MTODOS DE PREPARO DE AMOSTRAS PARA DETERMINAO DE 15N 1

Paulo Cesar Ocheuze Trivelin

Prof. Associado - CENA/USP

1. INTRODUO

Na anlise dos istopos de nitrognio por espectrometria de massas ou por espectrometria

de emisso, todas as formas de N em uma amostra que se pretende analisar devem ser
convertidas a um gs adequado. O nitrognio gasoso (N2) o preferido devido o seu baixo peso
molecular e estrutura simples (em termos de sua composio molecular e isotpica), pode ser
prontamente gerado de uma gama de compostos orgnicos e inorgnicos, quimicamente inerte
e rapidamente bombeado de espectrmetros de massas.

2. MTODOS CONVENCIONAIS DE PREPARO DE AMOSTRAS PARA

15
DETERMINAO DE N POR IRMS

Basicamente existem dois mtodos de converso de N-combinado N2: mtodo de

Kjeldahl-Rittenberg e o mtodo de Dums modificado. A combinao de Kjeldahl-Dums
modificado pode tambm ser empregada.

2. 1. Mtodo por via mida ou de Kjeldahl-Rittenberg

Esse mtodo foi introduzido por Rittenberg em 19482. O mtodo de Kjeldahl usado para
converter o N combinado da amostra amnia, que destilada e recebida em soluo cida.

2.1.1. Digesto da Amostra

1
Curso de Ps-Graduao em Energia Nuclear na Agricultura, CENA/USP, Piracicaba, maio de 2001.
2
Rittenberg, D.; In: Wilson, D.W.; Nier, A.O.C.; Riechman (eds.) Preparation and measurement of isotopic tracer.
Edwards, Ann Arbor, Mich., 1948, pp.31-42.
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A digesto da amostra inclui a converso do N-combinado ou orgnico N-amoniacal

com cido sulfrico concentrado e a quente (mtodo de Kjeldahl).
Existem muitas variaes deste mtodo incluindo o uso de misturas digestoras com cido
sulfrico concentrado com adio de sais para aumentar a temperatura de ebulio do cido,
catalisadores e agentes oxidantes outros que no o permanganato de potssio que foi sugerido
originalmente por Kjeldahl. Para amostras em que o N est na forma oxidada, como os nitratos e
nitritos, necessrio efetuar um pr-tratamento antes da digesto da amostra p. d. . Os nitratos
so reduzidos amnia; a adio de ferro reduzido em meio cido libera H+ e reduz o NO3-
amnia; os nitritos so primeiramente oxidados com permanganato nitrato e este
posteriormente reduzido amnia com adio do ferro reduzido em meio cido. O sulfato de
potssio adicionado ao cido sulfrico para elevar a temperatura de digesto. Os catalisadores
usados so selnio, xido de mercrio (II) e sulfato de cobre para promover a oxidao da
matria orgnica. Vrios agentes oxidantes so usados, um deles j referido o permanganato de
potssio. O agente oxidante mais usado o perxido de hidrognio (H2O2) e tem mostrado ser
melhor nas digestes que no requerem pre-tratamento da amostra.
Um tempo mnimo para digesto de amostras o de 5 horas a fim de assegurar completa
converso de N-orgnico NH4+. Um perodo curto de tempo de digesto pode levar a
inexatido dos resultados de razo isotpica, especialmente em amostras de solo. Para alta
preciso na anlise de N-total de material de solo ou vegetal, a amostra deve estar seca (60oC) e
bem moda (passar atravs de peneira de 150 m: 100 mesh), bem misturada e faz-se a
pesagem em balana de preciso 0,01 mg. Algumas vezes a digesto feita em amostras de solo
mido para evitar a perda de N durante a sua secagem. Controles (brancos) so includos em
cada conjunto de amostras postas a digerir, a fim de corrigir a contribuio do N contido nos
reagentes da mistura digestora e uma possvel absoro de N-NH3 do ar durante a digesto.
Inclui-se tambm amostras-controle para avaliar o desempenho da digesto. Um controle usado
padro primrio Tris hidroximetil amino metano.
Detalhes do preparo de misturas digestoras e procedimentos gerais na digesto de
15
amostras para anlise de N so encontradas em: Buresh et al. (1982); Fiedler & Proksch
(1975); Hauck (1982); Hauck & Bremner (1976); Mulvaney (1993) e Trivelin et al. (1973).
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2.1.2. Destilao ou difuso do N-NH4+

