Seminario Laboratorio de quimica organica: cromatografa en capa delgada.

INTRODUCCIN
Qu es cromatografa en capa delgada?
Podemos definir la cromatografa como una tcnica analtica rpida y sencilla, muy
utilizada en los laboratorios de qumica orgnica. Esta cromatografa permite:

Determinar el grado de pureza de un compuesto.

Comparar muestras de dos sustancias a partir de su desplazamiento a travs
de la placa.
Realizar el seguimiento de una reaccin

Fundamentos
Las separaciones en capa delgada se producen por diferentes fenmenos que
dependen de la clase de sorbente utilizado y del grado de humedad en que
se encuentra. Dado que los sorbentes tienen diferentes reas superficiales,
suelen presentarse fenmenos de adsorcin en sorbentes de gran
superficie, si la humedad es mnima; o de lo contrario, pueden presentarse
fenmenos de reparto si la humedad aumenta.
En las ltimas dcadas se han desarrollado sorbentes y cmaras para la
cromatografa en capa delgada que permiten un mayor control sobre los
parmetros del proceso.
La cromatografa en capa delgada es usada en el anlisis y estudio de
sustancias disponibles en pequeas cantidades: Flavonoides, principios
activos, esteroides, aminocidos, residuos de sustancia txicas en alimentos,
alucingenos en sangre, etc.
MATERIALES Y EQUIPO
La fase estacionaria de este tipo de cromatografa est constituida por placas.

A. PLACAS: Conjunto del soporte y del sorbente. Este ltimo extendido

homogneamente sobre el anterior. Las placas pueden:
i. Ser preparadas en el laboratorio: En dado caso se utilizarn
extendedores de la suspensin de sorbente, como los
extendedores Camac o Desaga. Resulta ms econmico.
ii. Ser adquiridas en el comercio.
iii.
B. SOPORTES: El material de soporte debe ser resistente a la accin de los
solventes y a los cambios de temperatura. El vidrio es el que satisface mejor
las condiciones, aun cuando tambin se usan lminas de plsticos (Polietileno
tereftalato) o de Aluminio.

C. SORBENTES: Estn comprendidos todos los materiales que se emplean como

fase estacionaria:
Adsorbentes
Geles de filtracin
Intercambiadores de iones
Adsorbentes para reparto
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Cromatografa de fase invertida.

o Indicadores para luz Ultra violeta en sorbentes: Los indicadores permiten
localizar algunos de los compuestos separados, a partir de la produccin
de una intensa fluorescencia cuando se exciten con la luz U.V a ciertas
longitudes de onda.
o Los sorbentes ms usados son:
GEL DE SLICE: cido silcico precipitado. Partculas que oscilan
entre los 5 y 25 mm. Tienen la capacidad de perder o adquirir agua;
por lo cual se pueden emplear en la cromatografa de adsorcin
para la separacin de compuestos no polares o en la de reparto
para la separacin de compuestos polares.
ALMINA: La almina u xido de aluminio es menos inerte que el
gel de slice; presenta reaccin alcalina, la cual puede conducir a
descomposicin o trasposicin de los compuestos de la muestra
durante la aplicacin o el desarrollo.
CELULOSA: Este sorbente tiene gran capacidad de absorcin de
agua, el fenmeno que predomina en las separaciones es el reparto
y, por lo tanto, es muy eficiente en la separacin de compuestos
hidroflicos.
KIESELGUHR: Tierra de diatomeas o de infusorios, est formado
por caparazones de algas marinas microscpicas llamadas
diatomeas, que en su mayora estn compuestos por frstulas
(compuestos silcicos) caracterizados por su amplia rea superficial,
lo que los hace especiales para el fenmeno de reparto en las
cromatografas de capa delgada y en columna
POLIAMIDA: Compuesto preparados a partir del Nylon. Las
separaciones en poliamidas se producen, principalmente por
diferencias en las fuerzas de los enlaces de hidrgeno entre el
polmero y los grupos hidroxilo o carboxilo de los compuestos que
se van a separar.
GELES DE FILTRACIN O TAMICES MOLECULARES: Geles de
dextrano, poliacrilamida o de agarosa, de los cuales el sephadex es
el ms utilizado. Separacin de aminocidos, oligopptidos y
protenas.
OTROS SORVENTES:
Carbn activado: separacin de antibiticos
Polvo de polietileno, sus steres metlicos y la urea para la
separacin de cidos grasos.
Poliacrilamida
Poli (N-acetilacrilamida)
Poliacrilonitrilo: separacin de compuestos solubles en agua.
D. SOLVENTES: Sern clasificados teniendo en cuenta su:
a. Fuerza o polaridad: SERIES ELUOTRPICAS (Tabulacin de
eluyentes en orden creciente de polaridad.
b. Selectividad.

