Peroxidasa

1. Introduccin
La peroxidasa (EC 1.11.1.7) es una enzima que cataliza la oxidacin de un amplio nmero de
sustratos orgnicos e inorgnicos, utilizando el poder oxidante del perxido de hidrgeno. Es
utilizada ampliamente en bioqumica clnica. As, los ensayos para la determinacin y cuantificacin
de metabolitos como glucosa, cido rico, colesterol o triglicridos en fluidos biolgicos usan
peroxidasa como enzima acoplada. Tambin se utiliza en inmunoensayos para la deteccin de virus
tan conocidos como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) causante del SIDA o el
herpesvirus. La peroxidasa tambin se utiliza como biocatalizador para la generacin de productos
de inters biotecnolgico e industrial como resinas fenlicas, adhesivos, antioxidantes, antiestticos
y protectores de radiacin magntica, colorantes alimentarios y componentes bioactivos de
detergentes.
Como la mayora de las enzimas, la peroxidasa puede ser inactivada por el calor, siendo una de las
que precisan mayor temperatura y ms tiempo para su inactivacin. Posee, adems, la propiedad
peculiar de la regeneracin enzimtica. Este fenmeno consiste en que al inactivarla por medio del
calor recupera parcialmente su actividad despus de un cierto tiempo. Esto ha sido explicado,
aduciendo que la fraccin proteica de la enzima sufre una desnaturalizacin slo parcial, con
prdida de su estructura terciaria, si el calor se aplica en un tiempo muy corto, producindose luego
una reversin de la protena a su estado normal, por recombinacin de sus grupos hidrgenos o
sulfhidrlicos.

2. Mtodos de Obtencin
2.1.

Peroxidasa aislada de la alcachofa Cynara scolymus

La peroxidasa aislada de alcachofa, puede ser obtenida a partir de tallos, hojas y brcteas de la
misma, mediante un procedimiento medianamente sencillo. Las partes utilizadas para su obtencin
provienen de los desechos de alcachofa generados por la industria conservera, por lo que el
procedimiento proporcionado supone la extraccin y purificacin de un producto de gran inters a
partir de un desecho industrial que constituye una fuente nueva y econmica de enzima con
actividad peroxidasa. Adems, el residuo slido obtenido tras la extraccin de dicha enzima con
actividad peroxidasa se puede utilizar como material enriquecido en fibra para el consumo animal
y/o humano, o bien como fuente para la obtencin de otros bioproductos con aplicaciones
sanitarias, agroalimentarias o industriales.
Los pasos que comprende esta obtencin son:
2.1.1. Extraccin
Se efecta mediante homogeneizacin de dichos tejidos de alcachofa en un medio acuoso, en un
intervalo de temperatura comprendido entre 4 y 30 C, el cual est constituido por agua o por una
disolucin acuosa salina, opcionalmente tamponado en un intervalo de pH comprendido entre 3,0
y 10.

El medio acuoso comprende, adems, uno o ms aditivos seleccionados entre antioxidantes,

