Evaluacin de un medio de cultivo para el

aislamiento de dermatofitos a partir de uas

Raga Ariel J; Druetta Silvina del V; Fraenza Laura B

Hospital Nacional de Clnicas, Laboratorio Central, Servicio de Micologa.

Santa Rosa 1564, Ciudad de Crdoba (C.P.5000).

micologiahnc@hotmail.com

1
RESUMEN

En el Laboratorio de Micologa del Hospital Nacional de Clnicas (Ciudad de

Crdoba) se formul un medio de cultivo especfico para el aislamiento de hongos

dermatofitos. Se denomin DTM 50% y surgi a partir de modificaciones del medio

DTM propuesto por Taplin. Se evalu la probabilidad de aislamiento de dermatofitos a

partir de uas de pie, efectuando una comparacin entre ambos medios.

Concluimos que, el medio de cultivo DTM 50% si bien brinda una mayor

probabilidad de recuperacin de hongos dermatofitos a partir de uas de pie comparable

con DTM, es ms permisivo para el desarrollo de hongos no dermatofitos.

Palabras clave: DTM, DTM 50%, onicomicosis, dermatofitos.

INTRODUCCIN

Las micosis superficiales son una de las patologas ms frecuentes de consulta

dermatolgica. La mayora de estas enfermedades cutneas son infecciones producidas

por el parasitismo fngico de los tejidos queratinizados como la piel y sus faneras, tanto

del ser humano como de animales (1). Los principales agentes causales son un grupo

homogneo de hongos queratinoflicos denominados dermatofitos, constituido por

tres gneros: Trichophyton, Microsporum y Epidermophyton (1). Pueden identificarse

por sus caractersticas macro y micro morfolgicas estudiadas sobre medios de cultivo

especficos y por el uso de pruebas bioqumicas (1,2,3).

El Dermatophyte test medium (DTM) formulado por Taplin en 1969 (4) es el

medio comnmente empleado para aislamiento e identificacin presuntiva de

dermatofitos. Contiene antibiticos para impedir el desarrollo de bacterias y

cicloheximida, antifngico que inhibe el crecimiento de la mayora de hongos miceliales

2
y levaduras saprfitas que pueden estar presentes en la muestra (1,5,6). Adicionalmente

incluye rojo fenol como indicador de pH, el cual vira de amarillo a rojo en presencia de

hongos dermatofitos, debido a que generan metabolitos alcalinos (6,9). Aunque su costo

es elevado, es til para primo aislamiento ya que, por sus caractersticas, permite un

mayor porcentaje de recuperacin de dichos hongos en comparacin a lo obtenido con

medios de cultivo convencionales (6).

Se han propuesto algunos medios de cultivo que, en comparacin a DTM,

brinden una mayor probabilidad de aislamiento de dermatofitos (9,10,11). La falta de

estudios registrados en los ltimos aos en la Ciudad de Crdoba motiv a nuestra

investigacin.
El objetivo de nuestro trabajo fue formular un medio de cultivo especfico para

dermatofitos y evaluar la probabilidad de aislamiento de estos hongos a partir de uas

de pie, comparndolo con DTM.

MATERIALES Y MTODOS

Medios de cultivo
Se prepar DTM segn Taplin (4) y el medio de cultivo a ensayar, al que se

denomin DTM 50%. Los componentes de este ltimo fueron los mismos que para

DTM pero se modificaron las concentraciones (Tabla 1).

Ambos medios de cultivo se esterilizaron en autoclave a 120C (1 atmsfera de

presin) durante 10 minutos. Luego se dispensaron en placas de Petri descartables de 50

x 12 mm, procurando alcanzar un espesor de capa de agar que oscile alrededor de los

6mm (aproximadamente 6 ml).

Tabla 1: componentes de DTM y DTM 50%.

DTM DTM 50%

Peptona de Soja 10g 5g

3
Cicloheximida 0.5g 0.25g

Glucosa 10g 5g

Sulfato de gentamicina 100ug/ml 50ug/ml

Clortetraciclina 100ug/ml 50ug/ml

Rojo fenol 0.5% 40ml 20ml

Agar/agar 20g 20g

Agua destilada c.s.p. 1000ml 1000ml

pH 5,5 5,5

Para las pruebas bioqumicas que formaron parte de la identificacin de los

hongos aislados se utiliz agar papa glucosado (Britania) para estimular la fructificacin

y agar urea de Christensen (Britania), con el que se realiz el test de produccin de

ureasa.

