallylaminopurine)
0,1 2,0
GA3 (Gibberellic acid)
0,1 2,0
Thng ngi ta pha cac dung dch me phytohormone co nong o cao gap
1000 lan dung dch lam viec. Do mot so phytohormone t tan trong nc nen can
phai pha nh sau: Can lng phytohormone u pha 100 ml dung dch me vao mot
ly kho. oi vi 2,4D, NAA, IAA, IBA, GA, trc het them 2 3 ml ru ethylic
90% va lac en khi tan het, sau o them nc cat en 100 ml. oi vi BA va 2-iP
trc het them 2 3 ml nc cat va vai giot HCl 1N, lac cho tan, sau o len the tch
en 100ml.
Bao quan dung dch me phytohormone trong lo kn (rieng IAA trong lo mau
nau), cat gi trong tu lanh, 2,4D, NAA tng oi ben, co the bao quan nh vay
trong mot nam. 2-iP, IBA, kinetin, GA bao quan c t 2 en 3 thang. IAA can
pha lai hang thang e am bao hoat tnh.
Can chu y, phytohormone co the tac ong len mo nuoi cay nong o rat thap,
v vay can dung pipet rieng cho tng loai phytohormone va chu y ra can than cac
dung cu thuy tinh a dung e ng va pha che cac phytohormone nong o cao.
Tr IAA va GA, cac phytohormone con lai c coi la ben vng trong qua
trnh hap vo trung.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 21 -
6. Cac chat hu c khac.

Nc da: chat co hoat tnh trong nc da a c chng minh la myoinozitol va mot so aminoacid. Lng nc da dung trong moi trng nuoi cay
thng kha ln, t 15 en 20% the tch moi trng.
Lay nc da trai da gia, loc trong va bao quan trong lanh sau cho en khi
dung. Thi gian bao quan khong qua vai thang, tot nhat la s dung ti.
Nc chiet nam men: la cac che pham thng dung trong nuoi cay vi sinh vat,
mo te bao ong vat, a c tieu chuan hoa va ban di dang thng pham. Thanh
phan hoa hoc khong ro, tr mot so aminoacid. Lng thng dung la 1 gam cho 1
lt moi trng.
7. Chuan b cac dung dch am ac va dung dch lam viec.

e thuan tien cho viec pha cac moi trng nuoi cay (moi trng lam viec)
ngi ta pha trc cac dung dch am ac, sau o ch can pha loang khi s dung.
Cac dung dch am ac c bao quan dai ngay trong tu lanh thng hoac tu lanh
sau.
Hien nay mot so hang san xuat hoa chat a co ban loai moi trng chuan b
san thanh goi gom u cac thanh phan thch hp vi mot muc ch nhat nh, v du,
moi trng MS e nhan giong mot so cay canh. Khi dung ch can hoa mot goi vao
mot lt nc cat, un soi la co ngay mot moi trng lam viec.
Sau ay chung ta se lam quen vi cong viec pha che moi trng qua v du vi
cac moi trng MS va White.
Trc het chung ta pha cac dung dch am ac (thng goi la dung dch me)
A, B, C, D, E, F, G va H vi thanh phan va nong o theo bang 1 (moi trng MS)
hoac bang 2 (moi trng White).
Bang 1. Thanh phan cac dung dch me MS.
Dung
dch
me
A
Hoa chat
Nong o (g/l)
EDTA
0,8
Fe2(SO4)3
0,38
NH4NO3
82,5
KNO3
95,0
H3PO3
1,24
KH2PO4
34,00
KI
0,166
Na2MoO4.2H2O
0,050
GS.TS. Mai Xuan Lng
So ml dung dch me
can cho 1000ml
dung dch lam viec
28
20
Khoa Sinh hoc
- 22 -
CoCl2.6H2O
0,005
MgSO4.7H2O
74,00
MnSO4.4H2O
4,46
ZnSO4.7H2O
1,72
CuSO4.5H2O
0,005
CaCl2.2H2O
88,00
Thiamine.HCl
0,02
NAA
0,10
Kinetin
0,40
0,5
Sau o, e pha 1 lt moi trng lam viec can thc hien cac ong tac sau:
-
Cho khoang 800ml nc cat vao mot cai bnh co dunh tch 2 lt;
Dung pipet cho 28ml dung dch me A, 20ml dung dch me B, 5ml moi
dung dch me C, D,E, F, 1 ml dung dch me G va 0,5ml dung dch me H.
Trong khi tron lan cac dung dch can luon luon khuay eu;
Them 100 ml mezo-inozitol;
o pH va dung HCl 0,1N va NaOH 0,1N e chnh pH en 6,5;
Them 20g saccharose va khuay cho tan
Them 6-8g aga-aga;
un soi cho en khi tan het thach, va un va khuay eu e aga-aga

khong b chay;
Chia hon hp dung dch nay vao cac ong nghiem hay bnh non khi con
ang nong trong khi aga-aga cha ong lai.
Bang 2. Thanh phan cac dung dch me White.

Dung
dch
me
Hoa chat
Nong o (g/l)
Ca(NO3)2.4H2O
3,0
Na2SO4
2,0
KNO3
0,80
KCl
0,65
NaH2PO4.2H2O
0,19
MgSO4.7 H2O
75,0
MnSO4.4H2O
0,50
GS.TS. Mai Xuan Lng
So ml dung dch me
can cho 1000ml
dung dch lam viec
100
10
Khoa Sinh hoc
- 23 -
ZnSO4.7H2O
0,30
H3PO3
0,15
KI
0,075
CuSO4.5H2O
0,001
Na2MoO4.2H2O
0,025
Fe2(SO4)3
0.25
10
Thiamine.HCl
0,01
10
Pyridoxine.HCl
0,01
10
8. Van e la chon moi trng.

Trong nuoi cay mo te bao thc vat co hang tram loai moi trng khac nhau.
Tuy nhien co the chia chung thanh 3 nhom:
- Moi trng ngheo dinh dng: ien hnh la moi trng Knop, moi trng
Knudson C;
- Moi trng trung bnh: ien hnh la moi trng moi trng White; moi
trnng B5 cua Gamborg;
- Moi trng giau dinh dng: ien hnh la moi trng Murashige Skoog
(moi trng MS).
V vay khi bat au nghien cu nuoi cay mo mot oi tng nao o ma cha co
tai lieu tham khao ve moi trng e nuoi cay oi tng o th trc het can tien
hanh th nghiem tham do mot trong 3 loai moi trng noi tren e tm moi trng
thch hp. Sau khi a tm thay moi trng thch hp chung ta co the tng bc cai
tien e t tm cho mnh moi trng thch hp nhat cho muc ch, oi tng va noi
dung nghien cu. V du, chung ta co the th tm ty le NO3-/NH4+ cho tng loai oi
tng. Vi cac cay trong tren can ngi ta thng khong dung NH4+ nhng oi vi
mot so cay khac co kha nang hap thu manh NH4+ nh cay lua th s dung ion nay
trong nuoi cay mo chac chan se em lai ket qua tot.
Do moi trng MS c xem la moi trng giau va can bang ve chat dung
dch, thch hp cho nhieu loai cay nen nhng ngi tap s lam nuoi cay mo thng
bat au bang moi trng nay trc khi tm ra moi trng rieng cua mnh.
III. CHON VA X LY MO CAY.

Ve nguyen tac, tr nhng mo a hoa go cac mo khac ttrong c the thc vat
eu co the dung lam mo cay. Tuy vay, cac mo con non nh mo phan sinh ngon,
tng tang, chop re, phoi ang phat trien, tht qua non, la non, cuong hoa, e hoa,
mo phan sinh ot... khi nuoi cay trong moi trng cha mot lng phytohormone
thch hp eu co kha nang tao mo seo hoac tai sinh cay con. Thong thng, e bat
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 24 -
au nghien cu nhan giong vo tnh mot cay nao o ngi ta thng dung choi nach
hoac mo phan sinh ngon.
Can chu y rang tuy mang mot lng thong tin di truyen nh nhau, cac mo
khac nhau tren cung mot cay co the cho cac mo seo phat trien hoan toan khac nhau
vi kha nang tai sinh choi, re hay toan cay rat khac nhau. V vay, khi bat au mot
chng trnh s dung phng phap nuoi cay mo e chon giong va nhan giong mot
cay nao o, trc het can th nghiem tm hieu phan ng cua cac bo phan khac nhau
cua cay trong nuoi cay cac nong o phytohormone khac nhau. V du, oi vi cay
ma, ket qua nghien cu cua nhieu tac gia cho thay la non ang con boc trong be
va ong hoa non la mo cay thch hp hn ca cho viec tao mo seo va tai sinh cay
hoan chnh.
Sau khi cay, mo cay can c at trong cac ieu kien nhiet o va anh sang on
nh phu hp vi nhu cau cua tng loai mo cay nh cac may ieu hoa t ong.
IV. PHONG TH NGHIEM NUOI CAY MO THC VAT.

Nuoi cay mo thc vat khong can nhieu may moc ac tien.. Co the bat au
hoat ong nuoi cay vi cac thiet b toi thieu gom noi hap vo trung va buong cay vo
trung hoac tu cay bang go co trang b en t ngoai.
1.Cach bo tr phong th nghiem nuoi cay mo.

Mot phong th nghiem nuoi cay mo hien ai c thiet ke phu hp vi tnh
chat day chuyen cua cong viec nh mo ta trong hnh 1.
1
5
6
10
Hnh 1. S o mot phong th nghiem nuoi cay mo hoan chnh:

1: Phong ra va san xuat nc cat; 2: phong say, hap, kho thuy tinh sach;
3: phong chuan b moi trng; 4: phong chuan b mau; 5: phong cay vo
trung; 6: phong anh; 7: phong knh hien vi; 8,9: phong sang; 10: phong
sinh hoa.
Ben canh phong th nghiem phai co he thong nha knh, vm m e trong
cay lay nguyen lieu nuoi cay va cay tai sinh trong ong nghiem.
2. Cac thiet b chu yeu cua phong th nghiem nuoi cay mo thc vat.
Mot phong th nghiem nuoi cay mo thc vat can co cac trang thiet b chu yeu
sau ay:
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 25 -
Rat can
Tuy theo nhu cau
PHONG RA VA NC CAT:
+ May cat nc mot lan 12-20l/h
+ May cat nc hai lan 5l/h

+ May san xuat nc kh ion
PHONG SAY HAP

+ Tu say 60 600oC
+Noi hap loai nho 20-30-lt
+ Noi hap dung tch 70 -100 lt

PHONG CHUAN B MOI TRNG
+ May o pH chnh xac 0,1 n v
+Giay o pH
+ Can phan tch o chnh xac 0,1mg
+ May khuay t
+ Can ky thuat
+ May rot moi trng
+ Bep ien, bep gas hoac bep dau hoa
+ Tu lanh sau (-20oC)
+ Tu lanh thng dung tch 200-400 lt

BUONG CAY VO TRUNG
+ en t ngoai treo tran hoac treo tng
+ Thiet b loc khong kh
+ Tu cay lamine hoac tu cay ong bang go

PHONG ANH
+ May anh va thiet b chup gan
+ Cac dung cu in anh en trang hoac mau

+ May chieu
PHONG KNH HIEN VI

+ Knh hien vi hai mat
+ Thiet b chup anh tren knh hien vi
+ Knh lup hai mat
+ Microtome va cac dung cu e quan sat

te bao hoc
PHONG SANG
+ cac gian en huynh quang 3000-4000 + May lac ngang khoang 100 vong/phut
lux
+ Cac dung cu nuoi cay te bao n
+ May ieu hoa nhiet o
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 26 -
CHNG III. CAC PHNG PHAP NUOI CAY MO
I. NUOI CAY NH SINH TRNG

Mo phan sinh nh cha nhng te bao nh sinh trng va c bao boc bi
mot lp vo co cau tao cutin han che thap nhat qua trnh mat nc.
thc vat s hnh thanh mi cac c quan bat au trong cac mo phan sinh
nh. Cac mo may phan hoa ngay t nhng giai oan phat trien au cua phoi va gi
lai trong suot i song cua cay. ieu nay xay ra la do trong mo phan sinh co s
phan hoa cua cac te bao khi sinh. Tat ca cac te bao con lai eu xuat phat t nhng
te bao khi sinh nay.
V mo phan sinh co the tch tng oi on nh nen cac te bao sinh ra t cac te
bao khi sinh sau mot vai lan phan chia se ri khoi mo phan sinh (hnh 2).
Hnh 2. nh sinh trng.