Aps concluda a digesto cida da amostra, o NH4+ resultante deve ser separado dos
reagentes usados para a sua converso, e tambm dos outros constituintes do extrato, para
eliminar as substncias que possam decompor o reagente hipobromito usado na oxidao de
NH4+ N2.
O modo convencional de separao conduzido por destilao da amnia da amostra por
arraste de vapor em aparelhos de destilao (Figura 1, adaptada de Mulvaney, 1993).
A amostra a ser destilada baseificada com soluo concentrada de NaOH (18 M). A
amnia destilada por arraste de vapor, sendo recebida em soluo de cido sulfrico, clordrico
ou de cido brico contendo indicador. Se a amostra destilada recebida em cido sulfrico ou
clordrico ela posteriormente titulada com uma base (soluo padronizada de NaOH ou KOH)
e por diferena entre o nmero de miliequivalente do cido antes e aps a destilao calcula-se a
massa de N da amostra; se ela recebida em soluo de cido brico contendo indicador
titulada diretamente com cido sulfrico ou clordrico padronizado. Nesse ponto, determina-se a
concentrao de N-total da amostra.

Figura 1. Aparelho destilador de amnia por arraste de vapor (Fonte: Mulvaney, 1993).
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Entre destilaes de uma amostra e outra aconselhvel destilar uma soluo contendo
cido formico e etanl, ou somente etanl, que remover algum resduo de NH3 da ltima
amostra que ficou aderida s paredes internas do destilador. Esse procedimento feito para
evitar contaminao entre amostras (cross contamination). Durante a destilao com etanl as
primeiras fraes do destilado adicionado amostra que precedeu a operao.
Muitos laboratrios tem usado na separao do N- NH4+ da amostra, a tcnica da difuso
como uma alternativa de destilao por arraste de vapor em aparelhos destiladores, tcnica essa
proposta por ODeen & Porter (1979). Para se usar essa tcnica a digesto das amostras de solo
ou planta so feitas em tubos especiais de digesto-difuso (Figura 2, adaptada de ODeen &
Porter, 1979). Aps a digesto das amostras adiciona-se ao extrato digerido 10 ml de NaOH 18
M para alcalinizar o meio. Na parte superior interna do tubo de digesto colocado um frasco
contendo um volume pr-determinado de soluo padronizada de HCl ou H2SO4. O tubo de
difuso ento fechado hermeticamente e retorna ao bloco temperatura de 140oC. O processo
de difuso das amostras ocorre por um perodo de tempo de 24 h (amostras contendo cerca de
1mg de N). O N-NH4+ recuperado na soluo cida pode ser determinada por titulao do cido
excedente com soluo de uma base padronizada.

Figura 2. Tubo de digesto e difuso (Fonte: ODeen & Porter, 1979).

 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 5

A soluo final pode ser concentrada para posterior anlise de razo isotpica de N. As
Tabelas 1 e 2 (ODeen & Porter,1979) ilustram o trabalho de padronizao da tcnica para uma
amostra contendo 1 mg de N e enriquecida com 15N (1,315% de tomos).

Tabela 1. Difuso de amnia e abundncia de 15N em funo da temperatura e tempo de difuso

com um volume fixo de 70 mL e um nvel de 1 mg de N (80o C com n = 8; 140o C
com n = 10). (Fonte: ODeen & Porter,1979)
Tempo de difuso, h
Temperatura 8 24 48 72 96 168 padro
80o C
% de difuso -- 34,1 60,2 73,1 -- 95,5 --
Ab.: % de tomos -- 1,2883 1,2884 1,2930 -- 1,3100 1,3144
Varincia x 10 -5 -- 10,3 16,3 50,7 -- 0,714 0,127

140o C
% de difuso 63,6 94,7 98,3 98,6 99,0 -- --
Ab.: % de tomos 1,3078 1,3072 1,3073 1,3093 1,3072 -- 1,3135
Varincia x 10 -5 0,903 1,13 1,16 0,502 0,633 -- 0,128

