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01/09/2004
INTRODUCCION
Las bacterias son microorganismos unicelulares sencillas, que diferencia de las clulas
humanas carecen de organelos intracelulares recubiertos de membrana, como el ncleo,
por lo que sus actividades fundamentales se realizan dentro del citoplasma y la cubierta
de las mismas. En general las bacterias que carecen de ncleo verdadero se clasifican
como procariotas.
- OBJETIVO GENERAL:
- OBJETIVOS ESPECFICOS:
Las bacterias son los organismos unicelulares ms pequeos capaces de duplicarse por
si solos a expensas del medio que les rodea. Las bacterias se caracterizan porque
carecen de organelos intracelulares recubiertos de membrana y las actividades
fundamentales de metabolismo y biosntesis son realizadas dentro del citoplasma y de la
cubierta celular.
Por lo general cada bacteria de nombra por su gnero y especie, y en algunos casos las
bacterias de subdividen en estereotipos y subespecies conforme a los antgenos
superficiales, su capacidad para causar estados de enfermedad con los cuales se
relacionan en forma nica o por sus caractersticas metablicas o biosintticas.
2. Frotis Teido: el estudio del frotis fijado y teido es de gran utilidad, ya que permite
determinar la forma, tamao, disposicin, formacin de esporas, ubicacin, nmero de
flagelos y la composicin de la pared celular, por su comportamiento frente a las
coloraciones de Gram o Zielh- Neelsen. La clula bacteriana se tie fcilmente con
colorantes bsicos como el cristal violeta, azul de metileno y Fucsina bsica, pero se
tie pobremente, con colorantes cidos como la eosina, esto se debe al carcter cido
del protoplasma de la clula.
- Montaje en fresco
- Frotis
- Coloraciones o tinciones.
Aplicacin de la
Portaobjetos
Muestra y cubreobjetos
Anotaciones
Para realizar un montaje en fresco se toma una muestra de agua sucia estancada, se
aplica sobre un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos para su posterior
observacin con el objetivo 10X y 40X. Finalmente se analiza y reporta lo observado.
2.2 FROTIS Y COLORACIONES
Amgdalas,
Obtencin de Muestra Bajalenguas
Escobilln
Aplicacin de
la Muestra Portaobjetos
Secado T Ambiente
Secado T Ambiente
Objetivo de
Observacin Inmersin.
Anotaciones
El frotis de secrecin faringea requiere de una muestra obtenida de la parte interna de la
boca usando bajalenguas y escobilln para luego ser aplicada en un portaobjeto
dejndola secar a temperatura ambiente y luego fijarse con calor.
Aplicacin de Mezclado de
la muestra La muestra
Extensin Extensin
Fijacin Fijacin
3 veces por calor
Enfriamiento Enfriamiento
TINCION DE GRAM
Para realizar frotis a partir de cultivos bacterianos se debe esterilizar un asa redonda (m.
lquido), o en punta (m. slido), colocar la muestra en el portaobjetos (debidamente
marcado) , bien sea directamente o diluido en soluciones salinas para el caso del medio
slido. Posteriormente se seca al aire libre, se fija por calor, se enfra para luego teir
Gram.
- Tincin de Gram.
TINCIN DE GRAM
Lugol 1 min.
Secado T Ambiente
Observacin Objetivo de
inmersin
Anotaciones
La tincin de Gram emplea 1 ml de cristal violeta, un lavado con agua destilada, luego se
adiciona Lugol por un minuto, se lava con agua destilada, se decolora con alcohol
acetona durante 14 segundos, se lava con agua destilada, se adiciona Safranina de
Gram durante 30 segundos, se lava con agua destilada, y se seca a temperatura
ambiente. Finalmente al realizar los frotis de cultivo en medio lquido y en medio slido
teidos con la tcnica de Gram, se analiza y se reporta lo observado para las dos
muestras.
Frotis de tierra con coloracin Zielh Neelsen.
Frotis de tierra
T Ambiente
Secado y Fijacin 3 veces por calor
Calentamiento
Fucsina Bsica Hervir 10 min.
Enfriamiento
Secado T Ambiente
Observacin Objetivo de
inmersin
Anotaciones
Se realiz un frotis de tierra que fue secado a temperatura ambiente, fijado con calor,
luego fue recubierta la muestra con Fucsina bsica, y fue calentada hasta emisin de
vapores sin dejar de hervir durante 10 minutos. Luego fue enfriada la muestra y lavada
con agua destilada para ser decolorada con alcohol cido y nuevamente ser lavada con
agua destilada. Posteriormente la muestra fue cubierta con azul de metileno durante dos
minutos, lavada con agua destilada, secada a temperatura ambiente y observada con el
objetivo de inmersin anotando finalmente lo observado.
