CCAYAC-M-004/11

METODO DE PRUEBA PARA LA ESTIMACION DE LA

DENSIDAD MICROBIANA POR LA TECNICA DEL NUMERO
MAS PROBABLE (NMP), DETECCION DE COLIFORMES
TOTALES, COLIFORMES FECALES y Escherichia coli

Q.F.B. Ma. Magdalena Mojica Anguiano

Febrero del 2012

OBJETIVO

Establecer la metodologa para la estimacin de la densidad de

Coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli por la
tcnica del nmero ms probable presentes en muestras de
alimentos y agua.

CAMPO DE APLICACIN
Aplica para la deteccin de Coliformes totales, coliformes fecales y
Escherichia coli .
en productos que se encuentran en bajas concentraciones de
microorganismos (<10 UFC/g o ml).

Ejemplo: Leche, agua, y para aquellos alimentos cuyas

caractersticas particulares puedan interferir en la exactitud de la
cuenta de unidades formadoras de colonias.

 PRINCIPIO

Es un mtodo de enumeracin basado en la fermentacin de la lactosa

Cosiste en una prueba presuntiva y una confirmativa

La serie de 3 tubos generalmente es para alimentos
La serie de 5 tubos moluscos y diversos tipos de agua.
El mtodo se basa en la dilucin de la muestra en tubos mltiples
Todos los tubos de la menor dilucin sea positivos y todos los tubos de la mayor
dilucin sean negativos.
El resultado positivo se demuestra por la presencia de gas y/o crecimiento
microbiano

propiedad de los microorganismos coliformes para producir gas a partir de la

fermentacin de lactosa dentro de las 48 horas de incubacin a 35 0,5C
(Coliformes) y 45,5 0,2C ( Coliformes fecales y E. coli).

 PRINCIPIO
Para obtener el Numero Mas Probable (NMP) en los
resultados se aplica la teora de la probabilidad, lo cual
tiene como condicin lo siguiente:
Una distribucin aleatoria de las bacterias que existen en la
muestra
Las bacterias se encuentran como entidades no agrupadas

Los microorganismos presentes en la muestra crecern en el

medio cuando son incubados y se mantengan en las
condiciones adecuadas para su desarrollo.

 CONSIDERACIONES
Si la cuenta microbiana es alta deber diluirse

La forma mas comn es mediante diluciones decimales y

usando un inoculo en series de 3, 5 o 10 tubos en series.
A medida que el numero de tubos inoculados para cada
dilucin aumenta , se reducen los limites de confianza.

EQUIPO

Bao de agua con : recirculacin continua, tapa de dos aguas y termostato que
evite variaciones mayores a 0,1 C

Lmpara de luz ultravioleta de longitud (365 nm) 4 watts

Incubadora de 35 0,5C.

Autoclave que alcance una temperatura de 121C con termmetro CALIBRADO

y previamente evaluada con esporas de Bacillus stearothermophilus

Potencimetro con sensibilidad de 0,1 de unidad de pH

Balanza con capacidad adecuada y sensibilidad de 0,1 g

Motor de licuadora u homogeneizador peristltico

Mechero Bunsen

MATERIALES
Tubos de cultivo de 18 x 200 y de 16X 160 mm con tapon de
rosca.
Campanas de fermentacin de 5 cm de largo por 5 mm de
dimetro (campanas de Durham).
Termmetro de inmersin con divisin mnima de 0,5C para
incubadora calibrado y/o verificado

Termmetro de mximas para autoclave con divisin mnima

de 0,5C calibrado
Termmetro de inmersin de 22C - 55C con subdivisiones de
0,1C y escala auxiliar aC
Asas bacteriolgicas de 3 a 3,5 mm de dimetro con porta
asa
Lentes protectores

MEDIOS DE CULTIVO
Prueba presuntiva
Caldo Lauril :
debido a su elevada cantidad nutritiva y el tampn de fosfatos que
contiene este medio de cultivo se garantiza el rpido crecimiento
y la intensa formacin de gas por la fermentacin de lactosa,
detectadas por campanas Durham.
El contenido de lauril sulfato inhibe notablemente el crecimiento
de la flora acompaante indeseable.
Concentracin sencilla
Doble concentracin
Triple concentracin

