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Silvana Menoncin
ERECHIM, RS BRASIL
FEVEREIRO DE 2007
Comisso Julgadora:
__________________________
Dbora de Oliveira, D.Sc.
(Orientadora)
__________________________
Helen Treichel, D.Sc.
(Orientadora)
__________________________
Eliana Setsuko Kamimura, D.Sc.
__________________________
Geciane Toniazzo, D.Sc.
ii
iii
AGRADECIMENTOS
professoras
Dbora
Helen
por
compartilharem
de
seus
iv
SUMRIO
RESUMO .........................................................................................................
xi
ABSTRACT......................................................................................................
xii
1 INTRODUO............................................................................................... 1
2 REVISO BIBLIOGRFICA.........................................................................
2.2.APLICAES DE LIPASES.......................................................................
2.5.CONCENTRAO DE LIPASES...............................................................
12
2.6.IMOBILIZAO DE LIPASES....................................................................
14
16
2.8.CONSIDERAES FINAIS........................................................................ 17
3 MATERIAL E MTODOS..............................................................................
19
3.1.MATERIAIS................................................................................................. 19
3.2. EQUIPAMENTOS......................................................................................
20
3.3.MTODOS.................................................................................................. 21
3.3.1. PRODUO DE LIPASES POR FERMENTAO EM ESTADO
SLIDO............................................................................................................
21
3.3.1.1. Microrganismo.....................................................................................
21
3.3.1.2. Inculo.................................................................................................
21
22
23
25
27
30
31
31
33
33
47
52
52
53
54
55
5 CONCLUSES E SUGESTES................................................................... 58
5.1.CONCLUSES..........................................................................................
58
59
6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.............................................................
60
7 ANEXOS........................................................................................................ 68
vi
NDICE DE TABELAS
Tabela 2.1. Fontes de carbono (substrato principal) utilizadas para Fermentao
em Estado Slido....................................................................................................11
Tabela 2.2. Atividades especficas obtidas na precipitao com sulfato de amnio
relatadas na literatura..................................................................................13
Tabela 3.1. Variveis e nveis estudados no planejamento fatorial completo 22 para
otimizao das condies de extrao........................................................24
Tabela 3.2. Variveis e nveis estudados no planejamento de experimentos 22 para
concentrao do extrato enzimtico obtido por P. verrucosum...................25
Tabela 3.3. Variveis e nveis estudados no segundo planejamento fatorial
completo 22 para concentrao do extrato enzimtico obtido por P.
verrucosum..................................................................................................25
Tabela 3.4. Variveis e nveis estudados no planejamento fatorial completo 22 para
a determinao do pH e temperatura timos...............................................31
Tabela 4.1. Matriz do planejamento experimental realizado (valores codificados e
reais com as respostas da atividade lipsica) para extrao da lipase de P.
verrucosum..................................................................................................34
Tabela 4.2. Anlise de varincia para a atividade lipsica do extrato enzimtico
bruto obtido por Penicillium verrucosum......................................................35
Tabela 4.3. Matriz do primeiro planejamento experimental realizado (valores
codificados e reais com as respostas da atividade lipsica) para
precipitao do extrato enzimtico obtido por FES utilizando P.
verrucosum................................................................................................37
Tabela 4.4. Anlise de varincia para a atividade lipsica do extrato enzimtico
concentrado obtido por Penicillium verrucosum .........................................38
Tabela 4.5. Matriz do primeiro planejamento experimental realizado (valores
codificados e reais com as respostas da atividade especfica) para
avaliao
do
efeito
da
dilise
das
lipases
de
Penicillium
verrucosum..................................................................................................40
vii
do
efeito
da
dilise
do
extrato
enzimtico
precipitado....................................................................................................43
Tabela 4.8.Anlise de varincia para a atividade lipsica do extrato enzimtico
concentrado obtido por Penicillium verrucosum, aps dilise................................44
Tabela 4.9. Mdias da atividade especfica da lipase de P. Verrucosum e Desvios
Padro encontrados na anlise dos resultados obtidos nos testes com
dilise pelo Teste de Tukey.........................................................................46
Tabela 4.10. Valores da Atividade Especfica, Reteno, Rendimento e Contedo
de gua na imobilizao da lipase produzida por FES utilizando Penicillium
verrucosum..................................................................................................47
Tabela 4.11. Matriz do planejamento experimental realizado (valores codificados e
reais com as respostas da atividade lipsica) para a caracterizao parcial
do extrato enzimtico concentrado..............................................................49
Tabela 4.12.Anlise de varincia para a atividade lipsica na etapa de
caracterizao parcial do extrato enzimtico concentrado..........................51
Tabela 7.1.Curva Padro Albumina utilizada para medida de protena pelo mtodo
de Bradford..................................................................................................68