2.2.4. Frotis de Bacillus subtilis en coloracin de Shaeffer Fulton (Esporas)
Enfriamiento T Ambiente
Safranina al
1 min
0.5%
Secado T Ambiente
Observacin Objetivo de
inmersin
Anotaciones
Secado T Ambiente
Fijacin T Ambiente
Sln acuosa de
Colorante de Hiss Cristal violeta 1%
Sln acuosa de
Lavado Sulfato de Cobre 20%
Secado T Ambiente
Observacin Objetivo de
. inmersin
Anotaciones
Al observar la muestra de agua sucia estancada con el objetivo de 10X se pudo observar
pequeas manchas o sucios del agua pero no era posible distinguir algn tipo de
microorganismo, al igual cuando se observ con el objetivo de 40X se increment el
aumento y se vean mucho ms las partculas sucias del agua, pero no se poda definir ni
clasificar morfolgicamente ningn tipo de microorganismo, slo se apreciaba pequeos
movimientos de partculas.
5. CUESTIONARIO.
RTA: La tincin de Gram es una tcnica de coloracin usada para examen microscpico
directo de muestras y subcultivos. Esta tcnica diferencial est basada en las
caractersticas qumicas y estructurales de la pared celular. El microbiologo Cristian Gram
descubri que al haber un preparado microscpico sucesivamente con un colorante
violeta, un fijador, un lavado con alcohol y un colorante de contraste rosa o rojo, algunas
bacterias aparecan violetas y otras rosadas.
Las clulas bacterianas fijadas por calor en un portaobjetos se tien de cristal azul violeta
(violeta de Genciana) que sirve como colorante primario y se une a la pared celular
bacteriana cuando se trata la llamada Disolucin de Lugol ( yodo y yoduro de potasio),
que sirve como mordiente para la unin del colorante, esto se debe a que el yodo forma
un complejo con el colorante azul que es insoluble en agua, pero soluble en etanol o
acetona.
Al final del proceso las bacterias o clulas que retienen el primer colorante (cristal azul
violeta) y se tien de violeta o azul oscuro se llaman Gram positivas, mientras que las
clulas que se tien con el colorante de contraste o segundo colorante, que aparecen
teidas de rojo se llaman Gram negativas.
Cuando estas reacciones de coloracin de Gram son observadas junto con el tipo (cocos
y bacilos) y la disposicin de las clulas bacterianas, pueden ser usadas para realizar
identificaciones presuntivas. Adems, la coloracin de Gram tambin puede ser utilizada
para identificar formas no bacterianas, como las tricomonas, larvas estrogiloides y otros
Parsitos.
RTA: Cualquier tincin precisa una fijacin previa de la preparacin, que en la mayora de
los casos se hace a la llama y en el caso de cpsulas termolbiles con alcohol metlico.
RTA: El lugol es una solucin dbil de yodo (yodo y yoduro de potasio), el cual sirve
como mordente para la unin del colorante formando un complejo con este (cristal azul
violeta), es decir, se utiliza para fijar la tincin. Por lo general, la solucin de lugol se
encuentra a un 3% de I2 y KI.
RTA: Los colorantes cidos y bsicos son compuestos orgnicos, los cuales indican si
una parte de una determinada molcula es catinica (bsicos) o aninica (cidos), de esta
forma los colorantes cidos se usan para teir sustancias bsicas o cargadas
positivamente, mientras que los colorantes bsicos se usan para teir sustancias cidas o
cargadas negativamente. Algunas sustancias cargadas negativamente son en general las
superficies celulares, mientras que dentro de las sustancias bsicas encontramos la
estructura citoplasmtica. Algunos colorantes son, cidos : eosina y bsicos: azul de
metileno.
Tincin de blanco de calco flor: Esta tincin utiliza el blanco de color flor, el
cual es una sustancia incolora utilizada por su fluorescencia, ya que por medio de esta
se pueden detectar hongos en preparados hmedos, en extendidos y en corte de
tejido. Tambin se utiliza mucho esta tcnica para detectar clulas de levadura, hifas
y seudohifas en raspado de piel y membranas mucosas. Cuando se observan
microscpicamente presentan un brillo verde manzana, o blanquecino fantasmal. Esta
tincin tiene la ventaja de que las secciones de tejido puedan ser teida con
coloracin de cidos o cualquier otra tincin especial sin interferir; adems
proporciona una buen definicin de estructuras fngicas finas y un mejor contraste
con respecto al fondo.
PANIAGOS, Ricardo. Biologa celular. Ed. Mac Graw Hill S.A. (Mxico). 1995.
1. MONTAJE EN FRESCO
2. FROTIS Y COLORACION