secuestradores de fenoles, agentes quelantes de cationes, polmeros para reparto de fases,
disolventes orgnicos y/o inhibidores o inactivadores de proteasas y sus mezclas. Se realiza una
trituracin de los tejidos de alcachofa previa a la homogeneizacin de los mismos, para despus
separar la parte soluble, del residuo slido, mediante un proceso de separacin slido-lquido
convencional, para obtener una primera fraccin soluble y un primer residuo slido.
La separacin slido-lquido se realiza por centrifugacin. El primer residuo slido se somete a uno
o ms ciclos adicionales de lavado y homogeneizacin en medio acuoso y posteriormente
separacin slido- lquido, para obtener un segundo residuo slido, y unas segundas fracciones
solubles que, opcionalmente se mezclan con dicha primera fraccin soluble y constituyen un
extracto crudo con actividad peroxidasa.
La primera fraccin soluble, opcionalmente mezclada con dichas segundas fracciones solubles, se
someten a un proceso de lavado, desalado y liofilizacin.
El segundo residuo slido se somete a un lavado con agua para obtener un material rico en fibra y
libre de biomolculas solubles, adecuado como fuente de fibra en la alimentacin humana o como
fuente para la obtencin de otros bioproductos con aplicaciones sanitarias, agroalimentarias o
industriales.
2.1.2. Fraccionamiento
En las plantas existen, adems de enzimas con actividad peroxidasa, otras enzimas con actividad
oxidasa que interfieren con la peroxidasa cuando sta se pretende usar como reactivo de anlisis.
Una de dichas enzimas con actividad oxidasa es la polifenol oxidasa.
Se deseca el segundo residuo slido lavado con agua y dichas enzimas con actividad oxidasa
eventualmente presentes en el material vegetal comprenden la polifenol oxidasa. La separacin de
la enzima con actividad peroxidasa de la polifenol oxidasa se realiza por precipitacin con sulfato
amnico por saturacin entre 60% y 80%.
Se deseca o se liofiliza el extracto resultante y se ha mantenerlo como fuente de enzima con actividad
peroxidasa para ensayos que no requieran el empleo de dicha enzima con elevada pureza.
2.1.3. Purificacin
Se realiza la purificacin total o parcial de dicha enzima mediante el empleo de una o ms tcnicas
convencionales de purificacin de protenas. Para la purificacin parcial de dicha enzima con
actividad peroxidasa se usa tcnicas cromatogrficas, cromatografa de afinidad en una columna de
Concanavalina A-Sepharose, cromatografa de intercambio catinico a un pH comprendido entre 4,0
y 6,0; cromatografa de intercambio catinico a un pH de 5,0 o mediante una combinacin de dos o
ms tcnicas cromatogrficas mencionadas anteriormente. Se lava, desala y liofiliza las fracciones
con actividad peroxidasa.
Se inmovilizan las fracciones con actividad peroxidasa mediante enlace a un soporte slido,
atrapamiento en geles, encapsulacin en vesculas, entrecruzamiento de molculas de enzima y
confinamiento en biorreactores de membranas. Dicho soporte slido se realiza sobre magnetita o
concanavalina-A. El biorreactor que comprende la enzima soluble o inmovilizada est acoplado a un
sistema de filtracin, afinidad, interaccin hidrofbica, intercambio inico, quelatacin o reparto.

2.2.

Peroxidasa Recombinante

Existe una demanda de nuevas peroxidasas ms estables y con mejores propiedades catalticas. Una
fuente alternativa de peroxidasas es el nabo (Brassica napus), ya que algunas isoformas son capaces
de polimerizar compuestos fenlicos de aguas residuales con alta eficiencia o pueden ser usadas en
reacciones de diagnstico; sin embargo, el proceso de extraccin y purificacin es complejo y se
obtienen bajos rendimientos de protena activa. Por lo que como alternativa se ha clonado un cDNA
de peroxidasa de nabo, para producir la protena recombinante en E. coli. El gen de la peroxidasa se
fusion con un hexmero de histidinas para facilitar su purificacin mediante cromatografa de
afinidad a metales inmovilizados (IMAC). El rendimiento de peroxidasa recombinante pura con este
mtodo es de 29 mg/l de cultivo, acumulada como cuerpos de inclusin.

3. Aplicaciones Biotecnolgicas
La reduccin de perxidos a expensas de sustratos donadores de electrones, hacen tiles a las
peroxidasas en un gran nmero de aplicaciones industriales y analticas. Debido a la naturaleza
oxidativa de las peroxidasas, existe una diversidad de reas donde stas podran remplazar a las
tcnicas de oxidacin qumica utilizadas actualmente. Los principales procesos de inters
biotecnolgico de las peroxidasas se describen a continuacin:

3.1.

Decoloracin de Colorantes Sintticos

La destruccin oxidativa de compuestos teidos es estimulada por enzimas oxidativas y puede ser
de inters prctico para la decoloracin de colorantes sintticos. Enzimas como lignina (LiP) y
manganeso peroxidasa (MnP) se han asociado con la degradacin de lignina y se han usado en la
decoloracin de colorantes sintticos como Naranja II y otros.
La peroxidasa de rbano picante (HRP) es conocida por degradar ciertos compuestos orgnicos
recalcitrantes como fenol y sus derivados va un mecanismo de polimerizacin de radicales libres,
mostraron que la HRP puede ser efectiva degradando y precipitando importantes colorantes
industriales tales como azul de Remazol. Este colorante industrial contiene al menos un grupo
aromtico en su estructura, hacindolo un posible sustrato de la HRP.

3.2.

