I.

OBJETIVOS
-

Aprender a determinar cmo influyen algunos factores qumicos del ambiente en la

velocidad de crecimiento de los microorganismos.

II. FUNDAMENTO TERICO

Las razones principales para controlar los microorganismos son: prevenir la trasmisin
de enfermedades, evitar el deterioro de los alimentos y evitar la contaminacin tanto
en procesos industriales que requiere cultivos puros, como en laboratorios de
diagnstico o investigacin.

III. MARCO TERICO

Los microorganismos resultan enormemente influenciados por los agentes qumicos del
ambiente. La respuesta a condiciones favorables es el crecimiento y a condiciones
adversas permite el control de los microorganismos perjudiciales. Los microorganismos
pueden ser eliminados, inhibidos o muertos por estos agentes.
III.1

AGENTE QUMICO

Es una sustancia (slido, lquido o gas) que se caracteriza por una composicin
molecular definida y que causa una reaccin en los microorganismos, por ejemplo los
compuestos fenlicos, los alcoholes, el cloro, el yodo y el xido de etileno.
Dependiendo de la concentracin y del tiempo de exposicin, los daa o los mata. El
pH y la salinidad, son factores qumicos que afectan el crecimiento de los
microorganismos.
AGENTES QUMICOS
Alta concentracin de solutos

Desinfectantes y antispticos

Antibiticos

Necesidad de oxgeno

TABLA N 1: Agentes Qumicos

3.1.1 Influencia de las altas concentraciones de solutos

Todos los organismos requieren de agua para vivir, la adicin de un soluto en un medio
puede influir en la disponibilidad de agua para los microorganismos. Las altas
concentraciones de solutos hacen que el agua disponible de los medios de cultivo sea
menos accesible a los microorganismos. Aunque existen muchos factores que influyen
para probar las necesidades de agua que requieren los microorganismos, uno de los
Aw
factores ms importantes es el tipo de soluto a utilizar para bajar la
. Por un lado
se puede probar la influencia de

NaCl

para determinar el halofilismo; y por otro lado

se puede determinar la influencia de la glucosa, u otro azcar, para probar la osmofilia

Fig. N1: Disponibilidad de Agua
de los microorganismos

Microorganismos halfilos: Estos microorganismos son capaces de competir

satisfactoriamente a la deshidratacin y resistencia a la desnaturalizacin protenica
causada por la sal.
TABLA N 2: Clasificacin de los microorganismos halfilos

Halfilos Moderados
Crecimiento ptimo 3% y
mximo hasta 15% de NaCl.

MICROORGANISMOS HALFILOS
Halfilos Extremo
Crecimiento ptimo 15 hasta
25% de NaCl.

Halotolerantes
Capaces de crecer
ptimamente en ausencia de
sal, pero son capaces de
tolerar hasta un 15 %

Biologa de los Microorganismos, (1998)

Microorganismos osmfilos: Estos microorganismos son capaces de desarrollarse en

altas concentraciones de azcar.
TABLA N 3: Clasificacin de los microorganismos osmfilos

MICROORGANISMOS OSMFILOS
Osmfilos
Osmotolerantes

Sern osmfilos si solamente crecen a

altas concentraciones de azcar.

Sern osmotolerantes si crecen en un

amplio rango de azcar

3.1.2 Determinacin de la accin germicida de algunos agentes qumicos

La accin germicida de algunos compuestos qumicos se determina poniendo en contacto
el microorganismo con una solucin del agente qumico y despus de un perodo de
tiempo se controla la viabilidad del microorganismo, sembrndolo en un medio de
cultivo adecuado.
Para la elaboracin de nuestra prctica utilizamos como agente qumico: alcohol al 70%.
Alcoholes: Sus principales caractersticas, adems de las
antimicrobianas, es la de ser buenos solventes de otros productos, entre
ellos muchos antispticos y desinfectantes, potencindolos en su
actividad. Al aumentar el nmero de carbonos se incrementa su eficacia
antimicrobiana, pero tambin su toxicidad, por lo que slo se emplean
los de bajo peso molecular: etanol o alcohol etlico e isopropanol o
alcohol isoproplico. La actividad depende de la concentracin, por lo
que el mximo de eficacia lo obtienen los que poseen una
concentracin entre el 60% - 80%. Las concentraciones ms usuales
varan entre el 70% y el 96% para el alcohol etlico y entre el 70% y el
100% para el alcohol isoproplico. Los alcoholes poseen una rpida
accin, incluso desde los 15 segundos, aunque no tienen efecto
persistente, y un amplio espectro de actividad, actuando sobre
bacterias gram negativas y gram positivas, incluyendo micobacterias. La Fig. N 2: Alcohol
accin microbicida se atribuye a la entrada a travs de la pared, membrana celular y
con la inactivacin de enzimas, mediante rotura de esas barreras y desnaturalizacin, en
el citoplasma, de protenas esenciales para el microorganismo. Su eficacia est
relacionada con la presencia de agua, ello se debe a que estos compuestos acuosos
penetran mejor en las clulas y bacterias permitiendo as el dao a la membrana y la
rpida desnaturalizacin de las protenas, con la consiguiente interferencia con el
metabolismo y lisis celular.
Limpieza y desinfeccin en la Industria Alimentaria, (2010)

