placa de LB, cada una con una cepas bacterianas, Staphylococcus aureus,

Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aureginosa , tubos con

caldo LB a distinta concentraciones de glucosa y rangos de pH (un tubo con
caldo LB, un tubo con caldo LB + 2% glucosa, un tubo con caldo LB + 2%
glucosa pH 4.5, un tubo con caldo LB + 2% glucosa pH 7.0 y un tubo con caldo
LB + 2% glucosa pH 9.0)
Se realizaran dos ensayo (cualitativo y cuantitativo) con el objetivo de lograr
determinar la capacidad formadora de biofilm de cuatro cepas distintas
(Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas
aureginosa)
En el ensayo Cualitativo en tubos:
Dos placas con cepas de bacterias pertenecientes a rghgfhghh, las cuales
fuen sembradas
1. A cada mesn recibir una placa de LB con dos cepas bacterianas.
2. Sembrar cada cepa en los siguientes medios:
un tubo con caldo LB un tubo con caldo LB + 2% glucosa un tubo con
caldo LB + 2% glucosa pH 4.5 un tubo con caldo LB + 2% glucosa pH 7.0
un tubo con caldo LB + 2% glucosa pH 9.0 3. Incubar por 48 horas a 37 C. 4.
Remover todo el medio de cultivo 5. lavar con agua destilada estril hasta
remover el medio de cultivo. 6. adicionar 3 mL de metanol a cada tubo e
incubar a temperatura ambiente por 15 min. 7. descartar el metanol (invertir
los tubos) 8. adicionar 3 mL de solucin de cristal violeta al 0,1% e incubar por
5 min. 9. Descartar el cristal violeta y lavar hasta que no se desprenda
colorante. 10. El desarrollo de un anillo en la interfase aire-agua confirma la
presencia de biofilms. Mtodo cuantitativo en microplacas 1. Sembrar cepas en
caldo LB incubar over night (ON) a 37 C. (se les entregar los cultivos). 6 2.
Da 2: Diluir 1:100 en : Caldo LB Caldo LB + 0,5% H2O2 Caldo LB + 2 %
H2O2 Caldo LB + 4% H2O2 3. Tomar alicuota de 200 L (en triplicado y
colocarlo en celdilla de microplaca. EJ: (A): en los pocillos: 2B, 2C y 2D 4.
Incubar 48 horas a 37C 5. Leer a 550 nm en lector de Elisa 7. Remover el
cultivo 8. Lavar 3 veces con 200 L de agua destilada estril. 9. Secar en
posicin invertida 10. Agregar metanol y eliminar. 11. Agregar 100 L de cristal
violeta al 1% por 5 min. 12. Retirar el colorante y lavar 3 veces con 300 L de
agua estril o hasta que no desprenda color. 13.Secar boca abajo por 2 horas.
14. Medir la OD550 nm A B C D E .......etc 7 Interpretacin de resultados:
OD550 1 altamente positiva. 0.1 OD550 < 1 bajo grado OD550 < 0,1
negativa