Sntesis Orgnica de Polmeros

Los radicales libres producidos por las peroxidasas, pueden participar en diferentes reacciones
post-enzimticas. La polimerizacin oxidativa de compuestos aromticos catalizada por
oxidoreductasas se ha estudiado para crear nuevos polmeros funcionales y sintetizar resinas
fenlicas con una buena conversin quimioselectiva. Esto se puede hacer sin utilizar formaldehido
txico, el cual se usa en la polimerizacin qumica.
La HRP se ha usado para polimerizar compuestos fenlicos y aromticos mientras que nuevos tipos
de polmeros aromticos se han sintetizado en solventes a base de agua y solventes orgnicos
solubles en agua. El cardanol es un derivado del fenol y contiene una cadena aliftica de 15 C
insaturados con 3 dobles enlaces en la posicin meta. Este compuesto se ha utilizado como materia
prima para producir resinas. En 2003, Kim y colaboradores reportaron que una peroxidasa de soya
cataliz la polimerizacin oxidativa de cardanol, usando metanol, etanol, 2-propanol, alcohol tbutilco o 1-4-dioxano. Se obtuvo un alto rendimiento (62 %) usando 2-propanol como solvente. Sin
embargo, el uso de HRP result en una ineficiente polimerizacin de cardanol.

3.3.

Biorremediacin de Compuestos Fenlicos

Los compuestos aromticos como fenoles y sus derivados, representan una buena parte de los
contaminantes en aguas residuales derivados de un gran nmero de industrias qumicas y de
alimentos. Se sabe que los fenoles son sustancias txicas y carcinognicas que se pueden acumular
en la cadena alimenticia. Debido a su toxicidad, los fenoles estn fuertemente regulados en muchos
pases, debiendo ser removidos de las aguas residuales antes de que sean descargadas al medio
ambiente.
Un mtodo para la remocin de fenol incluye la polimerizacin usando enzimas redox. Como se
mencion anteriormente, en presencia de perxido de hidrgeno (aceptor de electrones), la
peroxidasa puede catalizar la polimerizacin oxidativa de fenoles, anilinas y otros compuestos
aromticos para formar polmeros insolubles. El material insoluble puede ser removido usando un
sistema de sedimentacin o filtracin.
La mayora de los reportes de destoxificacin de aguas residuales contaminadas con fenoles,
cresoles y fenoles clorados, han usado HRP. Sin embargo, recientemente se ha sugerido a las
peroxidasas de otras fuentes como de soya y nabo como alternativas a la de rbano picante.

3.4.

Biosensores

Un campo que ofrece gran potencial para la aplicacin de peroxidasas son los biosensores
electroqumicos. Recientemente, se han usado ampliamente los electrodos basados en peroxidasas
en sistemas analticos para la determinacin de perxido de hidrogeno e hidroperxidos orgnicos.
Algunas peroxidasas de plantas se han caracterizado cinticamente en grafito con el objetivo de
encontrar candidatos para aplicaciones como biosensores y entender la naturaleza de la
transferencia de electrones directa para el caso de las peroxidasas de plantas.
La enzima HRP nativa y recombinante (producida en E. coli) fue utilizada para preparar electrodos
de oro para la deteccin de perxido de hidrogeno. Todas las formar de HRP formaron una mono
capa de la enzima HRP recombinante exhibieron una respuesta alta y estable hacia H 2O2 debido a
su reduccin bioelectrocataltica basada en la transferencia directa de electrones entre el oro y la
HRP.
Se han desarrollado electrodos selectivos para iones fluoruro para el ensayo de la HRP, glucosa y
colesterol. Este mtodo potenciomtrico se basa en la reaccin bisustrato en la cual la hemoprotena
cataliza la oxidacin de compuestos aromticos halogenados donadores de H (por ejemplo, el 4fluorofenol) y la liberacin de iones fluoruro:

Sin embargo, de acuerdo a este mecanismo los radicales libres producidos pueden iniciar una
variedad de reacciones no enzimticas incluyendo la degradacin y muchos procesos de
polimerizacin.

3.5.

