Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias

Biolgicas

Laboratorio Mtodos de Anlisis

Prctica:
Separacin de protenas por
electroforesis en gel de poliacrilamida

Morales Ramrez Tania

4IM2

Seccin 2

Prof.: Acua Gonzlez Carolina

 14/Noviembre/2016
Objetivos

Efectuar la separacin de protenas de varias muestras mediante la

tcnica de electroforesis en gel de poliacrilamida.
Determinar cul es el tamao ptimo del poro del gel para la mejor
separacin de cada una de las muestras utilizadas.

Fundamento

La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo

elctrico; Estas partculas migran hacia el ctodo o nodo (electrodos - y +), en
dependencia de una combinacin de su carga, peso molecular y estructura
tridimensional. La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en
electroforesis en gel, es qumicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de
ser preparado de forma rpida y reproducible. Forma, adems, geles
transparentes con estabilidad mecnica, insolubles en agua, relativamente no
inicos y que permiten buena visualizacin de las bandas durante tiempo
prolongado. Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de
polmeros, se puede modificar de manera controlada el tamao del poro

Datos experimentales e informe

%T= %T=
5.5 7.5

Suero Clara

Yogurt
 %T= %T=
Caracterstica 10
%T 5.5 7.5 12.510.0 12.5
Figura 1. Corrimiento de protenas a travs del gel de poliacrilamida
Longitud del gel antes 7.5 7.5 7.0 7.5
de teir, cm, (l)
Longitud del gel 8.0 8.0 7.7 8.2
despus de teir, cm, (l)
Distancia recorrida por 5.9 6.0 5.7 5.2
el colorante, cm, (f)
No. De bandas Suero 7.0 6.0 13.0 7.0
en: Yogurt 3.0 5.0 7.0 4.0
Clara 7.0 9.0 11.0 10.0
Tabla 1. Caractersticas de los electroferogramas a diferentes %T

%T Muestra Valores de m de la Valor Movilidad Log (Mx100)

protena seleccionada promedio electrofortic
(cm) de m (cm) a relativa M
5.5 Suero 6.2 6.2 6.1 6.1666666 0.9788 1.990693961
7
Yogurt 4.7 4.8 4.8 4.7666666 0.7523 1.876391062
7
Clara 6.3 6.2 6.4 6.3 1.001 2.000434077
7.5 Suero 5.6 5.6 5.6 5.6 0.875 1.942008053
Yogurt 4.6 4.55 - 4.575 0.7148 1.854184544
Clara 6 6 5.9 5.9666666 0.9312 1.969042967
7
10 Suero 4.2 4.3 4.3 4.2666666 0.6794 1.832125543
7
Yogurt 3.7 3.6 3.6 3.6333333 0.5794 1.762978491
3
Clara 5.1 5 5.1 5.0666666 0.807 1.906873535
Tabla 2. Movilidad electrofortica relativa promedio. 7
12.5 Suero 3.4 3.4 3.5 3.4333333 0.6038 1.780893109
3
Yogurt 3.2 3.2 - 3.2 0.5628 1.750354089
Clara 4.2 4.2 4 4.1333333 0.7269 1.861474669
3
 Ejemplo de clculo de movilidad:

l m
M =( ' )( )
l f

Para %T = 10

Suero:
M= ( 7.77 cmcm )( 4.26 cm
5.7 cm )
=0.6794

LOG (0.6794x100)=1.7486

Yogurt:
M= ( 7.77 cmcm )( 3.63 cm
5.7 cm )
=0.5794

Tabla 2. Movilidad electrofortica relativa promedio

LOG (0.5794x100)=1.7629

Clara:
M= ( 7.77 cmcm )( 5.06 cm
5.7 cm )
=0.807

LOG (0.807x100)=1.9068
 Grfica de Ferguson
1.2

1
f(x)
f(x) =
= -- 0.04x
0.06x +
+ 1.22
1.28
R = 0.99
R = 0.97 Suero
0.8
Linear (S
f(x) = - 0.03x + 0.92
Yogurt
0.6 R = 0.91
Log (M X 100) Linear (Yo
Clara
0.4
Linear (C

0.2

0
4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

%T

Grfica 1. Grafica de Ferguson para muestras.

1. Concluya acerca del tamao molecular relativo de las protenas y sus
cargas elctricas relativas al pH del regulador de trabajo (8.7-9.1).
De acuerdo a la grfica de Ferguson se pueden determinar ambas caractersticas.
El tamao molecular relativo est dado por la pendiente de la recta de cada una
de las muestras analizadas; el valor obtenido es negativo, sin embargo se toma el
valor absoluto de estas, siendo el Yogurt la muestra que tiene el tamao molecular
relativo ms grande, seguido por la clara de huevo y finalmente el suero humano
con el tamao molecular relativo ms pequeo de las tres muestras.

