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ABSTRACT
Introduction: Cronobacter spp. is a bacterial genus that includes
7 species; Cronobacter sakazakii is the clinical specie that is the
most reported and associated with meningitis and septicemia in
infants. Given that it is transmitted by powdered infant formula
(PIF), the WHO recommends that this product be free of Cronobac-
ter, whereas the Chilean Food Sanitary Regulation (RSA) does not
consider it. Objective: To assess the risk of C. sakazakii in PIF for
consumption by infants. Methodology: A total of 72 PIF samples Julio Parra F. (1,2)
were analyzed using three brands originating from three countries. Leslie Oliveras V. (2)
Aerobic plate count (APC), Enterobacteriaceae (ENT), and most Alejandra Rodriguez F. (1,2)
probable number (MPN) were performed using the methodology Francisca Riffo S. (3)
described by Puch and Ito (2001). Cronobacter differential agar Emily Jackson (4)
was used to isolate strains (DFI, Oxoid, England), and the ID32E Stephen Forsythe (4)
biochemical kit (Biomeriux, France) was used for phenotyping. The
pathogen was identified and genotyped by multilocus sequence (1) Departamento de Nutricin y Salud Pblica, Universidad del Bo-Bo, Chilln, Chile.
(2) Magister en Salud Pblica, Universidad del Bo-Bo, Chilln, Chile.
typing (MLST) based on the criteria found at http://www.pubmlst. (3) Escuela de Medicina, Universidad de Concepcin, Concepcin, Chile.
org/cronobacter. Results: Median APC for step 1 and preterm PIF (4) Pathogen Research Centre, School of Science and Technology, Nottingham Trent
was 300 CFU/g (10-36 000) and 650 CFU (70-30 000), respec- University, Clifton Lane, Nottingham, UK.
tively, and was higher in Chilean PIF (p=0.016). There were no Dirigir la correspondencia a:
significant differences for type, country, or PIF brand in 75 CFU/g Dr.
(10-36 000) and 200 CFU/g (10-1 000) ETN (p>0.05). Two strains Julio Parra F.
Nutricionista
from two different lots with characteristic strains in DFI agar were Magister en Salud Pblica
identified as C. sakazakii with 0.23 and 2.3 MPN/g. In addition, Departamento Nutricin y Salud Pblica
Franconibacter helveticus, specie closely related to Cronobacter Universidad del Bo-Bo, sede Chilln
Chilln, Chile
spp, was found in two other strains. Conclusions: The prevalence CP 3780000
of Cronobacter sakazakii in all the samples was 2.7% isolated Tel: (56)42-2463107 - Fax 42-2463132
only in PIFs manufactured in Chile. The absence of Cronobacter Email: juparra@ubiobio.cl
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Parra J. y cols.
poblacin ms afectados recin nacidos y adultos mayores, microbianos se realiz con la metodologa descrita en el
pero con mayor incidencia y gravedad en nios prematuros Compendium of Methods for the Microbiologycal Exami-
(6). El cuadro clnico consiste principalmente en meningitis, nation of Foods (21).
septicemia o enteritis necrozante en lactantes, aunque tambin Aislamiento de Cronobacter spp: Se utiliz la tcnica
se han observado cuadros diarreicos, infecciones urinarias y descrita por Iversen y Forsythe (22) utilizando 25 gramos de LP
septicemia con niveles de letalidad asociadas a infeccin en 225 ml de agua peptonada buffer (BPW, Oxoid, England).
general de 26,9%, con 42% y 20% en meningitis neonatal y Se enriqueci en Caldo EE Mossel (BD Difco, Sparks, MD,
septicemia respectivamente (7). USA) y posteriormente se estri en Agar Cromognico DFI
La enfermedad est asociada al consumo de leches en (CM 1055, Oxoid Termo-Fisher, UK). Las colonias presuntivas
polvo rehidratadas (LP-R) como vehculo del patgeno con (color verde o azul) se purificaron en agar soya tripticasena
eventual participacin de los utensilios y equipo como reser- (BD Difco, Sparks, MD, USA).
vorios (8). Dado el carcter ubicuo del patgeno puede ser Identificacin fenotpica: Se utiliz el kit comercial ID
aislado de leche en polvo (LP) y rehidratada (LP-R), cereales 32E (BioMrieux, Francia), siguiendo las indicaciones del
infantiles, alimentos diversos, agua, superficies, hogares y fabricante.
