TCNICAS PARA MEDICION DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

INDO

MENTOS
1. INTRODUCCIN
 2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GENERAL

Medir el crecimiento microbiano por los mtodos de conteo directo, densidad

ptica y peso seco celular.

2.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS

Medir el crecimiento microbiano por recuento microscpico directo con cmara de

Neubauer.
Medir la masa microbiana por diferencia de peso.
Aplicar el mtodo de densidad ptica las suspensiones preparadas en el
laboratorio.
 3. MARCO CONCEPTUAL

En cualquier sistema biolgico el crecimiento puede ser definido como el aumento

ordenado de todos los componentes qumicos de un organismo, lo cual, conduce al
aumento del nmero de individuos en la poblacin.

Para seguir el curso del crecimiento es necesario efectuar mediciones cuantitativas. El

crecimiento de poblaciones se mide estimando los cambios en el nmero de clulas, en la
cantidad de algn componente de las mismas (por ejemplo: protena) o en el peso total
seco de las clulas. Existen varios de contar el nmero de clulas o de determinar la
masa celular, adecuados para diferentes organismos o diferentes situaciones.

Se puede considerar el crecimiento de una poblacin a nivel de individuos dentro de una

poblacin (ciclo celular) o el crecimiento de poblaciones celulares (ciclo de crecimiento).

Recuento de clulas totales

El nmero de clulas en una poblacin se puede determinar contando una muestra con el
microscopio mediante el mtodo de recuento directo. El recuento directo se puede hacer
de dos formas, en muestras secas sobre porta o en muestras liquidas. Con muestras
liquidas se emplean cmaras de recuento especiales que, en esencia, son portas
excavados modificados, sobre cuya superficie de vidrio est marcada una rejilla con
pequeos cuadrados de rea conocida. (Ver Anexo A.)

Cada cuadrado de la parrilla puede contener un pequeo volumen conocido, muy

pequeo pero determinado con precisin. En el microscopio se puede contar el nmero
de clulas por cada unidad de rea de la parrilla, lo que permite conocer el nmero de
clulas por el volumen de determinada rea.
Medicin de la masa celular

Un mtodo muy utilizado para medir el crecimiento microbiano es secar volmenes

conocidos de un cultivo celular lentamente hasta obtener un peso constante. Cuando se
trata de clulas que sedimentan rpidamente, esto implica centrifugacin de muestras del
cultivo en tubos de centrifuga prepesados. Para las clulas bacterianas difciles de
concentrar por centrifugacin, las muestras de cultivo se filtran a travs de membranas
hidroflicas con un tamao de poro de 0.2m.

La tcnica ms adecuada para medir la masa celular de los microorganismos unicelulares

es un mtodo ptico llamado densidad ptica que consiste en medir la cantidad de luz
difractada por una suspensin de clulas. Esta tcnica se basa en el hecho de que las
partculas pequeas difractan la luz, dentro de ciertos lmites, de manera proporcional a
su concentracin. Cuando un haz luminoso pasa a travs de una suspensin bacteriana,
la reduccin en la cantidad de luz transmitida a consecuencia de la difraccin es pues
una medida de la masa bacteriana presente. Tales mediciones se hacen normalmente con
un fotmetro o espectrofotmetro.

Un espectrofotmetro est equipado con un prisma o una red de difraccin que permite la
iluminacin de la muestra con luz de un margen estrecho y ajustable a longitudes de
onda; un fotmetro tiene filtros intercambiables que permiten pasar un margen
relativamente amplio de longitudes de onda. Estos instrumentos miden en unidades de
absorbancia (A); la absorbancia se define como el logaritmo del cociente entre la
intensidad de la luz incidente sobre la suspensin (I0) y la de la luz transmitida por la
suspensin (I)
A = Log I0
I