Tabela 7.2. Caractersticas Carvo Ativo ANF Carvorite.....................................70
Tabela 7.3. Curva de Calibrao utilizada para medida de atividade de hidrlise do
extrato enzimtico imobilizado.....................................................................71
viii
NDICE DE FIGURAS
Figura 2.1. Caractersticas do fungo Penicillium verrucosum...................................8
Figura 2.2. Classificao dos mtodos utilizados para imobilizao de enzimas
(DallaVecchia et al., 2004)....................................................................................15
Figura 3.1. Bqueres utilizados para a FES do farelo de soja utilizando Penicillium
verrucosum..................................................................................................22
Figura 4.1. Superfcie de resposta e curva de contorno para atividade lipsica
obtida na otimizao das condies de extrao da lipase produzida por
FES..............................................................................................................35
Figura 4.2. Superfcie de resposta e curva de contorno para atividade lipsica
obtida no estudo das condies de precipitao por sulfato de amnio por
FES .............................................................................................................39
Figura 4.3. Grfico de Pareto da precipitao do extrato enzimtico produzido por
FES em funo das variveis estudadas aps dilise.................................40
Figura 4.4. Grfico de Pareto da precipitao do extrato enzimtico produzido por
FES em funo das variveis estudadas aps precipitao........................42
Figura 4.5 Superfcie de resposta e curva de contorno para atividade lipsica
obtida
na
precipitao
da
lipase
produzida
por
FES
aps
dilise........................................................................................................45
Figura 4.6. Foto da enzima imobilizada com Accurel EP 100 (direita) e Carvo
Ativo (esquerda)........................................................................................48
Figura 4.7. Superfcie de resposta e curva de contorno para atividade lipsica
obtida na avaliao da temperatura e pH timos para o extrato enzimtico
concentrado...............................................................................................51
Figura 4.8. Grfico de Barras da estabilidade da torta de soja fermentada
armazenada em congelador (-10oC)............................................................53
ix
RESUMO
CONCENTRAO, IMOBILIZAO E CARACTERIZAO PARCIAL DE LIPASE
PRODUZIDA POR Penicillium verrucosum UTILIZANDO FERMENTAO EM
ESTADO SLIDO
Silvana Menoncin
Fevereiro/2007
Orientadoras: Dbora de Oliveira e Helen Treichel
As lipases de origem microbiana constituem um importante grupo de enzimas com
alto potencial biotecnolgico, porm sua aplicao bastante reduzida devido ao seu
custo de produo. A imobilizao das enzimas visa a obteno de um biocatalisador com
atividade e estabilidade que no sejam afetadas durante o processo, em comparao
sua forma livre. Neste trabalho buscou-se a avaliao das condies de extrao, de
concentrao com sulfato de amnio e imobilizao em dois suportes, bem como a
caracterizao parcial dos extratos enzimticos (em termos de temperatura e pH timos e
estabilidade em baixas temperaturas). Observou-se que 37C e pH 7,0 foi a condio
otimizada para a extrao e que 60% de saturao com 5 horas foi a condio
maximizada para a precipitao da lipase com sulfato de amnio. A enzima imobilizada
com Carvo Ativo foi a que apresentou melhores resultados em termos de atividade
especfica (1,5 X 106 U/mg de protena), rendimento (30,42%) e reteno (382,51%). Na
caracterizao parcial da enzima precipitada, a temperatura de 42C e pH 8,5 foram as
condies timas encontradas. A torta de soja fermentada pde ser armazenada em
temperatura de congelamento at 56 dias sem perda da atividade de hidrlise e o extrato
bruto apresentou um aumento de atividade ao final do perodo de acompanhamento, 218
dias. O estudo realizado com o extrato enzimtico concentrado indicou que tanto a 4oC
como a -10oC a atividade de hidrlise praticamente a mesma da inicial, aps 91 dias de
armazenamento.
xi
ABSTRACT
CONCENTRATION, IMOBILIZATION AND PARTIAL CHARACTERIZATION OF
LIPASE FROM Penicillium verrucosum BY SOLID STATE FERMENTATION
Silvana Menoncin
Fevereiro/2007
Advisors:
Dbora de Oliveira
Helen Treichel
Lipases from microbial organisms comprise an important group of enzymes with potential
biotechnological interest but with unfavorable production costs. Towards establishing costeffective systems, enzyme immobilization has been attempted as an alternative to the use
of free enzymes. In this context, the main objective of this work was to evaluate the
conditions of the extraction, concentration in ammonium sulphate and immobilization using
two supports, as well as the partial characterization of the enzymatic extracts (in terms of
optimum temperature and pH and stability at low temperatures). The best extraction
condition was determined to be at 37C and pH 7.0 and that 60% of saturation in 5 hours
was the maximized condition for the precipitation with ammonium sulphate. The enzyme
immobilizaed with activated carbon led to best results in terms of specific activity (1.5 X
106 U/mg of protein), yield (30.42%) and retention (382.51%). Regarding enzyme partial
characterization, the most proper condition found was 42C and pH 8.5. It was possible to
store the frozen fermented soy cake for 56 days without verified losses of hydrolysis
activity. The raw extract presented an enhancement of activity at the end of the storage
period, 218 days. Results showed that the concentrated enzymatic extract at 4oC as well
as -10oC exhibit negligible change in the hydrolysis activity after 91 days of storage.
xii
Captulo 1 Introduo
1 INTRODUO
As lipases so enzimas que catalisam a quebra de gorduras e leos
liberando cidos graxos, diacilgliceris, monoacilgliceris e glicerol. Podem
tambm catalisar reaes de esterificao, transesterificao e interesterificao
em solventes orgnicos (Villeneuve et al., 2000). So biocatalisadores de grande
valor, devido principalmente a caractersticas como: ao sob condies amenas,
estabilidade em solventes orgnicos, especificidade ao substrato e rgio enncio
seletividade (Snellman et al., 2002).
