PREPARACIN DE CULTIVOS LCTICOS Y YOGUR

1. INTRODUCCIN

Aunque existen numerosos tipos de leches fermentadas, solo el yogur ha alcanzado

difusin internacional. Su popularidad se debe a diversos hechos, como su agradable y
aromtico flavor o su fama como alimento sano, pero quizs lo ms importante sea su
consistencia cremosa, que lo convierte en un vehculo ideal para diversos tipos de frutas.

El Yogur es un producto lcteo fermentado, semilquido, considerado un alimento

saludable. Se elabora con leche entera o descremada, cocida y concentrada por
evaporacin. La fermentacin se consigue aadiendo a sta cultivos de dos bacterias,
Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus. Se pueden obtener nuevos lotes
de yogur aadiendo a la leche concentrada una porcin del lote anterior.
 2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Seguir los pasos fundamentales para la preparacin de cultivos lcticos y yogur

2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

Preparar cultivos lcticos y yogur.

Determinar el comportamiento de la acidez a intervalos regulares de tiempo.
Inocular y sembrar en caldo y agar MRS.
Determinar la relacin coco bacilo en una muestra de yogur comercial.
 3. MARCO CONCEPTUAL

Los productos lcteos fermentados se caracterizan porque obtienen su carcter cido y su

tpica textura por experimentar una fermentacin lctica unida a una produccin de aroma.
Distintas especies y combinaciones de especies de bacterias lcticas acidificantes
fermentan una parte de la lactosa y en ocasiones de la sacarosa aadida a cido lctico y,
en menor medida, tambin a otros cidos orgnicos y sustancias aromticas. La
fermentacin provoca tambin la coagulacin de las protenas, que tambin sufren cierto
grado de desdoblamiento.

El yogur son leches fermentadas elaboradas a partir de la adicin de un cultivo de yogur a

la leche pasteurizada, en ocasiones homogeneizada, y normalizada en el contenido de
grasa, o la leche fresca desnatada, que puede contener productos estabilizadores. Para
incrementar la proporcin natural de extracto seco se concentra la leche por evaporacin
o se le aade leche en polvo o leche concentrada por ultrafiltracin.

Con el cultivo de yogur se le aaden a la leche las bacterias lcticas que van a
determinar la acidificacin y la fermentacin. La calidad del producto final depende en
fuerte medida de la calidad del cultivo, y por este motivo se le ha de prestar la mxima
importancia a la composicin y a la preparacin del cultivo.

Composicin del cultivo.

Los cultivos de yogur deben contener, como microorganismos, exclusivamente las
siguientes especies bacterianas termfilas:

Streptococcus thermophilus
Lactobacillus bulgaricus.

Observadas bajo el microscopio, se ve que S. thermophilus crece formando pares

(diplococos) o cadenas medianamente largas de clulas esfricas o elipsoides de un
dimetro aproximado de 0.7 0.9m. L. bulgaricus presenta una forma de bastoncillo
relativamente largo de 0.2 0.4 m de ancho con tendencia a formar cintas.

Las temperaturas ptimas de crecimiento son de 37 42C y 42 45C para S.

thermophilus y L. bulgaricus, respectivamente.

La microscopa permite adems determinar la relacin cuantitativa cocos/bacilos. S.

thermophilus y L. bulgaricus han de estar, en el cultivo preparado (y por tanto tambin en
el yogur), en una relacin cuantitativa de 1:1 a 1:5, aproximadamente.

Esta relacin se establece esencialmente en base a tres factores:

- Cantidad inoculada.
- Temperatura de incubacin.
- Tiempo de incubacin.

Despus de realizada la siembra la relacin se modifica varias veces durante el

transcurso de la incubacin para volver a adquirir al final de proceso el valor inicial. El
origen de esto se halla en las relaciones de verdadera simbiosis.

