Protocolo

Laboratrio de Biotecnologia Molecular

ENSAIO DE WESTERN BLOTTING

1. Todas as amostras que sero ensaiadas para o reconhecimento do anticorpo devem ser
submetidas SDS-PAGE 15%. Ao final da corrida eletrofortica, imergir o gel em
soluo para de colorao. Em seguida imergir o gel em soluo para descolorao.
Obs.: Usar luvas durante todo o ensaio.
2. Ao final da descolorao, o gel ser imerso (5 min.) no Tampo de Transferncia,
juntamente com a membrana de nitrocelulose e papis de filtro (Whatman 3MM, nas
dimenses do gel).
3. Montar um sanduche com a membrana e os papis de filtro, evitando a formao
de bolhas. O pacote ser prensado na cuba de transferncia, e submetido a uma potncia
de 150V (80 a 160 mA) por cerca de 2 h, no Tampo de Transferncia.

4. Aps a transferncia, desmontar o aparato. Descartar os papis de filtro e cortar no

canto da membrana, indicando a posio do primeiro poo. Em seguida, a membrana
ser corada com Soluo de Ponceau , por no mximo 5 min., seguindo a descolorao
em cido actico 0,1%, o que permitir a visualizao das bandas transferidas. A banda
de ineresse, deve ser marcada, com o auxlio de uma agulha, atravs de pequenos furos
na membrana.
5. Lavar a membrana com tampo TBS[1X]. Em seguida, a membrana ser incubada
com uma Soluo de Bloqueio por 40 a 60 min. a temperatura ambiente, ou durante a
noite, a 4oC, sob leve agitao.
6. Remover a membrana da soluo de bloqueio e lavar brevemente com tampo
TBS[1X], 3 a 4 vezes, com durao de 5 min. cada lavagem.

Protocolo

Laboratrio de Biotecnologia Molecular

7. Incubar a membrana por 1 a 2 horas com o 1o anticorpo (diludo em TBS[1X]) a

temperatura ambiente. Em seguida, lavar a membrana 3 a 4 vezes, 5 min cada lavagem
com TBS[1X].
8. Incubar a membrana com o 2o anticorpo conjugado com fosfatase alcalina (na
diluio recomendada pelo fabricante, normalmente 1:2000), diludo em TBS, por 1
hora a temperatura ambiente, sob leve agitao.
9. Lavar a membrana com tampo TBS[1X], 3 a 4 vezes, com durao de 5 min. cada
lavagem.
10. A membrana ser ento coberta com a Soluo Reveladora, permanecendo no
escuro at que a reao possa ser visualizada (geralmente de 10 a 15 min, mas pode ser
overnight).
11. A reao de revelao ser bloqueada atravs da lavagem com H 2O destilada e a
membrana ser secada a temperatura ambiente.

4. Solues e Tampes para Western blotting

Tampo de Transferncia
1,65 g de Tris
2,75 g de Glicina
540 mL de H2O
Metanol q.s.p. 650 mL.
Obs.: Poder ser usado mais de uma vez. Guardar na geladeira.
TBS
NaCl 150 mM
Tris 20 mM
pH 7,4

TBS [10X]
87,6 g de NaCl
60,5 g de Tris

Protocolo

Laboratrio de Biotecnologia Molecular

Tampo AP (p/ fosfatase alcalina)

Tris 0,1M
NaCl 0,1M
MgCl2 5 mM
Soluo Reveladora
10 mL de Tampo AP
33 L de soluo BCIP (50 mg de 5-bromocloroindoil-fosfato em 1 mL de NN
dimetilformamida)
66 L de soluo de NBT (100 mg de nitroazul de tetrazlio em 1,4 mL de NN
dimetilformamida + 600 L H2O)
Obs.: Tem pastilhas reveladoras prontas p/ dissoluo em gua.
Soluo de Bloqueio
2,5 g de leite em p desnatado
50 mL de TBS[1X]
Obs: Deve ser preparado na hora de usar
Soluo de Ponceau
0,5% de Ponceau
0,1% de cido actico
5. Referncias bibliogrficas

CARVALHO, C.V.; RICCI, G.; AFFONSO, R. Guia de Prticas em Biologia

Molecular. So Caetano do Sul, SP: Yendis Editora, 2010.
SAMBROOK, J. & RUSSEL, D. W. Molecular Cloning A Laboratory Manual 3rd ed.
Cold Spring Harbor, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.