Fundamento.

Es sabido que los pigmentos vegetales poseen espectros de absorcin

energtica a ciertas longitudes de onda segn su estructura molecular y
propiedades qumicas. La cuantificacin de estos pigmentos se basa en la
lectura de la densidad ptica a las longitudes de onda en las que la
absorbancia de luz es mxima para un determinado pigmento, de acuerdo a la
ley de Lamber y Beer. Esto se logra con un espectrofotmetro, que, como su
nombre lo indica, es un aparato que trabaja con el espectro luminoso, el cual
generalmente abarca longitudes de onda que van desde el ultravioleta hasta el
infrarrojo, amplitud espectral en la que absorbe la mayora de los pigmentos
fotosintetizadores.

El mtodo espectrofotomtrico implica la filtracin de volmenes grandes de

agua en sistemas Millipore o su equivalente para obtener suficiente material y
respuesta en las lecturas de la densidad ptica para cada pigmento. El lmite
inferior de deteccin corresponde a concentraciones de orden de 002 mg m-3;
se recomienda filtrar por lo menos medio litro para aguas costeras ricas en
fitoplancton y por lo menos diez litros para aguas pobres.
Para la obtencin de las muestras de agua se utilizan las botellas tipo van Dorn
o Niskin, mismas que pueden accionarse en profundidades determinadas
dentro de la columna de agua. Para filtrar las muestras usan sistemas de
Millopore de filtracin al vaci, de 47 mm de dimetro, porttiles e individuales
o bien sistemas mltiples e individuales o bien de sistemas mltiples de tres o
ms plazas.
Es necesario contar con bombas de vaco manuales o elctricas segn lo
requieran las condiciones del trabajo. La presin de vaco debe ser menor a 75
mm Hg o 0.7 bar y constante. Para filtrar agua se recomida usar filtros de
vidrio de Whatman CF/F que equivalen a un tamao de poro de 0.7 um, lo
que permite la retencin del micro y del nanoplancton; este ltimo puede ser el
componente ms importante del fitoplancton costero; adems, los filtros FG/F
no introducen turbidez a las muestras, cosa que suele suceder al usar
membranas de celulosa Millipore HA de 0.45 um de poro u otras de
policarbamato; asimismo, los filtros GF/F resultan ms baratos y de fcil
acceso.

En virtud de que tanto las clorofilas como los carotenoides son compuestos
lbiles se descomponen al ser expuestos a la luz, a cidos y a altas
concentraciones de oxgeno, es necesario tomar
precauciones para evitar la degradacin qumica y la fotooxidacin. Esto
implica trabajar con bajas temperaturas y baja iluminacin durante el proceso
de filtracin. En el campo se recomienda cubrir
el sistema de filtracin con un pao negro y estar en la sombra. Diversos
autores recomiendan cubrir los filtros con una solucin saturada de carbonato
de magnesio, compuesto que coadyuva a la estabilizacin del ncleo de
magnesio, evita la acidificacin y facilita la filtracin. Otros autores, tales como
Rowan (1989) consideran que el carbonato de magnesio no representa
beneficio alguno; otros lo recomiendan cuando la extraccin y anlisis de los
pigmentos no se hace en forma inmediata. En el caso que nos ocupa s se
recomienda su uso.
Una vez terminada la filtracin, el filtro debe doblarse con la ayuda de pinzas
de punta plana. Se debe evitar absolutamente el contacto con los dedos u otro
material que pudiera contaminar la muestra. El filtro se introduce en tubos
forrados con papel aluminio para evitar el efecto desfavorable de la luz; los
filtros se guardan en los tubos destapados, dentro de un recipiente que
contenga gel de slice de manera tal que se absorba la humedad; los filtros no
deben guardarse en papel aluminio. Se tapa el recipiente y se guarda en una
hielera. En el caso de una extraccin inmediata, el filtro se coloca
momentneamente sobre un papel absorbente antes de introducirlo en el
disolvente.