Preparacin y toma de muestras

En el Servicio de Micologa perteneciente al Laboratorio Central del Hospital

Nacional de Clnicas durante el periodo Octubre 2010- Mayo 2011, se recolectaron 108

muestras de uas de pie provenientes de pacientes de entre 15 a 65 aos de edad. Se

instruy a los pacientes para evitar la contaminacin de las mismas: se les indic

suspender la medicacin antifngica durante un lapso no inferior a siete das, suspender

uso de pomadas, talcos, tinturas y lacas, y por ltimo, lavar la/las uas afectadas con

jabn blanco no perfumado tres veces por da durante tres das previos a la toma de

muestra.
Previa desinfeccin con alcohol 70% de la zona afectada, se efectuaron los

raspados con hoja de bistur nmero 22, recolectando en portaobjeto o cpsula de Petri

estriles.

Procesamiento de las muestras

4
 Para el examen microscpico directo (EMD) se tom una fraccin de escamas

que fueron tratadas con hidrxido de potasio al 40% y calor, para facilitar la

visualizacin del hongo.

La totalidad de las muestras fueron sembradas en DTM y DTM 50%, se

incubaron a 28C durante 20 das. Los cultivos fueron revisados diariamente durante

dicho perodo.
La identificacin de gnero y especie fue realizada por observacin de

caractersticas macro y micro morfolgicas, y aplicacin del test de ureasa para

diferenciar las colonias de Trichophyton mentagrophytes de las colonias de

Trichophyton rubrum, siendo el test positivo slo para el primero.

Las colonias que no fructificaron en DTM y DTM 50% se repicaron en agar

papa glucosado.

Interpretacin de resultados
Tanto en DTM como en DTM 50%, se consideraron cultivos positivos para

dermatofitos a las placas que presentaron desarrollo de colonias de hongos filamentosos

hialinos con viraje del indicador del color amarillo al rojo y EMD previo positivo, con

presencia de hifas hialinas tabicadas o artrosporadas, compatibles con dermatofitos. Se

reportaron como negativas las placas que no presentaron desarrollo de dichas colonias

trascurrido el tiempo de incubacin, previa correlacin con lo observado en el EMD.

Anlisis estadstico
Se utiliz el programa SPSS versin 15.0 para el anlisis estadstico de los datos.

Se aplic la prueba Chi-cuadrado () de Pearson, trabajando con niveles de confianza

entre el 95% y 99%, siendo el valor de Chi crtico para 1 grado de libertad

respectivamente =3.84 y =6.64.

RESULTADOS

De las 108 muestras recolectadas slo en 65 (60.2%) se observ presencia de

hifas hialinas tabicadas o artrosporadas, compatibles con dermatofitos (Fig.1). A partir

5
de estas 65 muestras con EMD positivo se obtuvo desarrollo de hongos dermatofitos en

el 61,5% de las sembradas en DTM 50% y el 46,2% en DTM. Los aislamientos de

hongos dermatofitos en ambos medios de cultivo correspondieron a: Trichophyton

rubrum 60.0%, Trichophyton mentagrophytes 30.0% y Trichophyton spp. 10.0%.

Se repicaron en agar papa glucosado 15 colonias que desarrollaron sin

fructificacin en DTM ni DTM 50%, asimismo 7 de las mismas no fructificaron y se

clasificaron como Trichophyton spp.

Fig.1. EMD de material extrado

de ua de pie. Se observan hifas
artrosporadas compatibles con
dermatofitosis.
En todas las muestras con EMD negativo no hubo desarrollo de hongos

dermatofitos tanto en DTM como en DTM 50%, pero en algunos casos s hubo

desarrollo de hongos no dermatofitos.

Del total de las 108 muestras sembradas en DTM y DTM 50%, 21 (19.4%) y 39

(36.1%) respectivamente, desarrollaron hongos no dermatofitos de los gneros

Candida, Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Acremonium y hongos dematiceos, cuya

identificacin escapaba a los objetivos de este trabajo. Adems, se observ viraje del

indicador en 6 casos de los desarrollados en DTM y en 15 de los desarrollados en DTM

50%.
No se obtuvo una diferencia estadsticamente significativa en cuanto a la

posibilidad de que DTM 50% brindara una mayor probabilidad de aislamiento de

dermatofitos que DTM (experimental=3,09). Si hubo una diferencia estadsticamente

significativa (experimental=7.48) en cuanto al desarrollo de hongos no dermatofitos

en DTM 50% versus DTM.