Qua trnh sinh trng cua c quan dien ra theo 3 giai oan. Trong giai oan
th nhat, thng c goi la giai oan phoi sinh, trong cac iem sinh trng (trong
cac mo phan sinh nh) xay ra s hnh thanh mam c quan va s phan chia au tien
cua no thanh cac mo rieng biet. Trong giai oan th hai do s sinh trng nhanh
chong, mam c quan at en kch thc toi a va tr nen co hnh dang xac nh.
Cuoi cung, trong giai oan th ba ket thuc s phan hoa te bao, bat au s hoa go
cac vach te bao, ket qua la te bao khong con kha nang tiep tuc sinh trng. Trc
het cac u la xuat hien. The tch cua u la tang rat nhanh va keo theo no mot phan ln
cua nh sinh trng. Dan dan u la chuyen thanh mam la (the nguyen thuy). Mam
la sinh trng nhanh theo chieu dai. Do s sinh trng xay ra khong eu nen la
mam t cong len pha nh. Sau khi la c tach ra lai xay ra s phan phoi lai s
phan chia te bao, ket qua la the tch cua nh sinh trng c khoi phuc nhanh
chong va s hnh thanh la mi lai bat au.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 27 -
moi nach la eu co choi nach. Choi nach thc chat co cau tao khong khac
nh sinh trng cua than. Do hien tng c che u the ngon nen choi nach khong
phat trien, nhng khi c anh thc va bat au sinh trng chung co cau tao giong
nh nh sinh trng ngon.
Qua trnh tong hp ADN cua virus thc vat khong xay ra trong nh sinh
trng do mot c che hien nay khong ro. V vay mo nh sinh trng la mo duy
nhat sach virus trong mot cay nhiem virus. Do o trong ky thuat nuoi cay mo te bao
nh sinh trng c s dung e tai sinh nhng cay con sach virus.
Do vung mo phan sinh qua nho, ky thuat tach nh sinh trng c thc hien
di knh lup. Cac nh sinh trng kch thc 0,1 0,15 mm se tao ra c 100%
so cay con sach benh va t le nay giam dan en kch thc 1 mm. Mat khac, mau
cay cang nho cang kho tai sinh cay con va kha nang song sot cua mau cay cang
giam. V vay, noi chung, kch thc tng oi thng s dung la dai t 0,25 en 1,0
mm. X ly nhiet (Thermotherapy) cac cay trc khi t o lay nh sinh trng co
the lam tang kha nang loai tr virus. Mot so hoa chat loai tr virus, nh ribavirein,
c bo sung vao moi trng nuoi cay se lam tang kha nang tai sinh cay con sach
virus.
Khi a tao c cay con co u re, no co the c s dung lam nguyen lieu e
tao dong sach benh phuc vu san xuat.
Cay con nhan giong t nh sinh trng c s dung rat co hieu qua oi vi
nhieu loai cay thao moc. Cac vat lieu thu c t chng trnh nay a tr thanh
hng san xuat cay giong rat quan trong oi vi nhieu loai cay thng pham nh
cam chng, cuc, hoa lan, phong l, khoai tay, khoai lang, san, chuoi va nhieu cay
khac. Chng trnh nay phc tap hn oi vi cac loai cay go. oi vi nhom cay
nay phng phap vi ghep la mot giai phap thay the. Cai thien cac phng phap vi
nhan giong cay go co the lam m rong tnh hieu qua cua viec nhan giong nhom
cay nay.
Chung ta hay lam quen vi ky thuat nuoi cay nh sinh trng qua viec nuoi
cay nh sinh trng cay khoai tay va cay a lan Cymbidium.
1/ Nuoi cay nh sinh trng cay khoai tay.

Morel va Martin (1955) la nhng ngi au tien dung phng phap nuoi cay
nh sinh trng e thu c cay khoai tay khong cha virus. Ngay nay phng
phap nay a va ang c s dung nhieu nc tren the gii.
Phng phap nay bao gom nhng noi dung c ban sau ay:
Lay mot cu khoai tay trong vao mot chau at trong ieu kien nhiet o va anh
sang bnh thng. Khi mam cao 15cm, lay phan ngon dai 6-8 , cat bo 2 la di, cam
vao mot cai ly ng at mun a vo trung, ay mot ly khac e tranh b heo trong
vong 10 ngay cho ra re.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 28 -
Sau 3-4 tuan chuyen ly co cay vao ieu kien chieu sang 3000-4000 lux vi
che o chieu sang 16h/ngay, nhiet o khong kh 36oC ban ngay va 33oC ban em.
Sau o 2 tuan cat bo ngon mam e thuc cac choi nach phat trien. Sau khi x ly
nhiet 6 tuan, lay phan ngon choi nach e tach nh sinh trng. Cat bo bt la va at
choi tren mot t giay loc am trong mot hop long e tranh b heo. Khong can thiet
phai vo trung choi nach trc khi lam thao tac tach nh sinh trng, nhng can
tach trong ieu kien vo trung va dung cu tach phai c vo trung bang con va nc
cat vo trung. Di knh lup co o phong ai X 25 dung kim nhon e gat bo cac la
ngoai, e lo nh sinh trng vi hai la nguyen thuy. Dung mot manh dao cao gan
len au mot que sat e cat lay mo nh sinh trng co chieu dai khoang 0,6mm.
Dung kim nhon a nh sinh trng len mat moi trng thach, gi 23oC trong
ieu kien chieu sang16 gi/ngay em. Sau vai tuan, khi cay a ln c 3 cm va co
re, co the chuyen qua moi trng mi. Khi cay co nhieu la, cat oan va nhan len
nhieu cay, ong thi a chan oan virus tren cac cay ch th nh Gompherena
globa (virus X), Chenopodium amaraticolor (virus S va X), Solanum demisum
(virus Y).
Moi trng dung e cay nh sinh trng cua khoai tay la moi trng MS co
bo sung 0,5mg/l IAA, 0,1mg/l GA va 100mg/l inozitol. Neu thay cay khoai tay kho
ra re, can them 10mg than hoat tnh vao mot ong nghiem trc khi vo trung. Dung
ong nghiem nho 12 x 100mm, moi ong nghiem 3,5ml moi trng.
Sau khi a chac chan khong con virus trong cay khoai tay, cac ong nghiem
c a vao nhan giong va bao quan.
Khi a co c cac dong khoai tay khong cha virus, van e at ra la phai
duy tr, bao ve c cac dong nay khong b tai nhiem. Phng phap duy nhat co the
duy tr c giong khoai tay sach benh trong ieu kien nc ta la bao quan trong
ong nghiem bang phng phap nuoi cay mo. Hn the na, nhan giong khoai tay
bang phng phap nuoi cay mo la phng phap nhan giong cc nhanh. Toan bo quy
trnh nhan giong khoai tay bang phng phap nuoi cay mo phuc vu san xuat bao
gom cac bc sau ay:
Bc 1: Nhan giong trong ong nghiem; Tuy theo dien tch gieo trong, moi ha
cb can 50 ong nghiem.
Bc 2: Khay me: cat va cam cac oan than cay khoai tay t ong nghiem tren
cat am trong mot khay go 40 x 60 cm.Moi oan than co mot la, mot choi nach.
Khoang cach cam 3 x 3 cm. Che nang, gi am 7 ngay au. Khi oan than ra re ti
dung dch NPK loang moi ngay mot lan. Thng xuyen phun thuoc phong tr sau,
benh. Sau mot thang cat ngon e nhan tiep tren at nh mo ta bc 3. Sau khi
cat ngon 5-7 ngay, cac choi nach bat len cung c cat tiep e nhan tren at. Khay
me c s dung lien tiep tren 12 thang e cat choi ngon.
Bc 3: Nhan tren luong ma: Ngon chnh va cac choi thu tren luong cat c
cam vao at am giau dinh dng (ty le 3 phan at, 1 phan phan a hoai) goi la
luong ma khoai tay. Hon hp at phan can c vo trung s bo e tr sau benh va
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 29 -
c trai thanh luong rong 80 cm, dai 5 10 m. Be day lp at 6 8 cm. Khoang

cach cam ngon 5 x 5 cm. sau khoang 20 ngay lai tiep tuc cat ngon e tiep tuc nhan
sang luong ma khac. C nh vay cac luong ma khoai tay co the khai thac lien tuc
trong vong 6 7 thang.
Bc 4: Nhan giong trong bau at: Bau at lam bang la chuoi cuon tron, kch
thc khoang 3 x 8 cm, ben trong cha at giau mun nh oi vi khay ma bc 3.
Ngon va choi thu hai bc ba c cam vao bau at, moi bau at mot ngon. Che
nang va gi am 4 5 ngay au. Khi cay a ra re va vn ngon th th bo che va ti
hang ngay bang dung dch NPK loang. 15 20 ngay sau khi cay cay khoai tay co
bo re phat trien manh, than map, ngon vn cao tren 10 cm, co them nhieu la mi.
Luc nay co the em trong ngoai ong ruong.
Bc 5: Cay khoai tay bau at c trong vi mat o cao (100 ngan cay/ha)
e han che hnh thanh cu ln, tao nhieu cu nho 15-50 gam.
Bc 6: Trong cu nho a nay mam vi mat o 30.000 cay/ha e san xuat cu
giong. Khi thu hoach, sau khi loai bo cu ln e lam khoai thng pham, cu nho va
trung bnh dung lam giong cho the he tiep theo.
2/ Nuoi cay nh sinh trng cay a lan.