Estos instrumentos son adecuados para estimar concentraciones celulares y, cuando se

calibran con suspensiones bacterianas de concentracin conocida, constituyen un mtodo
exacto y rpido de determinar el peso seco bacteriano por unidad de volumen del cultivo.
Debe destacarse que tales mediciones tienen significado solamente cuando se usan
conjuntamente con una curva estndar como la representada en la figura 1.
 Absorbancia
= 420nm

= 650nm

Como la difraccin es inversamente proporcional a la cuarta potencia de la longitud de

Masa celular bacteriana (mg de peso seco por
onda de la luz que se difracta,ml)la sensibilidad de las mediciones incrementa notablemente
si se utiliza luz deFigura 1. Relacin
longitud de onda existente entre
ms corta; la absorbancia
en general, de unael limite inferior de
sin embargo
suspensin de bacterias y la masa celular bacteriana.
sensibilidad del mtodo se alcanza cuando las suspensiones bacterianas contienen unos
10 millones de clulas por mililitro. Para medir con mayor sensibilidad la luz difractada
existen instrumentos denominados Nefelmetros, que poseen un dispositivo sensor de luz
colocado en un ngulo recto respecto al haz de luz incidente, por lo que pueden medir
directamente la luz difractada.(Ver figura 2).

Luz difractada
Fotmetro

Tubo
Lente
Fuente Suspensin fotoelctrico
colimadora
luminosa bacteriana (sensor de luz)
Nefelmetro
Luz no
difractada

Fuente Lente Tubo

luminosa colimadora fotoelctrico
(sensor de luz)

Figura 2. Comparacin entre la disposicin de los componentes

pticos de un fotmetro y un Nefelmetro.
 4. PROCEDIMIENTO

4.1. Preparacin del cultivo madre (Sacharomyces cerevisiae).

Pesar 3g de levadura

Disolver 200ml de Agua destilada

Datos Concentracin

4.2. Preparacin de las soluciones A.

Pesar 6 tubos de 20 a 25ml

secos

Diluir Solucin madre en Agua

destilada (6 diluciones de
10ml)
Datos Concentraciones

4.3. Preparacin de las soluciones B.

Diluir Soluciones A en Agua

destilada (6 diluciones de
10ml)
Datos ml necesarios
4.4. Medicin del crecimiento microbiano por Conteo directo en cmara de
Neubauer.

Soluciones B

Agitar tubos

Tomar volumen 0.2 a 0.5

micro pipeta

Cmara de 1 gota cerca

Neubauer cubreobjetos

Platina del Colocar cmara

microscopio observar 40x

Enfocar Observar cuadro

enrejado centrado

Enfocar luz Observar enrejado y

clulas

Bordes externos Contar clulas 5 cuadros

marcados

Limpiar cmara Agua destilada

Secar cmara Despus de

cada lectura

Observar y
Todas las
contar
soluciones B
4.5. Medicin del crecimiento microbiano por Densidad ptica.

Soluciones B

Agitar tubos

Realizar lectura
Espectrofotmetro
de absorbancia

4.6. Medicin del crecimiento microbiano por Peso seco celular.

Introducir en la Tubos prepesados de

centrifuga Soluciones A

Centrifugar 3600rpm 15min.

Evacuar Pipeta o
sobrenadante micro pipeta

Evaporacin Tubos en estufa

90C

Pesar tubos

Evaporacin Hasta que alcance

un peso constante
 5. RESULTADOS

5.1. Preparacin del cultivo madre (Sacharomyces cerevisiae).

Se prepar una solucin madre del cultivo de levadura (Sacharomyces cerevisiae),
compuesta de 3g de levadura y 200ml de agua.
La concentracin en partes por milln (ppm) de esta solucin es:

ppm = mg Sto / Lt de Sln

[Sln] ppm = 3000mg / 0.2 Lt
[Sln] ppm = 15000mg/Lt
5.2. Preparacin de las soluciones A
Se prepararon 6 diluciones a partir de la solucin madre, las cuales tenan la siguiente
composicin.
Tabla 1. Composicin de las soluciones A
Nomenclatura 1A 2A 3A 4A 5A 6A
ml de agua 0 2 4 6 8 10
ml de cultivo 10 8 6 4 2 0

Para hallar la concentracin de las soluciones en ppm se utiliza la ecuacin:

C1 V1 = C2 V2
C2 = C1 V1 / V2
Donde C2 es la concentracin de la solucin A en ppm.