Estas enzimas so encontradas em tecidos animais, vegetais e em
microrganismos (bactrias, fungos e leveduras) (Villeneuve et al., 2000), tendo
suas propriedades variadas de acordo com sua procedncia (Saxena et al., 2003).
As lipases provenientes de microrganismos constituem um grupo de importantes
enzimas de aplicaes biotecnolgicas, devido principalmente versatilidade de
suas propriedades, no que se refere atuao enzimtica, especificidade pelo
substrato e facilidade de produo em grandes quantidades (Hasan et al., 2006).
Podem ser aplicadas na indstria oleoqumica em processos que
consomem grande quantidade de energia como hidrlise, glicerlise e alcolise,
na produo de cidos graxos poliinsaturados (aditivos de alimentos), na indstria
txtil (melhoria da qualidade e propriedade dos tecidos) (Hasan et al., 2006) e na
indstria de detergentes (remoo de manchas de batom, frituras, manteiga,
azeites, molhos, etc.) (Castro et al., 2004).
So utilizadas tambm na modificao de sabores (no processo de
fermentao de salame e vinho) (Hasan et al., 2006). Na indstria de laticnios so
empregadas no melhoramento do sabor e processo de maturao de queijos e na
obteno de margarinas com baixo teor calrico (Alonso, 2001), entre outras. No
entanto, sua utilizao reduzida devido aos altos custos de produo e
purificao e na busca por novas cepas produtoras que produzam mais
quantidade em tempos menores, com caractersticas desejveis (Martins, 2001).
As lipases podem ser produzidas por fermentao em estado slido (FES)
sendo que esta se baseia no crescimento e metabolismo dos microrganismos em
Captulo 1 Introduo
Captulo 1 Introduo
2 REVISO BIBLIOGRFICA
Neste captulo ser apresentada uma breve reviso da literatura referente
definio, aplicaes, fontes e propriedades de lipases e consideraes gerais
sobre Fermentao em Estado Slido. nfase especial ser dada ao processo de
extrao, estudo da concentrao, imobilizao e caracterizao parcial de
lipases, temas de interesse especfico deste trabalho.
2.1. DEFINIO DE LIPASES
Lipases (triacilglicerol ster hidrolases, EC 3.1.1.3) so enzimas que
catalisam a quebra de gorduras e leos liberando cidos graxos, diacilgliceris,
monoacilgliceris e glicerol. Alm disso, elas so tambm eficientes em vrias
reaes tais como esterificao, transesterificao e interesterificao em
solventes orgnicos. Estas enzimas so encontradas em tecidos animais, vegetais
e em microrganismos, tendo papel fundamental no metabolismo de lipdios destes
seres vivos: como enzimas digestivas, a deposio e mobilizao dos tecidos de
reservas energticas e no metabolismo intracelular, atuando sobre as membranas
celulares (Villeneuve et al., 2000).
As lipases eram tradicionalmente obtidas de pncreas de animais. A
descoberta foi feita por Claude Bernard, em 1856 e anos mais tarde, aumentou o
interesse pelas lipases microbianas devido dificuldade de acesso ao material de
origem animal (Hasan et al., 2006).
Embora a lipase mais estudada at hoje seja a lipase pancretica, do ponto
de vista industrial, as lipases microbianas so bem mais interessantes por
permitirem produo em maior escala. Alm disso, podem mais facilmente ser
expressas, via clonagem, em outros organismos, o que facilita sua obteno e
purificao (Palekar et al., 2000).
As lipases so originrias de um grande nmero de bactrias, fungos,
plantas e animais, tendo suas propriedades variveis de acordo com sua
procedncia (Saxena et al., 2003). As lipases provenientes de microrganismos
constituem um grupo de valiosas enzimas de aplicao biotecnolgica, devido
4
10
Substratos
farelo de trigo
farelo de arroz
farelo de cevada
bagao de cana-de-acar
torta de coco
torta de soja
torta de babau
11
otimizao das condies de extrao para lipases obtidas por FES, sendo esta
etapa tambm efetuada durante o desenvolvimento desta pesquisa.
Apenas como referencial terico, Vikineswary et al. (2006) encontraram
como condies timas de extrao de lacase produzida por Pycnoporus
sanguineus pH de 5,0 em 252C, na qual a atividade encontrada foi de 46,5 U/g
de substrato.
Castilho et al. (2000) em seu estudo para a otimizao das condies de
extrao de pectinases obtidas de Aspergillus niger, definiram o uso do tampo de
acetato pH 4,4 e a temperatura de 35C como ideais.
2.5. CONCENTRAO DE LIPASES
A etapa de purificao importante para a obteno de enzimas com alto
grau de pureza e com maiores nveis de atividade enzimtica. O processo de
purificao fundamental na obteno e aplicao industrial de uma enzima. Aps
a fermentao, a enzima encontra-se no meio contendo uma srie de outros
compostos que no so de interesse (Maldonado, 2006).
A precipitao normalmente utilizada como etapa inicial de isolamento,
sendo o fracionamento com sulfato de amnio o mtodo mais empregado
(Martins, 2001). Esta metodologia consiste em uma das tcnicas de concentrao
de protenas, para separao das mesmas dos outros compostos do meio. A
concentrao pela adio de sais, como sulfato de amnio, baseia-se no aumento
da fora inica, de tal forma que as molculas proticas se agregam e precipitam.