Extraccin

Para hacer la extraccin de los pigmentos pueden utilizarse diferentes

disolventes o una mezcla de ellos. Rowan (1989) recomienda la acetona al
90% para el fitoplancton marino, en virtud de que predominan grupos con
clorofilas cl, c2 y carotenoides y que dichos pigmentos se extraen mejor con
acetona.
Por el contrario, en el caso de fitoplancton de aguas epicontinentales, con
predominio de clorofila b, Rowan (1989) recomienda el metanol pues es mejor
disolvente para esta clorofila. Otros autores demuestran la bondad de una
mezcla de acetona y metanol, o bien de dimetilsulfuro con metanol.
Por lo genera] se agregan 10 mL de disolvente; es muy importante considerar
este volumen en los clculos de las concentraciones pigmentarias. Para una
mejor extraccin, se recomienda machacar el filtro con una varilla de vidrio que
posea un extremo cortante. En cuanto a la duracin de la extraccin, tambin
existen variantes: desde una extraccin inmediata hasta una de 24 horas o
ms. Cada caso tiene sus ventajas y desventajas. Una duracin corta evita la
degradacin de los pigmentos pero limita la total extraccin; por el contrario,
una larga duracin favorece la extraccin pero existe el riesgo de una
degradacin de los pigmentos. De acuerdo con nuestra experiencia, para
fitoplancton de lagunas costeras, una duracin dc 24 horas, en la oscuridad y
en refrigeracin, ha resultado adecuada.

Una vez transcurrido el tiempo de extraccin, las muestras se centrifugan

durante 15 minutos a 4 500 rpm. El sobrenadante se traslada a las celdas del
espectrofotmetro y se procede a hacer las lecturas. Es muy importante que las
celdas no estn rayadas o sucias pues esto altera la lectura de absorbancia; si
las celdas estn rayadas es necesario hacer una correccin para cada una
(Strickland y Parsons, 1972). Asimismo, para evitar un exceso de manipulacin
de las muestras se recomienda usar el mismo tubo desde la inclusin del filtro
hasta su centrifugacin.

Lecturas
Es indispensable que el espectrofotmetro cuente con una lmpara de
tungsteno con comando para absorbancia y con escala de longitudes de onda
que abarque, mnimo de 400 a 800 nanmetros, cuya precisin sea de por lo
menos 2 nm; de preferencia, 1 nm. Los ms usuales slo cuentan con celdas
de 1 cm de paso de luz, lo cual limita el anlisis de muestras pobres en
pigmentos; en esos casos, se requiere de un espectrofotmetro que cuente con
celdas de 4,5 o 10 cm de paso dc luz para poder detectar bajas
concentraciones pigmentarias. La seleccin de las longitudes de onda
depender del tipo de pigmentos que se deseen analizar. Como regla general,
siempre hay que hacer una lectura a 750 nm, longitud en la que se detecta
turbidez de la muestra dada por otros compuestos diferentes a los pigmentos
fotosintetizadores; este valor deber ser igual o menor a 0.005 de densidad
ptica (si es mayor habr que centrifugar nuevamente) y tambin ser sustrado
invariablemente a las lecturas hechas en las longitudes de onda seleccionadas.
Al respecto, tenemos el mtodo tricromtrico que permite la lectura de las
clorofilas a, b, c1 y c2, para lo cual hay que leer a 664, 647 y 63O nm y aplicar
las frmulas de Jeffrey y Humphrey (1975):
Clorofila a (mg. X m-3)=

( 11.8 A 6641.54 A 6470.08 A 630 ) x v

Vx 1

Clorofila b (mg m-3)=

(5.43 A 664+21.03 A 6472.66 A 630 ) x v

Vx 1

Clorofila c1 y c2 (mg m-3)=

(1.67 A 6647.60 A 647+24.52 A 630 ) x v

Vx 1

Donde

A= densidad ptica leda en el espectrofotmetro a la longitud de onda indicada

como subndice.

v = volumen del solvente expresado en mL (generalmente 10 mL)

V = volumen de agua filtrado, expresado en L

I = tamao del paso del haz de luz que atraviesa la celda (generalmente 1 cm)

Los distintos valores que aparecen en las formulas corresponden a los

coeficientes de extincin de las diferentes clorofilas.