3.1.3 Determinacin de la Accin de los Antibiticos

-

Mtodos de antibiograma basados en difusin

Los mtodos de difusin se basan en la distribucin homognea del antibitico sobre los
medios slidos de cultivo. En trminos generales los antibiticos se impregnan en discos
de papel que se colocan sobre placas de medio de cultivo en las que previamente se ha
extendido la bacteria a considerar. Tanto la cantidad de antibitico como el nmero de
bacterias (inculo) deben controlarse cuidadosamente. El antibitico se difunde por el
agar creando un gradiente de concentracin decreciente segn se aleja del disco. La
bacteria si resulta susceptible no crece en las inmediaciones del disco y forma un halo
de inhibicin. Dicho halo es ms grande cuanto mayor es el grado de sensibilidad de la
cepa al antibitico.
Microbiologa clnica prctica, (1994)

III.2 CEPAS:
Escherichia coli

Fig. N3: Aplicacin del disco de antibitico

Morfologa
Escherichia es el gnero tipo de la familia Enterobacteriaceae y E.
coli es la especie tipo del gnero. Es un cocobacilo corto catalasapositivo, oxidasa-negativo, fermentador de lactosa, glucosa y
sacarosa, tie de color rosado en la tincin Gram, por tanto es un
microorganismo no halfilo, Gram negativo, no esporgeno.
Requisitos nutricionales y de crecimiento
Fig. 4: Escherichia coli

Es verstil y se adapta muy bien a su ambiente. Es un anaerobio

facultativo que crece a un pH ptimo (6.0 7.0) y a un temperatura de 37C (mesfilo)

Microbiologa de los Alimentos, (1997)

Staphylococcus aureus

Morfologa microscpica
Es un coco que crece agrupado en racimos, gram positivo es
aerobio y anaerobio facultativo. Puede crecer en ausencia
de sal y es capaz de crecer hasta con un 10 % de sal comn,
es halotolerante.
Morfologa macroscpica

Fig. 5: Staphylococcus aureus

En medios no selectivos, S. aureus presenta colonias de 1 a 3 mm de dimetro, lisas,

levemente elevadas, de bordes enteros, levemente convexas y generalmente
pigmentadas con un color que puede ir desde crema al amarillo. La produccin de
pigmento se ve favorecida si se incuban los cultivos por 24 horas a 48 horas adicionales a
temperatura ambiente.
Resistencia a agentes qumicos

Es muy resistente a las condiciones ambientales normales. Es capaz de sobrevivir hasta

tres meses en un cultivo a temperatura ambiente. Muere expuesto a temperaturas
mayores de 60 C por una hora. En cuanto a los agentes qumicos, es sensible a la
mayora de los desinfectantes y antispticos, que lo matan en pocos minutos, se
necesitan 15 minutos de exposicin al alcohol de 70 para su eliminacin. La tintura de
yodo es mucho ms activa y requiere solo 1 minuto.
Etiopatogenia microbiolgica, (2008)

7: Microorganismos en concentracin de ion Sodio

BacillusFig.
subtilis

Bacillus es el gnero tipo de la familia Bacillaceae. Es un

bacilo catalasa-positivo. Es un microorganismo Gram
positivo aerobio, forma endoesporas. No se considera
patgeno para los seres humanos, se usa como fungicida
para semilla de flores y de productos agrcolas.

Fig. 6: Bacillus subtilis

IV.

PARTE EXPERIMENTAL

Materiales & Equipos

Reactivos

Cepas

Mechero Bunsen
Asa de Kolle
Tubos de Ensayo
Placas Petri
Estufas
Pipetas
Gradilla de madera
Tapones de Algodn

Cloruro de Sodio
Sacarosa
Fenol 0.5%
Alcohol 70%
Lugol
Cefoperazone 75 mcg

Salmonella typhi
Bacillus subtilis
Fig. 8: NaCl al 5%,
10% y 15%
Staphylococcus
aureus
Scherichia coli

Fig. 9: Sacarosa al 10%, 20% y 30%

EFECTO DE LOS AGENTES QUMICOS SOBRE

DESARROLLO BACTERIANO

Efecto de las altas concentraciones de solutos

DETERMINACIN DEL HALOFILISMO

1. Se procedi a rotular 3 placas Petri con rtulos de NaCl al 5%, 10% y 15 %

2. Se sembr el inculo de Staphyloccus aureus, en las placas Petri mediante el
Mtodo Francs.
3. Se incub los microorganismos a la temperatura de 37 oC por 24 horas y 48 horas.