O sal adicionado ao sobrenadante at uma porcentagem de saturao em que a
enzima de interesse precipitada e separada por centrifugao. A composio do
extrato, sua concentrao e temperatura podem influenciar a precipitao, no caso
das enzimas a temperatura deve ser mantida baixa (4C). A adio do sal deve
ser lenta e sob agitao para favorecer a homogeneidade. Aps a centrifugao o
precipitado deve ser redissolvido em tampo adequado, utilizando-se um volume
de aproximadamente duas vezes o volume de precipitado (Borzani et al., 2001).
12
Benjamin e Pandey
(2000) (20% a100%)
Bacha et al. (2005) (60%)
Sharma et al. (2002)
(30% a 70%)
Kanwar et al. (2002)
(60%)
Shu et al. (2006) (70%)
Fonte
Candida rugosa
lipase de pncreas
de avestruz
Kurtzmanomyces
(80%)
sp. I 11
Rhizopus sp
Penicillium
restrictum
Mucor sp
Atividade do
Atividade
extrato
especfica (U/mg
enzimtico
de protena)
18,14 U/mL
3,88
116000 U
521
2425 U
44,82
14,750 U
19,46
188,7 U
12,7
4,860 U
3,52
135600 U
103
31,038 U
14,1
118099 U
129
13
14
15
16
origem
microbiana
apresentam
um
grande
potencial
de
aplicaes
biotecnolgicas.
O conhecimento das caractersticas da lipase produzida como condies de
extrao, pH e temperaturas timas de atuao e estabilidade quando
armazenadas a baixas temperaturas so de extrema importncia para determinar
suas possveis aplicaes.
A concentrao da lipase utilizada como uma etapa inicial de isolamento,
sendo a concentrao com sulfato de amnio a mais utilizada, para
posteriormente purificar e/ou imobilizar as enzimas em suportes de material
insolvel como resina polimrica (Accurel EP100) e Carvo Ativo pelo processo de
17
18
3 MATERIAL E MTODOS
Neste captulo sero descritos os materiais, procedimentos experimentais e
a metodologia analtica utilizados para o desenvolvimento do estudo relacionado
otimizao da extrao, concentrao, imobilizao e caracterizao parcial da
lipase produzida por FES utilizando P. verrucosum.
3.1. MATERIAIS
Os principais reagentes, meios de cultura e suportes para a imobilizao da
lipase utilizados no decorrer deste trabalho foram:
Acetona (Quimex);
Acetonitrila (Vetec);
CaCl2 (Nuclear);
Fenolftalena (Nuclear);
Tween 80 (Vetec);
-nitrofenol (Merck);
3.2. EQUIPAMENTOS
Os principais equipamentos utilizados neste estudo foram os seguintes:
Dessecador;
Liofilizador (Edwards);
Potencimetro (Gehaka);
Refrigerador (Brastemp).
20
3.3. MTODOS
Nesta seo ser apresentada a metodologia empregada para a produo,
concentrao, imobilizao e caracterizao parcial da lipase produzida por FES
utilizando P. verrucosum.
3.3.1. PRODUO DE LIPASES POR FERMENTAO EM ESTADO SLIDO
3.3.1.1. Microrganismo
O fungo Penicillium verrucosum usado
para
estudo
foi
isolado
previamente por Freire (1996) em solo brasileiro. Este microrganismo foi prselecionado como bom produtor de lipases atravs das metodologias de seleo
em meio slido e lquido descritas na literatura (Freire, 1996). Este fungo tem sido
permanentemente estocado em glicerol, slica e meio slido recoberto com leo
mineral sob refrigerao. A propagao de esporos para posterior fermentao foi
feita por um perodo de 7 dias a 27,5C.
3.3.1.2. Inculo
O meio (Potato Dextrose Agar PDA) para o inculo era constitudo por
PDA 3,9% (m/v) e gua destilada. Aps a solubilizao completa do componente,
100 mL de meio foram transferidos para um Erlenmeyer de 500 mL e ento
autoclavados a 121C por 30 minutos.
Do tubo estoque, retirou-se uma alada e transferiu-se para um tubo de
ensaio contendo 10 mL de soluo de Tween 80. Aps a homogeneizao retirouse 0,30 mL contendo uma concentrao de esporos de 4 X 108 esporos/g e
inoculou-se nos erlenmeyers j resfriados, mantendo-se em cmara de
germinao a 27,5C por 7 dias (Vargas, 2004). O recolhimento de esporos foi
feito adicionando-se 10 mL de soluo Tween 80 (0,1% v/v) e prolas de vidro
estreis ao Erlenmeyer. Retirou-se 1 mL da soluo contendo esporos, este
volume foi transferido para um tubo de 9 mL de soluo de Tween 80 at diluio
10-3 podendo estes ser estocados a 4C, no mximo, 15 dias.
