I.

Prosedur
4.1 Skrining Fitokimia

4.1.1 Alkaloid
Simplisia dan bahan uji ditempatkan pada tabung reaksi lalu
diasamkan dengan asam klorida 2 N, lalu disaring. Filtrat
dibasakan dengan larutan amonia 10%, kemudian ditambahkan
kloroform dan dikocok kuat-kuat. Lapisan kloroform dipipet
sambil disaring, kemudian kedalamnya ditambahkan asam klorida
2 N lalu dikocok kuat-kuat sampai terdapat 2 lapisan dan lapisan
asam dipipet dan dibagi tiga bagian: pada bagian 1 ditambahkan
pereaksi Mayer dan adanya endapan putih atau kekeruhan
menandakan positif alkaloid, pada bagain 2 ditambahkan pereaksi
Dragendorff dan adanya endapan jingga-kuning atau kekeruhan
menandakan positif alkaloid, dan bagian 3 digunakan sebagai
blangko.
- Pembuatan pereaksi Mayer : 1,36 gram HgCl2 dilarutkan
dalam 60 ml air dan 5 gram KI dilarutkan dalam 10 mL air,
kemudian dicampurkan dan digenapkan dengan air hingga 100
mL.
- Pembuatan pereaksi Dragendorff : 8 g Bi(NO3)3.H2O
dilarutkan dalam 30% b/v HNO3 dan 27,2 g KI dilarutkan
dalam 50 mL air, lalu kedua larutan tersebut dicampurkan dan
dibiarkan selama 24 jam, disaring, lalu digenapkan dengan air
hingga 100 mL.

4.1.2 Senyawa Polifenolat

Simplisia ditempatkan pada tabung reaksi lalu ditambahkan
air secukupnya, lalu dipanaskan diatas penangas air dan disaring.
Ditambahkan larutan pereaksi besi (III) klorida kedalam filtrat dan
timbulnya warna hijau atau biru-hijau, merah ungu, biru-hitam
hingga hitam menandakan positif fenolat atau timbul endapan
coklat menandakan adanya polifenolat.

4.1.3 Flavonoid
1 gram simplisia ditempatkan dalam gelas kimia, kemudian
ditambahkan 100 mL air panas dan dididihkan selama 10 menit.
Campuran disaring, filtrat ditampung sebagai larutan c yang
nantinya akan digunakan untuk pemeriksaan golongan senyawa
flaonoid, saponin, dan antrakuinon.
5 mL larutan C dimasukkan kedalam tabung reaksi,
kemudian ditambahkan serbuk magnesium dan 1 mL asam klorida
pekat. Kemudian ditambahkan amilalkohol, dikocok kuat lalu
dibiarkan sampai terjadi pemisahan. Terbentuknya warna dalam
lapisan amilalkohol menunjukkan adanya golongan senyawa
flavonoid

4.1.4 Saponin
5 mL larutan C dimasukkan kedalam tabung reaksi dan
dikocok secara vertikal selama 10 detik. Dibiarkan selama 10
menit. Terbentuknya busa 1 cm yang stabil didalam tabung reaksi
menunjukkan adanya golongan senyawa saponin. Dan busa
tersebut masih bertahan (tidak hilang) setelah ditambahkan
beberapa tetes asam klorida.

4.1.5 Antrakuinon
5 mL larutan C dimasukkan kedalam tabung reaksi.
Ditambahkan beberapa tetes larutan natrium hidroksida 1 N.
Terbentuknya warna kuning hingga merah menunjukkan adanya
golongan senyawa kuinon.

4.1.6 Tanin
 1 gram simplisia dicampurkan dengan 100 mL air panas,
kemudian dididihkan selama 15 menit. Kemudian campuran
didinginkan dan disaring dan filtrat dibagi menjadi 3 bagian dalam
tabung reaksi.
Kedalam filtrat pertama ditambahkan larutan besi (III)
klorida 1%. Terbentuknya warna biru tua atau hitam kehijauan
menunjukkan adanya golongan senyawa tanin.
Kedalam filtrat kedua ditambahkan larutan gelatin 1%.
Terbentuknya endapan putih menunjukkan keberadaan senyawa
tannin.
Kedalam filtrat ketiga ditambahkan 15 mL pereaksi steasny,
lalu dipanaskan dengan penangas. Terbentuknya endapan merah
muda menunjukkan adanya tannin katekat.
Hasil uji filtrat ketiga disaring. Filtrat dijenuhkan dengan
penambahan natrium asetat, kemudian ditambahkan beberapa tetes
larutan besi (III) klorida 1%. Terbentuknya warna biru
menunjukkan adanya tanin galat.
- Pembuatan Pereaksi Steasny : 2 bagian formaldehid 30%
dicampurkan dengan 1 bagian asam klorida pekat