Preparacin de Caldo Lauril triptosa

Inoculo
mL

Cantidad de medio
por Tubo
mL

Volumen de medio +
Inoculo
mL

Caldo lauril triptosa

requerido
g/L

10 o mas

11 o mas

35,6

10

10

20

71,2

10

20

30

53,4

20

10

30

106,8

100

50

150

106.8

100

35

135

137,1

100

20

120

213,6

MEDIOS DE CULTIVO
Prueba presuntiva
Caldo lactosado
Este medio se puede utilizar alternativamente para muestras de
agua de mar, de reas de cultivo
Medio
mL

medio +
Inoculo
mL

Caldo
lactosado
g/L

10 o mas

11 o mas

13,00

10

10

20

26,00

10

20

30

19,50

100

50

150

39,00

100

35

135

50,10

100

20

120

78,00

Inoculo
mL

PROCEDIMIENTO ANALITICO PARA AGUA Y HIELO

PRUEBA PRESUNTIVA : PREPARACION DE LA MUESTRA

Agitar la muestra que debe ser mnimo de 100 ml.

Dependiendo de la naturaleza del agua y contenido

bacteriano hacer las diluciones necesarias en esta etapa.

AGUA PARA USO Y CONSUMO HUMANO Y ENVASADA

Realizar la inoculacin de los tubos de cualquiera de las

tres siguientes formas:
Transferir directamente 5 porciones con 20ml

Transferir directamente 10 porciones de 10ml

o una porcin de 100ml

AGUA PARA USO RECREATIVO

Utilizar 5 tubos de caldo lauril por cada
porcin de con 10ml , 1 y 0,1 ml

Hacer diluciones decimales cuando se espere

una desidad microbiana alta.

HIELO
Fundir el hielo a 45C y realizar el anlisis
como agua para uso y consumo humano.
NOTA IMPORTANTE
Revisar la tabla de preparacin del caldo lauril triptosa, para aplicar la
correcta cantidad de inoculo y de medio.

Agua de mar para el cultivo de

moluscos bivalvos
Utilizar 5 o 3 tubos por dilucin
(dependiendo del grado de exactitud
deseado)
Con porciones de 10, 1, o 0,1 ml
Hacer diluciones cuando se espere una
densidad microbiana alta.

 PROCEDIMIENTO Pruebas Presuntivas: Ejemplo

Agua para uso recreativo

muestra

10 mL de
muestra para
cada tubo

Concentracin doble

1mL de la
muestra para
cada tubo

Concentracin
sencilla

1mL de la
dilucin para
cada tubo

Concentracin
sencilla

 CONTINUACION DE PROCEDIMIENTO
Pruebas Presuntivas: Incubacin del medio

Incubacin de los tubos de caldo lauril : incubar los tubos a

35 + 0,5C

 Examen de los tubos:

Examinar los tubos a las 24 horas y observar si hay formacin de
gas .Registrar los resultados
De no ser as incubar 24 horas mas
Registrar los resultados

Prueba confirmatoria
Coliformes totales

MEDIOS DE CULTIVO
Caldo Verde Brillante Lactosa bilis: En el medio de cultivo, la peptona
aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano
la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el
desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepcin de
Coliformes.
la lactosa es el hidrato de carbono fermentable.

 Pruebas Confirmativas coliformes totales

Inoculacin del medio: resembrar una asada a partir de
cada tubo de medio de aislamiento (Caldo lauril ) que
mostro un resultado positivo por la produccin de gas
Los caldos de medios confirmativos mas selectivos son:
Caldo de Bilis Lactosa Verde Brillante
Para confirmar la presencia de organismos Coliformes
totales, incubar un tubo de CBVB a 35 0,5C y examinarlo
para ver si hay produccin de gas dentro de un periodo de
48 2 horas.
Registrar los resultados a las 48 horas
Utilizar estos resultados para calcular el Numero Mas
Probable de coliformes totales

Prueba confirmatoria
Coliformes fecales

MEDIOS DE CIVO

Caldo EC (E. coli): el contenido de lactosa favorece a

las bacterias lactosa-positivas, especialmente
Coliformes y E. coli,
las sales biliares inhiben notablemente el crecimiento
de grmenes G + o de especies microbianas no
adaptadas al medio ambiente intestinal.
Los bacterias lactosa positivos consumen la lactosa,
con produccin de gas.