La simbiosis es la asociacin vital que se establece entre distintos organismos y que se

beneficia a todos los participantes. En este caso S. thermophilus y L. bulgaricus. En esta
simbiosis es S. thermophilus la que inicia la fermentacin lctica y la que se desarrolla
muy intensamente hasta un pH de 5.5. La acidez, el consumo de oxgeno y la liberacin
de sustancias voltiles, por ejemplo el cido frmico que produce, crea las condiciones
ideales para que se desarrolle el L. bulgaricus.

La actividad proteoltica, es decir, liberadora de aminocidos de los lactobacilos estimula,

a su vez, el crecimiento y la actividad acidificante de los estreptococos. Los lactobacilos
desarrollan aparte una actividad lipoltica, por la que se liberan cidos grasos y producen
adems acetaldehdo (etanal), constituyndose as en los principales productores de
aroma del yogur.
La calidad de un cultivo se analiza, aparte de por la relacin cocos/bacilos, por el nmero
absoluto de grmenes. La capacidad estrter del cultivo, o sea, su capacidad de
produccin de cido, es otro de los criterios para valorar la calidad del mismo.

Preparacin del cultivo

La preparacin del cultivo se ha de realizar en condiciones de estricta asepsia para evitar
las contaminaciones por levaduras, mohos y bacterifagos. El mantenimiento del cultivo
de debera hacer en condiciones de de laboratorio y la preparacin se debera hacer en
una sala independiente de las salas de produccin que cuente con las instalaciones
adecuadas.

La Incubacin es un proceso discontinuo el cual maneja relaciones tiempo/temperatura

para brindar las condiciones optimas para el crecimiento de los microorganismos. El
proceso de incubacin se inicia con el inculo de los fermentos. Se caracteriza por
provocarse, en el proceso de fermentacin lctica, la coagulacin de la casena de la
leche. La coagulacin cida de la casena, es decir, la formacin en el punto isoelctrico
aproximadamente a un pH de 4.65 de un gel de yogur, es un signo que marca el final de
la incubacin y de la fermentacin. Este gel ha de presentar un aspecto cuajado
homogneo.

La relacin cocos/bacilos, y por tanto el desarrollo de la acidificacin, se puede regular

modificando fundamentalmente la temperatura de incubacin.

Temperaturas < 43C Predominio de cocos.

Temperaturas > 43C Predominio de lactobacilos.

La Normalizacin del extracto seco es otro proceso muy importante para la elaboracin
del yogur, ya que incrementando cantidades del 1 3% la proporcin de extracto seco
magro de la leche inicial se obtiene la tpica consistencia. Para normalizar el extracto
seco, usualmente se realiza una preparacin discontinua de la disolucin previa, en la
cual se disuelve, en un recipiente calentable, la leche en polvo obtenida por pulverizacin
en leche en caliente.
Existen medios selectivos para el crecimiento de bacterias cido lcticas. Uno de los ms
utilizados son el caldo y agar MRS (Man, Rogosa y Sharpe). Estos medios son utilizados
para el enriquecimiento, cultivo y aislamiento de todas las especies de Lactobacillus,
incluso especies como el L. brevis y L. fermenti difcilmente cultivables.

Los medios de cultivo MRS, contienen polisorbato, acetato de magnesio y manganeso, las
cuales son factores especiales de crecimiento para Lactobacillus as como una base
nutritiva y rica. Este tipo de medio posee muy escasa selectividad, por lo que pueden
crecer especies de Pediococcus y Leuconostoc. Para un mejor estudio o aislamiento el
material objeto de estudio se incorpora al caldo MRS para su enriquecimiento y
posteriormente se siembra en agar MRS por agotamiento o por el procedimiento de
vertido en placas.

En el caldo MRS, crecen microorganismos como: L. acidophilus, L. bulgaricus, L. casei, L.

fermentum, E. coli y Pseudomona aeruginosa; mientras que al sembrar en el agar MRS el
crecimiento se puede ver afectado por E. coli y P. vulgaris los cuales no son inhibidos del
todo en este medio.
 4. PROCEDIMIENTO

4.1. CULTIVO LCTICO

Reconstituir 200 ml de leche en

polvo

Esterilizar 95C 15 min.