Estimacin de feopigmentos

Para determinar las concentraciones de la clorofila a y de loa feopigmentos por

espectrofotometra se harn lecturas a 665 nm antes y despus de acidificar; la
acidificacin se hace con cido clorhdrico 0.3 molar, se aaden dos gotas a
cada muestra se homogeneiza y se esperan dos minutos; posteriormente se
vuelve a leer a 750 nm y 665 nm el. pH final de las muestras es muy importante
y debe quedar comprendido entre 2.6 y 2.8. Para los clculos se aplican las
frmulas propuestas por Lorenzen (1976);
Clorofila a (mg m-3)=

26.7 ( A 665 naA 665 a ) xv

Vx 1

Feopigmentos (mg m-3)=

26.7 ( 1.7 A 665 aA 665 na ) xv

Vx 1

Donde

A = densidad ptica leda en el espectrofotmetro a 665 mn

v = volumen del solvente en mL (acetona al 90% y generalmente 10 mL)

V = Volumen de agua filtrado, en L

L= tamao del paso del haz de luz que atraviesa la celda (generalmente 1 cm)
na = antes de acidificar
a = despus de acidificar

Estimacin de Carotenoides.

Se procede de la misma forma que para el mtodo tricromtico) pero en este

caso se hacen las lecturas a 480 nm y 510 nm y se aplican las frmulas de
Strickland y Parsons (1972):

Estimacin de carotenoides,
Se procede de la misma forma que para el mtodo tricromticos pero en este
caso se hacen las lecturas a 480 nm y 510 nm y se aplican las formulas de
Stricklsnds y Parsons (1972).

1) Carotenoide (mgm-3)

A 4801.49 A 510 xv 1

7.6

2) Carotenoides (mg m-3)=

4.0 ( A 480 )1.49

Vx 1

3) Carotenoides (mgm-3).

10.0 S 48 0 x v /Vx 1

dnde
A= absorbancia ledo, expresando en mL
v= volumen del disolvente
V= volumen muestra-.
L= tamao del paso de luz que atraviesa

En este caso, para la determinacin de pigmentos por espectrofotometra, el

material idneo es: botella tipo van Dom, Niskin o General Oceanic,
espectrofotmetro con escala de 400 a 800 nanmetros, centrfuga, sistemas
de filtracin Millipore, bomba de vaco, celdas limpias para espectrofotmetro,
tubos de centrfuga, pipeta de 10 ml, pipeta Pasteur, gradilla, pinzas de punta
plana, filtros GF/F de 4.7 cm de dimetro, varilla de vidrio paraflim, acetona al
90%, solucin saturada de carbonato de magnesio (MgCO3), HCl 0.3 molar.

Fundamento

La clorofila a es el nico pigmento presente en todos los fotoauttrofos que

liberan oxgeno por la va fotosinttica por lo que ha sido considerada como un
buen indicador de la eficiencia fotosinttica y de biomasa vegetal a pesar de
que su proporcin, respecto al peso seco, puede variar entre 0.1% a 5% en
respuesta a cambios fisiolgicos, de irradianza, de temperatura y de
disponibilidad de nutrimentos (Kirk, 1983).
Este pigmento fotosintetizador puede ser cuantificado por f1uorometria en
virtud de que emite luz en el rojo (665 nm), es decir, fluoresce a
esa longitud de onda despus de haber sido excitado con luz azul (440 nm).
Diversos autores han comprobado y demostrado la mayor precisin que tiene
este mtodo en comparacin con el espectro fotomtrico; segn Jeffrey et al.
(1997) puede llegar a ser hasta 50 veces ms sensible adems requiere poco
volumen filtrado de agua, a diferencia del espectrofotomtrico que implica
filtrado de hasta 10 o 15 Litros en aguas oligotrficas. Sin embargo, adolece de
ciertas limitaciones como es la interferencia con otros pigmentos, en particular
con la clorofila b (Spinrad et al., 1994).

E1 mtodo fluoromtrico tambin puede aplicarse a muestras in vivo y de

continuo, lo cual proporciona informacin sobre el estado del fito plancton en
tiempo real y sus cambios en el espacio. Un embargo, las lecturas son menos
eficientes que Je muestras con disolventes (Jeffrey et al, 1997) (Revisar
bibliografia 2.3.).