 Inoculacin del medio: resembrar una asada a partir de cada

tubo de medio de aislamiento (Caldo lauril ) que mostro un
resultado positivo por la produccin de gas en medio EC.
Inocular un tubo del caldo EC un control positivo de
Escherichia coli y un control negativo de Enterobacter
aerogenes e incubar con las muestras.
AGUA, MOLUSCOS BIVALVOS Y AGUA DE MAR
Para confirmar la presencia de organismos coliformes fecales
incubar EC a 44,5 0,2C durante 24 horas.
ALIMENTOS
Para confirmar la presencia de organismos coliformes fecales
incubar EC a 45,5 0,2C durante 24 horas observar si hay
produccin de gas, registrar la lectura en caso de no haber
formacin de gas, incubar 24 horas mas.

Prueba confirmatoria
Coliformes fecales
Registrar los resultados a las 24 horas y 48 horas
Utilizar estos resultados para calcular el Numero Mas
Probable de coliformes fecales

Prueba confirmativa para E. coli

(por identificacin Bioqumica)
Tomar una asada de los tubos positivos de caldo EC y sembrar
por estra cruzada en EMB para su aislamiento
Incubar las placas invertidas a 35C por 18 24 horas
Seleccionar dos colonias de cada placa: Colonias con centro
negro planas con o sin brillo metlico y sembrarlas en agar
cuenta estndar (placa o agar inclinado) para poder realizar
las pruebas bioqumicas. Incubar las placas o tubos a 35C por
18-24 horas.
Si no hay colonias con morfologa tpica, probar una o mas
colonias parecidas a E. coli de cada placa.

Agar Eosina azul de metileno de Levin (EMB-L)

La eosina y el azul de metileno son colorantes que
combinados forman un precipitado a un pH acido.
Ambos actan como indicadores de pH e inhibidores
Las bacterias gram positivas son parcialmente
inhibidas en el medio
La lactosa y sacarosa son los carbohidratos
fermentables Las lactosa positivo son colonias azul negras con o sin
centro negro y brillo metlico

Prueba confirmativa para E. coli

(por identificacin Bioqumica)
Hacer un frotis y teirlo por gram.
Observar al microscopio la presencia de
bacilos cortos o cocobacilos gram negativos

Pruebas Bioqumicas (IMViC)

Indol
Rojo de Metilo
Voges Proskauer
Citrato

Medios Para la produccin de Indol.

Agua triptona o Caldo Triptona: El caldo contiene triptfano que es
un aminocido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres
metabolitos indlicos principales, Indol, escatol (metl indol) y cido
indolactico ( IAA,indolacetato)
Incubar a 35C 0,5 por 24 horas. Adicionar reactivo de Kovacs

La presencia de una coloracin roja en

la superficie del tubo se considera positiva

Prueba Vogues-Proskauer

Determinar la capacidad de algunos microorganismos para producir un producto

final neutro , acetilmetilcarbinol (AMC, acetoina), a partir de la fermentacin de la
glucosa.

Esta prueba se utiliza para separar la Escherichia coli de los grupos KlebsiellaEnterobacter .
El alfa naftol actua como un intensificador de color y el KOH ayuda a la absorcion
de CO2 en el medio para formar el diacetilo , y reacciona con los nucleos de
guanidina presentes en la peptona produciendo un color rosado rojo.

Controles
VP positivo (+) Enterobacter cloacae: color rosado-rojo en la superficie del medio
(acetoina presente)
Vp negativo (-) Escherichia coli color amarillo en la superficie del medio . Puede
formarse un color cobrizo , pero es un resultado negativo

Prueba Vogues-Proskauer
Inocular un tubo con caldo MR-VP e incubar a 35C +/-0,5 por 48 +/-2horas.
Transferir 1 ml a un tubo de 13 x 100mm. Adicionar 0,6ml de solucin de alfa
naftol y 0,2ml de hidrxido de potasio al 40% y agitar.
Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo rosado de
15 a 30 min.