Nam 1962 George Morel lan au tien thanh cong trong viec nuoi cay mo a
lan Cymbidium.
Ngay nay, ky thuat nhan giong Cymbidium bang phng phap nuoi cay mo
a c pho bien rong rai. nhieu nc ben canh viec san xuat cay giong tren qui
mo cong nghiep con san xuat cay giong qui mo gia nh.
Ky thuat nhan giong Cymbidium bang phng phap nuoi cay mo c thc
hien qua cac bc c ban nh sau:
+ Chon cay giong va mo phan sinh:
-
Chon cay lan co nhieu ac iem tot ap ng c muc tieu kinh doanh;
- Lay te bao phan sinh t cac ot cay, choi ngu va nhng choi phat hoa con
non. Nhng ot cay la tot nhat cho viec nhan giong.
+ Chuan b mo e nuoi cay.
- Cat cac nh sinh trng, boc cac la bao, ra sach phan than con lai;
- Kh trung bang cac chat diet nam khuan thng dung nh calcium
hypochloride 9-10%, natrium hypochloride 9-10% trong 5-30 phut va nc brom 12% t 2-10 phut. Ngoai ra, hydro peroxide 10-12% trong 5-10 phut va chlorua thuy
ngan 0,1-1,0% trong 2-10 phut cung cho ket qua tot oi vi tng loai mo cay.
-
Boc nhe nhang cac la non en khi nhn thay mam nho ben trong;
Dung dao nhon lay mam a vao moi trng nuoi cay.
Tat ca cac thao tac tren eu phai tien hanh trong ieu kien vo trung.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 30 -
+ Moi trng nuoi cay:

Moi trng thng dung la moi trng MS, Vacin-Went hoac Knudson C.
Sau khoang 30 ngay t nh sinh trng hnh thanh cac the choi (protocorm)
nho li ti. Chia nho cac the choi nay e cay chuyen se tao ra c mot so lng ln
the choi. Khi cay chuyen sang moi trng thch hp t nhng the choi nay se hnh
thanh cac cay con hoan chnh.
Nhan giong hoa lan bang phng phap cay mo trong mot thi gian ngan co
the tao ra mot so lng cay giong ln cung cap cho cac c s nuoi trong tao nguon
hang xuat khau.
Nuoi trong, cham soc cay giong sau ong nghiem.
Cay con trong cac bnh cay khi moc c 2 re tot co the chuyen ra ngoai
trong vao chau chung hoac trong thanh luong. Trc khi trong cay lan con t trong
bnh lay ra can c bo vao chau nc e ra sach agar va vet tch moi trng bam
vao re. Chau trong lan va cac dung cu e trong lan con phai c kh trung, sau o
cho than cui hoac gach vun vao khoang na chau roi tuy thuoc loai lan can trong
ma them vao mot lp than, gach nhuyen hoac dn, x da cho gan ay chau.
at cac cay lan con vao chau e re xen ke vao cac lp than, gach va cong
dn. Moi chau chung trong khoang 30-40 cay con. Dung vo thong at chung quanh
chau va gia cac cay e bao ve bo re, khong cho chung lay ong khi gio manh hoac
khi ti nc.
Sau khi trong lan vao chau chung, can phai phun thuoc phong tr benh hai
nh dung dch captan hoac thiuran pha mot tha ca phe trong lt nc. Cac chau
chung phai e ni co mai che tranh nc ma va anh sang mat tri trc tiep chieu
vao cay con.
Cay lan con nuoi trong trong chau chung 4 thang th bat au chuyen sang
chau rieng kch thc nho 8cm. Ngam chau chung vao nc 1 gi e g lan con ra
khoi chat trong, tranh ton thng re cua cay. Moi trng trong cay lan giai oan
nay cung giong nh giai oan chau chung. Khi cay lan a co 4-6 la th chuyen sang
chau c 11-12cm. Trong va cham, soc lan con trong chau va cho en khi re phat
trien ra ngoai chau; cay co khoang 6-8 la th chuyen sang chau c ln 15-17cm va
cham ssoc cho en khi ra hoa.
Toan bo lan con trong trong chau chung, chau rieng, chau va c at len
sap cao 50cm, tren sap co gian che nang bang li polyethylen mau xanh hoac mau
en cao 2,5-3m so vi mat at. Ti nc va bon phan theo yeu cau oi vi tng
loai lan.
e tao ieu kien cho cay lan sinh trng va phat trien tot can phai s dung
che o bon phan hp ly.
Cay lan con sau khi ra khoi bnh cay t giai oan luc trong chau chung can
thiet phai tang cng dinh dng cho cay. Giai oan nay can giup cho cay sinh
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 31 -
trng manh nen can bon phan am vi ty le cao hn lan va kali. Tot nhat la bon
phan NPK vi ty le 30-10-10 nam ngay mot lan vao mua nang va 10-15 ngay mot
lan vao mua ma.
giai oan cay ln can phai cung cap dinh dng am bao cho cay sinh
trng va phat trien manh. Neu che o dinh dng va cham soc khong tot se anh
hng ln en s ra hoa va chat lng hoa.
Moi giong lan, moi loai lan co nhng yeu cau cham soc khac nhau. Nhng oi
vi giai oan nay co the ap dung che o phan bon nh sau:
C 5 ngay ti phan mot lan:
Lan 1 dung loai phan 20-20-20 va vi lng hoac pha che NPK theo ty le tren;
Lan 2 dung nc tieu ngi hoac phan heo, phan bo, bot ca.
-
Nc tieu: pha 1 pnan nc tieu + 30 phan nc;
Phan heo: pha 1 phan phan + 100 phan nc;
Phan bo: pha 1 phan phan + 30 phan nc.
Lan 3 dung loai phan tng t nh lan 1.

Sau o lan 4 lap lai nh lan 2, lan 5 lap lai nh lan 1, lan 6 lap lai nh lan 2...
Giai oan ra hoa la giai oan cuoi cung cua qua trnh nuoi trong va co y ngha
quyet nh en ket qua thu hoach san pham. Ve che o dinh dng, khi vn lan
gan en thi ky ra hoa phai tang cng ti bon t le lan cao cho cay. Phan hon
hp dung ti bon trong giai oan nay la loai phan:
-
6-30-30 va vi lng;
6-30-20 va vi lng;
Hoac pha che cac loai phan N-P-K theo cac t le tren.
Tren c s nghien cu sinh hoc phat trien cua Cymbidium ngi ta a ghi
nhan c rang t thang 6 en thang 8 bat au hnh thanh c quan sinh san. e
thuc ay s phat trien cua c quan nay can bon nhieu cac loai phan phospho va
kem, ong thi can nang cao nhiet o cua moi trng.
Mot phat hien ly thu khac la e tang so lng hoa can tao ra pH-stress vao 10
ngay th hai cua thang bay bang cach trong vong mot tuan can thay oi pH moi
trng 1,5-2,0 n v bang cach bon cacbonat canxi 0,8%. Sau o giam t t pH
cua moi trng cung vi tang cng ot ngot viec bon phospho cho cay. Viec tao
pH-stress e kch thch cay ra nhieu hoa ch em lai ket qua tot neu am bao che
o dinh dng cho cay nh a gii thieu tren.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 32 -
II. NHAN GIONG BANG CON NG PHAT SINH PHOI VO

TNH
thc vat bac cao phoi la san pham t nhien cua qua trnh thu tinh trong sinh
san hu tnh. Tuy nhien, phoi cung co the hnh thanh t cac te bao soma qua qua
trnh nuoi cay in vitro. Phoi loai nay c goi la phoi vo tnh (somatic embryos).
Phat sinh phoi vo tnh la s phat trien phoi t cac te bao va mo soma trong
cac he thong nuoi cay in vitro. au tien, trong nghien cu cac he thong huyen phu
Steward a phat hien c rang cac te bao ca rot khi x ly bang sa da se ngng
phan chia va phan hoa thanh cac cau truc tng t nh phoi co ten goi la embryoid.
Cung vao thi gian nay Reinert oc lap phat hien hien tng nh vay ca rot nuoi
tren thach co s dung cac nong o auxin nh yeu to gay cam ng. T o cac mo
ac trng thuoc cac loai khac nhau c tm thay co kha nang tao phoi vo tnh
trong cac he thong nuoi cay hoac co the c cam ng tao phoi vo tnh bang cach
x ly ac biet oi vi moi trng. Phoi vo tnh phat trien thong qua cac giai oan
tng t nh phoi hnh thanh t hp t. Tuy nhien, kch thc cuoi cung cua la mam
thng nho va khong co s phat trien cua phoi nhu hoac vo hat. Cac gen keo theo
kha nang tao phoi vo tnh va s ieu hoa hoat ong cua cac gen la nh nhau
phoi vo tnh va phoi hu tnh.
Phoi vo tnh tao ra tiem nang san xuat hang loat cay con nh nhng cay sinh
ra t hat giong. Cay giong c tao ra bang phng phap nay bao gom cac loai cay
trong ngoai ong (lua, co linh lang, au tng, cay an qua), cac loai rau (ca rot,
can tay, xa lach), Cay trong tren on ien (co dau, ca phe) va cac loai cay rng.
e bien kha nang nay thanh hien thc phai giai quyet toan bo cac van e ky thuat
va che tao cac phng tien nuoi trong. Van e bien oi tnh di truyen trong so cay
con tao ra can phai co s hieu biet sau sac va co bien phap kiem tra can than. Du
sao, s dung quy trnh nay la rat ha hen oi vi nhieu loai cay trong.
Phat sinh phoi vo tnh co the hu ch oi vi viec tach cac bien oi tnh di
truyen cua cac dong vo tnh ben trong tap oan cac te bao nham muc nh hoan
thien tnh di truyen cua cay giong. Cong viec nay co the thc hien c do nguon
goc te bao n cua phoi vo tnh. Tnh bien oi cua cac dong vo tnh oi khi c di
truyen ben trong cay nguon xuat phat t cac he thong sinh callus, c cam ng
bi cac mutagent hoac c tao ra bang cong nghe gen.
Phoi vo tnh phat trien t mot so te bao. ieu nay lam cho chung tr thanh
muc tieu hap dan e thc hien bien oi tnh di truyen. Mot trong nhng phng
phap bien oi tnh di truyen cua nhng te bao nay la phng phap s dung sung
ban gen. S tai sinh cac phoi vo tnh t nhng te bao nay se tao ra c nhng cay
co tnh di truyen a bien oi.
Quy trnh tao phoi vo tnh c xac lap oi vi tng kieu gen. Thong thng,
quy trnh nay bao gom cac giai oan sau ay:
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 33 -
+ Giai oan 1: Chon cay giong co vat lieu nuoi cay thch hp: Viec chon
nguon vat lieu nuoi cay la quyet nh quan trong nhat va oi hoi s phan tch chu
ao kha nang tao phoi cua cac nguon mau cay khac nhau trong cay lam giong. Giai
oan nay bao gom cac cong viec tao callus, tao huyen phu te bao hoac tao
protoplast bang cac phng phap mo ta trong giao trnh nay.
+ Giai oan 2: Cam ng kha nang tao phoi trong cac te bao nuoi cay. Viec
cam ng la rat can thiet oi vi nhom te bao va mau cay khong co kha nang tao
phoi. S cam ng c thc hien bang cach chuyen cac te bao can cam ng sang
moi trng c ban co nong o auxin cao. Loai auxin co hieu qua nhat la 2,4-D
hoac hon hp sa da vi nong o thap cua NAA. Sau mot hoac hai tuan mot so te
bao tien phoi co the xuat hien. Nhng khoi te bao va tien phoi ln co the c tach
ra da vao s khac biet ve kch thc e chuyen sang moi trng phan hoa. Nhng
te bao nho hn co the c cay chuyen e tiep tuc san xuat phoi vo tnh.
+ Giai oan 3:Phan hoa va s thanh thuc cua phoi vo tnh. Sau khi cam ng
kha nang tao phoi vo tnh trong moi trng cha auxin, khoi te bao tien phoi c
chuyen sang moi trng c ban co ham lng nit cao va khong cha auxin. Phoi
vo tnh xuat hien t cac te bao n trong khoi te bao nuoi cay, phat trien tnh phan
cc va tiep theo la qua trnh giong nh tao phoi bnh thng. S phat trien co the
thay oi ve toc o va mc o xuat hien cac bieu hien khong bnh thng vi cac
phoi th cap hnh thanh tren phoi s cap. Tnh ong bo va s phat trien bnh thng
co the at c bang cach ly tam theo ty trong e tach cac khoi tien phoi theo cac
kch thc khac nhau. Bo sung acid abscisic vao moi trng se lam tang tnh ong
nhat va ay manh s phat trien bnh thng cua phoi.
+ Giai oan 4: Tao cay con. Cac phoi vo tnh thanh thuc co kch thc bnh
thng co the c at len moi trng thach khong co bat ky loai auxin nao nhng
cha cytokinin nong o thap e tai sinh cay con hoan chnh.
+ Giai oan 5:a cay con ra vn m. Sau khi la va re a hnh thanh cay
con can c a ra vn m va cham soc nh moi cay con khac.
Mot s tien bo ang ke a c thc hien nh sang che va s dung cac bnh
phan ng kch thc ln e tai sinh phoi tng t nh cac thiet b len men hoac
thiet b nuoi cay so lng ln vi sinh vat va te bao e tao ra cac san pham cong
nghiep hoac dc lieu
Chung ta se lam quen vi phng phap nhan giong bang cach tao phoi vo tnh
trong ong nghiem qua v du oi vi cay ca phe.
Cac phoi vo tnh ca phe co mau trang, ban au hnh cau nho, sau o bien oi
thanh dang tim, thuy loi, va cuoi cung la s xuat hien hai la so xanh va he re. S
phat trien cua phoi vo tnh ca phe rat giong vi s phat trien cua phoi hu tnh t
hat.
Phng phap nhan giong ca phe bang cach tao phoi vo tnh trong ong nghiem
c thc hien nh sau:
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 34 -
La ca phe t cac cay nuoi cay in vitro c cat thanh cac manh co kch thc
1cm , khong cha gan chnh. at nhng mau la nay len tren moi trng MS,
vitamin Morel, 30g/l saccharose, 10% nc da, 10mg/l BA ,0,1mg/l IBA va 40
mg/l adenine.
2
Sau 50 60 ngay mep cat xung quanh cac manh la xuat hien cac om trang
hnh cau nho li ti. Cac lat cat cua cac khoi cau nay vi 200-300 te bao nhn di
knh hien vi co the thay ro chung gom cac te bao ac trng cho phoi (te bao chat
am ac, khong co khong bao,nhan to).
Cac phoi hnh cau co kch thc t 1 2 mm c cay vao moi trng nhan
phoi vi 5mg/l BA, 0,1mg/l IBA va 40ng/l adenine.
Neu nhan phoi tren moi trng ran vi 8g/l aga, so lng phoi tang len
khoang 2,5 lan sau mot thang nuoi cay.
Neu nhan phoi trong moi trng long tren may lac 50 vong/phut so lng
phoi tang 7 8 lan sau mot thang nuoi cay.
Cac phoi phat trien re va la so se c cay chuyen sang moi trng nhan
giong khong co chat sinh trng. Sau 50 60 ngay, khi cay co 5 6 cap la co the
a ra vn m.
Do s phat trien cua phoi vo tnh giong het nh phoi hu tnh nen a co nhieu
cong trnh nghien cu tao hat nhan tao t phoi vo tnh. Thanh tu cua cong nghe
nay se cung cap cho san xuat nong nghiep mot so lng hat giong thuan chung vo
cung to ln trong mot thi gian ngan, ong thi se cho phep nha nong gieo thang
hat trong vn m hay tren ong ruong, giam nhe c chi ph nhan giong trong
ong nghiem va chi ph van chuyen. Cho en nay mot so cong ty a quoc gia a a
thanh cong hat nhan tao cua mot so giong rau lai ra th trng.
oi vi cay ca phe, cac nha khoa hoc tai Trung tam Cong nghe sinh hoc TP.
Ho Ch Minh a thanh cong bc au trong viec tao hat nhan tao t phoi vo tnh
cua ca phe lai Arabusta bang cach boc phoi bang alginate trong dung dch
CaCl2.2H2O. Mot tnh chat quy gia cua alginate la de dang tao gen. Tuy nhien v
gel alginate co tnh a nc nen sau khi dung no lam vo boc th can phai boc tiep
ben ngoai mot lp vo k nc e hat de bao quan. Lp k nc nay c phu bang
chitosan von cung co tnh tng hp sinh hoc nh alginate. Vi ien tch dng cua
mnh, chitosan khi c s dung lam lp vo ngoai se lam cho vo boc mem khi co
mat cua nc. Tnh ben vng cua lp vo boc co the c tang cng bang cach
trung hoa so ien tch dng d tha cua chitosan.
III. NHAN GIONG BANG CACH TAO MO SEO (CALLUS).