Solucin 1A
V1 = 10ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml C2 = (10ml15000ppm)/10ml = 15000ppm
Solucin 2A
V1 = 8ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml C2 = (8ml15000ppm)/10ml = 12000ppm
Solucin 3A
V1 = 6ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml C2 = (6ml15000ppm)/10ml = 9000ppm
Solucin 4A
V1 = 4ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml C2 = (4ml15000ppm)/10ml = 6000ppm
Solucin 5A
V1 = 2ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml C2 = (2ml15000ppm)/10ml = 3000ppm
Solucin 6A
V1 = 0 ml C1 = 15000ppm
V2 = 10ml C2 = 0ppm

Los valores hallados matemticamente para las concentraciones de cada solucin A se

encuentran expresados en la tabla 2.
Tabla 1. Concentracin de de las soluciones A (ppm)
Nomenclatura 1A 2A 3A 4A 5A 6A
Concentracin en ppm 15000 12000 9000 6000 3000 0

5.3. Preparacin de las soluciones B

Se prepararon 6 diluciones a partir de las soluciones A a las cuales deben ser de la
concentracin expresada en la tabla 3.
Tabla 3. Composicin de las soluciones B
Nomenclatura 1B 2B 3B 4B 5B 6B
Concentracin en ppm 1000 800 600 400 200 0
A partir de 1A 2A 3A 4A 5A 6A

Para hallar el volumen necesario de las soluciones A para llegar a la concentracin pedida
se necesita la siguiente ecuacin:

C1 V1 = C2 V2
V1 = C2 V2 / C1
Donde V1 es el volumen en ml de la solucin A.
Solucin 1B a partir de 1A
C2 = 1000ppm V2 = 10ml
C1 = 15000ppm V1 = (10ml1000ppm)/15000ppm 0.67ml
Solucin 2B a partir de 2A
C2 = 800ppm V2 = 10ml
C1 = 12000ppm V1 = (10ml800ppm)/12000ppm 0.67ml
Solucin 3B a partir de 3A
C2 = 600ppm V2 = 10ml
C1 = 9000ppm V1 = (10ml600ppm)/9000ppm 0.67ml
Solucin 4B a partir de 4A
C2 = 400ppm V2 = 10ml
C1 = 6000ppm V1 = (10ml400ppm)/6000ppm 0.67ml
Solucin 1B a partir de 6A
C2 = 200ppm V2 = 10ml
C1 = 3000ppm V1 = (10ml200ppm)/3000ppm 0.67ml
Solucin 1B a partir de 6A
C2 = 0ppm V2 = 10ml
C1 = 0ppm V1 = 0ml

Los valores hallados matemticamente para los mililitros de las soluciones A necesarios
para preparar las soluciones B se encuentran expresados en la tabla 4.
Tabla 4. Composicin de las soluciones B
Nomenclatura 1B 2B 3B 4B 5B 6B
Volumen de A en ml 0.67 0.67 0.67 0.67 0.67 0

5.4. Medicin del crecimiento microbiano por conteo directo en cmara de

Neubauer

Para la medicin del crecimiento microbiano por conteo directo se tomaron las soluciones
B, depositando la muestra en una cmara de Neubauer y observando en el microscopio
con un objetivo de 40x.

La cmara de Neubauer posee una especie de rejilla, que en su cuadro central (ver Anexo
C) posee 25 cuadros, los que a su vez poseen 16 cuadritos, se deben contar las clulas
que se encuentren dentro de los 5 cuadros marcados (los de las cuatro esquinas y el del
centro).
El rea del cuadro central marcado con un crculo es de 0.01 mm2 y una profundidad de
0.1mm. Entonces el rea de cada uno de los 25 cuadros es de:

Ac= A / 25
Ac = 0.01 mm2 / 25 = 0.0004 mm2

El volumen de los cuadros que se cuentan es igual a la suma de sus reas multiplicado
por su profundidad.