PRUEBA DE ROJO DE METILO

Probar la capacidad de un microorganismo para producir y
mantener estables los productos finales cidos a partir de la
fermentacin de la glucosa y para vencer la capacidad buffer
del sistema.
Esta es una prueba cuantitativa para la produccin de acido
(determinacin de pH)
Los resultados del rojo de metilo son caractersticas valiosas
para la identificacin de especies bacterianas que producen
cidos fuertes a partir de la glucosa

 Es una prueba cuantitativa basada en el uso de un indicador

de pH, para determinar la concentracin de ion hidrogeno
cuando un microorganismo fermenta la glucosa.
A las 18-24 horas de incubacin la fermentacin resultante
produce derivados metablicos cidos y todos
Microorganismos entrico lo darn.
Sin embargo incubacin de 2-5 das los positivos continan
por una alta produccin de cidos: acido lctico acido actico
acido frmico

 El rojo de metilo es un indicador acido y denotara

cambios en la acidez por reacciones de color por
encima de un rango de pH de 4,4-6
A pH 4,4 o menor en el medio, el reactivo
permanece rojo, mientras que con la acidez
disminuida a pH 6, el indicador rojo de metilo cambia
al color amarillo.
Un color amarillo aun denota acidez, pero la
concentracin de iones hidrogeno es mucho mas
baja.
A un rango de pH de 5-5,8 se producen varios
matices de naranja

 Inocular un tubo adicional con caldo MR-VP e

incubar a 35+/-0,5C por 48+/-2horas.
Adicionar 5 gotas de solucin de rojo de metilo.
Se considera una prueba positiva cuando se
desarrolla un color rojo.
RM-positivo (+) Escherichia coli

RM-negativo(-) Enterobacter
aerogenes

Prueba de citrato de Koser y Simmons

Se utiliza para diferenciar a la E. coli de la
Enterobacter aerogenes basado en la
utilizacin del citrato como fuente de carbono.
Citrato de Koser: El crecimiento produce
turbidez en el medio.
Citrato de Simmons: El medio contiene azul de
bromotimol

 Inocular por estra. Incubar a 35+/-0,5C por 48

horas. Una prueba positiva se observa mediante
crecimiento y un cambio en la coloracin a azul, la
ausencia de crecimiento se considera negativa.
Positivo: Enterobacter aerogenes buen crecimiento
Negativo:Escherichia coli marcada inhibicin

Interpretacin de resultados de Pruebas

bioqumicas
Todos los cultivos que fermenten la lactosa
con produccin de gas a las 48 horas a 35C,
sean bacilos o cocobacilos Gram negativos no
esporulados y se obtengan las siguientes
combinaciones para el IMViC
Biotipo 1: + + - Biotipo 2: - + - Son consideradas como E. Coli

Reporte de NMP de E. coli

Calcular el NMP de la E.coli basada en la
proporcin de los tubos positivos de caldo EC
confirmados

PROCEDIMIENTO PARA ALIMENTOS

Pesar 25 o 50 g del alimento en 225 o 450 ml

de regulador de fosfatos
Moler por 2 minutos en vaso de licuadora u
homogeneizador peristltico.
Preparar diluciones decimales con regulador
de fosfatos.
Agitar 25 veces en un arco de 30 cm por 7
segundos.

PROCEDIMIENTO PARA ALIMENTOS

PRUEBA PRESUNTIVA COLIFORMES TOTALES Y
FECALES

Transferir volmenes de 1ml a 3 tubos con

10ml de caldo lauril sulfato de sodio por cada
dilucin.
Incubar a 35 0,5C. Examinar 24 horas
formacin de gas , si no continuar incubado 24
horas mas.

PROCEDIMIENTO PARA ALIMENTOS

PRUEBA CONFIRMATIVA

Coliformes totales: Igual a las condiciones y

medios de cultivo utilizados para coliformes
totales en agua.

Coliformes fecales: Igual a las condiciones y

medios de cultivo para coliformes fecales en
agua a excepcin de la temperatura que debe
ser a 45.5 0.2C por 24 a 48 horas.

Prueba para detectar E. coli en alimentos refrigerados

o congelados excepto moluscos bivalvos
Cuando el MUG es incorporado al caldo lauril, los
coliformes pueden ser enumerados en base a la
produccin
Gas a partir de lactosa y E. coli es identificada por la
fluorescencia al incidir luz ultravioleta al medio dentro de
las 24 horas.

