UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE INGENIERA QUMICA

CARRERA DE INGENIERA QUMICA
LABORATORIO DE BIOQUMICA

PRCTICA 3
MICROSCOPIA Y TINCIN GRAM

RESUMEN/DESCRIPTORES
1. OBJETIVOS
1.1. Conocer las partes y funcionamiento de un microscopio.
1.2. Tomar conocimiento del cuidado, manejo y utilidad de un microscopio en el
Laboratorio de Microbiologa.
1.3. Reconocer diferentes clulas por medio del microscopio
1.4. Conocer tcnicas de reconocimiento de bacterias
1.5. Reconocer las bacterias gram positivas y gram negativas

2. TEORA
2.1. Microscopia
2.1.1. Microscopio

Es un instrumento que permite observar objetos no perceptibles a al ojo humano. Esto

se logra mediante un sistema ptico compuesto por lentes, que forman y amplifican la
imagen del objeto que se est observando.

2.1.2. Partes del Microscopio

Est conformado por tres sistemas:

Sistema mecnico

BRAZO.- Es la parte de donde se debe sujetar, las pinzas el carro el tubo del
microscopio y el revlver. Adems sirve para trasladar el microscopio de un lugar a
otro.

BASE O PIE.- Es una pieza que proporciona estabilidad y sirve de soporte a todas las
partes del microscopio.

PLATINA.- Es una pieza metlica, cuadrada, que tiene en su centro una abertura
circular por la que pasar la luz del sistema de iluminacin. Aqu se coloca el
portaobjetos con la muestra a observar

PINZAS DE SUJECION.- Parte mecnica que sirve para sujetar la preparacin. La

mayora de los microscopios modernos tienen las pinzas adosadas a un carro con dos
tornillos, que permiten un avance longitudinal y transversal de la preparacin.

TORNILLO MACROMETRICO: Permite hacer un movimiento rpido hacia arriba o

hacia abajo del tubo o la platina, y se utiliza para localizar la imagen a observar.
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TORNILLO MICROMETRICO O DE ENFOQUE SUAVEREVOLVER.- Parte

mecnica de movimiento giratorio que nos permite colocar en posicin cualquiera de los
objetivos que se encuentran en l.

TUBO.- Parte mecnica que proporciona sostn a los oculares y objetivos.

CREMALLERA.- Permite que el movimiento de los tornillos macro y micromtrico sea

de mayor o de menor amplitud.

Sistema ptico:

OCULAR.- Se localiza en la parte superior del tubo ocular y son las lentes que Capta y
ampla la imagen formada en los objetivos. Los primeros microscopios eran
monoculares, es decir, posean una sola lente. Los microscopios actuales poseen dos
oculares, uno para cada ojo y se les llama binoculares.

OBJETIVOS: Se encuentran incrustados en el revlver son unos pequeos cilindros

colocados en el revlver que proporciona el poder de resolucin del microscopio y
determinan la cantidad total de aumento.

Sistema iluminacin:

La fuente luminosa consiste en un espejo o una fuente de luz elctrica que dirige un haz
de luz hacia el condensador.

CONDENSADOR.- Es una lente de gran abertura que permite dirigir o condensar la

mayor parte de los rayos luminosos en la preparacin. En nuestro microscopio est
integrado en la platina y tiene un diafragma unido en la parte inferior.

DIAFRAGMA: Existe un diafragma en el condensador, que elimina el exceso de

luminosidad para tener una buena iluminacin del objeto a observar.

FUENTE DE LUZ.- Para observar la muestra microscpica es necesario que sta se

ilumine con algn tipo de luz y nuestros microscopios cuentan con un foco que da
energa elctrica que dirige sus rayos luminosos hacia el sistema condensador.

2.1.3. Aumento
Existen 4 tipos entre los que se encuentran:

1.- La lupa (4 X) que sirve para hacer observaciones a bajo aumento.

2.- El objetivo seco dbil (10 X) que se utiliza para localizar la imagen que se va a
observar.

3.- El objetivo seco fuerte (40 X) aumenta la imagen anterior, para poder observar se
necesita primero acercar el objetivo al portaobjetos y posteriormente, enfocar el objetivo
hasta que aparezca la imagen.
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4.- El objetivo de inmersin (100 X) es un lente especial para observar imgenes tan
pequeas como las bacterias. Y se requiere del aceite de inmersin para lograr una
buena observacin.

2.1.4. Resolucin
El poder de resolucin est determinado en parte por la longitud de onda de la radiacin
empleada para iluminar el espcimen y es inversamente proporcional a la misma, es
decir, a menor longitud de onda, mayor poder de resolucin. El haz de electrones puede
tener longitudes de onda variables, las cuales influyen en el lmite de resolucin que a
su vez depender del voltaje empleado para acelerar los electrones.

Tabla 1-1.-Relacin del voltaje de aceleracin, la longitud de onda del haz de electrones
Voltaje de Longitud de onda () Lmite de resolucin
Aceleracin (kV) terico ()
10 0.122 (0.122nm) 3.7 (0.37nm)
20 0.086 (0.0086nm) 2.9 (0.29nm)
50 0.054 (0.0054nm) 2.1 (0.21nm)
100 0.037 (0.0037nm) 1.7 (0.17nm)
200 0.025 (0.0025nm) 1.3 (0.13nm)
500 0.014 (0.0014nm) 0.9 (0.9nm)
1000 0.009 (0.0009nm) 0.7 (0.07nm)
Fuente: Modificado de Sjstrand F. (1967). Electron Microscopy of Cells and Tissues.
Vol. 1, Instrumentation and Techniques (14).