hospitales (9). Estudios sobre incidencia de Cronobacter spp en Cuantificacin por nmero ms probable (NMP): Se
LP han demostrado su positividad en rangos de 3 a 30% (10). utiliz la tcnica descrita por Palcich y cols (23). Los lmites
En Chile, en un estudio realizado el ao 2008 y publicado el se establecieron de 0,009 a 316 NMP/g de LP con un 95%
ao 2012 por Sez y cols (11), encontraron 5% de positividad de confianza.
de Cronobacter spp (Enterobacter sakazakii) en 80 muestras Amplificacin para MLST: Se utiliz la metodologa des-
de LP de una planta elaboradora de productos lcteos de la crita en http://pubmlst.org/cronobacter . Todas las soluciones
Regin de los Lagos. utilizadas de PCR CORE Kit Qiagen (Cat No. 201225). La
La identificacin actual de Cronobacter sakazakii se secuenciacin y purificacin de los productos amplificados
basa en la identificacin mediante kits de test metablicos se realiz en MACROGENMR , Korea y Source Bioscience
(API 20E, ID32E, BIOLOG microarray) con bases de datos Sequencing, Nottingham, UK.
desactualizadas que reconocen an a Enterobacter sakazakii. Identificacin de Cronobacter sakazakii MLST: Este trabajo
Adems, mediante tcnicas moleculares con sondas para reac- se realiz en el Pathogen Research Centre, Nottingham Trent
cin de la polimerasa en cadena (PCR) y tiempo real (PCR-RT) University, Inglaterra. Identificando las cepas de Cronobacter
entre otras, que reconocen a Cronobacter spp y sus especies sakazakii con los criterios de la base de datos de acceso libre
(12-15). Sin embargo, esta identificacin se ve limitada al no http://pubmlst.org/cronobacter.
considerar la reclasificacin reciente de Cronobacter spp pro- Anlisis estadstico: Para describir se usaron medidas
vocando falsos positivos (16). Baldwin y cols (17), mejoraron de tendencia central, dispersin y posicin en el caso de
la identificacin de Cronobacter spp y sus especies mediante variables cuantitativas, y frecuencias absolutas y porcentajes
multilocus sequence typing (MLST), que utiliza fragmentos para variables cualitativas. Para comparar se utiliz la prueba
de 7 house-keeping genes y que adems, permite identificar de Mann- Whitney y Kruskall- Wallis utilizando el software
en la especie C. sakazakii, ciertas predominancias genticas STATA 7.0 con un nivel de significancia =0,05.
asociadas al desarrollo de meningitis neonatal en nios (18).
Para ello se utiliza la base de datos de acceso libre en: http:// RESULTADOS
www.pubMLST.org/cronobacter. Para los recuentos de RAM, el 50% de las muestras de
Considerando el riesgo asociado a Cronobacter, la FAO/ LP etapa 1 tenan al menos 300 UFC/g (10-36 000) y de
OMS han elaborado varias evaluaciones de riesgo con el fin de 650 UFC/g (70-30 000) para LP de prematuros. Por pas de
generar informacin para la toma de decisiones por parte de origen, se encontr un P50 global de 300 UFC/g (10-36
las autoridades de salud, adems de recomendar la ausencia 000), con un recuento para Chile 700 UFC/g (30-36 000);
de Enterobacteriaceae, Cronobacter spp y sus especies en Mxico 220 UFC/g (10-5 000) y Holanda 500 UFC (70-30
LP destinada al consumo de lactantes (19). Sin embargo, en 000). Para la marca n 1 el P50 global muestra que la mitad
Chile en las LP actualmente slo se considera la ausencia de de las muestras tiene al menos 700 UFC/g (30-36 000), n
Salmonella en el Reglamento Sanitario de los Alimentos, no 2 de 170 UFC/g (10-30 000) y n 3 de 450 UFC/g (100-2
considerando Cronobacter spp y Enterobacteriaceae en su 000). El recuento de RAM en las muestras procedentes de
normativa. Chile, result ser significativamente mayor con respecto a los
El objetivo de este trabajo fue presentar resultados dems pases en estudio (p=0,016) al igual que la marca n 1
preliminares del proyecto DIUBB 143720 cuyo objetivo es (p=0,0069) (figura 1). El 92% de las muestras evaluadas segn
evaluar el riesgo por C. sakazakii en LP destinadas al consumo este indicador y teniendo como referencia el RSA, cumpla
de lactantes. con niveles microbiolgicos aceptables (< 10 000 UFC/g),
8% como medianamente aceptables (> 10 000 a < 50 000
MATERIALES Y MTODOS UFC/g) y no existiendo muestras rechazables con valores >
Muestreo: Se utiliz un estudio analtico de corte trans- a 50 000 UFC/g. Slo cuatro muestras contenan probiticos
versal desde agosto 2013 a Marzo de 2014. Se colectaron 72 con valores menores a 100 UFC/g.