Prueba para detectar E. coli en alimentos refrigerados

o congelados excepto moluscos bivalvos
PRUEBA PRESUNTIVA
Utilizar caldo LAURIL con MUG en vez de caldo lauril
Inocular cepa de E .coli GUD positiva como control(ATCC
25922)
Inocular cepa Enterobacer aerogenes (ATCC13048) como
control negativo.
Incubar los tubos 24 a 48 2 horas a 35 C.
Examinar cada tubo con crecimiento (turbiedad y
gas),despus observar los tubos en la obscuridad con una
lmpara de luz ultravioleta.
Una prueba positiva presuntiva para E. coli es la presencia
de florescencia en el tubo.

Prueba para detectar E. coli en alimentos refrigerados

o congelados excepto moluscos bivalvos
PRUEBA CONFIRMATIVA
Confirmar todos los tubos positivos estriando en una placa
de agar EMB, Incubar a 35C por 24 2 horas.
Continuar con el procedimiento para Identificacin de E.
coli por pruebas bioqumicas .
Calcular el NMP de E. coli basada en la confirmacin de
tubos en las 3 diluciones consecutivas.

CALCULOS

Utilizar las tablas de acuerdo al numero de

tubos utilizados.
Si los resultados no estn incluidos en las
tablas , se debe repetir la prueba a partir de la
muestra original.
El intervalo del 95% de confianza se interpreta
como sigue :Si el analista supone que el
numero real de microorganismo cae dentro de
los limites, entonces se asume que ser
correcto el 95% de las veces.

CALCULOS

El valor del NMP tabulado representa un

intervalo y no un valor absoluto.
El NMP debe determinarse a partir de los
resultados de tres diluciones consecutivas.
PRIMERO:
Todas las diluciones que tengan todos los
tubos positivos, seleccionar la dilucin mayor.

CALCULOS

SEGUNDO:
Despus usar las 2 siguientes diluciones
mayores .
Cuando en ninguna da las diluciones probadas
hubiera crecimiento en todos los tubos ,
seleccionar las primeras tres diluciones
consecutivas para que la dilucin media
contenga resultados positivos
(C ejemplo 1 y 2)

INTERPRETACION DE RESULTADOS

Expresar en NMP/g o ml para alimentos

NMP/100ml para agua.
Cuando se obtienen resultados negativos ,
informar el limite de deteccion que
corresponde a menos de una vez el valor mas
bajo del NMP de la tabla utilzada.
En el caso del agua para uso y consumo
humano por acuerdo internacional se informa
NO DETECTABLE O ND

MEDIDAS DE CONTROL DE CALIDAD

Registrar las temperaturas de incubacin con termmetros
verificados.
Pesar la muestra en balanza calibrada y verificada
Verificar el ciclo de esterilizacin de autoclaves con indicador
biolgico y termmetro de mximas calibrado o verificado.
Verificar el ciclo de esterilizacin de hornos con indicador
biolgico.
Realizar control de medios de cultivo con cepas tipo
(evaluacin biolgica) y evaluacin fsica.
Realizar control ambiental por el mtodo de sedimentacin.
Volumen en los tubos de la solucin diluyente

MEDIDAS DE CONTROL DE CALIDAD

Verificar la funcionalidad del proceso analitico mediante
cultivos control como sigue:
Inocular una cantidad < 30 UFC/ml siguiendo el instructivo de
trabajo para la obtencin de un inoculo de trabajo con una
cuenta conocida.
Para la obtencion de una cuenta microbiana de 15 a 30
UFC/100L solo para el caso del control Positivo E. coli ATCC
25922.
Para el caso de los controles negativos se requiere un inoculo
de 100 a 1000 UFC / con una asa calibrada de 10 L.

CONDICIONES DE PRUEBA
Control de medio ambiente: En el rea donde se procesan las
muestras no debe rebasar de 15 UFC en 15 minutos de
exposicin de una placa de agar soya tripticasa o agar
peptona-glucosa extracto de levadura.

VALIDEZ DE LA PRUEBA
Si el crecimiento de los controles no es
caracterstico la prueba se invalida.
Cuando todos los tubos de la menor dilucin
sean positivos y todos los tubos de la dilucin
mayor o la combinacin de ambos

 BIBLIOGRAFIA

CCAYAC-M-004/11 Determinacin de bacterias Coliformes, Coliformes fecales. E.

coli por la tcnica del numero mas probable.

Mc Faddin Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias

de importancia clnica 3. Edicin, editorial Panamericana