Taller El papel de laboratorio en la prevencin y control del clera

INCIENSA, 8 de noviembre de 2013

Esta charla fue actualizada el 06/12/2013

Diagnstico de laboratorio del clera

Dra. Elena Campos Chacn, Coordinadora

Centro Nacional de Referencia de Bacteriologa, INCIENSA
Centro de Excelencia Regional WHO-Global Foodborne Infections Network para
Centroamrica, Mxico y Caribe de Habla Hispana
Bajo condiciones sanitarias deficientes
el clera se propaga rpidamente
Tiempo necesario para establecer el diagnstico de V. cholerae O1
por cultivo y mediante pruebas rpida de Cholera SMART

Tipo de muestra Tiempo requerido para establecer

el diagnstico
Cultivo Prueba rpida
Heces agua de arroz y lquidas sin moco 18 24 horas 15 minutos

Hisopados, heces semiformadas, heces con moco y 24 48 horas 6 horas

sangre, contenido intestinal post-mortem

Heces o hisopados de personas tratadas con 24 48 horas 18 horas

antibiticos antes de la obtencin de la muestra y de
asintomticos

Bolaos H. et al. 2004. Desempeo de los sistemas Cholera-SMART y Pathogen Detection Kit en el
diagnstico del clera. Rev. Panam. Salud Pblica 16:233-241.
 Clera: espectro de la infeccin
Vibrio cholerae O1, El Tor

75% infeccin asintomtica*

2% enfermedad grave
diarrea agua de arroz
5% enfermedad moderada

18% enfermedad leve

* Portadores: personas que no presentan sntomas, pero pueden transmitir la

enfermedad. Importantes en diseminacin del clera.
 La nica manera
de confirmar la presencia de clera epidmico
es mediante pruebas de laboratorio que demuestren la
presencia de Vibrio cholerae O1 o de V cholerae O139
 Red Nacional de Laboratorios de Bacteriologa
(RNLB = 80 labs)

Centro Nacional de Referencia en Bacteriologa, Coordinador

Clnicos humanos (59 pblicos + 4 privados )

Clnicos veterinarios (2 pblicos)

Alimentos para consumo humano (4 pblicos + 3 privados )

Alimentos para animales (1 pblicos + 1 privado)

Aguas (2 pblicos + 1 privados )

Empresas productoras de alimentos (3 privados)

10/12/2013 9
 Compartir informacin
especfica, oportuna y confiable
 La funcin del laboratorio en la etapa de alerta pre-epidmica

En esta etapa se debe Intensificar la vigilancia de laboratorio del clera

mediante coprocultivo de rutina (TCBS) en:
En pacientes con enfermedad diarreica aguda , (secretora), brotes y defunciones
asociadas a EDA.

En los casos que cumplen las definiciones de sospechoso de clera del

protocolo de vigilancia, se deben emplear adems los mtodos rpidos
(Cholera Smart) con el fin de detectar la presencia de Vibrio cholerae O1
epidmico en forma inmediata.
Toda persona que presente diarrea aguda secretora grave (heces tipo agua de arroz) y/o
vmitos de alta tasa.
Toda persona que presente diarrea aguda secretora (leve, moderada o grave),
proveniente de un rea con clera.
Toda persona que presente diarrea aguda secretora (leve, moderada o grave), relacionada a
un brote.
Toda persona que muera con antecedentes de diarrea, vmitos, deshidratacin y/o
por complicaciones debidas a la deshidratacin
 La funcin del laboratorio en la vigilancia,
prevencin y control del clera

Etapa epidmica
Una vez confirmada la presencia de casos de clera en una zona y que se
compruebe la transmisin continua de la infeccin, nicamente se realizar
el estudio de V.cholerae en el 10% de los casos sospechosos

Vigilancia estricta de la susceptibilidad a los antibiticos

Apoyar las investigaciones de brote para determinar

Vehculo de infeccin

Mecanismos de transmisin

Avance de la epidemia

Valoracin de la definicin de caso

Repercusin de medidas de control

Seleccin del tipo de muestra a recolectar
en el diagnstico e investigacin del clera