4. Se realiz la lectura respectiva

DETERMINACIN DE LA OSMOFILIA
5. Se procedi a rotular 3 placas Petri con rtulos de 10%, 20% Y 30% de Sacarosa.
6. Se sembr el inculo de Staphylococcus aureus, en las placas Petri mediante el
Mtodo Francs.
7. Se incub los microorganismos a la temperatura de 37 oC por 24 horas y 48 horas.

8. Se realiz la lectura respectiva

Se procedi a rotular 4 tubos de ensayo con rtulos de 1 minuto, 2.5 minutos, 5 minutos y 10 minuto

Fig. 10: Tubos de en

Con una pipeta se dej caer 0.5 ml del inculo Streptococcus aureus en una solucin de 5 ml de alco
Se agit y dej actuar por 1 minuto.
Se tom una asada de la mezcla y se sembr en el tubo con el rotulo 1.
A los 2.5 minutos
se repiti el
anterior
en el tubo
con elagentes
rotulo 2.5.
Determinacin
depaso
la accin
germicida
de algunos
qumicos
A los 5 minutos repiti el paso anterior en el tubo con el rotulo 5.
A los 10 minutos repiti el paso anterior en el tubo con el rotulo 10.
Se incub a la temperatura de 37 C por 24 horas y 48 horas
Se realiz la lectura respectiva.

 Determinacin de la accin de los Antibiticos

1. Se procedi a rotular una placa Petri con el
rtulo de A.N.H.
2. Se sembr por extensin en superficie 0.1 m
de inoculo de una cepa joven, distribuyendo
uniformemente.
3. Se aplic inmediatamente un disco del
antibitico Cefoperazone 75 mcg.
4. Se incub a la temperatura de 37 oC por 24
horas.
5. Se realiz la lectura respectiva.

Fig. 11: Disco de Cefoperazone

V. RESULTADOS
Efecto de las altas concentraciones de solutos
CONCENTRACIONES DE NaCl
BACTERIA

S. aureus

15%

10%

5%

Crecimiento
microbiano en 10
lneas

Crecimiento en 5
lnea

Crecimiento en 10 lneas

OBSERVACIN: La bacteria S. aureus present desarrollo en las tres muestras,

demostrando ser halotolerante pues son capaces de tolerar concentraciones salinas de
hasta 15%. La presencia de colonias de regular tamao con una elevacin convexa
levemente baja, todas las colonias presentaron una coloracin amarillenta, opaca. En las
tres placas Petri hubo evidencia de contaminacin pues hubo desarrollo fuera de las lneas
trazadas.
Fig. N 12

CONCENTRACIONES DE SACAROSA
BACTERIA

S. aureus

30%

20%

10%

Crecimiento en 20
lineas

Crecimiento en 10
lineas

Crecimiento en 15 lineas

OBSERVACION: La bacteria S. aureus present desarrollo en las tres muestras,

demostrando ser osmotolerante pues son capaces de tolerar concentraciones de sacarosa
de hasta 30%. Existe presencia de colonias de regular tamao con una elevacin convexa
levemente baja, todas las colonias presentaron una coloracin amarillenta, opaca. En las
tres placas Petri hubo evidencia de contaminacin pues hubo desarrollo fuera de las lneas
trazadas.

Fig. N 13

Fig. N 13

Determinacin de la accin germicida de algunos agentes qumicos

Agente qumico: Alcohol (70%)

BACTERIA

1 min.

2.5 min.

5 min.

10 min.

S. aureus
OBSERVACIN: No hubo presencia de turbidez en ninguno de los tubos, por tanto
podemos concluir que la bacteria Staphylococcus aureus es sensible a este agente
qumico al no presentar desarrollo de microorganismos.

acin de la accin de los Antibitico (Antibiograma)

BACTERIA

S. aureus

Antibiotico: Cefoperazona 75 mg/ disco

Medio: Mueller Hinton Agar (AMH)

OBSERVACIN: El dimetro del halo de inhibicin que circundaba al disco meda 27 mm.
Frente a las otras cepas, Scherichia coli (26 mm.) y la Salmonella Typhi (23 mm.) podemos
decir que el Staphylococcus aureus es ms sensible al antibitico Cefoperazona que las
otras sepas que presentan mayor resistencia frente a este antibitico, por ello su halo de
inhibicin es menor.