V = 5Ac Prof.
V = 5 (0.0004 mm2) 0.1mm = 0.0002 mm3
Con este volumen y el nmero de clulas contadas en los 5 cuadros, se puede hallar la
concentracin de clulas en clulas/ml.

El nmero de clulas contadas en el experimento para cada una de las soluciones B se

expresa en la tabla 5.

Tabla 5. Numero de clulas contadas en el experimento para las soluciones B

Nomencl.
Cuadro 1B 2B 3B 4B 5B 6B
1 156 90 88 32 29 0
2 121 106 94 49 31 0
3 90 67 69 33 41 0
4 85 107 73 36 26 0
5 102 85 109 35 30 0
Total 554 455 433 185 157 0

Para hallar la concentracin de clulas se divide el total de clulas de cada solucin B

entre el volumen de los 5 cuadros.

[Clulas] = # clulas / 0.0002 ml.

[1B] = 554 cel / 0.0002ml = 2770000 cel/ml

 [2B] = 455 cel / 0.0002ml = 2275000 cel/ml

[3B] = 433 cel / 0.0002ml = 2165000 cel/ml

[4B] = 185 cel / 0.0002ml = 925000 cel/ml

[5B] = 157 cel / 0.0002ml = 785000 cel/ml

[6B] = 0 cel / 0.0002ml = 0 cel/ml

Las concentraciones de las soluciones B obtenidas se encuentran en las siguiente tabla.

Tabla 6. Concentraciones de las soluciones B en cel/ml

Nomenclatura 1B 2B 3B 4B 5B 6B
Concentracin cel/ml 2770000 2275000 2165000 925000 785000 0

5.5. Medicin del crecimiento microbiano por densidad ptica

Se realiz una lectura de absorbancia a 540 nm en el espectrofotmetro y arroj los

siguientes resultados:

Tabla 7. Concentraciones de las soluciones B en absorbancia

Nomenclatura 1B 2B 3B 4B 5B 6B (Blanco)
Concentracin (A) 0.925 0.900 0.636 0.468 0.222 0

5.6. Medicin del crecimiento microbiano por peso seco celular

Se tom el peso de los tubos de ensayo vacos, se centrifug un volumen determinado de

las soluciones A. Luego se separ el sobrenadante y se evapor a 90C para eliminar el
agua restante, los resultados obtenidos fueron los siguientes:

Tabla 8. Datos para las soluciones A en la determinacin del peso seco celular
Nomenclatura 1A 2A 3A 4A 5A 6A
Volumen de A 9.33 9.33 9.33 9.33 9.33
(1) Peso de tubos (vacos) 17.1 16.4 16.7 17.0 17.0
(2) Peso de tubos + clulas 16.6 16.8 17.1 17.2 17.1
Peso de seco celular (2 1) 0.5 0.4 0.4 0.2 0.1

Para hallar la concentracin en g de clulas por mililitro se divide el peso seco celular
obtenido y se divide por los mililitros iniciales de la solucin antes de extraer el lquido.
 [Clulas] = Peso seco celular / ml de Sln.

[1A] = 0.5g / 9.33ml = 0.054g/ml

[2A] = 0.4g / 9.33ml = 0.043g/ml
[3A] = 0.4g / 9.33ml = 0.043g/ml
[4A] = 0.2g/ 9.33 ml = 0.021g/ml
[5A] = 0.1g / 9.33ml = 0.010g/ml

Las concentraciones de las soluciones A obtenidas se encuentran en las siguiente tabla.