Callus c tao ra tren mau cay in vitro e ap lai tac dung cua cac chat tao
vet thng va cac chat kch thch sinh trng noi sinh hoac c bo sung vao moi
trng. Cac mau cay t hau nh tat ca cac cau truc hoac bo phan cua thc vat:
canh, re, la, cac c quan d tr hoac qua eu c s dung e tao callus. Cay
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 35 -
chuyen lien tuc vi khoang cach ba hoac bon tuan t cac am te bao nho lay t
khoi callus nay co the duy tr callus trong thi gian dai.
Moi trng nuoi cay pho bien la moi trng MS cha mot to hp can bang
cac hp chat vo c c pha bo sung vi moi trng Linsmaier va Skoog co thanh
phan hu c can oi. Ca hai moi trng nay eu giau nguyen to a lng, ac biet
la nit, bao gom cac ion nitrate NO3- va ion ammon NH4+, saccharose va cac
vitamin. e bat au phan chia te bao va tao callus tiep theo oi hoi phai cung cap
cytokinin va auxin cho moi trng vi t le thch hp. Auxin vi nong o trung bnh
va cao la yeu to sinh trng au tien c s dung e tao callus. Cac auxin chu
yeu c s dung la IAA, NAA va 2,4-D theo trat t tang dan tnh hieu qua.
Cytokinin (nh kinetin hoac benzyladenine) c cung cap vi nong o thap hn
neu chung co qua t trong mau cay.
Mac du khoi callus co be ngoai nh mot khoi te bao ong nhat, nhng tren
thc te cau truc cua chung tng oi phc tap ve cac ban chat hnh thai, sinh ly va
di truyen. Sinh trng cua chung tuan thu ng cong logarit ien hnh:
- Toc o phan chia te bao ban au rat cham, oi hoi phai co auxin;
- Phase phan chia te bao rat nhanh cung vi sinh tong hp nhanh chong
ADN, ARN va protein;
-
Tiep theo la s ngng t t toc o phan chia te bao ;
Cuoi cung la phase phan hoa thanh cac nhom te bao nhu mo va te bao mo
dan.
Phan chia te bao khong xay ra vi toan bo khoi te bao nuoi cay ma ch xay ra
ban au khoi te bao sinh trng nam tai lp te bao mat ngoai. Bo phan ben trong
cua callus van duy tr trang thai khong phan chia va duy tr ac iem sinh ly, di
truyen khac vi khoi te bao mat ngoai. Toc o phan chia cua lp te bao ben ngoai
giam xuong va tren khoi callus xuat hien cac u nho do s phan chia te bao b han
che nhng khu vc te bao nhat nh. Nh vay, s bien ong ve tuoi va kieu te
bao co the xay ra ben trong khoi callus nuoi cay. Cac te bao ben trong gia hn, cac
te bao ben ngoai tre hn va van duy tr kha nang sinh trng.
S tai sinh cay con t callus phu thuoc nhieu vao t le cytokinin/auxin bo sung
vao moi trng nuoi cay. Neu t le nay cao se tao choi la chnh, neu ngc lai re se
hnh thanh, neu t le nay can bang se va tao choi va tao re. Tren c s nguyen
tac chung nay can phai chon t le hai nhom phytohormon nay thch hp cho tng
loai cay trong.
Callus co tiem nang bo ch oi vi cac phng phap nhan giong thng mai
do co toc o tai sinh cay con cao quy mo cong nghiep. Tuy nhien, trong thc te
cac phng phap nay cha c s dung mot cach trc tiep do trong qua trnh nhan
giong rat thng xay ra hien tng sai lech di truyen va bien oi kieu hnh. V vay,
kieu he thong nuoi cay nay chu yeu c s dung e tao ra cac genotype mi. S
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 36 -
bien oi tnh di truyen xay ra trong thc vat c tao ra t khoi te bao hoac callus
c goi la s bien oi dong vo tnh (somaclonal variation). Nhng bien oi nay co
the xay ra mot cach t nhien hoac c tao ra bang cach x ly cac tac nhan gay ot
bien hoac bang cac ky thuat cong nghe gen ac biet.
Tuy nhien, oi vi hang loat cay trong viec nhan giong thong qua tao mo seo
em lai ket qua rat tot. Co the tm hieu ky thuat nay qua v du oi vi cay ma
ng.
Lay phan ngon ma 3 4 thang tuoi, boc bo cac be gia va x ly vo trung mau
bang hypochlorit canxi 5% trong 20 phut. Cat phan la non thanh tng manh co kch
thc 0,5 x 2 cm va cay vao moi trng MS co bo sung 2,4D. Sau 2 tuan mo seo se
hnh thanh.
Khi a co mo seo, em cay chuyen e mo seo at kch thc 15 16 mm.
Chon cac mo seo kho va chat chuyen sang moi trng MS co bo sung IBA va BA,
at di anh sang huynh quang 2000-3000 lux. Sau 1 tuan cac iem xanh xuat hien
va sau 3 4 tuan cay ma con hnh thanh, cao 2 3 cm, e nhanh rat manh tao
thanh cum choi.
Khi a co cum choi, cay chuyen nhieu lan vao moi trng MS co bo sung
phoi hp gia BA vi IBA hoac NAA vi kinetin. Choi ma tiep tuc e nhanh
manh; mot so choi vn cao thanh cay ma con. Tach nhng cay nay cay sang moi
trng tao re va tiep tuc chia cac cum choi e cay chuyen nhieu lan.
IV. NHAN GIONG BANG NUOI CAY LAT MONG

oi vi nhieu lai cay trong e nhan giong ngi ta s dung nhng lat mong
cat t nhng mo con non nh oan than non, tht qua non, cu v.v...
Th nghiem cho thay trong nhieu trng hp phng phap nay cho ket qua rat
tot. Mot trong nhng trng hp nh vay la oi vi vay hanh cua cay Hue tay, hay
cay Lys (Lilium longiflorum). Chung ta hay lam quen vi phng phap nay.
Vat lieu nuoi cay la nhng cu lys a thanh thuc thu t nhng cay khoe manh
khong co cac trieu chng nhiem virus.
Sau khi ra sach cu, tach cac vay lp ngoai va kh trung bang chloramin 5%,
HgCl2 0,1% hay mot chat kh trung bat ky thng c dung trong ky thuat nuoi
cay mo. Sau o ra lai nhieu lan bang nc cat vo trung. Moi vay c at vao mot
a Petri vo trung trong tu cay ang hoat ong va cat theo chieu ngang thanh nhieu
lat day 1 3 mm va cay vao moi trng vi t the vay nam nga (mat trong cua
vay hng len tren). Can lu y rang t the cua mau cay anh hng rat ln en kha
nang tai sinh cay con cua lat cat. Th nghiem cho thay cac t the khac cua mau cay
co kha nang tai sinh cay con thap hn nhieu. Moi mau c cay vao mot ong
nghiem. Neu dung bnh tam giac 250ml th moi bnh co the cay 10 15 mau.
Co the dung cac moi trng a lng vi mc o dinh dng khac nhau nh
MS, White, B5, Knuson C, tham ch ca moi trng Knop, nhng tot nhat la moi
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 37 -
trng MS. Tat ca cac moi trng a lng nay eu can c bo sung vi lng
Heller, vitamin Morel, 100mg/l inositol, 20g/l saccharose va 10g/l agar. ieu kien
thuan li nhat cho tai sinh va sinh trng cua cay Lys trong ong nghiem la nhiet o
18 20oC va che o chieu sang 2500 3000 lux 16 gi moi ngay.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 38 -
Sau khi cay khoang 15 ngay mau cay chuyen dan sang mau luc va tren mau
cay bat au xuat hien cac khoi u. Nhng khoi u nay ln dan, sau khoang 30 ngay t
chung hnh thanh cac cu dang hanh li ti va cuoi cung nhng cu nay phat trien thanh
cay hoan chnh. Trong nhieu trng hp cac te bao cua khoi u phat trien thanh cac
cum choi. Co the tach va cay chuyen nhieu lan nhng cum choi nay e tao ra mot
so lng ln cay con. Trong trng hp nay e tang kha nang nhan cum choi can
bo sung vao moi trng dinh dng 2,0mg/l 2,4D hoac mot trong cac to hp
phytohormone sau ay: 1/ 1,0mg/l 2,4D + 15% V dch chiet chuoi xanh; 2/ 1,0mg/l
2,4D + 0,5mg/l BAP; 3/ 2,0mg/l NAA + 0,5mg/l BAP.
Hnh 3.S o quy trnh nhan giong Lys trong ong nghiem
e thuc ay sinh trng cay con, cac cum choi nen c cay chuyen sang moi
trng a lng MS + vi lng Heller + vitamin Morel va mot trong 4 loai
phytohormone sau ay: 1/ 0,1mg/l 2,4D; 2/ 0,5mg/l NAA; 3/ 1,0mg/l BAP; 4/ 5% V
dch chiet chuoi xanh.
Viec cay chuyen cung co the thc hien vi cac vay hanh lay t cac cay con
tai sinh trong ong nghiem.
Sau khoang 2 thang co the thu c cac cay con hoan chnh e em ra trong
ngoai vn m tren moi trng giau mun e lay cu giong cap mot. Nhng cay con
nay can c trong trong ieu kien che nang 50%, hang ngay ti dung dch Knop
50% va ap dung che o phong tr sau benh thch hp. Sau mot so the he trong
ngoai ong se thu c cac cu u ln dung e san xuat hoa thng pham.
S o quy trnh nhan giong Lys trong ong nghiem c trnh bay trong hnh 3.
V. NG DUNG KY THUAT VI GHEP TRONG NHAN GIONG.