En bao serolgico

Enfriar A 42C

Inocular 3% del yogur diettico

Incubar 43C 2 horas y media

Medir acidez Cada hr.

Titular 10 ml de cultivo
con NaOH 0.1N
Suspender Cuando la leche est
como gelatina

Agitar

Refrigerar
4.2. YOGUR

Leche entera 1 Lt.

Aumentar Al 3%
slidos Con leche en polvo

Adicionar Al 8%
azcar

Esterilizar 95C 15 min.

En bao serolgico

Enfriar

Inocular 3% del yogur diettico

Incubar 43C 3 horas

Agitar

Refrigerar

Adicionar
frutas
4.3 RELACIN COCO - BACILO

Muestra de
yogur

Hacer frotis

Fijar

Coloracin de
Gram

Observar en
Objetivo de
microscopio
100x

4.4. SIEMBRA EN CALDO Y AGAR MRS

Muestra 1ml de yogur

comercial

Inocular
Caldo MRS

Incubar
36C 24hr.

Agitar
Tomar inculo

Sembrar
Agar MRS

Incubar
36C 24hr.
 5. RESULTADOS

5.1. CULTIVO LCTICO

Se prepararon 200 ml de cultivo lctico a partir de una disolucin de leche en polvo a la

cul se le inocul el 3% de yogur diettico el cual corresponda a una cantidad de 6 ml. Y
se mantuvieron en incubacin durante 3 horas hasta que se formaron una especie de
cogulos.

5.1.1. Gramos de leche: necesarios para preparar 200 ml de cultivo al 10%

Volumen total % deseado

g. de Leche =
100 3% de humedad

200 ml 10%
g. de Leche =
100 3%
g. de Leche = 20.62 g

5.1.2. Volumen total de agua:

VT H2O = Volumen total Gramos de leche

VT H2O = 200 20.62
VT H2O = 179.38 ml.

5.1.3. Porcentaje de acidez:

ml de NaOH 0.1N
% Acidez = 100
10 ml de muestra

% Acidez = ml de NaOH/ ml
La determinacin del porcentaje de acidez se llev a cabo por medio de una titulacin con
NaOH 0.1N cada media hora obteniendo los siguientes resultados:

Tabla 1. Porcentaje de acidez en el tiempo

Tiempo (min.) 30 60 90 120 150 180
% Acidez 2.1 2.5 2.9 4.0 5.7 6.3

Por consiguiente un grfico de % Acidez vs. Tiempo quedara de la siguiente forma:

% de Acidez del cultivo lctico

7
6 5.7 6.3
5 4
% Acidez

4
2.5 2.9
3 2.1
2
1
0
0 50 100 150 200

t (min)

5.2. YOGUR

Se prepararon 1000 ml de yogur a partir de leche normalizada y azucarada.

5.2.1. Slidos solubles

Para aumentar los slidos solubles al 3% se le adicion la leche en polvo.

Volumen total % deseado

g. de Leche =
100 3% de humedad

1000 ml 3%
g. de Leche =
100 3%
g. de Leche = 30.93 g
5.2.2. Azcar al 8%
Se le adicion a la leche normalizada una cantidad de azcar hasta que alcanzara una
concentracin del 8%.

Volumen total % deseado

g. Azcar =
100 3% de humedad

1000 ml 8%
g. Azcar =
100 3%
g. Azcar = 82.47 g

5.3. RELACIN COCO-BACILO

Se observaron cadenas de cocos (estreptococos) Gram de color fucsia muy juntas y
diplobacilos alargados Gram+ de coloracin violeta en una relacin 5:1. (Ver anexo A)

5.4. SIEMBRA EN CALDO Y AGAR MRS

En el caldo MRS se observaron sedimentos de color crema, y el lquido de color
anaranjado oscuro.