Tabla 9. Concentraciones de las soluciones A en g cel/ml

Nomenclatura 1A 2A 3A 4A 5A 6A
Concentracin g cel/ml 0.054 0.043 0.043 0.021 0.010 0
 6. ANALISIS DE RESULTADOS

6.1. Preparacin del cultivo madre (Sacharomyces cerevisiae).

Cultivo de levadura comercial (Sacharomyces cerevisiae) diluido en agua en una
concentracin de 15000 ppm de color amarillento (ver Anexo C).

6.2. Preparacin de las soluciones A

Se realizaron a partir de la solucin madre de levadura de diferentes concentraciones
para un posterior estudio en la determinacin del peso seco celular, a medida que
disminua la concentracin en ppm se tornaba ms transparente.

6.3. Preparacin de las soluciones B

Las soluciones B fueron diluciones de las soluciones A en agua, estas soluciones brindan
la oportunidad de estudiar las clulas en el microscopio por la facilidad de conteo y por
tener una menor densidad ptica. Por esto fueron utilizadas para realizar el procedimiento
de recuento directo y de densidad ptica.

6.4. Medicin del crecimiento microbiano por conteo directo en cmara de

Neubauer
Para este mtodo se utilizaron las soluciones B, ya que, por ser diluciones, tenan una
menor concentracin, por lo tanto un menor nmero de clulas y as poder contarse ms
fcilmente.

Se utiliz la cmara de Neubauer la cual nos proporcionaba una informacin exacta sobre
la cantidad de clulas que se encontraban en un volumen conocido.

Luego de montar la cmara, y ubicarse en el cuadro central se observaron clulas de

color amarillo brillante en forma esfrica. Solo se contaron las clulas que se podan
diferenciar ya que algunas se encontraban muy juntas y no se poda determinar el numero
exacto de clulas.
6.5. Medicin del crecimiento microbiano por densidad ptica
Para la medicin de la densidad ptica se utiliz el espectrofotmetro arrojando resultados
que permitieron afirmar que la absorbancia es directamente proporcional a la
concentracin en ppm de las clulas en solucin.

6.6. Medicin del crecimiento microbiano por peso seco celular

En la medicin del peso seco celular se observ que a medida que la solucin tena una
menor concentracin, menor era el peso, lo que da a entender que el peso seco celular de
una solucin de clulas es directamente a su concentracin.
 7. CUESTIONARIO

1. Calcule y reporte la concentracin de cada una de las soluciones problemas en

clulas/ml, absorbancia y g de clulas/Lt.

Nomenclatura 1A 2A 3A 4A 5A 6A
Concentracin g cel/ml 0.054 0.043 0.043 0.021 0.010 0
Nomenclatura 1B 2B 3B 4B 5B 6B
Concentracin cel/ml 2770000 2275000 2165000 925000 785000 0
Concentracin (A) 0.925 0.900 0.636 0.468 0.222 0

2. Elabore un grafico de clulas/ml vs. absorbancia.

3. Elabore un grafico de g de clulas/ml vs. absorbancia.

4. Consulte y explique otros mtodos utilizados para la medicin del crecimiento

microbiano.
Recuento de clulas viables

En el recuento microscpico directo se cuentan tanto clulas vivas como muertas. En

muchos casos interesa contar solo las clulas vivas, y con este fin se han desarrollado
mtodos de recuento de clulas viables. Una clula viable se define como aquella que es
capaz de dividirse y dar lugar a una descendencia; y el mtodo usual para realizar una
determinacin de clulas viables se basa en contar el nmero de clulas de la muestra
que es capaz de formar colonias sobre un medio slido adecuado. Por esta razn el
recuento de clulas viables tambin se llama recuento en placa o recuento de colonias.
En este procedimiento se supone que cada clula viable puede formar una colonia.

Hay dos maneras de realizar un recuento en placa para viables: El mtodo de extensin
en placa y el mtodo de vertido en placa (ver Anexo D).