oi vi nhieu loai cay an qua, ac biet la cac loai cay co mui, ky thuat ghep
chiem v tr hang au trong nhan giong v ket hp c kha nang chong chu cua
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 39 -
goc cay hoang da vi u iem nang suat va pham chat cua canh ghep. Tuy
nhien,trong khi ghep theo ky thuat truyen thong do thi gian trong goc ghep keo
dai va kch thc mat ghep qua ln nen cac benh virus rat de lay truyen.
e khac phuc nhc iem tren,ky thuat ghep nh sinh trng (shoot apex
grafting), hay goi tat la vi ghep (micrografting) c th nghiem va mang lai ket
qua tot.
Ve nguyen tac, vi ghep la nuoi cay nh sinh trng nhng thong qua dinh
dng t nhien cua goc ghep. nh sinh trng lam mat ghep co kch thc 0,2
0,5 mm c tach t bup non ang sinh trng manh cua cay me trng thanh; goc
ghep la mam gia mi nay t hat cua giong hoang dai. Toan bo cay ghep c nuoi
dng trong ieu kien ong nghiem vo trung. Nhng cay ghep thu c bang
phng phap nay hoan toan sach benh va mang ac iem di truyen cua cay me cho
mat ghep.
Phng phap vi ghep oi vi cac loai cay co muoi (bi, cam, chanh, quyt...)
c tien hanh nh sau:
a/ Gieo hat lay cay mam lam goc ghep:
Tach hat t qua chn, ra sach va e kho trong phong 24 gi. Cat gi trong tu
lanh 4oC e dung dan. Khi gieo boc vo trau, vo lua, kh trung 5-10 phut bang
dung dch HgCl2 0,1%, gieo tren moi trng khoang MS cha 2% saccharose,0,8%
aga; e mau cay trong toi 25oC . Sau 10 ngay cay mam dai 5-8 cm c chon lam
goc ghep.
b/ Tach nh sinh trng lam mat ghep:
Chon cay me trng thanh co nang suat va pham chat tot. Hai bup non dai 1,5
3,0 cm, cho vao lo hoac tui nilon kn em ve phong th nghiem. Cat bo bt la, kh
trung bang hypochlorit natri 0,5% trong 5 phut. Dung kim nhon gat bo nhng la
non, sau o dung li dao cao be nhon e tach nh sinh trng kch thc khoang
0,5mm, e nguyen tren li dao e chuyen vao v tr ghep.
c/ Tien hanh ghep:
Dung dao cao cat bo au re, than tru tren la mam, e lai phan re chng 23cm va phan than chng 2cm. Co 3 cach ghep:
- Ghep len mat cat: at mat ghep trc tiep len be mat lat cat, tren vong tng
tang;
- Ghep ch T ngc: Dung au nhon li dao cat lo ghep hnh ch T ngc,
chan ch T la mat cat e de boc lo vung tng tang; at mat ghep sao cho mat cat
cua no tiep xuc vi tng tang;
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 40 -
- Ghep ham ech: Khoet tren than mam cach mat cat 5mm mot vet lom hnh
ham ech, chieu sau vet lom bang be day lp vo. at mat ghep vao ay ham ech
(hnh 4).
Hnh 4. V tr mat ghep trong 3 kieu vi ghep
d/ Nuoi cay ghep:
Cay ghep c at vao ong nghiem ln (25 x 200 mm) cha 6ml moi trng
MS long co cha 7,5% ng. e cay khong cham vao thanh ong nghiem, dung
mot manh giay sac ky 4,5 x 4,4 cm gap thanh hnh ln song e lam gia cho
mau. Nuoi mau 25oC, chieu sang 16 gi/ngay. Trong mot tuan mat ghep a at
kch thc 1,5 2,0 mm va sau 4 tuan choi ghep a co kch thc 15 20 mm; re
cua goc ghep cung moc them re phu. Cay ghep co the em trong ra at trong vn
m.
ieu quan trong oi vi ky thuat vi ghep la tao c s tiep xuc gia mat
ghep va te bao tng tang. Ch 2 3 ngay sau khi ghep co the quan sat thay mot
vong mo seo phat sinh t tng tang. o la ieu kien e mat ghep va goc ghep lien
ket vi nhau.
Th nghiem cho thay:
-
Kieu ghep T ngc co hieu qua nhat;
Thch hp oi vi cam ghep len bi la cac goc ghep 14 ngay tuoi;
- Mac du mat ghep ln co ty le thanh cong cao, song e am bao tnh sach
benh virus khong nen dung mat ghep ln hn 0,5mm.
Cung can chu y la trong nach la mam cua goc ghep co cac choi ngu, bnh
thng b u the ngon c che. Khi ghep ta kh ngon nen nhng choi ngu nay c
anh thc rat nhanh, lam c che s phat trien cua mat ghep. e tranh tnh trang nay
can kh mat ngu bang cach khoet vao than khi kh la mam e loai tr mat ngu.
Choi phu cung co the phat sinh t tng tang cua mat cat tren goc ghep. Can
loai bo chung ngay khi phat hien e tao ieu kien cho choi ghep phat trien nhanh.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 41 -
Cay ghep trong ong nghiem co bo re t nhien rat khoe v vay rat de song khi
a trong ra ngoai at. Can lu y ra sach dung dch nuoi giau ng e bo re
khong b nam. at phan lam bau nen kh trung e tranh lay nhiem benh. Nhng
cay ghep nay se la nguyen lieu au dong nen can trong chung nhng khu vc
cach ly tot.
VI. NUOI CAY TUI PHAN

T nam 1924 Blackelee a chng minh rang cac dong nh boi thuan ong hp
t co the thu c bang cach nh boi hoa cac the n boi. Nh vay rut ngan rat
nhieu thi gian tao cac dong thuan so vi phng phap co ien da tren t thu
phan. Van e cung tng t khi ta muon co cac dong a boi ong hp (homozygous
polyploids). Do khong co tnh troi lan the n boi, kieu hnh (phenotype) cua cay
phan anh kha trung thc kieu gen (genotype). V vay, chung la cac nguyen lieu ly
tng e s dung trong chon giong bang phng phap ot bien. The n boi con
giup cho di truyen hoc hieu c vai tro cua ADN nhan va ADN te bao chat, xac
nh c cac tnh trang lien quan nhieu en di truyen te bao chat. Chung con co
the s dung trc tiep trong trong trot, v du mot so cay canh do co hoa nho hn va
thi gian song lau hn the nh boi do co tnh bat duc.
Phng phap nuoi cay tui phan va hat phan ra i a lam giam han thi gian
va cong sc e thu nhan cac the n boi. Ngay nay rat nhieu loai cay a c trong
thanh cong bang nuoi cay tui phan va hat phan. Nhieu giong cay trong mi a c
tao ra bang phng phap nay.
Ta se lam quen vi phng phap nuoi cay tui phan qua oi tng cay lua ma
cac nha khoa hoc Phan vien Cong nghe sinh hoc Thanh pho Ho Ch Minh thc hien
nham muc ch cai tao giong lua Viet Nam. Phng phap nay gom cac bc sau
ay:
1/ Chon vat lieu khi nguyen;
2/ Tao cac to hp gen mi bang phng phap lai hu tnh;
3/ Nuoi cay tui phan cay lai;
4/ Nh boi hoa cay n boi t tui phan;
5/ Tao va anh gia cac dong n boi kep.
1.Chon vat lieu khi nguyen.

Vat lieu khi nguyen c chon da tren cac tnh trang chnh nh nang suat
cao, chu phen, chu man, khang ray, chn sm. Mot so trong cac tnh trang nay la
n gen (do 1 gen quyet nh), nh tnh khang ray nau, tnh chu phen; mot so khac
la a gen (do tap hp nhieu gen quyet nh), nh nang suat.
2.Tao cac to hp gen mi bang phng phap lai hu tnh.

Do cac gen quy nh cac tnh trang noi tren thng nam rai rac cac giong
lua khac nhau va nhieu khi chu tac ong cua cac gen c che nen lai hu tnh la rat
can thiet e tao c nhng to hp gen mong muon, tap hp c cac tnh trang tot
tren cung mot cac the, ong thi gop phan kh tac ong cua cac gen c che.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 42 -
Ky thuat lai: Cay me c kh nh va cham phan hoa cua cay bo a n len

