LAPORAN PRAKTIKUM TEKNOLOGI ENZIM

BT (2073)
DETEKSI GEN INVA DAN SPVC PENYANDI VIRULENT DAN INVASIF

FAKULTAS BIOTEKNOLOGI
UNIVERSITAS KRISTEN DUTA WACANA
SEMESTER GASAL 2014/2015

BAB I
PENDAHULUAN

A. Tujuan Praktikum
1. Memahami Prinsip analisis deteksi protein penyandi sifat virulensi dan invasif suatu
bakteri patogen.
2. Mampu mengaplikasikan teknik biologi melekuler untuk amlifikasi gen

B. Dasar Teori
Polymerase chain reaction ("reaksi berantai polimerase", PCR) merupakan teknik yang
sangat berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah kecil sekuens DNA
tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga dapat dianalisis), atau dimodifikasi
secara tertentu. Sebagai contoh, PCR dapat digunakan untuk menambahkan situs enzim restriksi,
atau untuk memutasikan (mengubah) basa tertentu pada DNA. PCR juga dapat digunakan untuk
mendeteksi keberadaan sekuens DNA tertentu dalam sampel (Yepyhardi. 2011).
PCR memanfaatkan enzim DNA polimerase yang secara alami memang berperan dalam
perbanyakan DNA pada proses replikasi. Namun demikian, tidak seperti pada organisme hidup,
proses PCR hanya dapat menyalin fragmen pendek DNA, biasanya sampai dengan 10 kb (kb=kilo
base pairs=1.000 pasang basa). Fragmen tersebut dapat berupa suatu gen tunggal, atau hanya
bagian dari suatu gen. Proses PCR untuk memperbanyak DNA melibatkan serangkaian siklus
temperatur yang berulang dan masing-masing siklus terdiri atas tiga tahapan. Tahapan yang
pertama adalah denaturasi cetakan DNA (DNA template) pada temperatur 94-96 C, yaitu
pemisahan utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal. Sesudah itu, dilakukan penurunan
temperatur pada tahap kedua sampai 45-60 C yang memungkinkan terjadinya penempelan
(annealing) atau hibridisasi antara oligonukleotida primer dengan utas tunggal cetakan
DNA(Yepyhardi. 2011).
Primer merupakan oligonukelotida utas tunggal yang sekuens-nya dirancang
komplementer dengan ujung fragmen DNA yang ingin disalin; primer menentukan awal dan akhir
daerah yang hendak disalin. Tahap yang terakhir adalah tahap ekstensi atau elongasi (elongation),
yaitu pemanjangan primer menjadi suatu utas DNA baru oleh enzim DNA polimerase (Lisdiyanti,
1997).
Adapun macam-macam tipe dan modifikasi dari PCR adalah sebagai berikut:
A. Real-Time PCR
Real-Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real
time ini juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction atau Q-PCR. Dimana
teknik ini digunakanuntuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung(kuantifikasi)
jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Realtime PCR memungkinkan dilalukan
deteksi dan kunatifikasi (sebagai nilaiabsolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif
setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yangditambahkan) sekaligus
terhadap sequens spesifik dari sampel DNA yangdianalisis. Pada analisa PCR konversional
deteksi keberadaan DNAdilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan keberadaan DNA
hasilamplifikasi dilakukan di gel agarose setelah dilakukan proseselektroforesis. Sedangkan
analisa menggunakan Real Time PCR memungkinkan untuk dilakukan pengamatan pada saat

reaksi berlangsung, keberadaan DNA hasil amplifikasi dapat diamati pada grafik yang
munculsebagai hasil akumulasi fluoresensi dari probe(penanda) (Handoyo, D. & R. Ari. 2001).
B. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Reverse Transcriptase-PCR juga sering dikenal dengan kineticpolymerase chain reaction.
RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR,dimana yang diamplifikasi berupa m-RNA. Pada
metode PCR biasasumber sampel yang digunakan adalah DNA yang diekstrak dari sel
atau jaringan. Pada RT-PCR sampel yang digunakan bukan DNA melainkanRNA. Sebagaimana
kita ketahui, RNA merupakan asam ribonukleat rantaitunggal, sedangkan DNA adalah asam
ribonuleat rantai ganda. Ciri khasRNA adalah tidak terdapat gugus basa timin (T) melainkan
diganti olehurasil (U). Proses RT PCR dibantu oleh enzim Reverse Transcriptase,karena hanya
enzim jenis ini yang dapat mensintesis DNA dengan cetakanRNA karena polimerase DNA hanya
dapat mensintesis dengan menggunakan cetakan DNA (Labequip 2016).
C. Nested PCR
Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan(replikasi) sampel DNAmenggunakan
bantuan enzimDNA polymerase yang menggunakan dua pasang primer untuk mengamplifikasi
fragmen.Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang salah diamplifikasi maka
kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya olehprimer yang kedua. Dengan
demikian, nested PCR adalah PCR yangsangat spesifik dalam melakukan amplifikasi.Nested PCR
dan PCR biasa berguna untuk memperbanyak fragmenDNAtertentu dalam jumlah banyak.
Dimana pada nested PCR digunakan 2 pasang primer sedangkanpada PCR biasa hanya
menggunakan 1 pasang primer. Oleh karena ituhasil fragmen DNA dari nested PCR
lebihspesifik (lebih pendek) dibandingkan dengan PCR biasa.Waktu yang diperlukan dalam reaksi
nested PCR lebih lama daripada PCR biasa karena pada nested PCRdilakukan 2 kali reaksi PCR
sedangkan pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR. Selain itu, keuntungan nested PCR adalah
meminimalkan kesalahan amplifikasi gen dengan menggunakan 2 pasang primer.Mekanisme
kerja dari nested PCR sendiri yakni pada Fase Denaturasi, Pertama-tama DNA mengalami
denaturasi lalu memasuki fasepenempelan. Fase Penempelan, sepasang primer pertama melekat
di keduautas tunggal DNA dan mengamplifikasi DNA di antara kedua primer tersebut dan
terbentuklah produk PCR pertama. Fase pemanjangan, produk PCR pertama tersebut dijalankan
pada proses PCR kedua di manapasangan primer kedua (nested primer) akan mengenali sekuen
DNAspesifik yang berada di dalam fragmen produk PCR pertama dan memulai amplifikasi bagian di
antara kedua primer tersebut. Hasilnya adalah sekuens DNA yang lebih pendek daripada sekuens DNA
hasil PCR pertama(Labequip. 2006).

