Citotoxicidad de

Plantago major L.
Glvez M.1; Lpez-Lzaro, M. 1; Navarro, E. 1; Mederos. S.l; Martn-Cordero, C; Ayuso, M.J. 1
1. LABORATORIO DE FARMACOGNOSIA. DPTO. FARMACOLOGA. FACULTAD DE FARMACIA. UNIVERSIDAD DE SEVILLA. ESPAA.
2. DPTO, FARMACOLOGA. FACULTAD DE MEDICINA. UNIVERSIDAD DE LA LAGUNA. ESPAA.
3. DPTO, BIOLOGA VEGETAl. FACULTAD DE FARMACIA. UNIVERSIDAD DE LA LAGUNA. ESPAA.

Resumen: tipo Soxhlet durante 24 h

Plantago majar L. ha sido empleado en medicina popular en el tratamiento con cloroformo (C13CH) y
de diferentes tipos de tumores. Este estudio muestra la actividad cito txica 48 h con metanol (MeOH);
"in vitro" de un extracto metanlico de P. majar silvestre y se compara con el disolvente fue eliminado a
los valores obtenidos con el extracto metanlico de P. majar cultivado por presin reducida. El rendi-
micropropagacin. miento de los extractos meta-
Los resultados revelaron que ambos extractos fueron activos, no existien- nlicos correspondientes a
do diferencias significativas (p>0,05) entre ellos. los plantagos a ensayar, fue
14,5% y 18,1 % (p / p), res-
Palabras clave: pectivamente.
Plantago majar, Llantn, Citotoxicidad, Micropropagacin.
Estudio fitoqumico
- Se realiz mediante reacclO-
Introduccin: El objetivo de este trabajo es, nes coloreadas (flavonoides,
La bsqueda de nuevos frma- por tanto, determinar la actividad taninos, saponsidos, iridoi-
cos antitumorales a partir de fuen- cito txica de extractos metanlicos des, esteroles y triterpenos,
tes de origen natural est siendo de hojas obtenidas a partir de P. cumarinas)(7.1 2.14) y mtodos
exitosa a nivel mundial y algunos majar silvestre y cultivado por mi- cromatogrficos (CCF) con
de los compuestos activos aislados cropropagacin. diferentes reveladores.
de especies vegetales forman parte
de la terapia oncolgica(l). Material y Mtodos: Actividad ctotxica
Plantago majar L. (Plantagina- Material vegetal Unin al ADN y ARNt
ceae), comnmente conocido como - Hojas de Plantago majar L. -El ensayo fue realizado si-
"llantn", es utilizado en medicina (Plantaginaceae) silvestre, re- guiendo el mtodo descrito
popular para el tratamiento de dife- colectado en Galdar, (Gran por Pezzuto y cols. (15). Se utili-
rentes enfermedades, entre ellas, el Canaria), y autentificado por z ADN de timo de carnero y
cncerI2 9) Dr. M. del Arco, del Depar- ARNt de levaduras (Sigma
Estudios qumicos de las hojas tamento de Biologa Vegetal, Chem.). El equipo HPLC
de P. majar han mostrado la presen- de la Universidad de La (Waters modo 510), con detec-
cia de flavonoides, cidos fenoles, Laguna. tor de absorbancia LC 85B
fenilpropanoides, iridoides, taninos - Hojas de P. majar cultivado por programado a 254 nm. La co-
y muclagos(2.6.1 0). micropropagacin por Mede- lumna fue C18 RP
Esta especie se propaga por se- ros y coIs. (11) (Spherisorb ODS-2,5 mm de
millas, y sigue una polinizacin tamao de partcula) y la fase
cruzada; como resultado, la proge- Preparacin de los extractos meta- mvil utilizada, H20:MeOH
nie muestra una variabilidad im- nlicos (80:20). En estas condiciones
portante. Una alternativa til para - Las hojas desecadas y pulveri- experimentales, el ADN Y
mejorar la calidad de la misma y zadas (90 g) de P. major silves- ARNt libre eluye con un
satisfacer su demanda, es el cultivo tre y cultivado, fueron some- tR = 1 mino Las muestras, y
por micropropagacin. tidas a extraccin continua soluciones de ADN o ARNt
(0.1 mg/mL en agua bidesti-
lada) fueron agitadas e incu-
Correspondiencia: badas a temperatura ambiente
Mara Jess Ayuso durante 30 min previo a la in-
Laboratorio de Farmacognosia. Dpto. Farmacologa. Facultad de Farmacia. yeccin. Los extractos fueron
Universidad de Sevilla.
el Profesor Garca Gonzlez, n02 ensayados a la concentracin
41012 Sevilla de 1 mg/ mL. El patrn fue
e-mail: ayuso@us.es vincristina.