4.1.7 Monoterpen dan Seskuiterpen

Simplisia digerus dengan eter lalu disaring. Filtrat
ditambahkan dalam cawan penguap dan dibiarkan menguap sampai
kering. Lalu ditambahkan larutan vanilin 10% dalam asam sulfat
pekat dan timbulnya warna-warna menandakan positif senyawa
mono dan seskuiterpen

4.1.8 Triterpenoid dan Steroid

Simplisia digerus dengan eter lalu disaring. Filtrat
ditempatkan dalam cawan penguap dan dibiarkan menguap sampai
kering, lalu ditambahkan larutan pereaksi Liebermann Burchard
 dan terjadinya warna merah-ungu menandakan positif triterpenoid,
sedangkan bila warna hijau-biru menunjukkan positif steroid.
Pembuatan pereaksi Liebermann Burchard : 1 mL asam asetat
anhidrat dicampur dengan 1 mL klorofom, lalu didinginkan pada
suhu 0o C, lalu ditambahkan 1 tetes asam sulfat pekat.
4.2 Ekstraksi

4.2.1 Soxhlet

Alat soxhlet dipastikan bersih, labu destilasi yang akan

digunakan dibilas dengan etanol, batu didih dimasukkan kedalam
labu bundar. Simplisia ditimbang sebanyak 350 gr kemudian
dimasukkan kedalam tabung soxhlet dan ditambahkan pelarut
etanol. Setelah itu pemanas dinyalakan, panaskan sampai pelarut
naik dan turun yang dianggap sebagai 1 siklus. Filtrat didinginkan
dan disaring menggunakan kertas saring kemudian disimpan dalam
wadah penampung.

4.2.2 Prosedur Pemekatan Ekstrak

Ekstrak cair dimasukkan kedalam alat vaccuum rotary

evaporator, suhu evaporator diatur pada suhu kurang lebih 30
40oC. Vaccuum rotary evaporator dijalankan, setelah pelarut
berkurang, tambahkan ekstrak cair Dilakukan hingga seluruh
ekstrak cair yang diperoleh terpekatkan.

4.3 Pemantauan Ekstrak

Kromatografi Lapis Tipis
Chamber dan fase gerak disiapkan dan dimasukkan
kedalam chamber kemudian kertas saring dimasukkan, ditutup dan
dibiarkan bejana jenuh. Ekstrak dilarutkan dalam beberapa mL
pelarut sampai diperoleh ekstrak yang tidak terlalu kental dan tidak
terlalu encer. Plat KLT diaktivasi dengan cara disimpan didalam
oven selama 15 menit. Ekstrak ditotolkan ke plat KLT dengan pipa
kapiler. Ekstrak dibiarkan kering dan plat KLT disimpan dalam
 chamber. Dibiarkan Fase Gerak naik hingga batas garis. Diangkat
plat KLT dan dibiarkan mengering. Kemudian dilihat pada sinar
UV dengan panjang gelombang 254 nm dan 366 nm.
4.4 Fraksinasi
4.4.1 Ekstraksi Cair Cair
Corong pisah ukuran 250mL disiapkan dalam keadaan
bersih, kemudian dibilas terlebih dahulu menggunakan etanol
kemudian keringkan, ekstrak ditimbang sebanyak 2gram sebanyak
6 kali kemudian dilarutkan dalam 95mL air dan ethanol 5mL,
dimasukan kedalam corong pisah, kemudian ditambahkan pelarut
n-Heksan sebanyak 100mL sebanyak 2x, fraksi ditampung.
Selanjutnya filtrat yang terdapat didalam corong pisah
ditambahkan pelarut baru diganti menggunakan etil asetat
sebanyak 2x kemudian fraksi etil di tampung ke botol, kemudian
sisa fraksi air ditampung ke botol, selanjutnya fraksi n-heksan dan
fraksi etil asetat di evaporasi menggunakan evaporator hingga
terjadi pemisahan antara pelarut dengan fraksi yang didapatkan.
Kemudian hasil fraksi dipekatkan hingga pekat di penangas air.
Masing- masing hasil fraksi di larutkan pada etanol
secukupnya, kemudian masing masing fraksi di uji KLT. Hasil
KLT yang telah dipilih adalah fraksi n-heksan untuk dilakukan uji
KCV.

4.4.2 Kromatografi kolom

Eluen dan botol vial 10 ml disiapkan sebanyak 17 vial.