latas (7 LP de prematuros y 65 de Etapa 1 o iniciacin) de Para los recuentos de ENT en LP etapa 1 el 50% de las
450 g de 3 marcas y 3 pases, comercializadas en farmacias y muestras contenan al menos 75 UFC/g (10-1 060) y 200
supermercados de Chilln. Como referencia se utilizaron los UFC/g (30-1 000) para LP de prematuros. Por pas de origen,
criterios de muestreo de la norma CAC/RPC 66 del Codex un P50 global fue de 90 UFC/g (10-1 060), siendo para Chile
Alimentarius (20). 160 UFC/g (10-1 060), Mxico 60 UFC/g (10-1 000) y Holanda
Microorganismos indicadores: Se utiliz el recuento 150 UFC (10-1 000). Para la marca n 1, el P50 global muestra
de microorganismos mesfilos aerobios (RAM) y Entero- que la mitad de las muestras tenan 90 UFC/g (10-1 060), la
bacteriaceae (ENT). La cuantifi cacin de ambos grupos n 2 con 60 UFC/g (10-1 000) y la n 3 con 105 UFC/g (10-1
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Riesgo de Cronobacter Sakazakii en leches en polvo para la nutricin de lactantes
000); no existiendo diferencias significativas en el recuento das slo 2 cepas de lotes diferentes elaborados en Chile. Para
de ENT por tipo de leche (p=0,097), pas de origen (p=0,086) las muestras producidas en Chile la prevalencia del patgeno
y marca de LP (p=0, 158) (figura 2). Considerando los rangos fue 9,5% (tabla 1).
en los recuentos de ENT en LP de prematuros, 28,6% (2/7) Se aislaron 20 cepas caractersticas en agar diferencial DFI
tena menos de 100 UFC/g, 57,1% (4/7) de 100 a 500 y 14,3% de muestras manufacturadas en Chile, las que se identificaron
(1/7) con 1 000 UFC/g. Para LP Etapa 1, 61% de la LP contena como Enterobacter sakazakii mediante ID32E con 94 a 99.9%.
menos de 100 UFC/g, 36% entre 100 y 1 000 y slo 3% con Adems, se identific en otras cepas a Enterobacter cloacae,
1 000 UFC/g. Klebsiella pneumoniae y Enterobacter amnigenus. Para MLST
La prevalencia de C. sakazakii fue 2,7%, siendo confirma- slo amplificaron 11 cepas, dos de las cuales fueron identifica-
FIGURA 1
Recuento de bacterias mesfilas aerobias (RAM) en leche en polvo por tipo de leche, pas de origen y marca comercial.
FIGURA 2
Recuento de Enterobacteriaceae en leche en polvo por tipo de leche, pas de origen y marca comercial.
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Parra J. y cols.
das como C. sakazakii con 0,23 y 2,3 NMP/g y Franconibacter RSA. De las 6 muestras consideradas medianamente acepta-
helveticus con 0,023 y 0,94 NMP/g en otras dos. El resto de bles, cinco correspondieron a Chile. La otra muestra corres-
las cepas fueron identificadas como Enterobacter spp (tabla 2). ponde a LP elaborados en Holanda y destinada al consumo
de nios prematuros. Estos valores de RAM son similares a
DISCUSIN los obtenidos por Chap y cols, que al estudiar 136 muestras
La lactancia materna es la forma ms segura de alimen- de LP a nivel internacional encontraron que 75% de las mues-
tacin para los lactantes: aporta la totalidad de los nutrientes tras tenan menos de 100 UFC/g, 16,2% entre 100 y 1 000
necesarios para la primera etapa de la vida, protege contra las UFC/g, 2.9 % de 1 000 a 10 000 y 5,1 % con ms de 100 000
infecciones y tiene mltiples beneficios para la salud y desa- UFC/g. Evidenciando la necesidad de controlar las fuentes de
rrollo integral en los nios (24). La Organizacin Mundial de la contaminacin de las LP debido al amplio rango de microor-
Salud recomienda su consumo exclusivo hasta los 6 meses de ganismos presentes en el RAM y por la mayor susceptibilidad
vida y en combinacin con otros alimentos, hasta los 2 aos de infeccin que tienen los nios prematuros y lactantes (27 ).