E. ADHESIVOS O AGLUTINANTES: Permiten que el adsorbente se adhieran

bien al soporte, con lo cual la placa se puede manejar fcilmente durante la
cromatografa.
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F. CMARAS: En esta cromatografa se utilizan cmaras para los desarrollos

ascendentes, horizontal y circular.
Son generalmente de vidrio, pero en algunos casos se pueden fabricar parcial
o totalmente de metal o de plstico. El tamao de las cmaras debe ser
proporcional al de las placas, de manera que stas puedan entrar y salir
fcilmente de la cmara, pero sin espacio excesivo, ya que la saturacin de
los vapores del solvente se realiza mejor cuanto menor sea el volumen de la
cmara.

METODOLOGIA
Preparacin y aplicacin de la muestra
Antes de empezar la cromatografa la muestra requiere varios tratamientos previos.
Si es slida se subdivide, ya sea por molienda o pulverizacin y luego se
homogeniza. Los compuestos orgnicos se extraen con un solvente de punto de
ebullicin bajo y el extracto generalmente se concentra. Adems para contribuir en
un buen cromatograma conviene sembrar una cantidad adecuada. Si se aplica
demasiado, las manchas sern alargadas, en forma de lgrimas, que hacen dudar si
corresponden a uno o ms compuestos y si se siembra muy poco las manchas no
sern perceptibles.
Para determinar la cantidad adecuada de muestra se acostumbra a utilizar el
siguiente ensayo in situ: en un papel pequeo o en una placa portaobjetos, se
aplica con un capilar 1, 2, 5 etc. Micro litros de la solucin problema; despus de
secar se revela, si es necesario, y se selecciona la cantidad que ha producido
mancha ntida e intensa.
Cantidad de muestra que debe aplicarse
La cantidad mnima de muestra est determinada por la sensibilidad de la reaccin
de deteccin y el lmite superior depende de la clase de sustancia. Las soluciones se
preparan en concentraciones del 0.1 al 1%. Si no se conocen la concentracin de la
solucin, se debe hacer un ensayo preliminar para determinar la cantidad
apropiada; si la solucin est muy concentrada las manchas no sern ntidas ni
redondeadas.
Aplicacin de la muestra
Al aplicar la muestra se debe tener en cuenta que el solvente en el cual se disuelve
debe ser fcil de remover de la placa despus de su aplicacin; es decir, que no
tenga un punto de ebullicin demasiado alto ni sea muy polar. La concentracin de
la muestra debe oscilar entre 0,01 y 1 %
Por otra parte la separacin de los compuestos se observa mejor cuando la muestra
se aplica en la placa en forma de banda, que cuando se efecta en forma de gota
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porque las sustancias separadas se alargan ms sobre el eje horizontal que sobre el
eje vertical, como sucede cuando se aplica por gotas. As se evita la formacin de
colas o estelas que impiden determinar bien el nmero de compuestos. Las zonas
de concentracin tienen generalmente un ancho de 2,5 cm en las placas
analticas y 4 cm en las placas preparativas.
Desarrollo
En cuanto al desarrollo, para favorecer la saturacin de las cmaras se acostumbra
a recubrir el interior de estas con papel de filtro, antes de colocar las placas para
realizar el desarrollo.
El desarrollo que se suele usar para este tipo de cromatografa se llama ascendente.
En este desarrollo el solvente se coloca en la parte inferior de la cmara y el papel
se sumerge en el solvente por el extremo prximo al origen, teniendo en cuenta
que la muestra no quede sumergida porque se disuelve en el solvente.
Otro tipo de desarrollo es el desarrollo por elucin con gradientes, el cual se va
variando la fase mvil por etapas o continuamente en su composicin o en su valor
de pH. Este desarrollo es til para la separacin de lpidos
Secado
Despus de efectuado el desarrollo, se saca el papel o la placa de la cmara, se
marca con lpiz el frente del solvente y se seca en la vitrina extractora, con la
ayuda de un secador de cabello, en frio si el sistema de solventes es voltil y en
caliente si no lo es; tambin puede emplearse la estufa para el secado.
Visualizacin de las manchas
Cuando se ha realizado la separacin es necesario localizar las sustancias en el
papel o placa por medio de mtodos fsicos, qumicos, o biolgicos, operacin
llamada revelado.
Los mtodos fsicos se basan en algunas propiedades particulares de los
compuestos como fluorescencia o radioactividad.
Los mtodos qumicos son los ms utilizados y consisten en emplear reactivos que
den productos coloreados o fluorescentes con los compuestos analizados, ejemplo:
los aminocidos se revelan con solucin de ninhidrina que produce, generalmente,
coloracin azul violeta con ellos. Estos se llaman reveladores especficos.
Los mtodos biolgicos para localizar sustancias en los cromatogramas emplean
propiedades tales como estimulacin o inhibicin del crecimiento de
microorganismos; por ejemplo, los antibiticos se localizan por la inhibicin del
crecimiento de microorganismo sensible al antibitico problema.
Calculo de los valores Rf Y Rx
Como las manchas correspondientes a los compuestos obtenidos despus del
revelado se pueden decolorar por accin de la luz, lo ms indicado tan pronto se
revela y seca el solvente, es medir las distancias de origen al centro de las manchas
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y del origen al frente del solvente, para calcular los valores Rf o Rx, para
compararlos con los de los patrones o tenerlos de referencia.
El clculo del valor Rx es conveniente si se tiene en cuenta que el valor de Rf es
difcil de reproducir y adems, en ocasiones, el frente del solvente no se determina.
Seleccin del sorbente y solvente
En primer lugar se deben tener en cuenta las propiedades fisicoqumicas de los
compuestos que constituyen la mezcla, ya que estos, el sorbente y el eluyente,
actan recprocamente. Las fuerzas impulsoras de la fase mvil como capilaridad o
gravedad interactan con otras fuerzas como las de Van der Waals o las que
intervienen en la formacin de puentes de hidrogeno para producir una rata de
migracin caracterstica para cada compuesto.
En general para la separacin de mezclas lipoflicas se emplea gel de slice, para la
separacin de mexclas hidroflicas se obtienen buenos resultados con celulosa, las
mezclas acidas se separan bien en gel de slice, las bsicas en almina, las neutras
en gel de slice o celulosa. Las mezclas inicas se separan bien en intercambiadores
inicos.
Que es sorbente y que es solvente?
Que es eluyente?