Razn para tomar la muestra Tipo de muestra a

recolectar
Tiene diarrea ahora Heces
Tiene diarrea ahora, pero recibi al Heces y suero
menos una dosis de antibitico
Tuvo diarrea durante la ltima semana Heces y suero
Tuvo diarrea hace 15 das o 1 mes Suero
No ha tenido diarrea, pero es contacto Heces y suero
de una persona con clera
Otro Heces y suero
 Heces Sangre
Equipo bsico para recoleccin de

Frascos estriles, Tubos vacutainer

boca ancha, (tapn rojo)
con tapa cierre Agujas para
hermtico vacutainer
muestras clnicas

Torniquete
Gradilla para tubos
Algodn
Cary Blair (medio de
Alcohol 70C
transporte)

Hisopos estriles
 Medidas bsicas de proteccin para recoleccin y
procesamiento de muestras
Normas de bioseguridad Nivel II

Usar guantes, lentes, bata de

laboratorio bozal, protectores
de zapatos y gabinete de
Guantes bioseguridad segn el riesgo de
actividad.

Usar tubos o frascos con tapas

hermticas irrompibles

No enviar elementos punzantes

Bolsas para o cortantes
material
contaminado No envolver los frascos de las
muestras en las boletas de
Gabacha, bozal solicitud de anlisis

Lavado de manos con agua, jabn y alcohol 70

Boleta de solicitud de anlisis Boleta de diagnstico
http://www.inciensa.sa.cr/servicios/boletas/USEC-
R01%20Solicitud%20de%20Diagnostico.pdf

Biological substance Category B

Datos demogrficos
Fecha inicio de sntomas
Fecha recoleccin muestra
Relacionado a brote?
Signos sntomas
Antibioticoterapia
Tipo de muestra
Origen
Fecha de recepcin INCIENSA
UN 3373

Boleta de confirmacin / tipificacin

http://www.inciensa.sa.cr/servicios/boletas/USEC-
R02%20Solicitud%20de%20Confirmacion%20Diagnostica.pdf

Patgeno referido
Resultados PSA (NO)

Boleta de alimentos

Sistema de informacin
 Diagnstico de laboratorio clera
(Red Nacional de Laboratorios de Costa Rica)

Nivel local
Aislamiento e identificacin de Vibrio cholerae O1
Presencia o ausencia de leucocitos y eritrocitos en heces

Observacin microscpica 100X de la motilidad y morfologa bacteriana

Enriquecimiento en (APA)

Prueba rpida Cholera Smart

Agar TCBS, AS y McConkey y otros medios para coprocultivo.

Pruebas de oxidasa, crecimiento en 0 y 1% NaCl y cordn

Identificacin bioqumica convencional, Vitek, Microscan, Api

Medio de Transporte Cary Blair

Toda cepa sospechosa de Vibrio cholerae debe ser referida al CNRB

con carcter de urgencia para su confirmacin y caracterizacin
 Diagnstico de laboratorio clera
(Red Nacional de Laboratorios de Costa Rica)

Centro Nacional de Referencia

Diagnstico de clera y otros enteropatgenos (brotes)

Deteccin de Vibrio cholerae O1 en alimentos

Confirmacin y tipificacin de:

Vibrio cholerae y otras especies

Serogrupo: O1, O139

Serotipo: Inaba, Ogawa, Hikojima

Biotipo: El Tor, Clasico

Vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos

Caracterizacin de factores de virulencia: toxina colrica

Electroforesis de campo pulsado (PFGE)

Determinacin de anticuerpos vibriocidas

Clera: historia natural y marcadores de laboratorio

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15

Tomado de: El laboratorio en la vigilancia y control del clera en Mxico. Instituto Nacional de Diagnstico
y Referencia Epidemiolgicos (INDRE), julio 1991.
Antes de procesar las muestras

Leer la informacin clnico-epidemiolgica

Cumple con definicin de caso sospechoso de clera
Edad
Sntomas
Apariencia de las heces
Otros enfermos asociados
Viajes