15
Tabela 2. Difuso e abundncia de N em funo do volume de soluo de sal e tempo de
difuso com um nvel constante de 1 mg de N por tubo, na temperatura de 140oC (8h,
n = 4; e 24h , n = 5a). (Fonte: ODeen & Porter,1979)
Volume, mL
50 30 10 50 30 10
8h 24 h
% de difuso 69,2 90,9 99,8 98,7 99,4 100
Ab.: % de tomos 1,3030 1,3059 1,3147 1,3113 1,3109 1,3153
Desvio do padro
(partes por mil) 9,95 7,75 1,06 3,65 3,95 0,61

a
Abundncia de 15N do padro = 1,3161
 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 6

A tcnica de difuso pode tambm ser usada para N inorgnico de solo (NH4+ e NO3-)
extrados com KCl (relao 1:3 a 1:10 de solo: extratante). Com essa tcnica, da mesma forma
como realizado em aparelho destilador (Keenney & Nelson, 1982) o extrato tratado numa
primeira difuso com um alcali (MgO), e a amnia gerada da frao N-NH4+ recebida em
quantidade pr-estipulada de soluo de cido sulfrico padronizado colocado em um frasco
dentro do tubo de digesto, que permanece hermeticamente fechado, durante o processo de
difuso. Numa segunda etapa adiciona-se um redutor de nitrato + nitrito (liga de Dewarda) e
repete-se a operao de difuso separando a frao N-NO3+NO2. Aps o perodo de difuso da
amostra os frascos contendo a amnia difundida so tituladas com uma base padronizada e
determinado o N-total da frao.
Brooks et al. (1989) desenvolveu a tcnica com um frasco especial de difuso do N-
mineral para extratos de solo (Figura 3, adaptada de Barrie & Prosser, 1996), em que a amostra
recebida em disco de microfibra de vidro ou papel de filtro acidificada com 10 l KHSO4 2,5 M,
sendo as amostras posteriormente levadas para anlise de N-total e de 15N em aparelhos (IRMS)
automatizados. A massa de solo a ser usada na extrao com KCl ser funo da massa de N-
NH4+ ou de N-NO3- necessrio para anlise por espectrometria de massas (50 a 100 g de N para
um IRMS com analisador automtico ANCA-SL da Europa Scientific). A Tabela 3 e Figuras 4 e
5 adaptadas de Brooks et al. (1989) ilustram os testes de calibrao com o mtodo.

Figura 3. Frasco de difuso de amnia de amostras lquidas para discos de microfibra, adaptao
15
para determinao de N em IRMS com analisador automtico de nitrognio (Fonte:
Barrie & Prosser, 1996).
 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 7
15
Tabela 3. Recuperao de N de uma soluo padro com KCl em papel de microfibra
contendo soluo cida (n = 5) (Fonte: Brooks et al.,1989).

Tratamentos % de Recuperao
Volume da amostra Contedo de N Mdia SD
mL mg L-1 de N cido

40 2 KHSO4 100 1
60 2 H2SO4 96 2
50 20 KHSO4 101 2
40 20 H2SO4 101 1

Figura 4. Difuso de NH3 de extratos de solo para discos de microfibra por 140 h de incubao,
a temperatura ambiente (Fonte: Brooks et al.,1989).

Figura 5. Acumulao de gua em discos de microfibra contendo H2SO4 e KHSO4 durante a

difuso de NH3 de extratos de solo (Fonte: Brooks et al.,1989).
 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 8

2.1.3. Concentrao da amostra de NH4 obtida por destilao ou difuso

A soluo destilada (difundida) e neutralizada (titulada) levemente acidificada com 1ml

de soluo de cido sulfrico 0,05 M antes de ser concentrada, i.e., a operao que ir reduzir o
volume at completa secagem do sal resultante. Essa etapa conduzida em estufa ventilada ou
chapa aquecedora. Deve ser tomado muito cuidado nessa etapa para que a amostra que foi
cidificada no fique exposta em ambiente contendo amnia. Se for absorvida amnia do ar, com
15
abundncia natural (0,366% de tomo) essa ir diluir a concentrao de N da amostra. Assim
essa etapa deve ser conduzida rapidamente e em ambiente isento de amnia na atmosfera.

