INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERA CAMPUS

GUANAJUATO

Tecnologas de produccin de Biomolculas

7BM1
Equipo 6:

- Campos Falcn Erick de Jess

- Galvn Cantero Vctor Giovanni
- Hernndez Muoz Aldo Fabian
- Lpez Castaeda Mariana Profesora:
- Olvera Gonzlez Dennis Hiram Karla Lizbeth Macas Snchez
- Ramrez Casas Jessica del Roco 1
Introduccin
Bacillus spp. son los productores de protenas homlogas y heterlogas, antibiticos, nucletidos,
biosurfactantes, biocombustibles y biopolmeros. Es el principal productor de casi todas las proteasas
detergentes.

Bacillus licheniformis, es una bacteria Gram positiva, crece a 37-50C y tiende a formar esporas. Se
encuentra comnmente en el suelo y plumas de aves. Es utilizado para:

La produccin industrial; de enzimas, antibiticos y pequeos metabolitos .

Produccin de proteasas (detergentes) a altos niveles de pH.

Cambios de color en las plumas de las aves.

Fig. 1. Bacillus licheniformis
B. licheniformis es parte del grupo subtilis junto con Bacillus subtilis y Bacillus pumilus. Estas bacterias son comnmente conocidas
por causar intoxicacin alimenticia y deterioro de los alimentos. B. licheniformis tambin es conocido por contaminar los
productos lcteos. 2
El -PGA es un biopolmero aninico, soluble en agua y
biodegradable.

Constituido por 10 000 monmeros de D- y L- cido

glutmico.

Forma enlaces -peptdicos. Fig. 2.-Estructura qumica del cido poli(-glutmico)

Peso molecular de 10-1000 kDa en su produccin

con Bacillus spp.

Aumenta la viscosidad del caldo de fermentacin

durante el cultivo (pseudoplstico).

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- Las proteasas detergentes se fabrican en grandes cantidades en la industria
de los detergentes, esta industria representa ms de un tercio del mercado de
enzimas industriales.

- Bacillus spp produce -PGA (cido gamma poliglutmico), este puede ser
degradado qumicamente o enzimticamente por depolimerasas especficas,
tambin se obtiene como subproducto no deseado de otros procesos.

- La viscosidad del caldo de fermentacin puede alterar la mezcla, la masa

gas/lquido y la transferencia de calor en el cultivo. Pseudoplstico:
disminuye la viscosidad aparente aumenta la velocidad de corte.
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Existe una condicin llamada fuera de fase; en la que el lquido de un frasco de agitacin, no sigue la
fuerza de rotacin que genera el agitador. Esta condicin provoca la reduccin de mezclas y
transferencias de masa.

La produccin de un biopolmero
(pseudoplstico):

- Afecta en fermentaciones con tanque

agitado.

- La velocidad de corte es ms baja que en

un frasco de agitacin.

- Las viscosidades aparentes en caldos de

fermentacin son mayores en un tanque
agitado.
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Hay fuera de fase si la viscosidad es elevada, el lquido permanece en el fondo
del frasco con potencia de entrada reducida.

** Este estudio demuestra el fenmeno de la produccin indeseada de -PGA de

una proteasa industrial que produce la cepa de Bacillus licheniformis

que puede aplicarse para cultivos de biorreactores de tanque agitado y un frasco

de agitacin. Usando un intercambio de una fuente nitrgeno a un medio minera
definido.Los medios simples de las mediciones de viscosidad con un remetro se
eligieron para seguir fcilmente la produccin de -PGA durante fermentaciones
en comparacin con tcnicas analticas ms complicadas y que consumen ms
tiempo como la cromatografa de permeacin en gel.
6
Metodologa: Cepa microbiana y medio de cultivo
La cepa fue proporcionada por
Henkel AG & Co.

Los qumicos fueron

comprados los cuales son de
grado analitico

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Metodologa: Cepa microbiana y medio de cultivo
Precultivo: El medio de cultivo principal contiene por litro:

25 g caldo de infusin de 20g de glucosa

1.01g MgSO4 7H2O
ternera 0.026 g CaCl2 2H2O
0.05 g MnCl2 4H2O
15 g (NH4)2SO4
5 g extracto de levadura 5 ml de elementos traza de la solucin
madre
0.05 g FeSO4 7H2O
41.85 g (0.2 M) MOPS acid
3.4 g K2HPO4
50 mg sulfato de kanamicina
Este medio se prepar a partir de agua
destilada y solucion madre estril aadido en
orden de aparicin.