au nhuy. Cat bo nhng hoa khong lai va boc cac gie a lai bang tui giay dau mau
sang. Hat lai cua cac to hp tren c trong thanh cay F1. Dung tui phan cua cay F1
e nuoi cay.
3.Nuoi cay tui phan cay lai.
Ky thuat nuoi cay tui phan.
Tui phan nuoi cay ch cho cay n boi khi cha hat phan nhng giai oan
phat trien thch hp. cay lua giai oan phat trien cua tui phan thch hp cho nuoi
cay tng ng vi luc khoang cach gia tai la ong va la th hai khoang 3 5 cm.
boc vo la ong luc nay se thay au vo hat lua co mau xanh la ma nhat; cac tui phan
ben trong vo mau vang nhat va chiem hn 1/3 chieu dai hat lua. Dung nhng gie
lua gia bong lua, ni cac tui phan phat trien tng oi ong eu, e lam mau vat
nuoi cay.
ong lua sau khi a chon c boc trong bao nilon kn e gi am va e
10 C trong toi t 48 en 72 gi trc khi nuoi cay. Khac vi nhng nu hoa thong
thng c kh trung bang dung dch hypochlorit canxi 1 5% trong 5 15 phut,
lua do bong c boc kn trong la ong, t b nhiem ban nen ch can ra nc va
lau qua ong bang con 70o. Boc vo be la ong, chon nhng gie lua thch hp va kh
trung chung trong dung dch hypochlorit canxi 2% trong 5 phut la u. Co the dung
nhng chat kh trung khac nh HgCl2 0,2%, H2O2 va tang hieu qua kh trung bang
nhng chat co hoat tnh be mat nh tween-80, fotoflo, teepol, nong o 0,2%. Moi
trng va dung cu nuoi cay c kh trung trong noi hap. Tat ca cac cong viec tren
eu c thc hien trong buong cay vo trung.
o
Sau khi kh trung hoa lua c ra ky 5 7 lan bang nc cat vo trung. Dung
keo cong cat au va mot canh cua vo hoa lua cho lo ro cac tui phan va at nhe len
moi trng thach nghieng trong ong nghiem. Chu y tranh lam ton thng cac tui
phan e khong lam giam kha nang phat sinh mo seo va han che gay nhiem. Sau khi
cay dung parafin dan kn nap ong nghiem. Nen dung loai ong nghiem 25 x 100mm
co nap thuy tinh e co the cay khoang 18 tui phan trong mot ong nghiem. Moi
trng thch hp nhat cho viec tao mo seo lua la moi trng N6 cai tien vi thanh
phan nh trnh bay trong bang 3.
Tuy theo yeu cau cua tng loai cay, ngi ta chon nhng ieu kien nuoi cay
thch hp. Thong thng cac tui phan c nuoi nhiet o 24 27oC, anh sang
2000 lux vi chu ky chieu sang 14h/ngay. lua cung nh nhng loai tao cay qua
mo seo, noi chung, thi ky tao mo seo co the nuoi trong toi, nhng qua giai oan tai
sinh cay t mo seo nhat thiet phai c chieu sang ay u. Thong thng ngi ta
s dung en anh sang trang cng o 2000lux, chu ky chieu sang 9h/ngay.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 43 -
Bang 3. Moi trng N6 cai tien dung e tao mo seo t tuu phan lua.
Thanh phan
a lng
Nong o (mg/l)
KNO3
(NH4)2SO4
KH2SO4
MgSO4.7H2O
CaCl2.2H2O
FeSO4.7H2O
Na2EDTA
2830
463
400
185
166
557
745
Vi lng
MnSO4.4H2O
H3BO3
ZnSO4.7H2O
KI
4,4
1,6
1,5
0,8
Thanh phan
Vitamine
Glycine
Thiamine HCl (B1)
Pyridoxin HCl (B6)
Acid nicotinic (PP)
Cac chat hu c
Dch chiet nam men
Saccharose
Agar
Than hoat tnh
Phytohormone
IAA
Kinetin
NAA
pH = 5,8
Nong o (mg/l)
2,0
1,0
0,5
0,5
1g/l
50g/l
9g/l
1g/l
0,5
1,0
8,0
Sau 3 5 ngay nuoi cay hat phan nuoi cay phat trien theo hai hng sau ay:
- Phan ln cac hat phan tiep tuc phat trien va phan chia bnh thng, tao
thanh 2 nhan sinh dng va sinh san. Nhan sinh dng to, nhan sinh san nho, nam
sat vach te bao.
- Mot so t hat phan phat trien va va phan chia thanh hai nhan bang nhau; sau
5 7 ngay chung tiep tuc phan chia e tao nen 4 8 nhan; vao khoang 10 ngay sau
cac tien phoi dang cau co kch thc ln vi 32 nhan c hnh thanh.
Sau khi cay c 20 30 ngay t mot so tui phan xuat hien cac mo seo hnh
cau nho mau trang. Chung pha v tui phan va thng phat trien rat nhanh. Mo seo
at 0,5 1,0 mm (tng ng 10 15 ngay tuoi) em cay chuyen sang cac bnh tam
giac cha 60ml moi trng tai sinh vi thanh phan gom khoang a lng, vi lng
va vitamin N6, 1g/l dch chiet nam men,30g/l saccharose, 9g/l agar, 1g/l than hoat
tnh,0,2mg/l IAA, 1mg/l kinetin, pH = 5,8.
Tren moi trng tai sinh kch thc cac mo tang kha nhanh. Sau vai tuan tren
mot so mo xuat hien nhng iem xanh, t chung hnh thanh nhng choi va t o
phat trien thanh cay, ong thi nhng re trang xuat hien an sau vao moi trng
thach.
Mot mo co the cho nhieu cay. Nhng mo khong cho cay sau mot thi gian se
en dan roi chet. Khi cay cao khoang 8 10 cm co the cay chuyen sang moi trng
White tiep tuc nuoi them mot thi gian na trc khi chuyen ra trong ngoai vn
m. Thi gian nay cay tang trng nhanh nen moi cay c trong vao mot ong
nghiem 25 x 200mm vi cng o chieu sang cao hn (3000 lux). Nhng cay nho
hn c nuoi tiep trong moi trng tai sinh.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 44 -
Cay con cao 15 20cm c chuyen ra vn m trong trong cac chau at,
trong nhng ngay au che bt anh nang e cay quen dan vi ieu kien t nhien.
Nh boi hoa cay n boi t tui phan.
Khong phai tat ca cac cay t nuoi cay tui phan eu la n boi. Ve hnh thai co
the phat hien cay n boi theo mot vai tnh trang cua chung nh cay thap, la nho,
mau nhat hn cay nh boi. Theo doi va kiem tra nhiem sac the cac cay con t tui
phan thay t le gia boi t nhien cua chung kha cao, ch khoang 20 50% la cay n
boi. Thng co the thu c cac cay lua co mc boi the khac nhau (t 1n en 4n).
S gia boi t nhien khong ch xay ra te bao mo seo ma ca te bao soma cua cay
con mi tai sinh, tham ch xuat hien ca nhng cay kham vi nhng am te bao vi
mc boi the khac nhau. V vay can thiet phai kiem tra va phat hien kp thi cay n
boi e co bien phap nh boi hoa.
+ Phng phap kiem tra mc boi the.
Cac cay con sau khi a ra chau 20 30 ngay co chng 10 15 nhanh. Lay
ngau nhien moi cay 2 3 nhanh, cat bo het cac be la ngoai, ch lay mot oan non
trong cung va anh dau th t cho tng cay.
Mau c co nh theo Carnua (75ml con tuyet oi + 25ml acid acetic am
ac) t 6 en 12 gi. Ra mau bang dung dch carmin 2% hoac carbon fuchsin theo
Kao. Dung dch carbon fuchsin c pha nh sau:
Dung dch A: Hoa 3g fuchsin basic trong 100ml con 70o.
Dung dch B: 1ml dung dch A + 90ml phenol 5%.
Dung dch C: 45ml ddB + 6ml acid acetic + 6ml formaldehyde 37%.
Ep mau trong acid acetic 45%; kiem tra mc boi the di knh hien vi.
+ Phng phap nh boi hoa.
Cay lua n boi sau khi kiem tra nhiem sac the c x ly colchicin 2% trong
24 gi e tao cay nh boi ong hp t bang mot trong cac phng phap tien hanh
nh sau:
- Nho, ra va ngam re lua trong dung dch colchicin khi cay bat au e nhanh
manh, sau o ra sach va cay lai.
- Cat bo phan tren cay lua (sat tren ong non) va bao cho cat cua phan di
bang bong tam dung dch colchicin.
- Dung dao lam rach nhe t tren xuong mot oan doc theo than khoang 2cm
ngay tren ngon bong lua cha tro thanh mot khe nho va at vao o mot mieng bong
tam dung dch colchicin.
- oi vi hai phng phap sau e tranh bay hi nhanh co the pha colchicin
trong dung dch 2% glycerin.
Cay n boi do ch cha 1 trong 2 nhiem sac the cua moi cap nen meios b roi
loan, tao nen nhng giao t khong co sc song cay ch co toan hat lep co kch
thc xap x 1/2 hat lua bnh thng. Nhng cay a qua x ly colchicin va ca mot
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 45 -
so cay tuy khong qua x ly colchicin nhng nh nh boi hoa t nhien co the cho
nhng bong hoac nhng hat chac nh lua bnh thng. Ngoai ra con co the thu c
nhng the kham, tren o ngoai cac nhanh n boi (la chu yeu) con co ca nhng
nhanh nh boi cho t 2 en 10 hat chac tren moi bong. Co nhng cay cho toan bong
va hat chac. Nhng hat nay co sc nay mam rat cao va c ky hieu la hat H0. Do
thu c nh nuoi cay tui phan lai, chung chnh la tien than cua nhng dong n
boi kep mang trong mnh nhieu to hp gen khac nhau t cac cay bo me, trong o
co nhng to hp co y ngha kinh te va ca tnh ong hp t rat cao do a qua n
boi.
Moi hat lai la khi thuy cua mot dong lai H0, t chung co the tao cac dong
n boi kep H1 bang cach lai cac dong cua 2 to hp lai H0 khac nhau.
VII. NUOI CAY VA DUNG HP PROTOPLAST THC VAT

Protoplast la te bao thc vat a mat vo cellulose di tac dung cua mot so
loai enzyne thuoc nhom cellulase, ch con lai mang sinh chat (plasmodesma) bao
quanh chat nguyen sinh. Protoplast co kha nang dung hp (fusion) vi nhau e tao
thanh cac the lai vo tnh di tac dung cua polyethylen glycol (PEG), co kha nang
hap thu trc tiep cac phan t nh virus, vi khuan, cac c quan t va cac ai phan t
nh ADN, ptotein.
Dung hp la qua trnh ket hp hai protoplast thanh mot, con goi la lai vo tnh
(somatic hybridization). Nh nhng ac tnh tren, ky thuat protoplast giup cho viec
cai tao nhanh chong bo may di truyen cua te bao thong qua tai sinh cac the lai vo
tnh t cac protoplast lai, dung hp protoplast cua cac cay khong tng ong gii
tnh (sexual incompatible) hoac cac cay co ho hang xa, tang kha nang quang hp
va tnh khang sau benh cua cay bang cach chuyen cac ty the va luc lap vao cac cay
co he thong quang hp yeu hoac tnh khang yeu, nuoi cay protoplast phuc vu cho
cac nghien cu tnh di truyen va bien tnh nh hng Gan ay nhieu phong th
nghiem tren the gii a tien hanh nghien cu chuyen trc tiep ADN la vao
protoplast cua cac cay thuoc ho Hoa thao nh lua ma khong can s ho tr cua
Agrobacterium tumefaciens hoac qua bat c vi khuan trung gian nao khac.
Cho en nay ky thuat tach, nuoi cay va tai sinh protoplast khong nhng a
hoan thien oi vi cac cay hai la mam co ien nh thuoc la ma cung a giai quyet
c cac oi tng kho tai sinh nh khoai lang va cay mot la mam quan trong
nh cay lua. Ngoai viec phuc vu trc tiep cho cong tac giong, protoplast con la mo
hnh ly tng cho cac nghien cu di truyen, tnh chong chu khang sinh, chong chu
sau benh, tnh chu phen, chu man v.v
Trong nuoi cay va dung hp protoplast can nam vng cac ky thuat sau:
-
Ky thuat tach, nuoi cay va tai sinh protoplast cac cay co gia tr kinh te;
Dung hp protoplast e tao cac the lai vo tnh va tai sinh cac the lai thanh
cac cay hoan chnh;
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc

-
- 46 -
S dung protoplast cho cac nghien cu di truyen (nh chuyen cac gen la
hoac cac c quan t vao protoplast.
1. Tach va nuoi cay protoplast thc vat.