DISCUSIN Y CONCLUSIONES

6
 Las onicomicosis son consideradas como las micosis superficiales ms difciles

de diagnosticar (5,12,13), ya que estn sujetas a diferentes variantes, que van desde las

condiciones higinicas y medidas adoptadas por el paciente antes de la toma de muestra,

hasta las dificultades que se presentan en el laboratorio, como la obtencin de una

muestra ptima que permita identificar las hifas en el EMD, la calidad de la muestra que

permita el desarrollo de colonias puras del agente causal y la utilizacin de medios

selectivos para el aislamiento de patgenos especficos como los dermatofitos. Cabe

mencionar que dichos medios de cultivo presentan un elevado costo comercial, por eso

es que DTM 50% fue formulado con menores concentraciones de los componentes

propuestos por Taplin (4), con el propsito de reducir el costo de su preparacin.

La visualizacin de estructuras compatibles con dermatofitos en el EMD arroja

un diagnstico presuntivo debido a su carcter de patgeno primario en onicomicosis

(1,3,14). Segn algunas publicaciones, slo resultan positivos los cultivos en el 50-70%

de los EMD positivos ungueales (3,14,15,16), sin embargo, Singh y cols informaron

haber alcanzado porcentajes superiores al 85% (17). En nuestro estudio el porcentaje

obtenido a partir de DTM 50% no es superior a lo informado por Singh (17), pero se

ubica dentro del 50-70% reportado por otros (3,14,15,16) y adems fue superior a lo

obtenido a partir de DTM.

En la bibliografa se reporta a Trichophyton rubrum y Trichophyton

mentagrophytes como los hongos aislados con mayor frecuencia a partir de escamas de

uas de pie (3,6,12,13,15,18,19). En nuestro trabajo se obtuvo una frecuencia similar

tanto a partir de DTM como de DTM 50%, ya que, del 100% de dermatofitos aislados

en uas de pie, un 60% correspondi a Trichophyton rubrum, lo cual concuerda con el

63% informado por Rich y cols (6). Por otro lado, se aisl Trichophyton

mentagrophytes en un 30%, siendo mayor al 7% informado en el estudio antes

7
mencionado. La diferencia podra deberse simplemente a variaciones de tipo

epidemiolgicas y no relacionadas al medio de cultivo.

Hubo colonias de dermatofitos que desarrollaron sin fructificacin en DTM ni

DTM 50%, y a pesar de repicarse en agar papa glucosado no fructificaron, por lo que, al

no observarse las estructuras micro morfolgicas caractersticas de los hongos y no

disponer de otras vas de identificacin en nuestro laboratorio, se clasificaron como

Trichophyton spp. Consideramos que fue producto de las propiedades intrnsecas de los

hongos, ya que las colonias se comportaron de igual manera en ambos medios.

En ninguna muestra con EMD negativo hubo desarrollo de hongos dermatofitos

tanto en DTM como en DTM 50%. Esto no concuerda con el estudio realizado por

Nazar y cols (19) donde se informa lo contrario. Esta diferencia se debera a una

variable aleatoria difcil de controlar como es la presencia de estructuras fngicas en la

fraccin de escamas utilizadas para el EMD.

En publicaciones referidas a onicomicosis por dermatofitos y por hongos no

dermatofitos, muchos investigadores analizaron la utilidad de DTM y proponen que la

concentracin de cicloheximida que compone el medio de cultivo no garantiza la

inhibicin del desarrollo de hongos no dermatofitos, ya sean saprfitos o patgenos,

incluso muchos de ellos son capaces de inducir cambios en el color del medio de cultivo

(9,11,12,19,22). En consecuencia, el proceso de recuperacin e identificacin de

dermatofitos se ve afectado a partir del primo aislamiento en DTM. En nuestro trabajo

fue mayor el porcentaje de desarrollo de hongos no dermatofitos en DTM 50% que en

DTM, muy probablemente debido a la reduccin de concentracin de cicloheximida que

se us en DTM 50%. Es de destacar que esto no redund en un diagnstico errado, ya

que los hongos dermatofitos poseen caractersticas micro y macro morfolgicas

diferenciales. A partir de estos hallazgos pueden surgir nuevos estudios comparativos

que evalen la concentracin de cicloheximida en el medio de cultivo.

8
 Concluimos que el medio de cultivo DTM 50% brinda una elevada probabilidad

de recuperacin de hongos dermatofitos a partir de uas, comparable a DTM, siendo til

en el diagnstico de dermatofitosis en uas de pie. Debido a la reduccin de

concentracin de algunos componentes, resulta ms econmico que DTM.

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