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Metodologa
La viscosidad del caldo de fermentacin se midi con un remetro
Physica MCR301. en una gama de velocidades de corte entre 10 y 2000
s-. El anlisis de los datos se realiz con el software RheoPlus / 32 V3.40
(Anton Paar).

Metodologa DelMar EG. Temperatura de 30C para 5 minutos. La

actividad proteasa se calcul a partir del cambio de absorcin a 405 nm
con el coeficiente de extincin de pNA a 405 nm (8.48 cm2 mol-1).
Adems, se calcul la velocidad mxima de formacin de proteasa
utilizando los datos de la actividad de proteasa medida y la correlacin
OD-CDW establecida (Ec. 3).
Las concentraciones de glucosa y acetato, acetona, 2,3-butanediol) fueron
determinados por HPLC con una columna con un resina orgnica (250 x 8
mm). Temperatura 60C. El anlisis de los datos se realiz con el
software Chromeleon

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Resultados y Discusin

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Se utiliz sulfato de amonio [(NH4)2SO4], y nitrato de potasio (KNO3), como las
diferentes fuentes de nitrgeno.

Adems de la viscosidad, tambin fueron medidas otras variables como la

velocidad de transferencia de oxgeno (OTR), densidad ptica a 600 nm (OD), pH,
y las concentraciones de los sustratos y productos de la fermentacin, y la
actividad enzimtica de las proteasas.

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Impacto de la fuente de N2 en la acumulacin de la viscosidad
De a-c, la
fuente de
carbono fue
(NH4)2SO4

De d-f fue
KNO3.

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En la grfica a y d se encuentran las mediciones para OTR, y OD600.
Los cuales tienen sus puntos mximos a las 12 horas, siendo 56 mmol/L*h y 11,
respectivamente, para a. Mientras que en d los puntos mximos se alcanzaron
aproximadamente a las 14 h, siendo 50 mmol/L*h y 12.

Para ambas fuentes de nitrgeno se puede observar un decaimiento de estos

valores, atribuido, en el caso de la densidad ptica a cambios morfolgicos en la
clulas y al inicio de la lisis celular. El declive en la transferencia de oxgeno se
atribuye pues, a la igualmente decadencia en la concentracin de glucosa al
mismo tiempo (Meissner et al., 2015).

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La grfica b y e nos deja ver el comportamiento de la viscosidad, el pH y la
actividad de la proteasa durante el periodo de incubacin de la cepa.
Para ambos casos el pH inicial fue de 8.0 hasta un mnimo de 6.6 en b, y 7.7 en e,
este decremento se debe a la produccin de acetato (Meissner et al., 2015.

El consumo de nutrientes provocaron un cambio en el pH a 7.4 y 9.4 para cada

fuente de N. Esto debido a que contrariamente al amonio, que conduce a una
disminucin en el valor del pH cuando se consume, el consumo de nitrato
aumenta el valor del pH.

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En la misma grfica, podemos observar como mientras en donde se us sulfato
de amonio la viscosidad se increment hasta 30 mPa*s, coincidiendo con el punto
mximo de transferencia de oxgeno y densidad ptica, y decayendo de igual
modo hasta su valor inicial; debido en gran medida a la formacin indeseable del
cido glutmico, reportada para esta cepa (Bajaj & Singhal, 2011).

En contraste, cuando se us KNO3 la viscosidad no tuvo un cambio relevante

durante el proceso.

15
Del mismo modo se observaron las actividades enzimticas de proteasas para
ambas fuentes, siendo para sulfato de amonio de 30 U/mL y para nitrato de
potasio de 46 U/mL.

Esto corresponde a que en la prueba que present un mayor cambio en la

viscosidad, se afect ms la actividad de las proteasas.

En c y f, se muestran los valores de las concentraciones de sustratos y productos

durante la experimentacin.

16
17
Para verificar la influencia del amonio y nitrato en la formacin indeseable de -
PGA, se utilizaron cloruro de amonio y nitrato de sodio como fuente de nitrgeno.

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Se compararon con la fuentes de N anteriores, y las cuatro mostraron
crecimiento exponencial de la OTR durante las primeras 13 hr.

Se alcanzaron OTR mximos de 48 a 61 mmol/L*h

Cuando se usa amonio las viscosidades son altas, mientras que con nitrato se
mantienen bajas.