Det
er
min

VI. DISCUSIONES
-

Ingraham, J. en su libro: Introduccin a la Microbiologa II, manifiesta que: El

mtodo de difusin en placa o Kirby-Bauer las placas se incuban durante el
tiempo adecuado para que las bacterias crezcan, despus de producirse el
crecimiento, algunos discos de antibiticos estarn rodeados por un halo claro
(sin crecimiento), lo cual indicar una inhibicin del crecimiento bacteriano
producida por el agente microbiano.
Los resultados de nuestra prctica concuerdan con el autor debido a que en la
lectura del mtodo de difusin en placa (segn el autor) o Determinacin de la
accin de los Antibiticos por medio del Antibiograma, se pudo observar un halo
que rodeaba al antibitico, sin presencia microbiana en el halo respectivo.

Ingraham, J. en su libro: Introduccin a la Microbiologa II, seala que: Si el

crecimiento del microorganismo se inhibe por una baja concentracin del
antibitico, el halo ser muy grande. Si el crecimiento se inhibe solamente por
una concentracin elevada del antibitico, el halo ser ms pequeo. El
tamao de cada halo se mide y se compara con patrones de susceptibilidad
para cada antibitico.
Los resultados de nuestra prctica concuerdan con el autor debido a que nuestra
placa con Staphylococcus aureus posea un halo ms grande con respecto a las
pruebas realizadas con Salmonella typhi y Scherichia coli, por lo que se puede
inferir en que el Staphylococcus aureus es ms susceptible a la accin del
antibitico Cefoperazone.

Seija, V. en su libro: Etiopatogenia microbiolgica, seala que: Staphylococcus

aureus en cuanto a los agentes qumicos, es sensible a la mayora de los
desinfectantes y antispticos, que lo matan en pocos minutos, se necesitan 15
minutos de exposicin al alcohol de 70 para su eliminacin
Concordamos con el autor puesto que no hubo desarrollo de microorganismos en
nuestros tubos de ensayo que presentaron al alcohol de 70 como agente qumico.

Segun Gerard, J. en su libro: Introduccin a la microbiologa, manifiesta que

"Considerar como microorganismo halfobo al que slo crece a concentraciones
de cloruro de sodio inferiores al 1%, como ligeramente halfilo, si crece hasta
5 % de cloruro de sodio, como moderadamente halfilo, si crece hasta
concentraciones del 12%; y como extremadamente halfilo o simplemente
halfilo si crece a concentraciones mayores de cloruro de sodio. Los
microorganismos halfilos estrictos necesitan obligatoriamente el cloruro de
sodio en el medio de cultivo y slo crecen bien cuando las concentraciones son
superiores al 10 %.".
Segn la experiencia que se realiz con el Microorganismo: S. aureus, se logr
apreciar el mayor crecimiento microbiano en la concentracin al 5% de NaCl con
esto demostramos que el Microorganismo es tolerantemente halfilo porque hay
desarrollo en concentraciones de 5%, mayor a 12% (utilizamos 15% en la prctica)
de lo indicado por el autor.

VII. CONCLUSIONES

Se determin que los factores qumicos (antibiticos, altas concentraciones y

agentes qumicos) influyen en la velocidad del crecimiento de los microrganismos.
Se determin que el microorganismo Staphylococcus aureus es ms sensible al
antibitico Cefoperazone frente a los otros microorganismos ya que su halo de
inhibicin fue ms grande (27 mm.), a su vez el microorganismo Salmonella thypi
es mucho ms resistente a este antibitico ya que su halo de inhibicin fue menor
(23 mm.), por tanto podemos decir que a mayor halo de inhibicin, la bacteria
presentar menor resistencia al antibitico (mayor sensibilidad).
Observamos contaminacin en nuestras placas Petri tanto en la determinacin del
halofilismo, asi como la determinacin de osmofilia ya que hubo desarrollo
microbiano fuera de las 21 lneas trazadas mediante el Mtodo Francs, esto se
podra deber ya que las ventanas del laboratorio estaban abiertas, por tanto hubo
presencia de agentes externos, a su vez al mal manejo del mechero ya que se
debera realizar la prueba a 30 cm. de este y debera estar prendido en todo
momento hasta la finalizacin de la prueba.

VIII. REFERENCIA BIBLIOGRFICA

Garca, P. et al (1994): Microbiologa clnica prctica. Servicio publicaciones UCA.

Espaa.

Geneser, F.(1997). Microbiologa de los Alimentos. Editorial Mdica Panamericana,

Buenos Aires.
Ingraham, J. (1998) Introduccin a la Microbiologa II. Revert: Espaa.

Madigan, M. (1998): Brock, Biologa de los Microorganismos. Person Education:

Espaa.

Seija, V. (2008): Etiopatogenia microbiolgica. En:

http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/Staphylococcus.pdf. El: 21 de junio del 2015.

Stanga, M. (2010) Limpieza y desinfeccin en la Industria Alimentaria. WILEY-VCH.

Gerard, J. (2007) Introduccin a la microbiologia. Editorial Panamericana: Argentina.