CANARIAS MDICA YQUIRRGICA Enero-Abril 2004 . 19

Canarias Mdica y Quirrgica I Vol. 2 - N 4 - 2004
(%) Reduccin del
Extracto M eO H
P. majol' silvestre
Extracto MeOH
P. major cultivado
Vincristina
. ActIvIdad slgmficatlva es mdIcada cuando dos o mas ensayos mdependIentes muestran valores negativos, mayores
o iguales al 20% de inhibicin.
Efectos de los extractos metanlicos de P. major silvestre y cultivado en la unin al ADNI ARNt y en la
inhibicin de la tumorignesis en discos de patata
Tumorignesis en discos de patata
La tumorignesis sobre discos
de tubrculos de patata (Solanum
tuberosum) fue propuesto como un
sistema ideal para investigacin de
la transformacin de procesos ce-
lulares y es inducida por cadenas
especficas del ADN de la bacteria
Gram (-) Agrobacterium tumifa-
ciens(16). Este bioensayo fue realiza-
do siguiendo la tcnica descrita
por Ferrigni y cols. (17) y llevado a
cabo por mostrar buena correla-
cin con los ensayos en clulas tu-
morales animales(18).
Las muestras fueron preparadas
disolviendo 8 mg de cada uno de
los extractos metanlicos en 2 mL
de dimetilsulfxido (DMSO) est-
ril, y tras filtrado y dilucin, se mez-
claron con el cultivo bacteriano
para la inoculacin. Vincristina fue
utilizado como control positivo.
Lneas celulares humanas
- La citotoxicidad en las tres lne-
as tumorales humanas ensaya-
das , adenocarcinoma renal
(TK-10), adenocarcinoma de
mama (MCF-7), y melanoma
(UACC-62) fue determinada
siguiendo los protocolos esta-
blecidos por el Instituto
Nacional del Cancer, (NCI) (19).
Para el mantenimiento de las l-
neas celulares hay que conse-
guir el nmero apropiado de
clulas en fase logartmica de
crecimientd20)
La determinacin de la densi-
dad celular se realiz por la
tcnica de la sulforhodamina
B (SRB). Esta tcnica colori-
mtrica estima el nmero de
clulas de forma indirecta,
mediante tincin de las prote-
nas celulares totales, con el
20 . CANARIAS MDICA YQUIRRGICA . Mayo-Agosto 2004
(%)Reduccin del %
pico deADN pico de ARN,
99.6 % 7%
100 % 5%
75 % 75 %
Tabla 1
colorante SRB(1 9). Se calcula-
ron los parmetros CI50 (con-
centracin que produce un
50% de inhibicin del creci-
nlento celular), CTI (con-
centracin que produce una
inhibicin total del creci-
miento) y CL50 (concentra-
cin qu e causa un 50% de
muerte celular), de acuerdo
con lo s protocolos previa-
mente descritos(19). Al menos
dos experimentos indepen-
dientes se realizaron para cada
extracto, ensayando cinco
concentraciones (0.025, 0.25,
2.5,25 y 250 mg/ mL).
Resultados
En el extracto metanlico de P.
major obtenido por micropropa-
gacin, se detect la presencia de
flavonoides, cumarinas, triterpenos
e iridoides, el resto de los ensayos
en el estudio fitoqumico fueron
negativos.
Los resultados obtenidos en el
ensayo de la interaccin con el
ADN y ARNt, realizado por
HPLC, se muestran en la tabla 1,
donde se expresa el % de reduc-
cin del rea del pico correspon-
diente al ADN y ARNt libre.
Ambos extractos metanlicos in-
ducen un marcado descenso en el
rea del pico de ADN libre, indi-
cndonos que poseen compuestos
que han interaccionado con el
ADN, formando complejos que
eluyen a otro tR diferente.
Asimismo, en la tabla 1 se
muestran los resultados del % de
inhibicin de la induccin de tu-
mores en discos de p atatas produ-
cidos por los extractos en dos ex-
perimentos independientes. Se ob-
serva que el extracto metanlico
Inhibicin en
disco de patata'
19/ 13
50/ 33
20/25
de P.major cultivado, es ms activo
(50 / 33 %) que el extracto de la
planta silvestre (19/13 %).
Del documento, los autores. Digitalizacin realizada por ULPGC. Biblioteca universitaria, 2011
La actividad citotxica de los
extractos n1.etanlicos en las lneas
celulares TK-10, MCF-7 y
UACC-62, expresados como me-
dia SEM (n=2), figuran en la ta-
bla 2. El compuesto antitumoral,
etopsido, fue utilizado como con-
trol positivo en comparacin con
los extractos ensayados. Estos ex-
tractos mostraron actividad citot-
xica en dos de las tres lneas celula-
res a las dosis recomendadas por el
NCI (EEUU), siendo inactivos en
la lnea TK-10. El crecimiento de
la lnea UACC-62 fue inhibido to-
talmente por ambos extractos, sil-
vestre y cultivado, (CTI=112,5 y
223,5 mg/mL, respectivamente);
tambin mostraron total inhibicin
del crecimiento de la lnea MCF-7
(CTI=97 y 159,5 mg/ mL, respec-
tivamente) . En esta lnea celular,
ambos extractos producen una
muerte celular neta del 50%
(CL50) a las dosis de 207 y 193,5
mgl mL, respectivamente.
Los valores obtenidos para cada
extracto fueron comparados esta-
dsticamente (prueba t-Student,
doble cola) observando que no hay
diferencia significativa (p>0.05)
entre los resultados obtenidos para
los extractos en estudio.
Discusin
El conocinlento etnofarmaco-
lgico de las plantas es de gran uti-
lidad para la bsqueda de actividad.
Nuestros resultados demuestran el
efecto cito txico de los extractos
metanlicos de P. major (silvestre y
obtenido por micropropagacin).
Estos resultados prelinlnares pue-
den ser justificados por la presen-
 Glvez M.; LpezLzaro, M.; Navarro, E.; Mederos. S.; Martn-Cordero, C; Ayuso, M.J.