21
Figura 3.1. Bqueres utilizados para a FES do farelo de soja utilizando Penicillium
verrucosum
3.3.1.4. Preparo das Amostras
Aps 48 horas de fermentao na cmara de germinao a 27,5C
(Pinheiro, 2006) as amostras foram maceradas em cmara de fluxo e colocadas
em Erlenmeyers de 250 mL a adicionados 45 mL de tampo fosfato de sdio 100
22
A=
(3.1)
23
onde:
A= Atividade de hidrlise (U/mL ou U/g de subtrato);
Va= Volume da amostra titulada (mL);
Vb= Volume do branco titulado (mL);
Vc= Volume da amostra usada na reao (mL) ou massa de amostra
utilizada na reao (g);
t= Tempo de reao (minutos);
M= Molaridade da soluo de NaOH.
3.3.2. OTIMIZAO DAS CONDIES DE EXTRAO
Na determinao das condies de extrao da lipase produzida por
Penicillium verrucosum em FES, foi realizado um planejamento fatorial completo
22 com dois pontos axiais para cada varivel independente e triplicata do ponto
central, totalizando 11 experimentos. As faixas de pH e temperatura estudadas
so apresentadas na Tabela 3.1. Todos os experimentos foram realizados em
duplicata e os resultados referem-se mdia aritmtica dos mesmos.
Tabela 3.1. Variveis e nveis estudados no planejamento fatorial completo 22 para
otimizao das condies de extrao.
Variveis/Nveis
Temperatura
pH
-1,41
30
4,88
-1
32
5,50
37
7,00
42
8,50
1,41
44
9,11
24
agitador orbital por 30 minutos a 150 rpm nas temperaturas tambm avaliadas
segundo metodologia de planejamento experimental, sendo efetuada aps este
procedimento, a medida da atividade de hidrlise, como descrito anteriormente.
3.3.3. CONCENTRAO DO EXTRATO ENZIMTICO
3.3.3.1. Precipitao com sulfato de amnio
Para a determinao da melhor condio de concentrao do extrato
enzimtico, foram realizados planejamentos experimentais fatoriais completos 22
seqenciais, onde foram estudados a saturao do sulfato de amnio (%) e o
tempo de precipitao, conforme apresentados nas Tabelas 3.2 e 3.3.
Tabela 3.2. Variveis e nveis estudados no primeiro planejamento fatorial
completo 22 para a concentrao do extrato enzimtico obtido por P. verrucosum.
Variveis/Nveis
% saturao
Tempo (h)
-1
40
70
10
100
14
% saturao
Tempo (h)
-1,41
32
-1
40
60
80
12
1,41
88
13
25
este
tempo
de
precipitao,
as
amostras
eram
ento
[ ] prt. =
Abs.
. 10 . d
fator
(3.5)
onde:
[ ] prt= Concentrao de protena (mg prot./mL);
Abs= Absorbncia lida nas amostras a 595nm;
d= Diluio das amostras;
fator = valor obtido na curva de calibrao.
26
(% ) =
Ps
x 100
Po
(3.4)
onde:
= Rendimento (%);
Ps= Quantidade de protena absorvida (diferena entre a inicial e a estvel);
Po= Quantidade de protena utilizada na imobilizao (soluo de entrada).
Ra (% ) =
As x 100
Ar
(3.5)
onde:
Ra= Reteno (%);
As= Atividade Real (atividade da enzima imobilizada) (U);
Ar= Atividade Terica (U) (Equao 3.6).
Ar = Ae As
(3.6)
onde:
28
29
A=
(F
. VF . 1000
(CC . VA )
(3.7)
onde:
A= Atividade de hidrlise (U);
F= Fator da curva obtido do grfico ABS com tempo;
VF= Volume total (amostra + tampo + substrato) (2mL);
CC= Coeficiente da curva de Calibrao;
VA= Volume da Alquota (substrato).
A partir dos valores de atividade de hidrlise e protena das amostras foi
calculada a atividade especfica do extrato enzimtico imobilizado, conforme
Equao 3.8.
Ae =
onde:
AH
P
(3.8)
Temperatura (C)
pH
-1,41
30
4,88
-1
32
5,50
37
7,00
42
8,50
1,41
44
9,11
31
32
4 RESULTADOS E DISCUSSO
Neste captulo sero apresentados e discutidos os resultados obtidos ao
longo dos processos de otimizao da extrao, precipitao com sulfato de
amnio, imobilizao com os diferentes agentes imobilizantes, bem como
caracterizao parcial e estabilidade em temperatura de congelamento dos
extratos enzimticos obtidos a partir de Penicillium verrucosum por fermentao
em estado slido.
4.1 OTIMIZAO DAS CONDIES DE EXTRAO DA LIPASE
Nesta etapa, avaliou-se o efeito da temperatura e do pH na extrao da
lipase produzida por fermentao em estado slido, sendo o conhecimento destas
variveis de grande importncia na determinao das condies de operao em
possveis aplicaes desta enzima. Foi utilizado um planejamento fatorial
completo com pontos axiais para verificao dos efeitos de primeira e segunda
ordem bem como as interaes entre as variveis. A Tabela 4.1 apresenta a
matriz do planejamento com os valores reais, codificados e as respostas para a
atividade lipsica.
Verifica-se que as maiores atividades enzimticas encontradas nesta etapa
do estudo esto no ensaio correspondente ao ponto central (temperatura de 37C
e pH 7,0), a qual ficou em torno de 4 U/mL.