Determinar la calidad de la muestra

Tipo de muestra
Fecha de inicio de sntomas
Fecha de recoleccin de muestra
Fecha de recepcin de la muestra
en el laboratorio
Consumo de antibiticos previo
a la recoleccin de la muestra
Transporte de la muestra
Anlisis macro y microscpico

bacteriana
 El reporte de laboratorio

Se deben reportar los resultados negativos y positivos, de

acuerdo a lo investigado
Aclarar las limitaciones del resultado
Calidad de la muestra
Fecha de inicio de sntomas vs. fecha de recoleccin de la
muestra
Fecha de recoleccin de la muestra vs. fecha de recepcin en
el laboratorio
Uso de antibiticos previo a la recoleccin de la muestra
Comentarios o sugerencias que permitan actualizar el
conocimiento en relacin a los hallazgos clnico
epidemiolgicos
Confidencialidad de la informacin.
Coprocultivo
 Vibrios de importancia clnica

Presentacin clnica
Especie Gastrointestinal Infeccin de Septicemia
heridas, odos

V. cholerae O1 ++ (+)

V. cholerae no O1 ++ + +
(incluyendo O:139)

V. mimicus ++ +

V. parahaemolyticus ++ + (+)

V. vulnificus + ++ ++

V. alginolyticus ++

++: Presentacin ms comn; +: otra presentacin clnica; (+) presentacin poco usual
 Clera: diagnstico diferencial

Otros enteropatgenos, adems de Vibrio cholerae O1 y

V. cholerae O139 tienen la habilidad de elaborar toxinas
similares a la CT, por lo que producen cuadros clnicos
indistinguibles del clera (ej. V. mimicus, E. coli enterotoxignica,
Aeromonas).

Dado su potencial epidmico, cuando se diagnostica

V. cholerae O1 y V. cholerae O139 se deben realizar de
manera urgente las medidas de control de foco especficas,
a fin de contener la diseminacin de la enfermedad.

El diagnstico de la enfermedad se debe establecer

mediante la identificacin del agente por el laboratorio.
 Clera: diagnstico de laboratorio

Aislamiento primario
Agua peptona alcalina pH 8.5 0.2 (APA)
Agar tiosulfato sales biliares sacarosa (TCBS)
Ver Captulo IV del Manual del CDC: Mtodos de laboratorio para el
diagnstico de Vibrio cholerae en:
http://www.cdc.gov/cholera/pdf/es/Aislamiento-de-Vibrio-cholerae-a-partir-de-
muestras-fecales_cap%C3%ADtulo-4.pdf

Identificacin bioqumica y serolgica

Determinacin de factores de virulencia

Prueba de sensibilidad a los antibiticos

Mtodos rpidos (ej. Cholera SMART II TM)

No sustituyen el cultivo tradicional

Diagnstico serolgico (anticuerpos vibriocidas)

Cuando no se puede realizar el cultivo
En pacientes que ya recibieron antibiticos
 Identificacin bioqumica de Vibrio cholerae
Bioqumica convencional
Tradicionalmente se ha considerado el estndar de oro (confirmacin)
Al respecto se recomienda consultar el Captulo VI del Manual del CDC: Mtodos de
laboratorio para el diagnstico de Vibrio cholerae en:
http://www.cdc.gov/cholera/pdf/es/Identificaci%C3%B3n-de-Vibrio-cholerae-en-ellaboratorio-
cap%C3%ADtulo-6.pdf

Galeras API 20 E (preparar el inculo bacteriano en SS 0,85%)

Tarjetas GN / Sistema Vitek 2

Paneles ID para Gram Negativos/ NUC 45,50 o 55 / Sistema MicroScan

Sin embargo, es importante hacer notar que:

En la literatura hay estudios que reportan que los mtodos automatizados y
miniaturizados presentan dificultad en la identificacin, de Vibrio, Aeromonas y
Plesiomonas tanto a nivel de gnero como de especies *.