(25). Una alternativa a la lactancia materna son las leches en Con respecto a ENT, 100% de las muestras analizadas
polvo (LP), que se obtienen a partir de leche de vaca y que por presentaban valores sobre lo permitido segn la norma in-
su proceso de elaboracin industrial la poblacin microbiana ternacional del Codex CAC RPC 66, que exige ausencia de
disminuye considerablemente. Por ello, estos productos no este indicador en 25 g de LP. Estos resultados no se pueden
deben ser reconocidos como un producto estril (26). De comparar con el estndar de Chile ya que el RSA vigente no
esta forma el uso de indicadores microbianos como recuento considera valores para este grupo indicador. An cuando, no
de aerobios mesfilos (RAM) y Enterobacteriaceae (ENT) nos existen diferencias significativas por tipo, marca o pas de ori-
proporciona informacin til de las condiciones de higiene gen de las LP (p>0,05), la sola presencia de Enterobacteriaceae
durante su elaboracin. en las LP es un factor de riesgo por s solo. Esta situacin no
De acuerdo al contenido de RAM en las muestras eva- es del todo excepcional, Reich y cols en una planta de proceso
luadas, 92% (66/72) de las muestras fueron calificadas como de LP en Alemania, encontraron ENT en todas las muestras
aceptables y 8% (6/72) medianamente aceptables segn el analizadas, y en siete lugares con valores muy superiores a 500
TABLA 1
Chile 21 NP 2 2 9,5
Mxico 44 NP 0 0 0
Holanda 7 0 NE 0 0
Total 72 0 2 2 2,7
NP: No producen este tipo de LP
NE: No evaluadas
TABLA 2
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Riesgo de Cronobacter Sakazakii en leches en polvo para la nutricin de lactantes
UFC/g. Enfatizando la necesidad del monitoreo en el proceso Adems, identificamos en 2 cepas de dos muestras pro-
de elaboracin y de medidas de inocuidad e higiene durante ducidas en Chile a Franconibacter helveticus, germen cono-
su produccin (28). cido hasta julio 2014 como Cronobacter helveticus, especie
La alta positividad a ENT en nuestro estudio es compati- estrechamente relacionada a Cronobacter spp (36),
ble con la presencia de varios microorganismos oportunistas Otro aspecto importante a considerar es que desde el
y patgenos asociados a enfermedad en lactantes en diversas ao 2007, la OMS recomienda el uso de agua > 70C para
publicaciones (19). Por lo que estos hallazgos deben ser hidratacin de las leches en polvo para limitar el riesgo de
analizados en trminos del riesgo asociado al consumo de las infeccin por Cronobacter spp (37). Recomendando adems,
LP en lactantes, del poco control que estaran realizando las que la administracin de los LP rehidratados a los lactantes se
empresas elaboradoras y de la autoridad de salud responsa- realice dentro de 2 horas despus de preparado o conservado
ble en nuestro pas. Aun cuando, la asociacin de enfermar en refrigeracin a < de 4C. No cumplir con esta temperatura
con la ingesta de LP contaminados con ENT an no se ha de refrigeracin le confiere la posibilidad de desarrollo al
establecido con certeza, su ausencia en el LP proporciona patgeno por su caracterstica psicrtrofa (38).
una proteccin adicional a los recin nacidos, especialmente Ninguna de las etiquetas de las LP evaluadas en nuestro
para prematuro, inmunocomprometidos, y recin nacidos de estudio consideraba este aspecto, y solo recomendaba el uso
bajo (<2 500 g) y muy bajo (<1 500 g) peso al nacer, durante de agua hervida tibia, lo que no slo contraviene la recomen-
la preparacin, almacenamiento, o la administracin de la dacin de OMS, sino que expone a los lactantes a un riesgo
alimentacin infantil (29). innecesario. Forsythe (2009), encontr en un estudio extensivo
Debido a la necesidad de asegurar la inocuidad de las en Europa que las etiquetas de las LP no entregan instrucciones
LP en lactantes, la FAO/OMS ha realizado dos reuniones de de reconstitucin con agua a 70C, slo especifican el uso de
expertos estudiando casos de enfermedades relacionadas a agua de rehidratacin hervida y tibia, siendo riesgo permanen-
su consumo, ya sea epidemiolgica o microbiolgicamente. te de desarrollo de Cronobacter y otras enterobacterias (39).