As condies encontradas como timas para a extrao de lipases
produzidas por Penicillium verrucosum em FES neste trabalho so semelhantes
quelas utilizadas por Palma et al. (2000) e Gombert et al. (1999) para a extrao
de lipase de Penicillium restrictum utilizando torta de babau como substrato e por
Pinheiro (2006) na extrao de lipase de Penicillium verrucosum utilizando farelo
de soja como substrato. Cavalcanti et al. (2005) utilizaram pH 7,0 e temperatura
de 35C para a extrao de lipases de Penicillium simplicissimum utilizando torta
de babau como substrato. importante salientar que em todos os trabalhos
citados as condies de extrao no foram estudadas de maneira sistemtica,
33
Temperatura (C)
pH
-1 (32)
-1 (5,5)
1,20
+1 (42)
-1 (5,5)
3,40
-1 (32)
+1 (8,5)
3,40
+1 (42)
+1 (8,5)
2,80
5*
0 (37)
0 (7,0)
3,75
6*
0 (37)
0 (7,0)
4,06
7*
0 (37)
0 (7,0)
4,37
0 (37)
-1,41 (4,9)
0,41
0 (37)
+1,41 (9,1)
1,88
10
-1,41 (29,9)
0 (7,0)
1,80
11
+1,41 (44,1)
0 (7,0)
1,72
* Ponto central
(4.1)
34
Soma
Graus de
Mdia
Variao
Quadrtica
Liberdade
Quadrtica
Regresso
12,56
3,14
Resduo
4,04
0,67
Falta de ajuste
3,85
Erro puro
0,19
Total
16,60
10
F calculado
4,66
35
Saturao (%)
(S)
Atividade Especfica
aps Precipitao (U/mg)
-1 (40)
-1 (6)
1,24
+1 (100)
-1 (6)
1,10
-1 (40)
+1 (14)
0,81
+1 (100)
+1 (14)
0,00
5*
0 (70)
0 (10)
1,03
6*
0 (70)
0 (10)
0,94
7*
0 (70)
0 (10)
0,88
* Ponto central
Atividades especficas mais altas foram encontradas por Shu et al. (2006)
(12,7 U/mg) precipitando lipase de Antrodia cinnamomea com 70% de saturao.
Jesus et al., (1999) obtiveram 14,1 U/mg com 80% de saturao na precipitao
de lipases de Penicillium restrictum e Kanwar et al., (2002), precipitando lipase de
Pseudomonas com 60% de saturao, atingiram uma atividade mxima de 19,46
U/mg. Sharma et al., (2002) obtiveram 44,82 U/mg na precipitao de lipases de
Bacillus sp. RSJ 1 com 30% a 70% de saturao. Pastore et al., (2003), na
precipitao de lipase de Rhizopus sp. com 70% de saturao, alcanaram 103
U/mg. Abbas et al., (2002), na precipitao de lipases de Mucor sp. com 75% de
saturao, atingiram 129 U/mg e Bacha et al. (2005) encontraram 521 U/mg de
atividade precipitando lipase de pncreas de avestruz 60% de saturao .
Observa-se, portanto, que h uma diferena significativa entre as atividades
encontradas na literatura, variando de acordo com a condio experimental e o
37
(4.2)
Soma
Graus de
Mdia
Quadrtica
Liberdade
Quadrtica
Regresso
0,92
0,31
Resduo
0,06
0,02
Falta de ajuste
0,05
Erro puro
0,01
Total
0,98
F calculado
15,83
38
39
Ensaio
Saturao (%)
Tempo (h)
-1 (40)
-1 (6)
0,83
+1 (100)
-1 (6)
0,29
-1 (40)
+1 (14)
0,53
+1 (100)
+1 (14)
0,09
5*
0 (70)
0 (10)
0,69
6*
0 (70)
0 (10)
0,66
7*
0 (70)
0 (10)
* Ponto central
Ensaio
Saturao (%)
Tempo (h)
-1 (40)
-1 (6)
0,48
+1 (80)
-1 (6)
0,31
-1 (40)
+1 (12)
0,52
+1 (80)
+1 (12)
0,65
5*
0 (60)
0 (9)
0,69
6*
0 (60)
0 (9)
0,61
7*
0 (60)
0 (9)
0,71
-1,41 (31,8)
0 (9)
0,63
+1,41 (88,2)
0 (9)
0,33
10
0 (60)
-1,41 (5)
0,91
11
0 (60)
-1,41 (13)
0,67
* Ponto central
42
Saturao (%)
(S)
Atividade Especfica
aps Dilise (U/mg)
-1 (40)
-1 (6)
0,23
+1 (80)
-1 (6)
0,39
-1 (40)
+1 (12)
0,58
+1 (80)
+1 (12)
0,51
5*
0 (60)
0 (9)
0,79
6*
0 (60)
0 (9)
0,63
7*
0 (60)
0 (9)
0,67
-1,41 (31,8)
0 (9)
0,45
+1,41 (88,2)
0 (9)
0,56
10
0 (60)
-1,41 (5)
0,51
11
0 (60)
-1,41 (13)
0,74
* Ponto central
43
(4.3)
Soma
Graus
de Mdia
Quadrtica
Liberdade
Quadrtica
Regresso
0,16
0,08
Resduo
0,11
0,01
Falta de ajuste
0,09
Erro puro
0,01
Total
0,26
10
F calculado
5,90
44
Mdia* (U/mg)
Desvio Padro
1 (Extrato)
0,96
0,04
2 (Extrato Precip.)