Con respecto a las cargas elctricas relativas, se pueden aproximar con la

ordenada al origen. Las protenas poseen determinada carga elctrica con grupos
aninicos y catinicos capaces de disociarse. La carga neta de la partcula est
dada por el pH del medio y puede ser modificada por la interaccin con pequeas
molculas de iones u otras macromolculas. En el caso de las muestras
trabajadas se sabe que tienen carga negativa y se desplazan hacia el anodo, el
pH utilizado no afecta ya que est regulado. Sabiendo esto y comparando con los
resultados obtenidos, se muestra al suero con mayor carga relativa, seguido por la
clara de huevo y con una menor carga elctrica el yogurt.

2. Diga cual %T recomienda para la separacin de las protenas de cada

muestra Por qu?
%T 5.5 7.5 10 12.5
No. De bandas Suero 7.0 6.0 13.0 7.0
en: Yogurt 3.0 5.0 7.0 4.0
Clara 7.0 9.0 11.0 10.0

De acuerdo al nmero de bandas obtenido, en este caso se recomienda el 10%T,

ya que se consideran estos %T como el tamao ptimo del poro del gel para cada
muestra. Al tener un mayor nmero de bandas, nos indica que su poder de
resolucin es mayor con respecto a otros.
 3. Escriba la reaccin completa para la copolimerizacin de la acrilamida y
la bis-acrilamida por radicales libres, Qu funcin tienen el TEMED y el
persulfato de amonio?

Acrilamida Metilen-bis-acrilamida

Polimerizacin
(TEMED, PSA)

Enlace bis-acrilamida

Poliacrilamida

La reaccin de polimerizacin se inicia por un sistema redox de catlisis. El

TEMED cataliza la formacin de radicales libres que dirigen la reaccin a partir del
in persulfato que se aade en forma de APS y que acta como iniciador.

4. Mencione una aplicacin de la electroforesis preparativa y una de la

electroforesis analtica.
 Electroforesis preparativa: Obtencin de polinucletidos, y recuperacin de
los mismos para estudios o aplicaciones diversas.
Electroforesis analtica: Identificacin de los compuestos separados para
ser utilizados en mtodos pticos, radio qumicos o ensayos biolgicos.

5. Defina velocidad de migracin y movilidad electrofortica. Explique la

diferencia.

Velocidad de migracin: En electroforesis la velocidad de la molcula se le

conoce como velocidad de migracin electrofortica. Es directamente
proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial
elctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de friccin (f)
relativo a la talla y forma de la molcula, o sea, a la resistencia que le
ofrece el medio.
v=qE/f
Movilidad electrofortica: Es un caso particular de la velocidad de migracin
de un in, cuando se aplica un campo elctrico de 1 V/cm. Su signo es igual
al de la carga de la partcula.

6. Defina el termino electroferograma.

Cuadro densitometrico o colorimtrico obtenido con tiras de papel de

filtro sobre las cuales sustancias se han separado por electroforesis.
Grfico realizado con los resultados de un anlisis por electroforesis que
muestra la secuencia de datos producida por una mquina automtica
de secuenciacin de ADN.

7. Tcnica de inmunoelectroforesis.

La inmunoelectroforesis es una tcnica que se realiza en dos fases. Primero se

separa la mezcla de Ags por electroforesis y posteriormente el antgeno que se
desea detectar se hace reaccionar con un anticuerpo especfico colocado en un
pocillo lateral. Por difusin llegan a encontrarse los antgenos y el antisuero,
apareciendo el complejo Ag-Ac visible en forma de lneas de precipitacin que
pueden ser estudiadas por comparacin con un sistema estndar. En Inmunologa
clnica, esta tcnica puede utilizarse en la identificacin de las protenas de
mieloma.

Discusin

En esta prctica se llev a cabo la separacin de tres protenas conocidas por

electroforesis en gel de poliacrilamida, para esto, se arm primeramente el marco
del gel para despus preparar el soporte que se compone de un gel separador y
un gel empacador.