En el agar MRS se observaron colonias bien formadas que seguan la lnea de siembra.
Colonias de forma esfrica, circular, con elevacin convexa, borde entero y color crema
semitransparente. (Ver anexo B)
 6. ANLISIS DE RESULTADOS

6.1. CULTIVO LCTICO

En el cultivo lctico, la formacin de cogulos indica la fermentacin de la lactosa por
parte de las bacterias lcticas acidificantes produciendo cido lctico y la vez, coagulando
las protenas de la leche reconstituida. Esto conlleva a determinar un ptimo crecimiento
por parte de los microorganismos.

El incremento del porcentaje de acidez es inherente al crecimiento de las bacterias

productoras de cido, por consiguiente, la grfica de % de acidez vs. Tiempo sera
anloga a una grfica de crecimiento bacteriano vs. Tiempo.

Inicialmente los microorganismos se adaptan en la fase de latencia, posteriormente se

empiezan a duplicar en una fase logartmica consumiendo los nutrientes del medio,
produciendo los respectivos cidos caractersticos de este tipo de fermentacin los cuales
cambian la acidez y el pH del medio afectando la velocidad de crecimiento. A medida que
transcurre el tiempo, los nutrientes van disminuyendo y aumentando los metabolitos hasta
llegar a una fase estacionaria en el cual la cantidad de microorganismos permanece
constante.

6.2. YOGUR
Las caractersticas sensoriales obtenidas al final de la incubacin en el producto
elaborado fueron propias de un yogur. El aroma caracterstico de yogur fue obtenido por la
produccin de acetaldehdo por parte de los Lactobacillus. El sabor cido y la textura
fueron producto de la fermentacin de la lactosa y parte de la sacarosa por parte de las
bacterias lcticas presentes en el yogur. Por ltimo, la viscosidad caracterstica se produjo
por la coagulacin de las protenas efectuada al cabo de dicha fermentacin.

6.3. RELACIN COCO BACILO

Las bacterias observadas corresponden a:
Bacterias fucsias, esfricas Gram Streptococcus thermophilus
Bacterias violetas, bacilares Gram + Lactobacillus bulgaricus

La relacin observada fue de 5:1 para Streptococcus thermophilus y Lactobacillus

bulgaricus, respectivamente, indicando un adecuado crecimiento y simbiosis entre los dos
microorganismos.

6.4. SIEMBRA EN CALDO Y AGAR MRS

En los medios MRS se puede apreciar un ptimo crecimiento de Lactobacillus bulgaricus
contenidos en el yogur comercial.
 7. INVESTIGACIN

Qu problema representa el hecho de encontrar en ocasiones levaduras en

un porcentaje elevado en productos como kumis y yogur?
 8. CONCLUSIONES

El yogur es un producto lctico obtenido por la simbiosis entre los microorganismos:

Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus.

Las caractersticas sensoriales del yogur son obtenidas como producto de la

fermentacin de la lactosa y de la sacarosa por parte de estas bacterias lcticas

La acidez cambia de manera proporcional al crecimiento de las bacterias

fermentadoras de cido lctico.

El medio MRS es utilizado para el enriquecimiento y aislamiento de Lactobacillus.

 BIBLIOGRAFA

SPREER, Edgar. Lactologa industrial. Ed. Acribia, S.A. 2 edicin. Zaragoza

(Espaa). 1991.

TAMIME, A. y ROBINSON, R. YOGUR: Ciencia y tecnologa. Ed. Acribia, S.A.

Zaragoza (Espaa). 1991.

BALTIMORE BIOLOGICAL LABORATORY, INC. Medios de cultivo, materiales e

instrumentos para laboratorios de microbiologa. Editorial B.B.L. Cuarta edicin.
Baltimore, Maryland. (E.U.A). 1959.

Enciclopedia ENCARTA 2000. Microsoft Corporation 1993 1999.

 ANEXO A.
RESULTADO DE LA OBSERVACIN AL MICROSCOPIO CON TINCIN DE GRAM
 ANEXO B.
RESULTADO DEL CRECIMIENTO BACTERIANO EN MEDIO MRS

CALDO MRS

AGAR MRS