1,61a
0,07
3 (Fosf. de sdio)
0,49c
0,02
0,46c,d
0,02
5 (Tris- HCl)
0,47c,e
0,02
6 (Tris-HCl Geld.)
0,50c
0,02
d,e
0,36
0,02
0,14g
0,01
0,93b
0,02
0,25
0,02
0,00
0,00
c,e
0,39
0,02
0,92b
0,04
0,37d,e
0,02
46
Carvo Ativo
10,4 X 103
10,4 X 103
7,9 X 103
6 X 103
92,4 X 103
1,5 X 106
368,130
382,516
Rendimento () (%)
11,74
30,42
5,50
10,06
Nesta tabela pode-se observar que a enzima imobilizada com Carvo Ativo
apresentou melhores resultados em termos de atividade especfica (1533425,5
U/mg de protena), reteno (382,516%) e rendimento (30,42%). Estes resultados
so muitos promissores, pois o Carvo Ativo tem um baixo custo e existem poucos
relatos na literatura quanto ao uso deste suporte na imobilizao de lipases
(Kaewthong et al., 2005).
Observa-se que a reteno obtida em ambos os suporte utilizados foi maior
que 100%, significando que alm de imobilizar, devido afinidade da enzima pelo
suporte, pode ter ocorrido uma concentrao desta obtendo-se, portanto,
porcentagens de reteno na ordem de 300%.
47
Figura 4.6. Foto da enzima imobilizada com Accurel EP100 (direita) e Carvo Ativo
(esquerda).
O estudo de imobilizao de lipase produzidas por Penicillium verrucosum
em FES mostrou-se bastante relevante do ponto de vista do baixo custo de um
dos suportes utilizados (carvo ativo), bem como em funo dos altos valores de
reteno da enzima a este suporte.
48
TEMPERATURA
pH
TIMOS
DO
EXTRATO
ENZIMTICO
CONCENTRADO
Como j citado no captulo anterior, a caracterizao parcial do extrato
bruto obtido por Penicillium verrucosum em FES em termos de temperatura e pH
timos foi definida anteriormente por Pinheiro (2006). Nesta etapa foram ento
avaliados a temperatura e pH timos do extrato enzimtico concentrado, nas
condies definidas e apresentadas anteriormente.
Para a determinao da temperatura e pH timos do extrato concentrado
por precipitao com sulfato de amnio, foi realizado um planejamento fatorial 22
completo com 4 pontos axiais e 3 pontos centrais, sendo a matriz do planejamento
experimentos bem como os resultados de atividade lipsica apresentados na
Tabela 4.11.
Tabela 4.11. Matriz do planejamento experimental realizado (valores codificados e
reais com as respostas da atividade lipsica) para caracterizao parcial do
extrato enzimtico concentrado.
Ensaio
pH
Temperatura (C)
-1 (5,5)
-1 (32)
22,32
-1 (5,5)
+1 (42)
28,49
+1 (8,5)
-1 (32)
48,51
+1 (8,5)
+1 (42)
60,06
5*
0 (7,0)
0 (37)
44,93
6*
0 (7,0)
0 (37)
57,55
7*
0 (7,0)
0 (37)
41,78
-1,41 (4,9)
0 (37)
21,28
+1,41 (9,1)
0 (37)
59,12
10
0 (7,0)
-1,41 (30)
46,97
11
0 (7,0)
+1,41 (44)
40,81
* Ponto central
49
(4.4)
50
Soma
Graus de
Mdia
Variao
Quadrtica
Liberdade
Quadrtica
Regresso
1547,90
1547,90
Resduo
380,66
42,29
Falta de ajuste
241,36
Erro puro
139,29
Total
1928,56
10
F calculado
36,59
51
52
19
6
18
2
15
4
13
3
10
5
77
56
28
15
140
120
100
80
60
40
20
0
0
% da Ativ. Lipsica em
relao a Inicial
Tempo (dias)
Figura 4.8. Grfico de Barras da estabilidade da torta de soja fermentada
armazenada em congelador (-10C).
Os resultados apresentados na Figura 4.8 demonstram que a atividade
lipsica da torta de soja fermentada armazenada em congelador apresentou um
aumento at o 28 dia de armazenamento, diminuindo aps este perodo, sendo
que aos 196 dias era de apenas 5% e aps 200 dias de armazenamento a torta
fermentada perdeu toda sua atividade.
Observa-se, portanto, que a torta de soja fermentada apresentou um
comportamento varivel em relao manuteno da sua atividade durante o
armazenamento. importante tambm frisar que a torta fermentada apresentou
boa
estabilidade,
pois
aos
56
dias
de
armazenamento
apresentava
53
120
100
80
60
40
20
8
21
19
17
16
14
13
11
10
91
77
63
42
28
0
0
Tempo (dias)
54
120
100
80
60
40
20
0
0
14
21
28
35
42
49
56
70
77
84
91
Tempo (dias)
55
140
120
100
80
60
40
20
0
0
14
21
28
35
42
49
63
70
84
91
Tempo (dias)
final
do
perodo
de
acompanhamento,
indicando
possibilidade
de
57
5 CONCLUSES E SUGESTES
5.1 CONCLUSES
Aps a realizao deste estudo pode-se concluir que:
como
maximizada
aps
realizao
de
dois planejamentos
experimentais seqenciais.
