SEPARACIN DE PROTENAS EN GEL DE POLIACRILAMIDA

Camacho Galn Araceli. 4IM1. Seccin 2. 04/May/2016

Profe. Hernndez Derramadero Fernando
INTRODUCCIN
La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo elctrico; estas
partculas migran hacia el ctodo o nodo (electrodos - y +), en dependencia de una combinacin de su
carga, peso molecular y estructura tridimensional.
El movimiento de las molculas est gobernado por dos fuerzas adicionales; la friccin con el solvente,
que dificulta el movimiento, lo que genera una fuerza que se opone al movimiento; por otro lado las
molculas tienen a moverse en forma aleatoria (movimiento browniano) debido a que poseen energa
cintica propia. Esto se denomina difusin y sigue la ley de Fick. La energa cintica de las molculas
aumenta con la temperatura, por ello a mayor temperatura mayor difusin.
La velocidad de migracin de la partcula es directamente proporcional al producto de su carga efectiva y
el gradiente de potencial elctrico e inversamente proporcional al coeficiente de friccin relativo a la talla
y forma de la molcula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio.
Los mtodos electroforticos son de alta sensibilidad, poder de resolucin y versatilidad, y sirven como
mtodo de separacin de mezclas complejas de cidos nucleicos, protenas y otras biomolculas, donde
aportan un potente criterio de pureza. Es til adems para determinar otros parmetros como peso
molecular, punto isoelctrico y nmero de cadenas polipeptdicas de las protenas.
La poliacrilamida es un gel resultante de la polimerizacin qumica de acrilamida y bisacrilamida.
Regulando la concentracin de ambas se consiguen distintas porosidades.

OBJETIVOS

Efectuar la separacin de protenas de varias muestras mediante la tcnica en electroforesis en

gel de poliacrilamida.
Determinar el tamao del poro ptimo de poro del gel, para la mejor separacin de cada una de
las muestras.

RESULTADOS
Tabla 1. Caractersticas de los electroferogramas a diferentes %T

%T

5.5

7.5

10.0

12.5

7.5

6.3

6.2

8.2

7.2

6.8

8.2

6.3

5.4

4.5

6.3

3
1
4

8
2
8

4
6
8

3
2
8

Caracterstica

Longitud del gel antes de teir ,

cm. (l)
Longitud del gel despus de
teir, cm. (l)
Distancia recorrida por el
colorante, cm. (f)
No. De
Suero
Yogurt
bandas en:
Clara

Tabla 2. Movilidad electrofortica relativa promedio de cada muestra a diferentes %t

Muestra
%T

5.5

7.5

10

12.5

Suero
Clara
Yogurt
Suero
Clara
Yogurt
Suero
Clara
Yogurt
Suero
Clara
Yogurt

Valores de m de
la protena
seleccionada
(cm)
6.2
6.3
6.5
6.2
6.7
6.5
6
6.7
6.5
5.3
5.3
5.3
5.5
5.6
5.6
5.3
5.7
X
4.5
4.5
4.5
5.4
5.4
5.5
5.5
5.3
5.1
4
4.1
3.9
4.6
4.7
4.6
4.5
4.5
4.4

Valor
promedio
de m (cm)

Movilidad
electrofortica
M

Log (M X 100)

6.33
6.47
6.40
5.30
5.57
5.50
4.50
5.43
5.30
4.00
4.63
4.47

0.9184
0.9378
0.9291
0.8588
0.9000
0.8912
0.9117
1.1001
1.0738
0.6194
0.7170
0.6909

1.9630
1.9721
1.9681
1.9339
1.9542
1.9500
1.9599
2.0414
2.0309
1.7920
1.8555
1.8394

Ejemplo de clculo de la Movilidad electrofortica.

Se emplean la formula siguiente:
M=

( l'l )( mf )

Donde
l: longitud en cm del electroferograma antes de teir
l: longitud en cm del electroferograma despus de teir
m: distancia recorrida en cm, por la protena elegida en cada muestra, desde la parte inferior del pozo
hasta el recorrido mximo de cada banda
f: distancia recorrida por el colorante
Entonces, para la concentracin de 5.5 %T de poliacrilamida y con la muestra de suero:
M=

6.33
=
( 7.5
)(
8.2 6.30 )

0.9184

El clculo anterior se realizo para cada %T de poliacrilamida y con las distintas muestras de protena.
Posteriormente los resultados obtenidos se multiplicaron por cien y se obtuvo su logaritmo.
Despus con los valores de la tabla, se construy la grfica de Ferguson.