Co the tach protoplast t tat ca cac phan cua cay nh re, than, la, not san re,
la mam, vo qua, trang hoa, te bao me hat phan, t mo seo hay huyen phu te bao.
ay chung ta ch lam quen vi phng phap tach protoplast t la v cac te bao nay
tng oi ong nhat va co u iem la khong tch luy cac roi loan di truyen nh te
bao mo seo.
Qua trnh tach protoplast gom 4 bc:
-
Kh trung mau (oi vi cac cay nuoi trong trong ieu kien vo trung th
khong can);
Cat mau;
X ly enzyme;
Lam sach protoplast va a vao moi trng nuoi cay.
a/ Tach va nuoi cay protoplast t cay thuoc la (Nicotiana tabacum) .
Nguyen lieu:
Cay thuoc la c nuoi in vitro tren moi trng MS cha vitamin Morel,20g/l
saccharose, 8g/l agar. Chon nhng la phat trien ay u cua nhng cay 20 30 ngay
tuoi (5 6 la).
X ly enzyme.
Hon hp enzyme cellulase Onozuka R10 1% va Macerozym 0,5% c pha

trong moi trng Kao a c cai tien co cha sacchrose 0,4M (137g/l), pH 5,8.
Dch enzyme c loc vo trung qua loc milipore. (Co the thay the hon hp enzyme
tren bang Driselase 1%).
La thuoc la c cat thanh si nho va ngam vao hon hp enzyme trong 12
gi, e trong toi, nhiet o 28 30oC. C 1g la ti can 10ml hon hp enzyme. Sau
khi x ly lac nhe e cac protoplast ri khoi la. Tat ca cac thao tac thc hien trong
ieu kien vo trung. Sau o dch enzyme cha protoplast c loc qua bo li loc e
loai bo cac manh mo la. Dch loc c ly tam 500 vong/phut trong 5 phut. Sau khi
ly tam protoplast noi len tren be mat mot lp mau xanh; dung pipet Pasteur hut nhe
lp protoplast va chuyen sang mot ong nghiem ly tam khac co cha moi trng
Kao. Ly tam lai hai lan na roi hut lp protoplast e chuyen sang moi trng nuoi
cay.
Nuoi protoplast.
4ml huyen phu protoplast c nuoi trong a Petri 60 vi moi trng K1 cai
tien co cha 0,1mg/l 2,4D, 0,2mg/l BA va 1mg/l NAA sao cho am bao mat o
protoplast at 2000/ml moi trng. Bao paraphin va at trong toi trong hop gi am.
Sau 4-5 ngay vo cellulose hnh thanh lai va protoplast bat au phan chia. Sau
10 ngay hnh thanh cum co t 4-10 te bao. Them vao moi a Petri 2ml moi trng
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 47 -
K2 (nong o NAA giam xuong 0,2mg/l, ng giam xuong 100g/l). Sau o hut
1,5ml dch te bao gieo tren mat a thach cha moi trng K3 (K2 co them thach
7g/l).
Sau 5 ngay quan sat bang knh hien vi tren mat thach hnh thanh cac cum te
bao ln. Cat lp thach o thanh tng mieng0,5 x 0,5 cm at tren moi trng tao mo
seo (Moi trng MS cha 1mg/l 2,4D, 0,5mg/l kinetin), nuoi tren a Petri at trong
toi.
Tao choi va tai sinh cay.
Sau 15 ngay cay chuyen, tren mat thach hnh thanh cac cum mo seo ln mau
trang. Cay chuyen sang moi trng tao choi (moi trng khoang MS, vitamin Kao,
50mg/l ng, 7g/l thach,2mg/l BA, 0,5mg/l IAA). Cac bnh choi c chieu sang
2.000 lux. 8 gi/ngay. Sau 10 ngay am mo seo chuyen thanh mau xanh hoan toan
va xuat hien choi sau 15 ngay. Sau o chuyen sang moi trng tao re (khoang MS,
ng 20g/l). Re hnh thanh sau 10 ngay.
b/ Tach protoplast t mo tht la khoai lang (Ipomoea batatas)
Nguyen lieu:
Te bao n la khoai lang c tach bang cach nghien mo la trong coi Potter.
Do la khoai lang co cac te bao mo dau vach kha day va co o ben cao oi vi tac
ong c gii, viec tao huyen phu te bao n t mo la khong co g kho khan. Cac te
bao n nay c nuoi tren moi trng Lin va Staba vi nong o BA 0,1mg/l, 2,4D
0,1mg/l, saccharose 100g/l. Chon nhng te bao ang phan chia lan th nhat e tach
protoplast.
Tach va nuoi protoplast.
Cho vao moi a Petri co te bao n nuoi tren mat thach 3ml hon hp enzyme
a loc qua milipore gom cellulase Onozuka R10 2%, pectinase hoac
maceroenzyme 1%, manitol 0,6M, pH 5,8. Dung que cay gat nhe te bao ra khoi
mat thach va chuyen toan bo dch enzyme cha te bao sang a Petri khac, e trong
toi nhiet o 28oC trong thi gian 24 gi, thnh thoang lac nhe.
Sau khi x ly enzyme rot tat ca dch enzyme cha protoplast vao ong nghiem
ly tam 1 x 12 cm, ly tam 400 vong/phut cho protoplast lang xuong ay. Dung pipet
hut bo dch enzyme, sau o ra protoplast bang cach ly tam mot lan vi manitol
0,6M va mot lan vi moi trng nuoi cay. Protoplast c treo trong moi trng
long vi mat o 3.105 protoplast trong 1ml. Lay 0,5ml protoplast nuoi tren mat
thach trong a Petri cha 2ml moi trng LS co 20g/l saccharose va manitol 0,6M.
Gan parafin gi am va at trong toi 28oC.
Tren moi trng LS sau 10 ngay nuoi cay phan ln protoplast song khoe
manh va co thay oi hnh dang, chng to te bao a hnh thanh va bat au phan chia.
Viec ket hp phng phap c hoc e tach te bao n va x ly enzyme cho phep thu
nhan mot so lng ln protoplast khoe manh.
c/ Tach protoplast t mo la lua Oryza sativa.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 48 -
Nguyen lieu.
Ngam hat lua 2 3 ngay cho nay mam, sau o gieo vao chau at. Chon
nhng cay ma 13 20 ngay tuoi lam nguyen lieu.
Tach va nuoi protoplast.
Cay lua c ra sach, cat bo re va phien la. Lay oan be la dai 5 6 cm kh

trung con 70o trong 2 phut, sau o bang hypochlorit canxi 7% trong 20 phut. Ra
nhieu lan bang nc cat vo trung.
Sau khi kh trung boc lay phan be non mau trang hay vang nhat ben trong,
cat ngang thanh tng manh nho va ngam vao hon hp enzyme gom cellulase
Onozuka R10 1% va pectinase 0,5%, manitol 0,6M, pH 5,8 trong 12 gi nhiet o
28-30oC, t le 1 gam la ti trong 10ml dung dch enzyme. Trong khi u thnh thoang
lac nhe. loai bo cac manh la khong b enzyme phan huy, dch long c rot vao ong
ly tam ay nhon, ly tam 500 vong/phut trong 5 phut e protoplast noi len. Dung
pipet hut va cho vao moi trng nuoi cay mat o 104 105/ml. Cac a Petri c
gan parafin va at vao cho toi nhiet o 25oC.
2. Dung hp protoplast.
S ket hp hai protoplast lam mot c goi la dung hp (fusion) hay lai vo
tnh. Hien tng nay c Power va Cocking phat hien nam 1971 trong cac th
nghiem dung hp cung loai va khac loai cac protoplast tach t chop re cay ngo va
cay yen mach. T o tiep tuc co nhieu cong trnh nghien cu thanh cong trong viec
dung hp protoplast cua nhieu loai khac nhau song vi tan so thap.
Nam 1974 Kao va Michaylus a phat hien polyethylen glycol (PEG) gay ra
s ket dnh dung hp tot protoplast thc vat va tm ra c cac ieu kien e at
c tan so dung hp cao.
Trong nhng nam gan ay cac phong th nghiem hien ai con dung phng
phap dung hp bang ien (electrofusion) e tien hanh dung hp protoplast nhieu
loai cay. Ngi ta dung mot thiet b xung ien (electroprorator) e lam tang tang so
dung hp cua protoplast khi cho no i qua cc cua may xung ien. Bang phng
phap nay a nhan c cac cay lai vo tnh gia Solanum melongena L. va Solanum
torvum Sw., gia cac giong khoai tay nh boi BF 15 (H1), Aminca (H6) va Cardinal
(H3).
Chung ta se lam quen vi phng phap dung hp protoplast vi dong thuoc la
bach tang SRA va dong thuoc la xanh Nicotiana tabacum Nia 63 khong co hoat tnh
nitrat reductase.
Dong Nicotiana tabacum Nia 63 la mot dong ot bien b hong phan
apoenzyme cua nitrat reductase nen khong co kha nang kh nitrat va do o khong
the hap thu nit nitrat ma ch hap thu c nit dang amon. Ve hnh thai, dong Nia
63 ch ton tai dang mo seo, khong co kha nang tai sinh cay hoan chnh.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 49 -
Phep lai c tien hanh gia dong Nia 63 vi dong bach tang SRA (b hong
c che tong hp diep luc) e tao cay lai mau kham xanh co kha nang hap thu nit
nitrat (hnh 5).
Qua trnh lai c tien hanh nh sau:
1/ Nguyen lieu;
- Cay thuoc la bach tang SRA c nuoi tren moi trng MS co cha 2mg/l
BA, 0,5ml/ NAA, 20g/l saccharose, 8g/l agar, pH = 5,6 trong ieu kien anh sang
yeu, 15 ngay cay chuyen mot lan.
X
Protoplast dong Nia 63 khong co hoat tnh
nitratreductase
Protoplast dong bach tang SRA khong co

kha nang tao diep luc
Cay lai kham xanh co hoat tnh nitratreuctase

Hnh 5. S o lai vo tnh gia hai dong thuoc la Nia 63 va SRA
- Lay 2 g mo seo Nia 63 nuoi trong bnh tam giac cha 50ml moi trng long
khoang a lng MS vi nguon nit la succinat amon, vi lng B5, 10mg/l thiamin
HCl,0,1mg/l GA3, 0,1mg/l BA, 0,4mg/l 2,4D, 30g/l saccharose, pH = 5,6. Cac bnh
tam giac c lac lien tuc tren may lac di ieu kien anh sang yeu. Khoang 3-4
ngay cay chuyen mot lan.
2/ Hoa chat.
a/ Enzyme dung e tao protoplast.
- Dung dch enzyme 1: Cellulase Onozuka R10 2%, Maceroenzyme 1% pha
trong saccharose 0,4M, pH = 5,6 dung e tao protoplast t la cay thuoc la bach
tang SRA;
- Dung dch enzyme 2: Callulase Onozuka R10 2%, Macerozyme 1%,
Driselase 1% pha trong saccharose 0,4M, pH = 5,6 dung e tao protoplast t dong
Nia 63. Cac dung dch enzyme c loc vo trung qua loc milipore.
b/ Cac hoa chat dung cho dung hp:
- Dung dch 1: 0,5M glucose,, 3,5mM CaCl2.2H2O, 0,7mM KH2PO4.H2O
trong 1000ml nc cat. pH = 5,6.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 50 -
- Dung dch 2: 50mM glycine,50mM CaCl2.2H2O, 0,3 M glucose trong 1000