Aps
realizao
de
um
planejamento
de
experimentos
para
acompanhamento,
indicando
possibilidade
de
armazenamento
deste
em
59
6 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
ABBAS, H.; HIOL, A.; DEYRIS, V.; COMEAU, L. Isolation and characterization of
an extracellular lipase from Mucor sp strain isolated from palm fruit. Enzyme and
Microbial Technology, v. 31, p. 968-975, 2002.
ALONSO, F. O. M. Efeito da agitao e aerao na produo de lipases por
Yarrowia lipalytica (IMUFRJ 50682). Rio de Janeiro: 2001. Dissertao de
Mestrado. Centro de Cincias da Sade. Universidade Federal do Rio de Janeiro.
BACHA, A. B.; GARGOURI, Y.; ALI, Y. B.; MILED, N.; REINBOLT, J.; MEJDOUB,
H. Purification and biochemical characterization of ostrich pancreatic lipase.
Enzyme and microbial technology, v. 37, p. 309-317, 2005.
BASTIDA, A.; SABUQUILLO, P.; ARMISEN, P.; FERNNDEZ-LAFUENTE, R.;
HUGUET, J.; GUISN, J. M. A single step purification, immobilization, and
hyperactivation of lipases via interfacial adsortions on strongly hydrophobic
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BENJAMIN, S.; PANDEY, A. Isolation and characterization of three distinct forms
of lipases from Candida rugosa produced in solid state fermentation. Brazilian
Archives of Biology and Technology, v. 44, p. 213-221, 2000.
BIANCHI, V. L. D.; MORAES, I.O.; CAPALBO, D.M.F. Fermentao em estado
slido, Biotecnologia Industrial Engenharia Bioqumica, 1 edio, Ed. Edgard
Blcher Ltda, 2001, v. 2, p. 247-276.
BORZANI, W.; LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; SCHMIDELL, W. Processos
Fermentativos e Enzimticos Biotecnologia Industrial, 1a edio. Editora Edgard
Blcher, v.3, p. 377 -378, 2001.
60
61
P.;
PRABHAKAR,
T.;
RANAKRISHNA,
B.;
TALEB,
A.
T.;
62
63
64
65
SHARMA,
R.,
CHISTI,
Y.,
BANERJEE,
U.
U.
Production,
purification,
66
67
Captulo 7 Anexos
7 ANEXOS
Anexo I
Reagente de Bradford
Para o preparo do reagente de Bradford, 100 mg de Laomassi Brilhante
Blue foram dissolvidos em 50 mL de etanol e transferidos a um balo volumtrico
de 1 L. Foram adicionados 100 mL de cido fosfrico 85%. A soluo resultante foi
diluda em gua destilada at o volume final de 1 L.
A soluo foi filtrada e transferida para um frasco mbar e identificado e foi
preparada uma curva padro de albumina, conforme apresentada na Tabela 7.1.
Tabela 7.1. Curva Padro Albumina utilizada para medida de protena pelo mtodo
de Bradford.
Tubo
(L)
Alb. (L)
100
0,00
80
20
0,02
70
30
0,03
60
40
0,04
40
60
0,06
30
70
0,07
68
Captulo 7 Anexos
Anexo II
Preparo das Membranas de Dilise
O procedimento adotado para utilizao das membranas de dilise consistiu
em preparar 1 L de soluo de EDTA 1 mM com 2% de bicarbonato de sdio,
utilizando gua miliQ estril. A soluo teve seu pH ajustado para 7,98 8,0.
Ferveu-se por 10 minutos as membranas nesta soluo. Esperou-se esfriar e
lavou-se individualmente cada membrana com gua miliQ estril.
Aps preparou-se 1 L de soluo EDTA 1 mM com gua miliQ estril
ajustando o pH para 8,0. Ferveu-se por 10 minutos as membranas nesta soluo.
Deixou-se esfriar e guardou-se em geladeira.
69
Captulo 7 Anexos
Anexo III
Pulverizado
Granulometria
pH
5,0 a 6,5
Eficincia relativa
75%
Cinzas
5% a 7%
Densidade aparente
0,450 g/cm3
Umidade ao embalar
<4%
Filtrabilidade
tima
70
Captulo 7 Anexos
Anexo IV
Curva de Calibrao Atividade Enzimtica do Extrato Enzimtico Imobilizado
A Tabela 7.3 apresenta a curva de calibrao para medida da atividade
enzimtica do extrato imobilizado, obtida a partir do -nitrofenol. Preparava-se
uma soluo de -nitrofenol adicionando-se 0,00811 g de -nitrofenol a 10,93 mL
de acetonitrila.
Tabela 7.3. Curva de Calibrao utilizada para medida da atividade de hidrlise do
extrato enzimtico imobilizado.
Ensaios
gua (L)
0,000
1,050
1,95
0,005
1,045
1,95
0,010
1,040
1,95
0,015
1,035
1,95
0,020
1,030
1,95
0,025
1,025
1,95
0,030
1,020
1,95
71
Captulo 7 Anexos
M =
massa
PM
massa = 10,46g
d=
massa
volume
1,19 =
10,46
volume
volume = 8,79mL
72