Mtodo de extensin en placa: En este mtodo, un cierto volumen de cultivo

diluido, que no suele ser superior a 0.1ml, se extiende sobre la superficie de una
placa con medio slido utilizando un asa estril de extensin. La placa se incuba
despus hasta que aparecen las colonias y se cuenta su nmero. Es importante
que la superficie del medio est seca de modo que el lquido de la muestra se
absorba. No se suelen usar volmenes mayores a 0.1ml porque el exceso de
lquido no se absorbe, y origina problemas en el recuento al favorecer la extensin
y mezcla de las colonias.

Mtodo de vertido en placa: En este mtodo se pipetea un volumen conocido

(normalmente 0.1 a 1ml) de cultivo en una caja de Petri estril sobre la que se
aade el medio con agar fundido y se mezcla todo bien con suaves movimientos
de la placa sobre la superficie de la mesa antes de dejar que se solidifique. Como
la muestra se mezcla con el medio fundido, se pueden usar volmenes de inoculo
mayores que en el mtodo de recuento por extensin; sin embargo, con este
mtodo el organismo que se cuenta debe ser capaz de resistir la temperatura del
agar fundido a 45C.
Recomendaciones para estos mtodos

En los dos mtodos sealados anteriormente es importante que el numero de colonias

que aparezcan en las placas no sea demasiado grande, pues algunas colonias se podran
fusionar dando estimaciones errneos. Tambin es importante que el numero de colonias
no sea demasiado bajo para que el calculo sea estadsticamente significativo.

Para obtener el nmero apropiado de colonias casi siempre se diluye la muestra. Lo ms

frecuente es realizar diluciones decimales de la muestra (ver Anexo E). En la mayor parte
de los casos se realizan dichas diluciones seriadas para alcanzar la dilucin final
deseada.

Recuento electrnico de partculas

El contador electrnico se basa en el principio de que las clulas son malos conductores
elctricos en comparacin con una solucin electroltica. Una suspensin de clulas
diluidas en un electrolito salino o cualquier otro electrolito conveniente, se hace discurrir
por una minscula abertura por la que circula una corriente elctrica entre dos electrodos.
La elevacin del voltaje resultante es proporcional al volumen de la partcula que pasa a
travs del orificio. Los impulsos son amplificados y registrados en la pantalla de
osciloscopio al tiempo que son cortados. El contador electrnico dispone de mandos de
puesta a cero que permiten contar nicamente los impulsos de cierta magnitud. Cuando
se modifica el nivel cero, las partculas de tamaos diferentes son contadas
selectivamente.

Medicin de un constituyente celular

A veces, por causa del tipo de crecimiento (las clulas pueden formar filamentos o grupos
difcilmente dispersables), o de la complejidad del medio, resulta muy poco practico medir
la masa o el numero de clulas. En estos casos, el crecimiento puede medirse calculando
la cantidad de un constituyente celular determinado (por ejemplo, protenas,
peptidoglicano, DNA, RNA ATP) en el medio. Con frecuencia, tales mediciones son
tambin el mtodo ms prctico de calcular la masa y el crecimiento microbiano en un
ambiente natural.

5. Consulte las ventajas y desventajas de cada una de las tcnicas utilizadas en el

experimento.

Recuento de clulas totales

Este mtodo da resultados con mayor rapidez que cualquier otro, gracias al hecho de que
no se requiere periodo de incubacin para que las clulas se metabolicen y multipliquen.
Sus ventajas son:
Manipulaciones sencillas
Facilidad de ensayo
Aparte del microscopio, el instrumental se reduce al mnimo
Las placas obtenidas pueden conservarse y constituir un fichero de datos
permanentes
Permite hacerse una idea del tipo de microorganismo presente (cocos, bacilo, etc.)
Los recuentos se refieren a los microorganismos del producto original
Se pueden aadir conservantes a la muestra antes de su anlisis
Se requiere solamente una mnima cantidad de muestra.