cia, en ambos extractos en estudio, Parmetros de TK-10 M CF- 7 UACC- 62

de t1avonoides e iridoides. Ryu 12 1\ inhibicina (mg/mL)
Le Bai1(22) y Post yVarma (23 ) , mostra-
ron que la flavona luteolina, genina C I50 >b 46,5 5,5 46,5 5,5
del hetersido mayoritario luteoli- Exto MeOH CTI > 97,5 11,5 112,5 12,5
na-7 -O- b- glu csido de Plantaga P. major silvestre * C L50 > 207 23 247 3
spp., posea actividad citotxica en
diferentes lneas celulares humanas C I50 > 87.5 52.5 61 11
como renal A-549, ovario SK-OV- Exto MeOH CTI > 159,5 90,5 223.5 26.5
3, mela noma SK-MEL-2, XF-498, P. major cultivado CL50 > 193,5 56,5 >
HCT15 , gstrica HGC-27, mama
MCF-7 y leucmica I2 1.23) . Similares C I50 c 9,95 0,08 0,87 0,21 1,13 0,21
resultados han sido establecidos por Etopsido CTI 52,4 0,4 > 13,3 2,4
Chowdhury y cols. (24) y Glvez y C L50 > > >
coIs. (21)) , al encontrar respectiva-
mente, que luteolina y luteolina b- * Datos publicados en (20).
glucsido, se comportan como ve- " Concentracin (mg/mL) necesaria para inhibir el crecilTliento celular en un 50% (CI50);
nenos de topoisomerasa 1, contri- para producir inhibicin total de crecimi ento (CTI) y para inducir 50% de la muerte ce-
buyendo a este potencial efecto ci- lular (CL50) .
b > indica que no se ha observado actividad a la dosis mxima ensayada (250 mg/mL en el caso
totxico.