* OHara, CM. et al. Accuracy of six commercially available systems for identification of members of Family Vibrionaceae. J. Clin. Microbiol.
2003:5654-5659.
Saini A. et al. Discrepancies in identification of Vibrio cholerae strains as members of Aeromonadaceae and Enterobacteriaceae by
automated microbial identification system. Lett. Appl. Microbiol. 2012;55:22-26. Accesado en
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22502586
 Identificacin bioqumica de Vibrio cholerae

Por lo anterior y tomando en cuenta que la mayora de los laboratorios

del pas estn empleando mtodos automatizados o miniaturizados:
SE SOLICITA QUE:

.
Todo aislamiento de Vibrio, Aeromonas o Plesiomonas,
realizado en cualquier laboratorio clnico del pas, que utilice
VITEC, MicroScan o API debe ser referido de inmediato al
CNRB-INCIENSA, a fin de realizar la confirmacin
correspondiente por los mtodos convencionales

* OHara, CM. et al. Accuracy of six commercially available systems for identification of members of Family Vibrionaceae. J. Clin. Microbiol.
2003:5654-5659.
Saini A. et al. Discrepancies in identification of Vibrio cholerae strains as members of Aeromonadaceae and Enterobacteriaceae by automated
microbial identification system. Lett. Appl. Microbiol. 2012;55:22-26. Accesado en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22502586
 Identificacin bioqumica de Vibrio cholerae

Importante:
Para los laboratorios que emplean equipos automatizados y
miniaturizados de identificacin bacteriana, es fundamental que sigan las
instrucciones del fabricante, por ejemplo:
Se debe tomar en cuenta que los vibrios son bacterias que tienden a
formar grumos, difciles de homogenizar, por lo que en la preparacin
del inculo para las pruebas de identificacin y de sensibilidad a los
antibiticos se requiere de especial cuidado.
En el caso de los laboratorios que emplean API 20E, el inculo
bacteriano se debe preparar en solucin salina 0.85%.
Para los que emplean Microscan, el panel debe ser hidratado con el
Prompt y separadamente preparar una suspensin de la bacteria 0,5
Mc Farland en solucin salina 0,85%. Posteriormente, inocular
manualmente 50 l de esta suspensin en cada uno de los pocillos.
Para una correcta identificacin pueden requerir de la realizacin de
pruebas complementarias, para lo que se recomienda revisar los
manuales de los equipos.
 Determinacin de serogrupo y serotipo

Antgeno: puro, cultivo fresco y de

medios no selectivos

No auto aglutina
Opciones cuando autoaglutina
Antisueros de calidad
 Experiencia en el uso de pruebas rpidas
como apoyo al diagnstico del clera en Costa Rica

http://www.inciensa.sa.cr/ensenanza/ensenanza_documentos/taller_colera/pruebas%20rapidas%20para%20el%20diagnost
ico%20del%20colera/Validacion%20prueba%20rapida%20CHOLERA%20SMART%20%20CR%202004.pdf
 Motilidad de Vibrio cholerae

40 X

100 X

En el link a continuacin puede acceder los videos sobre la movilidad

de Vibrio cholerae y otras bacterias:

http://www.inciensa.sa.cr/vigilancia_epidemiologica/Observacion_vibrio%20cholerae.aspx

Motilidad en dardo: En un campo 100x se pueden observar

bacterias que cruzan el campo de un extremo al otro, esta motilidad
es caracterstica de los miembros de la familia Vibrionaceae.

Movimiento Otros tipos de movimiento

browniano (Salmonella)
 Flujograma para el uso de pruebas rpidas
como apoyo al diagnstico del clera en los
laboratorios del nivel local *

Con la estrategia propuesta (observacin de motilidad + prueba

rpida):

Es posible aumentar la especificidad y sensibilidad de las pruebas

rpidas

Establecer el diagnstico del clera en un tiempo menor que

empleando el cultivo

Recurso accesible para ser utilizado en la vigilancia del clera, an

en pases en vas de desarrollo.