Ekstrak kental dan silika gel 60 ditimbang dan dilarutkan eluen
dalam wadah yang berbeda sambil diaduk. Ujung kolom disumbat
dengan kapas bebas lemak. Lalu eluen dimasukkan kedalam kolom
sambil kran dibuka sedikit-sedikit. Kemudian adsorben
dimasukkan sedikit-sedikit hingga diperoleh adsorben padat dan
tidak ada udara yang terjebak. Eluen diturunkan hingga lapisan
tipis permukaan eluen diatas permukaan adsorben. Lalu kran
 ditutup. Lapisan atas permukaan adsorben ditutup dengan kertas
saring khusus. Kemudian ekstrak dimasukkan sedikit demi sedikit
diatas permukaan adsorben yang telah dilapisi kertas saring
khusus. Lalu ditambahkan eluen sedikit demi sedikit hingga
permukaan eluen minimum sekitar 2 cm diatas permukaan larutan
ekstrak. Kran dibuka, hingga eluen turun. Fraksi ditampung dalam
botol vial 10 ml. Lalu dipekatkan dan ditimbang. Kemudian
dilakukan pemantauan fraksi dengan KLT preparatif, dilihat warna
bercak dibawah sinar tampak, sinar UV 254 nm dan 366 nm.

4.5 Teknik Pemisahan dan Pemurnian

4.5.1 KLT preparatif

Disiapkan pelat KLT tebal khusus untuk KLT preparatif.

Ditotolkan fraksi hasil kromatografi kolom/ KCV membentuk pita
bergaris tepat 1 cm dari ujung bawah pelat. Disiapkan eluen yang
sama dengan yang digunakan untuk pemantauan KLT pada fraksi
yaitu n-heksan : Etil Asetat (50 : 50). Dijenuhkan chamber terlebih
dahulu dengan cara memasukkan kertas saring ke dalam chamber
yang telat diisi eluen, kemudian didiamkan hingga kertas saring
terbasahi sempurna. Dimasukkan pelat KLT yang telah berisi
totolan isolat ke dalam chamber. Didiamkan hingga pada pelat
diperoleh bercak yang telah memisah sempurna/ sudah terelusi.
Dilakukan pemantauan bercak dengan menggunakan sinar UV 254
nm/352 nm. Dikerok bercak pita yang diduga senyawa target, lalu
dimasukkan ke dalam gelas kimia. Ditambahakan pelarut
Methanol, lalu disaring larutan hingga silika gel terpisah. Filtrat
kemudian diuapkan hingga diperoleh kristal atau hingga sedikit
pekat.

4.6 Uji kemurnian

4.6.1 KLT Satu Dimensi
Disiapkan tiga buah Chambers dimana masing-masing
Chambers berisi eluen yang berbeda, Chambers pertama berisi n-
 heksan 5ml, Chambers kedua berisi etil asetat 5ml, Chambers
ketiga berisi methanol 5ml, kemudian Chambers dijenuhkan. Plat
KLT yang sudah disiapkan dan ditandai dilakukan aktivasi terlebih
dahulu. Kemudian totolkan larutan dibagian tengan plat KLT.
Dimasukan plat KLT kedalam masing-masing Chambers yang
berisi larutan berbeda, dilakukan elusi samapai eluen menaik
sempurna. Plat KLT yang sudah dielusi kemudian diangkat lalu
dilakukan analisis dengan sinar UV 352.
4.6.2 KLT Dua Dimensi
Disiapkan dua bauah Chambers dimana masing masing-
masing Chambers berisi eluen, Chambers pertama berisi elun n-
heksan : etil asetat (7:2) dan Chambers kedua berisi n-heksan : etil
asetat (2:7), kemudian Chambers dijenuhkan. Plat KLT yang sudah
disiapkan dan ditandai dilakukan aktivasi terlebih dahulu.
Kemudian totolkan larutan tepat disemailah kiri plat KLT.
Dimasukan plat KLT kedalam Chambers pertama lalu dibiarkan
sampai eluen menaik sempurna. Plat KLT diangkat lalu dilakukan
analisis dengan sinar UV pada panjang gelombang 352. Kemudian
plat KLT dimasukkan kedalam Chambers kedua dengan terlebih
dahulu memutar plat sebesar 900 C sehingga bercak tepat berada
dibawah, kemudian dibiarkan sampai eluen menaik sempurna. Lalu
dilakukan analisis dengan sinar UV pada panjang gelombang 352.
Dilakukan analisi apakah pada plat KLT memperlihatkan adanya
pengotor atau tidak.
4.7 Karakterisasi isolate
Spektrofotometri UV
Dimasukan metanol kedalam kupet sebagi blangko,
kemudian dilihat panjang gelombangnya. Kemudian masukan
larutan dan diencerkan dengan sedikit metanol, diamsukan
kedalam kuvet dan dilihat panjang gelombang yang ditunjukan
dengan menggunakan spektrofotometer UV.