Para la preparacin del gel separador, cada equipo lo hizo con diferentes
concentraciones de las soluciones ya establecidas, esto con el fin de saber que
concentracin final de acrilamida es recomendada para la separacin de estas
protenas; esto se puede ver reflejado ya que las concentraciones de estas
preparaciones influyen en el tamao del poro del gel debido a los
entrecruzamientos que ocurren entre las cadenas de poliacrilamida. En la
preparacin del gel, la polimerizacin de los monmeros de acrilamida produce
cadenas lineales. Al incluir bis-acrilamida, sta da lugar a puntos de ramificacin
en el polmero, lo que permite formar una matriz tridimensional, dando lugar al gel
de poliacrilamida. El tamao de los huecos o poros que forma la retcula del
polmero depende de la concentracin de acrilamida y del grado de
entrecruzamiento (de la proporcin de bis-acrilamida con respecto al total). As,
variando la concentracin de acrilamida y bis-acrilamida en la preparacin del gel
se consiguen distintos grados de porosidad y, por tanto, distintos intervalos de
separacin de protenas. Se aadi el Tris-HCl que cumple la funcin de tampn.
Adems del persulfato de amonio, el cual fue el iniciador de la polimerizacin, que
al disolverse con el agua genera radicales libres que transforman la acrilamida en
radical libre y se inicia la polimerizacin. Tambin se aadi al medio TEMED
(N,N,N,N-tetrametil-etilendiamina) como catalizador porque puede existir en
forma de radical libre. El SDS tiene la propiedad de unirse a las cadenas
polipeptdicas en una proporcin masa:masa constante, de modo que en el
complejo SDS-protena la carga de la protena queda enmascarada por la de las
mltiples molculas de SDS y sta es proporcional al tamao (n de aminocidos).

El gel empacador se prepar y se adicion hasta el borde de las placas colocando

posteriormente el peine. Cuando este polimerizo se procedi a colocar las placas
en las cmaras donde se llev a cabo la electroforesis verificando que no
existieran fugas y as poder colocar la sustancia reguladora con el extremo
cuidado de que no existieran burbujas. Se aplicaron las muestras en los espacios
formados por el peine, las cuales ya se encontraban mezcladas con el azul de
bromofenol, el cual solamente nos ayuda a observar el corrimiento de estas en el
gel, ya que este no tie a las protenas, por lo que cumple con la funcin de
indicador.

Se conectaron los electrodos cuando las muestras se encontraban en el gel

empacador, y se aument cuando estas llegaron al gel separador, esto se hizo
porque el gel empacador como su nombre dice empaca y compacta todas las
protenas que estn corriendo, para que as entren al mismo tiempo todas en
contacto con el gel separador y aumentando el voltaje estas corran a distintas
velocidades para as medir despus su corrimiento. El corrimiento se pudo deducir
ya que las protenas que se utilizaron tienen carga negativa y se dirigieron hacia el
nodo (carga positiva) de la cmara electrofortica.

Cuando las muestras corrieron lo suficiente hasta llegar 1cm antes del borde
inferior del gel se apag la cmara, sin embargo en nuestro caso las muestras
tardaron ms de lo establecido en tiempo que se tena para correr por lo que el
corrimiento se detuvo antes de llegar al centmetro. Se retiraron los geles y
posterior a esto se fijaron con TCA, el cual desnaturaliza a las protenas y les
brinda un medio cido, por lo que el color del medio vira a un color amarillo. Una
vez que las protenas estaban ya fijas, se tieron con azul de Coomassie, el cual
es el color que se observa en los geles y nos permite contar el nmero de bandas
obtenidas en la prctica.

Con los resultados obtenidos, se puede decir que conforme el %T aumentaba la

distancia recorrida era menor, lo que nos indica que el tamao del poro es ms
chico con respecto a los anteriores, lo cual se debera haber visto reflejado en el
nmero de bandas, sin embargo fue 10%T la concentracin que mejor separ a
las 3 muestras.

De acuerdo a la grfica de Ferguson se puede determinar el tamao molecular

relativo de las muestras utilizadas teniendo como resultado que la protena del
yogurt tiene el peso molecular ms grande, seguido por la clara de huevo y
finalmente el suero humano, bibliogrficamente se esperaba tener a la protena del
suero con el mayor peso molecular (67,000 Da), seguido de la protena de la clara
de huevo seleccionada (45,000 Da) y finalmente la protena del yogurt (23,600
Da), la nica coincidencia encontrada, fue la clara de huevo en segundo lugar.

Conclusiones
 Se efecto la separacin de protenas mediante la electroforesis en gel
de poliacrilamida.
Mediante la grfica de Ferguson se determinaron el peso molecular
relativo y la carga elctrica relativa de cada muestra.
La protena ms grande fue el Yogurt, seguido de la clara de huevo y el
suero sanguneo.
Mediante el nmero de bandas se determin que el %T recomendado es
de 10.

Bibliografa

http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/inmunoquimica.pdf
Fuentes, X., Castieiras, M., Queralt, J., Bioqumica clnica y
patologa molecular, Vol.1, 2, edicin, Editorial Revert, Espaa,
1998. Pags: 311-312.
Berg, J., Tymoczko, J., Stryer, L., Bioqumica, 6a. edicin,
Editorial Revert. USA, 2007. Pgs: 72-74
Voet, D., Voet J., Bioqumica, 3 edicin, Editorial Panamericana,
USA, 2004. Pgs: 152-155.