Cromatografa en capa delgada de alta eficiencia

Mediante esta cromatografa es posible obtener las siguientes ventajas:
- Separar hasta cuarenta sustancias en un solo recorrido
- En el analisis cualitativo se pueden obtener valores de Rf exactos, con una
desviacin estndar del ms o menos 1%
- En el analisis cuantitativo se alcanzan desviaciones estndar relativas del
ms o menos 2,3%
Cromatografa cuantitativa
- La muestra debe estar libre de interferencias, tales como los iones, en la
determinacin de azcares.
- El solvente empleado para preparar las soluciones del problema y los
patrones referencia debe ser poco voltil, con el fin de evitar la concentracin
de las mismas
- Las muestras se aplican con micro pipetas, en volmenes exactamente
medidos, de manera uniforme y ocupando un circulo lo ms pequeo posible.
- Escoger un sistema de eluyente que produzca manchas redondeadas,
evitando metanol y etanol en concentraciones mayores del 10%
- Emplear cantidad suficiente de revelador con el fin de alcanzar a reaccionar
con la totalidad de los compuestos a analizar y aplicndolo uniformemente, lo
cual se obtienen mejor con la tcnica de inmersin que con la de aspersin.
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- Despus de efectuado el desarrollo, los papeles o placas deben permanecer

horizontalmente, mientras se evapora el exceso de eluyente y se seca el
solvente del revelador, lo cual favorece la homogeneidad de las manchas.
Cromatografa Preparativa
- Esta utiliza placas de mayor espesor que las utilizadas en el trabajo analtico:
oscilan entre 500mm (0,5 mm) y 2000 mm (2.0 mm).
- Hay mayor reproducibilidad de las condiciones de las placas empleadas en la
cromatografa preparativa, en tanto que las separaciones son ms ntidas
porque el tamao de las partculas es menor y las bandas pueden eluirse ms
rpidamente.
- Para obtener los compuestos separados en una placa preparativa se puede
proceder de varias maneras. La ms usada es raspar con una esptula la
zona que contiene cada compuesto, transferir a un tubo pequeo; luego,
efectuar dos o ms extracciones con un solvente polar, agitando y
centrifugando cada vez, pipetear cuidadosamente el sobrenadante y
evaporar el solvente.
Cromatografa Centrfuga
- Cromatografa preparativa de disco rodante
- En el cromatotrn, la suspensin del sorbente se vierte sobre un plano
circular inclinado, sobre el cul se coloca un dispositivo que permite
emparejar el sorbente a diferentes espesores. La muestra puede aplicarse
sobre la placa hmeda o seca y la elucin puede realizarse con solvente de
composicin constante o por gradiente, por accin de la fuerza centrfuga.
- Ofrece algunas ventajas sobre la preparativa en placa clsica, tales como la
aceleracin del flujo de la fase mvil, por accin de la fuerza centrfuga y la
obtencin de compuestos ms puros, libres de fase estacionaria. La elucin
produce bandas concntricas y en la periferia se colectan las fracciones.
APLICACIN DE LOS RESULTADOS DE LA CROMATOGRAFA EN CAPA
DELGADA A LAS SEPARACIONES EN CROMATOGRAFA DE COLUMNA.
- A partir de esta cromatografa se pueden establecer algunos parmetros para
la cromatografa en columna, gracias a la rapidez, escaso consumo de
eluyentes y eficiencia en las separaciones obtenidas en cromatografa en
capa delgada.
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