2.1.4. Converso de NH4+ N2 (reao de Rittenberg)

O sal amoniacal seco que contm o N da amostra de interesse oxidado N2, sob vcuo,
com o reagente hipobromito alcalino de ltio ou de sdio (LiOBr ou NaOBr), conforme a reao
(reao de Rittenberg):
2NH3 + 3LiOBr 3LiBr + 3H2O + N2
No incio dos trabalhos com o traador 15N, essa etapa era executada em tubos em forma
de Y com torneira prpria para vcuo, onde num ramo adicionava-se a amostra concentrada e no
outro o reagente LiOBr (Figura 6, Mulvaney, 1993). Aps ter sido feito vcuo no interior do
tubo, o mesmo fechado e retirado da linha de vcuo. Com a simples inclinao do tubo coloca-
se em contato a soluo de LiOBr e a amostra de sal amoniacal. A reao libera o N2. O tubo
ento levado diretamente para a entrada do espectrmetro de massas, passando o gs por uma
armadilha de N-lquido. Nessa armadilha ficava retido vapor de gua, vapor de Br e N2O gerado
na reao, sendo admitindo no IRMS somente o gs N2. Deve-se tomar cuidado com as amostras
muito cidas que neutralizam o excedente de LiOH que acompanha a soluo de hipobromito
alcalino de ltio. Nesses casos pode ocorrer liberao excessiva de Br gasoso prejudicando a
anlise no IRMS.
Para evitar o uso dos tubos em Y no preparo de amostras pela reao de Rittenberg foi
desenvolvido um sistema de converso de amostras amoniacais N2, como mostrado na Figura 7
de Porter & ODeen (1977). O sistema original foi sendo modificado e aperfeioado como
mostrado na Figura 8 de Mulvaney (1993).
 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 9

Figura 6. Tubo em Y de Rittenberg. (a) Posio na vertical para realizar vcuo e desgasificao
nas solues; (b) Inclinao a fim de por em contato o reagente LiOBr com o sal de
amnio (Fonte: Mulvaney, 1993).

Figura 7. Aparelho de converso de amnio a N2 para instalao na entrada do sistema de

admisso de IRMS (Fonte: Porte & ODeen, 1977).
 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 10

Figura 8. Aparelho de converso de amnio a N2 para instalao na entrada do sistema de

admisso de IRMS (Fonte: Mulvaney, 1993).

O sistema desenvolvido no laboratrio de Istopos Estveis (LIE) do CENA para anlise

por espectrmetria de massas no automtico (ATLAS MAT CH4) uma adaptao dos dois
sistemas, no havendo presso positiva de He como nos sistemas de Porter & ODeen (1977) e
de Mulvaney (1993). No reservatrio de hipobromito feito vcuo previamente antes de ser
abastecido com o reagente. O reservatrio contendo o hipobromito novamente evacuado antes
de ser levado para o IRMS. O LiOBr admitido ao frasco com a amostra por gravidade, aps
este ter sido evacuado.
A Tabela 4 de Hauck & Bremner (1976) relaciona as possveis fontes de erros na
converso de N-combinado N2 pelo mtodo de Kjeldahl-Rittenberg.
 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 11

Tabela 4. Possveis erros envolvidos no preparo de amostras de nitrognio (N2) para

determinao de 15N com uso de hipobromito alcalino de ltio reao de Rittenberg
(Fonte: Hauck & Bremner, 1976).

Etapa Fontes de erro

Converso do N-combinado do material Uso de mtodos de digesto no especficos

orgnico a forma de amnio
Destilao de amnia
Concentrao de amostras de amnio
Converso do amnio a N2 na reao com o Remoo incompleta, antes da reao, do N2
LiOBr
de converso. Converso incompleta.
Destilao incompleta. Contaminao
cruzada durante a destilao.
Perdas de amnio como amnia.
Contaminao do amnio da amostra por
amnia da atmosfera
dissolvido na soluo ou no tubo de reao.
Incompleta converso do amnio a N2. Falha
na recuperao do N2 dissolvido, produto da
reao com o LiOBr. Vazamento de ar
atmosfrico para o interior do tubo de
reao. Contaminao de N2 por N2O ou
outro gs envolvido na reao do amnio
com o LiOBr