Anlisis Clnico y Diagnstico

La HRP es la enzima ms comnmente utilizada para aplicaciones analticas. Sin embargo, las
peroxidasas de otras fuentes podran ser una buena alternativa como sustitutos. Sharma, desarrollo
una biotira, que es una tecnologa simple y econmica para la estimacin de lactosa mediante la
inmovilizacin de B-galactosidasa, galactosa oxidasa y HRP en un soporte polimrico, y se pudo
estimar lactosa en leche en un rango de 20 100 g/l. Debido a la habilidad de la enzima peroxidasa
para generar productos cromognicos a bajas concentraciones y su relativamente buena
estabilidad, es adecuada para la preparacin de conjugados enzima-anticuerpos y en kits de
diagnstico. Angostini, purifico varias peroxidasas de cultivo de races de nabo (Brassica napus) in
vitro y desarrollaron un kit de diagnstico para la determinacin de cido rico.

3.6.

Inmunoensayos Enzimticos

El ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas (ELISA) tambin conocido como EIA, es una
tcnica de inmunoensayo en la cual un antgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo
ligado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color. Para esto, es
necesario de un anticuerpo especfico para un antgeno ligado a una enzima as como un sustrato
cromognico, el cual en presencia de la enzima cambia de color. La cantidad de color desarrollado
es proporcional a la cantidad de antgeno en la muestra.
La HRP es probablemente la mejor enzima para la preparacin de conjugados enzima-anticuerpos
los cuales se utilizan en ensayos tipo ELISA, debido a su habilidad para generar productos
cromognicos a bajas concentraciones. Acopladas con otras enzimas en sistemas polienzimticos,
la peroxidasas se usan en la determinacin de analitos, tales como glucosa en sangre, cido rico.
Grigorenko describe por primera vez la produccin de una fusin recombinante de una protena
analito con la HRP en E. coli. El analito es la protena de unin a cidos grasos de corazn humano.
(H-FABP), utilizada recientemente como un sensible marcador para infarto al miocardio agudo. Con
la aplicacin de la peroxidasa de soya se permiti el desarrollo del inmunoensayo con una mejora
en la sensibilidad y amplio rango de linearidad.

Bibliografa
1) RODRGUEZ CABRERA, Norma Azucena. Expresin y caracterizacin de una peroxidasa
recombinante de nabo (Brassica napus) en un sistema bacteriano [en lnea]. 2013. Tesis
Doctoral. [Fecha de consulta: 21 de Junio del 2015].
Disponible en:
http://ri.uaq.mx/bitstream/123456789/385/1/RI000076.pdf
2) GUTIRREZ SALAZAR, Patricia Maribel. Estudio de la polimerizacin de fenoles utilizando
peroxidasas presentes en rbano comn (Raphanus sativus var sativus), con aplicacin en la
biorremediacin de aguas residuales de una empresa textilera [en lnea]. 2011. [Fecha de
consulta:
21
de
Junio
del
2015].
Disponible
en:
http://repositorio.espe.edu.ec/bitstream/21000/3139/1/T-ESPE-031024.pdf
3) RODRGUEZ-LPEZ, J. N., et al. Enzima con actividad peroxidasa aislada de la alcachofa (Cynara
scolymus, L.), procedimiento para su aislamiento y purificacin y aplicaciones [en lnea]. 2002.
[Fecha
de
consulta:
21
de
Junio
del
2015].
Disponible
en:
http://www.google.com/patents/WO2002034898A1?cl=es

4) GENZ-UMU: Grupo de Investigacin Enzimologa (E006-05). Departamento de Bioqumica y

Biologa Molecular-A. Facultad de Qumica. Universidad de Murcia. Aplicaciones biotecnolgicas
sobre enzimas: Peroxidasa [en lnea]. [Fecha de consulta: 21 de Junio del 2015]. Disponible en:
http://www.um.es/genz/e00605/serv01b.htm
5) SCHMIDT, H. H.; PENNACCHIOTTI, M. I. Las enzimas en los alimentos. Su importancia en la
qumica y la tecnologa de los alimentos. Determinacin de actividad de Peroxidasa y de su
regeneracin [en lnea]. 2011. [Fecha de consulta: 21 de Junio del 2015]. Disponible en:
http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuticas/schmidth02
/index.html
6) DUARTE, Luca Estrella Baquero, et al. Catalasa, peroxidasa y polifenoloxidasa en pitaya amarilla
(Acanthocereus pitajaya): maduracin y senescencia. Acta Biolgica Colombiana [en lnea].
2005, vol. 10, no 2, p. 49. [Fecha de consulta: 21 de Junio del 2015]. Disponible en:
http://www.scielo.org.co/pdf/abc/v10n2/v10n2a04.pdf