El recuento directo por microscopa es un mtodo rpido para conocer el nmero de

clulas. Sin embargo, presenta ciertas limitaciones:
No distingue las clulas vivas de las muertas.
Las clulas pequeas son difciles de ver con el microscopio y algunas
posiblemente se pierden en el recuento.
En ocasiones la precisin es difcil.
Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando las muestras no se
tien.
El mtodo no suele ser adecuado para suspensiones con baja densidad.
Medicin de la masa celular

La nica manera de medir la masa celular es determinar el peso seco del material celular
en un volumen fijo de cultivo. Para ello hay que separar las clulas del medio, secarlas y
pesarlas. Tal determinacin requiere mucho tiempo y es relativamente poco sensible. Con
un equipo ordinario es difcil pesar con exactitud menos de 1mg, y sin embargo este peso
seco puede suponer el equivalente de unos 5000 millones de bacterias.

6. Qu son los colorantes supravitales y para que se usan.

Los colorantes supravitales son aquellos que permiten diferenciar las clulas viables de
las no viables. Estos colorantes permiten que se tia una parte de la pared celular de las
clulas no viables; mientras que las clulas viables son refringentes.

Entre estos encontramos el azul de metileno, azul de tripan, lugol. Colorantes como el
Wright o el Giemsa permiten colorear los restos de DNA de clulas muertas.
8. CONCLUSIONES
 BIBLIOGRAFIA

MOSSEL, David. Microbiologa de los alimentos. Ed ACRIBIA, S.A. 2 da edicin.

Zaragoza (Espaa). 2003.

MADIGAN, Michael. Brock. Biologa de los microorganismos. Ed Pearson Prentice

Hall. 10a edicin. New Jersey (E.U.A).2003.

STANIER, Roger. Microbiologa. Ed Revert, S.A. 2da edicin. Barcelona (Espaa).

1996.
 ANEXO A.
PROCEDIMIENTO DE RECUENTO MICROSCOPICO UTILIZANDO UNA CAMARA DE
TIPO PETROFF HAUSSER.

Bordes que sostienen el cubreobjetos

Para calcular el nmero por mililitro de

muestra:

(# de clulas) (# de cuadrados grandes)

(ml de muestra)

La muestra se aade aqu con cuidado para que Se cuentan las clulas de
no se rebose; el espacio entre el portaobjetos y un cuadrado grande. En
el cubre objetos es de 0.02 mm. La rejilla tiene la prctica se cuentan
25 cuadrados grandes un rea total de 1 mm2 y varios cuadrados y se
un volumen total de 0.02 mm3. halla media)
 ANEXO B.
REJILLA DE UNA CMARA DE NEUBAUER
 ANEXO C.
PROCESO DE DILUCION PARA EL EXPERIMENTO

3g en 200 ml

1A 2A 3A 4A 5A 6A

1B 2B 3B 4B 5B 6B
 ANEXO D.
MTODOS DE REALIZAR UNA DETERMINACION DE CLULAS VIABLES

Siembra por expansin

Colonias en superficie

Incubacin

La muestra se pipetea La muestra se extiende

sobre la superficie de uniformemente sobre la
la placa con agar superficie del agar usando Resultado tpico de la
un asa de vidrio estril siembra por extensin

Siembra por vertido en placa

Colonias incluidas en
medio
Colonias en superficie

Incubacin

La muestra se pipetea Se aade el medio estril

sobre la superficie de y se mezcla bien el Resultado tpico del
la placa estril inoculo vertido en placa
 ANEXO E.
PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE VIABLES USANDO DILUCIONES
SERIADAS DE LA MUESTRA Y EL MTODO DEL VERTIDO EN PLACA

1ml

1ml 1ml 1ml 1ml 1ml

1/10 1/100 1/103 1/104 1/105 1/106

(10-1) (10-2) (10-3) (10-4) (10-5) (10-6)
Pasar a placa muestras de 1ml

159 17 2 0
Colonias Colonias Colonias Colonias
Demasiadas colonias
para contar

159 x 103 = 1.59 x 105

Recuento Factor de Clulas (unidades
de la placa dilucin formadoras de
colonias) por
mililitro de muestra
original