El uso de pruebas rpidas no excluye la realizacin del cultivo.

* Fundamentado en la experiencia de Costa Rica en el uso de estas pruebas: Bolaos H. et al. 2004.
Desempeo de los sistemas Cholera-SMART y Pathogen Detection Kit en el diagnstico del clera.
Rev. Panam. Salud Pblica 16:233-241.
 Ver video movilidad

http://www.inciensa.sa.cr/vigi
lancia_epidemiologica/Observ
acion_vibrio%20cholerae.aspx

Sensibilidad 107 ufc / ml

= Coprocultivo
Tiempo necesario para establecer el diagnstico de V. cholerae O1
por cultivo y mediante pruebas rpida de Cholera SMART

Tipo de muestra Tiempo requerido para

establecer el diagnstico
Cultivo Prueba rpida
Heces agua de arroz y lquidas sin moco 18 24 horas 15 minutos
Hisopados, heces semiformadas, heces con moco 24 48 horas 6 horas
y sangre, contenido intestinal post-mortem

Heces o hisopados de personas tratadas con 24 48 horas 18 horas

antibiticos antes de la obtencin de la muestra
y de asintomticos

Bolaos H. et al. 2004. Desempeo de los sistemas Cholera-SMART y Pathogen Detection Kit en el
diagnstico del clera. Rev. Panam. Salud Pblica 16:233-241.
http://www.inciensa.sa.cr/ensenanza/ensenanza_documentos/taller_colera/pruebas%20rapidas%20para%20e
l%20diagnostico%20del%20colera/CHOLERA%20O1%20SMARTTM%20II%20-
%20prueba%20rapida%20(traduccion%20panfleto).pdf
 Diagnstico serolgico del clera
(se requiere de suero agudo y convalesciente)

Tipos
Anticuerpos vibriocidas (bactericidas) dirigidos contra antgeno O )

Antitoxina (cruzan con otras toxinas), dirigidos contra toxina CT

Usos:
Exposicin previa al clera
Circulacin silenciosa del agente
Grado de avance de una epidemia
Diseminacin de la enfermedad
 Insumos requeridos
DESCRIPCION Costo unitario $
(aproximado)
Medio de transporte Cary Blair (caja de 50 unidades). Incluir certificado de 45
control de calidad del lote que se est entregando. (Fecha de vencimiento no
menor a un ao al momento de ingreso al laboratorio). Catlogo BBL 220097
Prueba rpida para diagnstico del clera CHOLERA SMART II, caja para 25 250 *
determinaciones (Fecha de vencimiento no menor a 1 ao al momento de ingreso
al laboratorio). Catlogo New Horizons 89-113225
Agua peptona alcalina, caldo para enriquecimiento de Vibrio spp. Presentacin 120
500 gramos. Incluir certificado de control de calidad del lote que se est
entregando. (Fecha de vencimiento no menor a un ao al momento de ingreso al
laboratorio). Catlogo Sigma A0340- 500G u Oxoid 1028B
Agar TCBS, presentacin 500 gramos. Incluir certificado de control de calidad 120
del lote que se est entregando (Fecha de vencimiento no menor a un ao al
momento de ingreso al laboratorio). Catalogo OXOID CM0333B
Tiras de Oxidasa Microbact. Presentacin de 50 tiras. (Fecha de vencimiento no 50
menor a un ao al momento de ingreso al laboratorio). Catlogo Oxoid MB0266A
Deoxycolato de sodio (C24H39NaO4) >= 97% (titulacin). Presentacin en frasco de 40 **
25 gramos. Debe incluir ficha de seguridad. (Fecha de vencimiento no menor a
un ao al momento de ingreso al laboratorio). Catlogo Sigma-Aldrich D6750-25G
Antisuero polivalente, Vibrio cholerae O1. Presentacin 2 ml. (Fecha de 165
vencimiento no menor a un ao al momento de ingreso al laboratorio). Incluir
certificado de control de calidad del lote que se est entregando. Catlogo Denka
293831
..Gracias!!