D. Multiplex-PCR
Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuranPCR tunggal untuk
menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yangspesifik untuk sekuens DNA yang berbeda. Dengan

penargetan gensekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari lari-tes tunggal yangtidak akan
membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktuuntuk melakukan. temperatur Annealing
untuk masing-masing set primerharus dioptimalkan untuk bekerja dengan benar dalam reaksi
tunggal, dan ukuran amplikon. Artinya, panjangnya pasangan basa harus berbeda cukup untuk
membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis gel(Handoyo, D. &
R. Ari. 2001).

BAB II
METODOLOGI

A. Alat dan Bahan

o Thermocycler-PCR machine
o Kit PCR (Dream Taq TM Green PCR Mastermix)
o Sampel DNA target
o Primer gen inVA danSpvC
o Gel agarose 1,2% dalam TBE 10X
o Sbyr safe green
o Loading dye
o Marker DNA
o Gel apparatus

B. Cara Kerja :
1. Hidupkan mesin PCR, kemudian dilakukan setting program PCR dengan pengaturan
sebagai berikut (lihat tabel di bawah ini)
Tabel Program PCR
Program
Gen InvA (244
bp) dan SpvC
(571 bp)

Jumlah siklus
1
35
1

Tahapan
Hot-Star
(denaturasi awal)
Denaturasi
Annealing
Ekstensi
Ekstensi akhir

Suhu
95C

Waktu
1 menit

95C
54C - 64C
72C
72C

30 detik
30 detik
30 detik
7 menit

2. disiapkan PCR mix solution sesuai dengan prosedur yang tercantum dalam kit PCR yang
tersedia dengan mencampurkan :
- 25 l PCR mastermix
- 1 l primer forward (10 pmol)
- 1 l primer reverse (10 pmol)
- 22 l dH2O bebas DNAse/ RNAse
- 1 l DNA cetakan
3. dilakukan amplifikasi pada mesin PCR
4. setelah siklus ke 30 berakhir, dilakukan running produk PCR pada gel elektroforesis
BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Hasil

Hasil praktikum yang didapatkan dari PCR lubang gel 6, kelompok 6 menggunakan
isolat Salmonella Typhi NCTC 786 No. 9

B. Pembahasan
Optimasi PCR perlu dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan hasil PCR yang
optimal. Secara umum optimasi proses PCR dapat dilakukan dengan cara memvariasikan kondisi
yang digunakan pada proses PCR tersebut. Optimasi kondisi berkaitan erat dengan faktor-faktor
seprti jenis polimirase DNA, suhu konsentrasi, PCR, buffer, dan waktu. Pemilihan suhu pada
proses PCR sangat penting karena suhu merupakan salah satu faktor yang menentukan
keberhasilan suatu PCR. Dalam hai ini suhu berkaitan dengan proses denaturasi DNA templat,
anneling dan elongsi primer.
Enzim DNA poluymerase yang digunakn pada saat proses perbanyakkan DNA berasal
dari Thermus aquaticus. Hal tersebut disebabkan karena bakteri tersebut bersifat termostabil
sehingga enzim tidak mudah terdenaturasi pada proses PCR yang berlangsung pada suhu tinggi.
Kondisi siklus reaksi yang digunkan dalam praktikum bergantung pada setiap tahap yang
meliputi denaturasi, annealing dan polimerisasi. Pada tahap denaturasi diatur dengan suhu
sebesar 94oC selama 30 detik. Denaturasi berfungsi untuk mengurangi untai ganda DNA menjadi
untai tunggal. Tahap anneling (penempelan primer) berlangsung selama 30 detik pada suhu
55C. Tahap elongsu atau polimerisasi DNA berlangsung pada suhu 72C karena suhu tersebut
merupakan suhu optimum polimirase DNA yang biasa digunakan untuk proses PCR. Ada
bebrapa faktor yang menyebabkan tidak berhasilnya PCR, pada saat pengambilan gel salah,
pengambilan primer ataupun reserve tertukar enzim.

BAB IV
KESIMPULAN
1. Polymerase chain reaction ("reaksi berantai polimerase", PCR) merupakan teknik
yang sangat berguna dalam membuat salinan DNA. PCR memungkinkan sejumlah
kecil sekuens DNA tertentu disalin (jutaan kali) untuk diperbanyak (sehingga dapat
dianalisis), atau dimodifikasi secara tertentu.

DAFTAR PUSTAKA

Handoyo, D. & R. Ari. 2001. Prinsip umum dan pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR).
PCR 9: 17-28.
Labequip. 2006. Perkin elmer gene amp 9600 thermal cycler. 1 hlm.
http://www.labequip.com/perkinelmer-geneamp-9600-thermal-cycler.html, diakses 09 Mei
2013, pk. 15.57 WIB.

Lisdiyanti. 1997. Polimerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Warta Biotek.
Bogor.
Yephyhardi. 2011. Mengenal PCR (Polymirase Chai Reaction).
http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerase-chain-reaction/