2.2. Mtodo por via seca: combusto de Dums modificado

O mtodo original de Dums envolve a oxidao de matria orgnica com xido de cobre
em uma atmosfera de dixido de carbono que passa ento atravs de uma soluo hidrxido de
potssio concentrada a fim de reter o CO2.
No mtodo de Dums modificado a matria orgnica oxidada com xido de cobre e os
gases gerados, com exceo do N2 so retidos em xido de clcio. A reao levada a efeito sob
vcuo, em tubo de vidro pyrex ou quartzo.
A amostra finamente moda com aproximadamente 1 mg de N (50 a 200 mg de matria
seca vegetal) colocada num tubo de vidro de borossilicato de aproximadamente 20 cm de
comprimento e 0,9 mm de dimetro interno. O tubo fechado numa das extremidades ficando
com uma ponta fina, especialmente preparada, como ilustrado na Figura 9. Juntamente com a
amostra adicionado 1,5 g de CuO e 1,5 g de CaO. Essas quantidades de reagentes so em
excesso (Fiedler & Proksch, 1975). A seguir feito um estrangulamento na parte superior do
 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 12

tubo o que facilitar o fechamento aps realizado o vcuo no seu interior. Os tubos so ento
levados uma linha de vcuo (Figura 10) at que seja atingida a presso de 0,01 mbar. Os tubos
so ento fechados com auxlio de chama de maarico. Em seguida realizada a combusto das
amostras em forno mufla onde as amostras permanecem por 12h na temperatura de 550oC. A
temperatura poder ser de 900-1000oC caso os tubos sejam de quartzo ou vicor. Nesses casos o
tempo de combusto ser de 2-4 horas. Antes da combusto conveniente que seja misturada a
amostra com o reagente CuO. Isto feito para aumentar o contato da amostra com o oxidante. Os
gases gerados na combusto de Dumas so: N2, CO2, vapor de gua, SO2 e NO. O CO2 e vapor
de gua reagem com o CaO dando CaCO3 e Ca (OH)2. Os xidos de enxofre e de nitrognio so
reduzidos pelo Cuo produzido com a liberao de oxignio do CuO. Se a amostra contm nitratos
e nitritos necessrio adicionar tambm cobre metlico para facilitar a reduo das formas
oxidadas de N. O tubo contendo em seu interior o N2 gerado da combusto da amostra orgnica
levado para a entrada do espectrmetro de massas, onde por meio de um quebrador a
estremidade fina do tubo quebrada (breack seal) sendo o N2 admitido no aparelho para a
anlise, como mostrado em figura.

15
Figura 9. Preparo de amostras vegetais para determinao de N por IRMS pelo mtodo de
Dums modificado. Procedimentos do Labor. de Istopos Estveis do CENA/USP.
 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 13

Figura 10. Linha de alto-vcuo no preparo de amostras pelo mtodo de Dums modificado.

Detalhes dos procedimentos gerais do mtodo so encontrados em Fiedler & Proksch

(1975); Hauck & Bremner (1976); Mulvaney (1993) e Trivelin et al. (1973).

2.3. Mtodo combinado Kjeldahl- Dumas modificado

No mtodo combinando Kjeldahl e o Dumas modificado, o N-amoniacal resultante da

digesto-destilao ou da difuso e aps concentrao da amostra at a secagem, adicionada no
interior de um tubo de vidro juntamente com CuO e CaO e segue o procedimento normal pelo
mtodo de Dumas modificado.
 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 14

3. MTODOS AUTOMATIZADOS DE PREPARO DE AMOSTRAS PARA ANLISE

DE 15N POR IRMS

3.1. Analisador automtico pelo mtodo de Rittenberg - ARA (Automated

Rittenberg Apparatus)

Para anlise pela tcnica de Rittenberg via ARA-MS requerido que as amostras de sal
de amnio que contenham entre 20 a 150g de N, estejam colocadas em pequenos frascos
colocados em um microprato do auto-analisador para 137 amostras. As trs primeiras etapas do
mtodo convencional so necessrias para se obter o sal de amnio da amostra. A diferena com
o mtodo convencional est na quarta etapa de preparao (reao do sal amoniacal com o
LiOBr) e na anlise que executada automaticamente, sem a necessidade de acompanhamento
de cada amostra por um tcnico. Esse tipo de autoanalisador foi desenvolvido inicialmente por
McInteer e Montoya em 19813 nos laboratrios de Los lamos USA (Mulnaney, 1993) e foi
comercializado juntamente com Espectrmetros de Massas, mas logo caram em desuso com o
advento dos analisadores automticos por combusto direta.
O funcionamento do autoanalisador consistia, de forma resumida, em uma bandeja
contendo os frascos com as amostras que movia-se sequencialmente. Cada frasco era atuado
pneumaticamente, ficando bem vedado, e o ar no seu interior sendo purgado com gs Freon .
Aps isso o reagente LiOBr era adicionado e o N2 gerado passava por uma armadilha de N-
lquido antes de ser admitido no IRMS.