2.1.5. Factores que Afectan el Poder de Resolucin

Al observar pequeos objetos al microscopio, la luz incidente proveniente de ellos es
desviada de su trayectoria inicial y mientras ms pequeos sean, mayor ser la
desviacin. Las lentes del objetivo deben recolectar como sea posible la mayor cantidad
de rayos desviados para formar una imagen ntida; a ms rayos capturados, mayor
resolucin
Otra manera de incrementar la resolucin es creando, del lado de la fuente luminosa, un
cono amplio con un ngulo mayor. Para ello se emplea otro juego de lentes denominado
condensador el cual posee la misma apertura numrica que el objetivo
Para aumentar an ms la resolucin, adems de agregar un condensador, otra
posibilidad es colocar algn lquido entre la lmina cubreobjeto y el objetivo. Se ha
obtenido buenos resultados con ciertos aceites (aceite de cedro) cuyo ndice de
refraccin es igual al del vidrio cubreobjeto, eliminando toda reflexin de los rayos
luminosos

2.2. Tincin Gram

2.2.1. Tincin simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras celulares se tien con la
misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno de Loeffler, Azul de lactofenol).
El Hidrxido de potasio al 10% (solucin de KOH) permite ver elementos de hongos ya
que el KOH digiere parcialmente los componentes proteicos, por ejemplo de la clula
husped, pero no acta sobre los polisacridos de las paredes celulares de los hongos
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La tinta china o Nigrosina permite observar clulas levaduriformes capsuladas

(Cryptococcus), sobre todo en LCR. Los polisacridos capsulares rechazan la tinta china
y la cpsula aparece como un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de
metileno de Loeffler puede agregarse a las preparaciones en fresco de heces para
observar la presencia de leucocitos.

2.2.2. Tincin diferenciada

Las tinciones diferenciales se utilizan ampliamente en microbiologa; consisten en la
aplicacin de dos colorantes que contrastan en su intensidad o color y un paso
intermedio que provoca una respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre
determinadas clulas dentro de una poblacin. La diferenciacin puede ser provocada
por un agente qumico o fsico, permitiendo observar dos tipos de respuestas diferentes
a la tincin en una misma muestra. Las dos tinciones diferenciales ms utilizadas en
bacteriologa son la tincin de gram y la tincin de cido alcohol resistencia.
Tincin de Gram Esta tincin diferencial fue propuesta por el medico dans Christian
Gram(1884)(TORTORA et al., 2007) que examinando tejido pulmonar de enfermos
fallecidos por neumona observ que la bacteria Streptococcus pneumoniae, presente en
los pulmones, retena el colorante conocido como marrn Bismark(sustituido
posteriormente por el cristal violeta),mientras que el tejido pulmonar no era capaz de
retener el colorante.
Es la tincin diferencial ms utilizada de forma rutinaria y prcticamente la primera
prueba a la que se someten las muestras de cualquier origen antes de su estudio.
Proporciona una informacin esencial, adems de sobre la forma, tamao y agrupacin
celular, como es el tipo y composicin de la pared que presentan las bacterias. La
tincin de Gram divide a las bacterias con pared del Dominio Bacteria en dos grandes
grupos: bacterias con pared de tipo gram positiva y bacterias con pared de tipo gram
negativa.

2.2.3. Frotis
Se denomina frotis a la extensin que se realiza sobre un portaobjetos de una muestra o
cultivo con objeto de separar lo ms posible los microorganismos, ya que si aparecen
agrupados en la preparacin es muy difcil obtener una imagen clara y ntida. Este frotis
debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos para poder aplicar los mtodos
habituales de tincin que permiten la observacin al microscopio de las bacterias sin
que la muestra sea arrastrada en los sucesivos lavados. La fijacin de una
extensin bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al vidrio
alterando lo menos posible la morfologa y bacteriana y las posibles agrupaciones de
clulas que pudiera haber.

2.2.4. Bacterias Gran + y Gran

La pared celular que rodea a las bacterias es compleja y existen dos formas bsicas:
pared celular grampositiva con una gruesa capa de pptidoglucano y una pared
gramnegativa con una delgada capa de pptidoglucano, as como una membrana
externa.
BACTERIA GRAM POSITIVA Tiene una capa gruesa de Peptidoglicano (mureina) y
dos clases de cidos teicoicos: cido Lipoteicoico que est en la superficie, empotrado
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en la capa de peptidoglicano y unido a la membrana citoplsmica. Y cido teicoico de

la Pared que est en la superficie y se une slo a la capa de peptidoglicano. El cido
Teicoico es el responsable del determinante antignico del organismo.
BACTERIA GRAM NEGATIVA Tiene una capa delgada de Peptidoglicano (mureina)
unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de
protena, fosfolpido y lipopolisacrido . En el lipopolisacrido, la porcin de lpido est
embebida en el fosfolpido y el antgeno O polisacrido est en la superficie. El lpido se
llama Lpido A y es txico, pero el lipopolisacrido entero se llama Endotoxina. La
pared de la clula tiene poros llamado Porines para el transporte de substancias de peso
molecular bajo. Entre la membrana citoplsmica y la pared celular hay un espacio
periplsmico con enzimas hidrolticas, enzimas inactivadoras de antibiticos y protenas
de transporte.