Grfica de Ferguson
2
f(x)
2.08
f(x) =
= -- 0.02x
0.03x +
+ 2.07
2.11
R
=
0.98
R = 0.99

1.95
1.9
1.85
Suero
Linear (Suero)
Log (Movilidad
* 100)

Clara

Linear (Clara)

Yogurt

Linear (Yogurt)

1.8
1.75
1.7
5

10

11

12

13

%T

Grfica 1. Grfica de Ferguson para determinar carga y peso molecular relativo de las muestras de clara, yogurt y suero .

Se obtuvo la ecuacin de la recta para las diferentes muestras, ya que la ordenada al origen proporciona
la carga neta de la protena que se separo, mientras que la pendiente aporta el valor del peso molecular
relativo, resultando lo siguiente:
Clara

Peso molecular relativo= 0.0173

Carga= 2.0739

Yogurt Peso molecular relativo= 0.0191

Carga= 2.0815

Suero

Carga= 2.1104

Peso molecular relativo= 0.0252

NOTA: Los resultados de 10 de %T no se utilizaron para elaborar la grfica de Ferguson, debido a que
presentaban valores demasiado altos que salan de la tendencia general.
PREGUNTAS EXTRA.
1. Diga cul %T recomienda para la separacin de las protenas de cada muestra?, Por qu?
Es recomendable 7.5 de %T, ya que a ese tamao de poro las protenas de las muestras
empleadas tuvieron una mejor separacin, lo que se observa reflejado en el nmero de bandas en
el gel. A dicho %T se logra una mejor separacin y resolucin.
2. Escriba la reaccin completa para la copolimerizacin de la acrilamida y la bis-acrilamida por
radicales libres, Qu funcin tiene el TEMED y el persulfato de amonio?

La reaccin de copolimerizacin de la acrilamida y la bis-acrilamida (N, N-metilen-bis-acrilamida),

es iniciada por el TEMED (tetrametiletilndiamina) y el persulfato de amonio. El radical persulfato
activa el TEMED, que a su vez activa al monmero de acrilamida para que polimerice.
Las cadenas de poliacrilamida se entrecruzan de forma azarosa por la bisacrilamida, formndose
una red de porosidad uniforme, la cual puede ser regulada variando las condiciones de la
reaccin y las concentraciones de los monmeros.
La polimerizacin se detiene cuando desaparecen los radicales libres del medio; entre los
agentes que producen su desaparicin con mayor eficacia se encuentra el oxgeno molecular.

Imagen 1. Reaccin de copolimerizacin de la acrilamida y la bis - acrilamida

3. Mencione una aplicacin de la electroforesis preparativa y una de la electroforesis analtica.

Electroforesis preparativa. Purificar molculas y fragmentos de DNA y RNA, y aplicar una
preparacin a las muestras a analizar.
Electroforesis analtica: determinar la composicin, peso molecular y carga de una protena.
4. Defina velocidad de migracin y movilidad electrofortica. Explique la diferencia.
Velocidad de Migracin: movimiento de una molcula, determinada velocidad, la cual es especfica
para cada molcula y campo elctrico. Sus unidades son cm/s. Adems es inversamente
proporcional a la viscosidad del medio y proporcional a la carga neta de la molcula.
Movilidad Electrofortica: parmetro que determina el comportamiento de una molcula bajo la
accin de un campo elctrico, velocidad de migracin por unidad de campo elctrico.
La diferencia es que, la velocidad de migracin hace referencia al movimiento y carga neta de las
molculas de la muestra y a las caractersticas del medio como la viscosidad, mientras que la
movilidad electrofortica tiene relacin con la aplicacin de un campo elctrico al gel donde se est
llevando la separacin y a la migracin de las molculas de la muestra por cada unidad de campo
elctrico.
5. Defina el trmino Electroferograma
Grfico construido a partir de los resultados de una electroforesis, representa las bandas
distribuidas en el gel de poliacrilamida, permite diferenciarlas y analizarlas con ms detalle.
Relaciona la respuesta de separacin en funcin del tiempo en el que se desarrolla la
electroforesis.