ml nc cat, pH = 10,5 (chnh bang NaOH 0,1N).
- PEG: Chuan b PEG 40%: 8g PEG (MW 1500 6000), 2,5mg KH2PO4.H2O,
31mg CaCl2.2H2O, 1,2 g glucose pha nc cat thanh 20ml. Chnh pH ti 5,6.
3/ Phng phap dung hp.
- Tao protoplast t la cay thuoc la bach tang SRA: lay 1g la bach tang, cat
nho va ngam vao 10ml dung dch enzyme 1, u trong toi 12 gi nhiet o thng.
- Tao protoplast t te bao nuoi cay dch long dong Nia 63. Loc dnh huyen
phu te bao qua pheu loc sat 3 ngan 2000, 50037 e loai bo cac te bao to. Ly
tam dch long cha te bao toc o 500 vong/phut trong 5 phut e thu nhan te bao,
sau o x ly dung dch enzyme 2. U 12 gi trong toi nhiet o thng.
Dch enzyme cha protoplast c loc va ly tam 3 lan vi saccharose 0,4M
e ra sach enzyme, sau o ly tam vi dung dch 1 e lam lang protoplast.
- Dung hp:
Tron hai loai protoplast vi nhau theo ty le 1:1 trong dung dch 1 vi mat o
5.10 /ml. Nho 3 giot dch hon hp protoplast len 3 cho trong a Petri nha (ng
knh 6cm), e yen 15 phut cho protoplast lang xuong ay a.
6
Nho nhe nhang 1 giot PEG len nh moi giot dch cha protoplast sao cho lp
protoplast dnh chat vao ay a va khong b bong len.
U protoplast trong dch PEG 30 phut nhiet o trong phong.
Them mot cach nhe nhang 2 lan cach nhau 15 phut, moi lan 0,5 ml dung dch
2 e lam tang kha nang ket dnh cua protoplast. Sau o ra sach protoplast 5 lan,
moi lan 2ml moi trng nuoi cay bang cach dung pipet Pasteur hut nhe dch ra ra.
Sau khi a ra sach PEG, cho vao moi a 2ml moi trng nuoi cay co cha am
amon e cho te bao phuc hoi sau qua trnh tach va dung hp (neu cho ngay vao moi
trng ch co am nitrat vao moi trng th ca te bao dong Nia 63 von khong co
kha nang kh nitrat va te bao lai eu se chet).
Sau 3 4 ngay te bao bat au phan chia. Cay chuyen sang moi trng K1a
ch co am nitrat. Tren moi trng am nitrat cac te bao dong Nia 63 se chet dan.
Sau 10 ngay nuoi cay cac te bao phan chia thanh cum te bao. Cay chuyen
sang moi trng K2a (giong moi trng K1a nhng ng giam xuong 100g/l, 2,4D
0,1mg/l, BA 0,2mg/l va NAA 0,2mg/l. Sau 10 15 ngay quan sat thay hnh thanh
cum te bao to. Cay chuyen sang moi trng tao mo seo (MS ch co am nitrat, IAA
1mg/l, kinetin 0,5mg/l, thach 8g/l saccharose 30g/l.
Sau 15 ngay cay chuyen, e cac bnh mo seo di anh sang 2000 lux. Co hai
loai te bao mo seo: mot loai mo mau xanh nhat, mot loai mau trang vang. Tiep tuc
cay chuyen 3 4 lan tren moi trng am nitrat th cac mo xanh dong Nia 63 b
chet, trong khi o cac mo mau trang vang phat trien rat manh.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 51 -
Cay chuyen cac mo seo trang vang tren moi trng tao choi cha BA 2mg/l/
IAA 0,5mg/l, at di anh sang 2000 lux. Sau 15 ngay choi xuat hien. Gia nhng
choi hoan toan trang thay xuat hien nhieu choi mau vang la kham xanh (chiem t le
choi trang).
Chon cac choi co la kham xanh cay tren moi trng khong co chat sinh trng
e cho cay ra re.
Viec lai vo tnh thanh cong bang ky thuat dung hp protoplast se m ng
cho viec ng dung ky thuat nay trong tao giong cay trong.
VIII. CHUYEN GEN THC VAT

Ngay nay nh s phat trien nhanh chong cua cong nghe sinh hoc ngi ta a
co the chuyen cac gen xac nh vao c the thc vat e lam cho chung co c
nhng tnh chat can thiet. Nhng gen nay co the lay t mot cay khong co quan he
hoc hang hoac t ong vat, con trung, nam, vi khuan v.v...
1. Agrobacterium.
Viec chuyen gen a c thc hien bang nhieu cach khac nhau, tuy nhien, a
so c thc hien bang he thong chuyen gen Agrobacterium.
Agrobacterium tumefaciens la loai vi khuan hnh que, gram am, co nhieu
trong at, thuoc ho Rhizobiaceae, co kha nang gay u thc vat, con A. Rhizogenes
gay benh re toc (hairy root).
Agrobacterium tumefaciens co mot plasmid dai 120-150 kb, quyet nh ac
tnh gay u, c goi la plasmid Ti (tumer inducing). A. rhizogenes cung co plasmid
vi kch thc tng t, kch thch tao re toc, c goi la plasmid Ri. (root
inducing). Mot phan ADN cua plasmid Ti hoac Ri goi la ADN. T, tc ADN van
chuyen, c gan vao bo gen cua bo gen thc vat, lam xuat hien khoi u hoac re toc.
Nh ac tnh nay ngi ta s dung cac plasmid Ti va Ri lam cac vect chuyen gen
e thay oi cac tnh trang di truyen thc vat theo y muon. Plasmid Ti hoac Ri co
cha mot hoac nhieu gen la c a tr lai vao Agrobacterium tumefaciens roi vi
khuan nay se chuyen va gan chung vao bo gen te bao thc vat.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 52 -
Cau tao cua plasmid Ti va Ri c mo ta trong hnh 6.
Hnh 6. S o cau tao cua plasmid Ti hoac Ri cua Agrobacterium

Vung T: Vung phat sinh ADN van chuyen (ADN T). Cac gen
nay khi chuyen vao cay va bieu hien trong bo nhan cua thc
vat;
Vung B: Vung chc nang cua vi khuan;
Rhiz: Cac gen tham d vao hnh thanh re;
Onc: Cac gen gay ung th tham d vao hnh thanh khoi u;
Bg va Bd: B trai va b phai gii han vung T;
OPS: Cac gen tong hp cac opin;
OPC: Cac gen d hoa cac opin;
ORI: Nguon goc sao chep Agrobacterium;
VIR: Cac gen ma bieu hien cua chung lien quan en moi
tng tac gia vi khuan gay benh va te bao thc vat, theo
theo s van chuyen cua vung T.
S thiet lap moi quan he gia mot cay va Agrobacterium c bat au bang
vet thng cua thc vat. Cac te bao thc vat b thng san sinh ra hp chat phenol
nh acetosyringon co tac dung gay cam ng s tng tac gia vi khuan va te bao
thc vat, giup cho cac gen cua ADN. T cua vi khuan hoa nhap de dang vao bo gen
cua te bao thc vat.
Sau khi hoa nhap vao bo gen cua te bao thc vat, cac gen cua ADN. T bieu
hien te bao thc vat: chung ma hoa cho tong hp cac phytohormone dan en tao
ra khoi u hoac re toc. Khi phan ADN. T cha cac gen lien quan en chc nang tao
khoi u c cat bo khoi plasmid Ti, chung van gi nguyen kha nang chuyen gen la
vao thc vat. Cac plasmid nh vay c goi la plasmid lanh (disarmed plasmid)
hien nay ang c dung nhieu vao viec chuyen gen khong kem theo khoi u.
2. Chuyen gen nh Agrobacterium.

Protoplast, a la hoac cac the nuoi cay mo khac c nuoi chung vi Agrobacterium vi plasmid Ti co ngam gen la. Sau o vi khuan c loai bo bang cach
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc
- 53 -
dung cac khang sinh ac hieu nh carnebicilin, cefotaxin. Cac nguyen lieu thc
vat sau o c chuyen en moi trng tai sinh. Cac cay tai sinh c nuoi trong
vn m va c trong ra at. Viec chuyen gen c xac nh thanh cong nh he
thong gen anh dau gan kem nh gen khang vi khang sinh, gen ma hoa cho mot
enzyme co phan ng mau khi bieu hien, gen ma hoa cho luciferase, mot enzyme
cua om om giup cac mo chuyen gen phat sang trong toi v.v
Gen anh dau c s dung nhieu nhat la gen ma hoa cho enzyme -glucuronidase (c goi la gen GUS A). Enzyme nay t co thc vat trong ieu kien t
nhien. Neu a c gen GUS vao bo gen cua thc vat va gen nay c bieu hien
th trong mo thc vat se xuat hien enzyme -glucuronidase. No se xuc tac cho mot
phan ng mau ac trng (xanh da tri) vi c chat X-gluc (5-bromo-4-chloro-3indolyl--D-galactopyranoside). Plasmid pBI 121 do hang Chonetech Laboratories
(My) ban ra dang a c chuyen vao Agrobacterium tumefasiens (chung LBA
4404) co cha gen GUS A va c dung nhieu e chng minh s chuyen gen a
thanh cong tren mot oi tng thc vat nhat nh. e a cac gen co y ngha kinh
te nh gen ma hoa vo protein cua virus, gen oc to cua Bacillus thuringensis v.v
co the gan gen o vao pBI 121 va dung gen GUS e kiem tra.
GS.TS. Mai Xuan Lng
Khoa Sinh hoc

Công Nghệ Sinh Học Thực Vật Phần 1 - GS.ts. Mai Xuân Lương

Uploaded by

Document Information

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Công Nghệ Sinh Học Thực Vật Phần 1 - GS.ts. Mai Xuân Lương

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

TRNG AI HOC A LAT

CONG NGHE SINH HOC

GS.TS. MAI XUAN LNG

Cong nghe Sinh hoc thc vat

GS.TS. Mai Xuan Lng

Khoa Sinh hoc

Cong nghe Sinh hoc thc vat

GS.TS. Mai Xuan Lng

Khoa Sinh hoc

Cong nghe Sinh hoc thc vat

PHAN I. NHAN GIONG IN VITRO

GS.TS. Mai Xuan Lng

Khoa Sinh hoc

Cong nghe Sinh hoc thc vat

GS.TS. Mai Xuan Lng

Khoa Sinh hoc

Cong nghe Sinh hoc thc vat

CHNG I. NHNG NGUYEN TAC CUA NUOI CAY MO

GS.TS. Mai Xuan Lng

Khoa Sinh hoc

Cong nghe Sinh hoc thc vat

II. TAI SINH CAY CON TRONG NUOI CAY MO.

1. Nhan giong t hat trong ieu kien vo trung.

2. Nuoi cay phoi.

3. Nuoi cay te bao trng.

GS.TS. Mai Xuan Lng

Khoa Sinh hoc

Cong nghe Sinh hoc thc vat

1.Giai oan I. Kien lap va on nh mau cay.

GS.TS. Mai Xuan Lng

Khoa Sinh hoc

Cong nghe Sinh hoc thc vat

GS.TS. Mai Xuan Lng

Khoa Sinh hoc

Cong nghe Sinh hoc thc vat

2.Giai oan 2: nhan giong.

3.Giai oan 3: hnh thanh re.

GS.TS. Mai Xuan Lng

Khoa Sinh hoc

Cong nghe Sinh hoc thc vat

GS.TS. Mai Xuan Lng

Khoa Sinh hoc

Cong nghe Sinh hoc thc vat

IV. S LC LCH S PHAT TRIEN CUA NUOI CAY MO

GS.TS. Mai Xuan Lng

Khoa Sinh hoc

Cong nghe Sinh hoc thc vat

GS.TS. Mai Xuan Lng

Khoa Sinh hoc

Cong nghe Sinh hoc thc vat

GS.TS. Mai Xuan Lng

Khoa Sinh hoc

Cong nghe Sinh hoc thc vat

GS.TS. Mai Xuan Lng

Khoa Sinh hoc

Cong nghe Sinh hoc thc vat

CHNG II. PHONG TH NGHIEM NUOI CAY MO TE BAO

Bao am ieu kien vo trung;

I. BAO AM IEU KIEN VO TRUNG.

2. Nguon nhiem tap.

3. Vo trung dung cu thuy tinh, nut ay va moi trng.

GS.TS. Mai Xuan Lng

Khoa Sinh hoc

Cong nghe Sinh hoc thc vat