3.2. Analisador automtico por combusto direta das amostras

3.2.1. ANCA-SL

O modo mais simples de automao na anlise dos istopos de N envolve um analisador

automtico de CN interfaceado com um espectrmetro de massas (IRMS).
A tcnica teve seu incio no princpio da dcada dos anos 80 com um analisador
elementar de N interfaceado diretamente fonte de ons de um IRMS. Os inventores da tcnica
foram Preston e Owens (Barrie & Prosser, 1996) que fizeram melhorias na tcnica e em 1986,

3
McInteer, B.B. and Montoya, J.g. (1981) Automation of a mass spectrometer for N isotope analysis. In Recent
Developments in Mass Spectrometry in Biochemistry, Medicine and Environmental Research, vol 7(
Frigerio, sd.), pp. 343-349, Elsevier, Amsterdam.
 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 15

em trabalho de cooperao com a indstria, produziram um instrumento dedicado, controlado

por softwere que integrava a preparao de amostra com anlise de razo isotpica por
espectrometria de massas (ANCA, Europa Scientific, Crewe, UK). Desde ento outros
fabricantes tem produzido o instrumento ANCA-MS, (Automatic Nitrogen and Carbon
Analyser- Mass Spectrometer) fazendo uso de um analisador elementar (NA 1500, Carlo Erba,
Itlia) conectado ao espectrmetro de massas (Finnigam MAT).
O funcionamento do ANCA-MS da Europa Scientific U.K. mostrado
esquematicamente na Figura 11 de Barrie & Prosser (1996). Amostras orgnicas e minerais com
20-150g de N, finamente modas so seladas em cpsulas miniaturas de estanho (Sn), sendo
admitidas no auto-amostrador de um ANCA com lugar para 66 amostras. As amostras so
purgadas do ar com um fluxo de He ultrapuro no auto-amostrador. Em seqncia, as amostras
so levadas para o interior de tubo de combusto vertical quando um pulso de O2 ultra puro
substitui temporariamente o fluxo de He. O tubo de combusto preenchido com um catalisador
o Cr2O3 (xido de cromo) e CuO (xido de cobre) em fios cortados em pequenos pedaos, que
oxida os hidrocarbonos, e l de prata (Ag) que tem a funo de reter o S (SO2) e halogneos.
Quando o pulso de O2 chega ao forno de combusto juntamente com a amostra selada na cpsula
de Sn, a temperatura no local inicialmente em 1000oC, aumenta para 1700oC o que causa
completa combusto da amostra. Os produtos da combusto: CO2, N2, NOx e H2O so levados
para um tubo de reduo mantido a 600oC e que contm cobre metlico (Cu). No tubo de
reduo os xidos de nitrognio so reduzidos N2 , sendo tambm retido o excesso de O2. A
seguir, os gases so conduzidos pelo gs carregador para uma coluna preenchida com perclorato
de magnsio [Mg(ClO4)2] que retm o vapor de gua. Para anlises isotpica de N2 sem que se
queira analisar tambm na mesma amostra a razo de 13C/12C, o CO2 retido em uma armadilha
de Carbosorb. Por ltimo uma coluna cromatogrfica separa o N2 de impurezas. Caso seja
15
desejvel analisar na mesma amostra as razes N/14N e 13
C/12C deve-se ter o cuidado para
selecionar, ou a temperatura adequada para a separao cromatogrfica de N2 e do CO2, ou ainda
selecionar o tipo de coluna adequada.
Uma pequena frao do efluente (0,1%) do sistema de preparao de amostra entra no
IRMS atravs de um longo tubo capilar com um constritor para ajuste do fluxo de gs na entrada
15
do IRMS. O gs entrando na fonte analisada para N-total e razo N/14N, por meio das
intensidades das massas 28 (14N14N), 29(15N14N) e 30(15N15N).
 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 16

Figura 11. Sistema analisador automtico ANCA-SL/IRMS da Europa Scientific (UK) (Fonte:
Barrie & Prosser,1996).