Lee y cols Y5\ ITIOstraron que,
iridoides como aucubina y su ge-
nina, posean actividad antitumoral
al inhibir las enzimas ADN y ARN
polimerasas en clulas Hep G2, e
interaccionar con el ADN. Todo lo
expuesto nos sugiere qu e esta rela-
cin estructura qumica-actividad
farmacolgica, pudiera ser aplicada
a nuestro estudio.
Por tanto, en nuestras condicio-
nes experimentales, es evidente
que el cultivo por micropropaga-
ci n de P majar proporciona una
alternativa til a la propagacin por
Del documento, los autores. Digitalizacin realizada por ULPGC. Biblioteca universitaria, 2011
de los extractos y 100 mM para etopsido)
, Los valores de inhibicin de etopsido estn expresados en mM.
Tabla 2
Actividad citotxica de los extractos metanlicos de P. major silvestre y
cultivado frente a tres lneas tumorales humanas, expresados como me-
dia SEM (n =2).
semillas, y permite obtener un ex- Agradecimientos
tracto estandarizado que no pierde Agradecemos al Instituto N a-
la actividad antitumoral de la plan- cional del Cancer (NCI), EEU U,
ta silvestre, y admite la posibilidad por proporcionar generosam ente
de realizar una multiplicacin a las lneas tumorales utilizadas en la
gran escala. presente investigacin.