Se identificaron tres categoras de microorganismos con base En resumen, en este estudio encontramos una inadecua-
en la solidez de las pruebas de una relacin causal entre su da calidad microbiolgica de las LP que son consumidas por
presencia en los LP y la enfermedad de stos: A) microorga- prematuros y lactantes. Adems, identificamos la presencia de
nismos con claras pruebas de causalidad, Salmonella entrica y Enterobacteriaceae y de Cronobacter sakazakii, lo que es un
Cronobacter (Enterobacter sakazakii); B) microorganismos para llamado de alerta a los fabricantes y autoridades reguladoras
los cuales la causalidad es posible pero que no ha sido demos- en la salud pblica de nuestro pas. Es necesario establecer un
trada todava, principalmente de la familia Enterobacteriaceae, mejor control de las condiciones higinicas en la elaboracin
y C) microorganismos en los cuales la causalidad es menos de las LP y de su vigilancia microbiolgica, con el fin de evitar
probable o no ha sido demostrada todava, y que no han sido riesgos innecesarios para la salud en la poblacin infantil que
identificados en los LP (30). Las orientaciones entregadas por consume masivamente estos alimentos.
estas comisiones de expertos, a nuestro parecer fundamentan
la necesidad de revisar los criterios microbiolgicos del RSA RESUMEN
vigente en trminos de asegurar la inocuidad de las LP que se Introduccin: Cronobacter spp es un gnero bacteriano
comercializan en nuestro pas. con 7 especies, siendo C. sakazakii la especie clnica ms
Adems de encontrar otras especies de ENT en las LP, reportada y asociada a meningitis y septicemia en lactantes.
identificamos Cronobacter sakazakii en dos lotes de leches Es transmitida por leche en polvo (LP) por lo que la OMS reco-
producidas en Chile. La presencia de este patgeno debe mienda su ausencia en este producto. En Chile, el reglamento
ser objeto de estudio y fiscalizacin por parte del fabricante sanitario de los alimentos (RSA) no lo considera. Objetivo:
y de las autoridades, debido a su alta letalidad y secuelas Evaluar el riesgo por Cronobacter sakazakii en LP destinadas al
neurolgicas que produce (31). La probabilidad de enfermar consumo de lactantes. Metodologa: Se analizaron 72 muestras
por este patgeno ha sido estimada en muy pocos pases. En de LP de 3 marcas y 3 pases. El recuento de bacterias mesfi-
Estados Unidos se estima una tasa de infeccin de 1 por 100 las (RAM), Enterobacteriaceae (ENT) y nmero ms probable
000 nios recin nacidos y que aumenta a 9,4 por 100 000 (NMP) se realiz con la metodologa de Puch and Ito (2001).
en nios con un peso menor a 1,500 g (32). En Holanda, se Se utiliz agar diferencial Cronobacter para aislamiento (DFI,
estima una probabilidad de 0,53 casos de infeccin por ao Oxoid, England) y kit bioqumico ID32E (Biomeriux, Francia)
con una tasa de 1 por 100 000 nios (33). En Chile descono- para fenotipo. El patgeno fue identificado y genotipificado
cemos esta informacin, ya que C. sakazakii no es parte de la por multilocus sequence typing (MLST) utilizando criterios de
pesquisa habitual de notificacin. http://www.pubmlst.org/cronobacter. Resultados: La media-
A fines de 2011 en Estados Unidos, 4 nios menores de nas de RAM para LP etapa 1 y prematuros fueron 300 UFC/g
6 meses enfermaron gravemente de meningitis al consumir LP (10-36 000) y 650 UFC/g (70-30 000), siendo mayor en las
contaminada por C. sakazakii de los cuales dos murieron. Se muestras de Chile (p=0,016). Para ENT de 75 UFC/g (10-1 060)
identific la presencia en las cepas aisladas del complejo clonal y 200 UFC/g (30-1 000), no existiendo diferencias significativas
ST4 que ha sido asociado al desarrollo de meningitis neonatal por tipo, pas o marca de LP (p>0,05). Dos cepas de 2 lotes
y que est presente en todos los casos de meningitis asociada diferentes caractersticas en agar DFI se identificaron como C.
a este patgeno en los ltimos 30 aos (34). sakazaki con 0,23 y 2,3 NMP/g. Adems de Franconibacter
La cuantificacin de este patgeno en una de las mues- helveticus en otras 2 cepas, especie relacionada estrechamen-
tras fue 2.3 NMP/g, valor muy elevado de acuerdo a lo que te con Cronobacter spp. Conclusiones: La prevalencia de C.
reporta la literatura cientfica (19). Si consideramos que un sakazakii en todas las muestras fue de 2,7% y aisl slo en LP
lactante consume varias veces al da y diferentes volmenes, de elaborados en Chile. La ausencia de Cronobacter spp en
el riesgo aumenta. Aun cuando la dosis infectante es desco- 25 g debe ser incorporado en el RSA de Chile.
nocida, Iversen y cols, propusieron 1 000 UFC (35), diferente Palabras clave: Cronobacter sakazakii, leche en polvo,
de expresada por la OMS de 10 000 UFC (19). lactantes.
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Riesgo de Cronobacter Sakazakii en leches en polvo para la nutricin de lactantes
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