Por tanto se puede concluir que son estos iones los que tienen mayor
relevancia en la formacin indeseable de -PGA.

19
La produccin indeseada de -PGA
puede prevenirse usando al nitrato
como fuente de nitrgeno.

Esto puede explicarse a travs del

anlisis del metabolismo del
nitrgeno en Bacillus.

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Figura 4. Influencia del control del ph en la acumulacin de viscosidad

Sulfato de amonio como

fuente de Nitrgeno.

En (a-c), se utiliz buffer

0.2 MOPS. El pH8 inicial

En (d-f)se utiliz titulacin

con 2M de NaOH y 2M
HCL el pH 7 inicial

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 Formacin de mayor biomasa con un mximo de OD600 en 15 y ligeramente
ms formacin de acetato.

La viscosidad alcanz un mximo de 12 mPa s, esto puede ser atribuido a la

mayor biomasa y formacin de acetato observada, para el proceso regulado
por buffer

La fuente de carbono dirigida a la formacin de acetato ya no estaba

disponible para la formacin de biopolmero

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 La concentracin de amonio alcanz un mnimo de 132 mmol L-1 a las 18 h
que corresponde con el pH 7.1 mnimo al mismo tiempo, de ah la
concentracin de amonio incremento a 162 mmol L-1 debido al consumo de
cido glutmico liberado de la degradacin de -PGA. (b-c)

La actividad final de la proteasa fue 31 U mL.1 (b) y la tasa mxima de

formacin de proteasa fue 204 U h1g1CDW despus de 19 de cultivo

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 La viscosidad alcanz un mximo de 23 mPa s para pH controlado por
titulacin.

La concentracin de amonio alcanz un mnimo de 138 mmol L-1 a las 15 h

concentracin de amonio increment a 189 mmol L-1 fig 4-f)

La actividad final de la proteasa fue 18 U mL.1 (b) y la tasa mxima de

formacin de proteasa fue 146 U h1g1CDW despus de 13.8 h de cultivo

24
 De los resultados obtenidos puede ser concluido que independientemente del
mtodo de control del pH aplicado, el producto -PGA causante de la
elevacin de la viscosidad es formado cuando el amonio es utilizado como
fuente de nitrgeno mientras que el nitrito previene la formacin de este
producto indeseado.

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Figura 5. Impacto del control del pH y limitacin de oxgeno en la viscosidad

Nitrato como fuente de

nitrgeno

En (a-c) se mantuvo
pH 7 con 2 M NaCL y
2M de HCL

En (d-f) se us buffer
MOPS 0.2M

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En la fermentacin con titulacin como control de pH, no se observ aumento en
la viscosidad (fig 5-b).

La concentracin de nitrato alcanz decreci de 229 mmolL-1 a 167 mmolL-1

despus de 15 h y permanece constante (fig 5.c)

La actividad final de la proteasa fue 36 U mL.1 (b) y la tasa mxima de

formacin de proteasa fue 146 U h1g1CDW despus de 11.6 h de cultivo

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influencia de la limitacin de oxgeno en la viscosidad

De la figura (5e) un en aumento de la viscosidad apoya fuertemente la

hiptesis de que bajo condiciones limitantes de oxgeno ms nitrato es
reducido a amonio, el cual est disponible para la formacin de -PGA.

La combinacin de alta glucosa y altas concentraciones de amonio provocan

un exceso en el metabolismo de B. licheniformis llevando a la formacin de -
PGA (Wilming et al,2013).

Por lo tanto la aplicacin de cultivo por lotes para limitar ya sea el amonio, la
glucosa o ambos debera prevenir la formacin del producto indeseado.

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Conclusin
La cepa de B. licheniformis usada en este estudio es una productora
de proteasa industrial que tambin es capaz de secretar -PGA como
un subproducto no deseado bajo condiciones de fermentacin
estndar.

El medio aplicado contena amonio como nica fuente de nitrgeno y

glucosa como fuente de carbono, del que B. licheniformis sintetiza
muy probablemente glutamato como un metabolito en exceso. En
presencia de este exceso de glutamato, se forma -PGA.

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Referencia
Meissner L., Kauffmann K., Wengeler T., Mitsunaga H., Fukusaki E. & Bchs J. (2015).
Influence of nitrogen source and pH value on undesired poly(-glutamic acid)
formation of a protease producing Bacillus licheniformis strain. Magazine of J Ind
Microbiol Biotechnol 42:12031215.

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