B IBLIOGRAFA

1. Mann J.: Natural Products in Cancer C hemotherapy: Past,
Prese nt and Future. Nature R ev. 2002; 2:143-148.
2. Bza nger-Beauquesne L, Pinkas M, Torch M , Trotin F. Plantes
Medicinales des Rgions Tempres. Paris. Maloine., 1990.
3. Duke JA. Handbook of Medicinal H erbs. Florida. CRC Press,
1986.
4. Ja n J. Man ual de Medicina Popular Ca nar ia . Tenerife. Centro
de la C ultura Popular Canaria., 1992.
5. Ja n J. Hierbas Medicinales de Canarias . Gran Canaria. Caja de
Canarias, 1993.
6. Montes M, WiJkomirski T. M edicina Tradicional Chilena.
Concepcin. Universidad de La Concepcin., 1985.
7. Paris RR , Moyse H . Precis de Matiere Medicale. Paris.
Masson, 1971.
8. Schmeda-Hirschmann G, Loyola J I, Sierra J, R etamal L,
Rodrgu ez J.: Hypotensive Effect and Enzyme Inhibition
Activity of Mapuche Medicinal Plam Extracts. Phytother.Res.
1992; 6: 184-188.
9. Fernndez M, Nieto A. Plantas Medicinales. Pamplona. Eunsa,
1982.
10. Kawashty SA, Gamal ED,Abdalla ME, Saleh NAM.: Flavonoids of
Plantago Species in Egypt. Biochem.System.Ecol. 1994; 22:729-
733.
11. Mederos- Molina S.: Cultivo in Vitro De pices Caulinares D e
Plantago Major L. Llantn. Proceedings 1I Jornadas Ibricas de
Plantas Medicinales, Arom ticas y de Aceites
Esenciales.Lisboa.Portugal 1991 .
12. Bruneton j. Farmacognosia. Fitoqumica. Plantas medicinales.
2 ed. Acribia S.A. Zaragoza, 2001.
13. Ca bo-Torres J, Pardo P. Prcticas de Far macognosia y
Farmacodinamia . Granada. Grficas del Sur, 1974.
14. Dominguez XA. Mtodos de Investigacin Fitoqumica.
M xico. Limusa., 1973.
15. Pezzuto JM, Che CT, McPherson DD, Zhu JP, Topcu G,
Erdelmeier CA, Cordel! GA. : DNA As an Affinity Probe
Useful in the Detection and Isolation of Biologically Active
N atural Compounds.j.Nat.Prod. 1991; 54:1522-1530 .
16. Anand VK, Heberlein GT.: Crown-Gal! Tumorigenesis in
Potato Tumor Tissue. Am.j.Bot. 1977; 64: 153-158.
17 . Ferrigni NR, Putnam JE, Anderson B, Jacobsen LB, Nichols
DE, Moore DS, McLaughlin JL.: Modifica tion and Evaluation
of the Potato Disc Assay and Amitumor Screening of
Euphorbiaceae Seeds. j.Nat.Prod. 1982; 45:679-686 .
18. Galsky AG, Wilsey JP, Powel! RG.: Crow Gall Tumor Bioassay.
A Possible Aid in the D etection of Compounds With
Antitumoral Activity. Plant Physiol. 1980; 65:184-185.
19. Monks A, Scudeiro D, Skehan P, Shoemaker R , Paull K,Vistica
D, Hose C, Langley J, Cronise P, Vaigro-Wolff A, Gray-
Goodrich M, Campbell H, Mayo J, Boyd M.: Feasibility of a
High- Flux Anticancer Drug Screen Using a Diverse of Panel

CANARIAS MDICA YQUIRRGICA . Mayo-Agosto 2004 . 21

CanariasMdica y Quirrgica I Vol. 2 - N 4 - 2004
of C ultured Human Tumor Cell Lines. J.Nat.Can cer lnst.
1991; 83 :757-766.
20. Glvez M , Martn-Cordero C, Lpez-Lzaro M , Corts F,
Ayuso MJ.: Cytotoxic Effect of Plantago spp. on Cancer Cell
Lines.] Ethnopharmacol. 2003; 88 :125-130.
21. Ryu SY, Choi SU, Lee ca, Lee SH , Ahn Jw, Zee O P.:
Antitumor Activity of Some Phenolic Components in Plants.
Arch.PharmacoI.Res. 1994; 17:42-44.
22. Le Bail ]C, Varnat F, Nicolas j C, Habrioux G.: Estrogenic and
Antiprolifera tive Activiti es on M C F- 7 Human Breast Ca ncer
Cells bv Flavo noids. Can cer Lett. 1998; 130:209-216.
22 . CANARIAS MDICA YQUIRRGICA . Mayo-Agosto 2004
23. Pos t ]FM, Varma RS .: Growth lnhibitory Effects of
Bioflavonoids and Related Compounds on Human Lellkel11ic
CEM-C1 and CEM-C7 Cells. Cancer Lett. 1992; 67:207-213 .
24. C howdhury AR, Sharm a S, Madal S, Goswami A,
MlIkhopadhayay S, Majllmder HK.: Luteolin, an Emerging
Anti- Cance r Flavonoid, Poiso ns E lI ka ryotic DNA
Topoisomerase 1-. Biochel11 J. 2002; 366:653-661.
25. Lee DH, C ho IG, Park MS, Kim KN, C hang 1M , Mar W c.:
Stlldies on th e Possible Mechanism of Protective Activity
Against a-Amanitina Poisoning by AlIcubi n. Archi eves of
Pharmacal R esearch 2001; 24(1): 55-63.
Del documento, los autores. Digitalizacin realizada por ULPGC. Biblioteca universitaria, 2011