15
O desempenho das anlises de N nesses sistemas limitado pela contribuio do
branco, sendo essa contribuio importante para amostras pequenas. Nesse sentido muito
importante a pureza dos gases He (normalmente 10ppm ou menos de N) e O2 (5ppm ou menos
de N2). Para amostras de N2 pode-se controlar pelo softwere do ANCA-MS da Europa Scientific
trs modos de anlise (Figura 12, Barrie & Prosser, 1996). Os modos normal e acelerado que
servem para amostras com quantidade maiores de N, somente diferindo em relao a preciso e
tempo de anlise. Existe uma coincidncia entre o pulso de N2 da amostra e o branco devido ao
O2. Pode-se nesses modos selecionar procedimentos com desconto do branco nas anlises. No
modo: amostra pequena, o pulso de O2 atrasado para mover o branco (N2) do O2 fora da
coincidncia da amostra. O Cr2O3 possibilita o oxignio necessrio para a combusto da amostra.
O pulso de O2 recupera o catalizador a sua forma mais oxidada Cr2O3.
O ANCA-SL da Europa Scientific U.K. considerado um sistema dedicado e possui
vantagens sobre combinaes de analisadores elementares combinados IRMS. Os sistemas
dedicados so providos de softwere com controle de pulso de O2, permitindo que o seu volume
seja varivel para atender o tipo e tamanho da amostra desejada. O O2 somente flui durante a
injeo do pulso, enquanto em analisadores elementares o O2 flui continuamente.
 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 17

Figura 12. Opes do sistema analisador ANCA-SL/IRMS por controle de software do

autosampler, pulso de O2 e coleo dos resultados (Fonte: Barrie & Prosser,1996).

As amostras slidas a serem analisadas no ANCA devem ser finamente modas (passam
em peneira <150m: 100 mesh) para assegura homogeneidade tanto na anlise de N-total
15
assim como na de N. Amostras contendo 10-1000g N so analisadas rotineiramente.
Exemplos so: 12 mg de gros, 12 mg de palha e 20 mg de solo.
 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 18

As amostras lquidas so normalmente mais homogneas e produzem boa reproduo de

resultados. As solues so pipetadas (10-30L de soluo) sobre um absorvente inerte
(Cromosorb). Os padres (soluo de sulfato de amnio) so normalmente lquidos.
Rotineiramente, a durao de um tubo de combusto de 1000 determinaes, quando os
reagentes devero serem repostos. Tem-se que remover a cada 100-200 determinaes as cinzas
geradas da combusto das amostras. O cobre metlico do tubo de reduo tem durao de 300-
500 determinaes. A Figura 13 (Barrie, 1990) ilustra a anlise de N-total e de 15N pelo mtodo
tradicional Kjeldahl-Rittenberg aplicado a IRMS e pelo ANCA-SL.

Figura 13. Comparao de determinaes de 15N e de N-total pelo mtodo tradicional Kjeldhal-
Rittenberg e pelo sistema com analisador automtico ANCA-SL/IRMS (Fonte:
Barrie, 1990)
 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 19

3.2.2. ANCA-G

Um importante requerimento para anlise de gases em cincia do solo a medida de 15N2

e 15N2O em estudos de desnitrificao. O equipamento tambm projetado para determinao de
razo 13C/12C em metano (CH4).
O sistema mostrado na Figura 14 de Barrie & Prosser (1996) prprio para a medida de
15
N em N2 e N2O nas concentraes atmosfricas encontradas sobre o solo e nas mais altas
concentraes encontradas em plantas e aplicaes em solos.

Figura 14. Sistema ANCA-G da Europa Scientific (UK) para anlise de gases NOx e CH4
(Fonte: Barrie & Prosser,1996)
 Mtodos de Preparo de Amostras para Determinao de 15N 20

O instrumento capaz de concentrar os gases traos por meio de um mdulo de desoro

trmica que pode ser acionado. Na anlise de N2 e N2O o gs primeiro seco (a gua
removida) em uma armadilha de perclorato de magnsio, passando em seguida por outra
armadilha (Carbosorb) em que o CO2 removido. N2 e N2O so separados por cromatografica
gasosa. O N2 o primeiro gs eluido do GC e passa ao IRMS atravs de um forno de reduo
que remove traos de oxignio que podem combinar com o N2 na fonte de ons do MS, dando
NO (massa 30). Para o pulso de N2O o gs desviado do forno de reduo sendo dirigido
diretamente ao mdulo de desoro trmica, onde uma zeolita seletiva absorve o N2O. A zeolita
ento aquecida focalizando o N2O desorvido como um pico bem definido num fluxo lento de
He que o levar ao IRMS para anlise das massas 30, 31 e 32.

REFERNCIAS

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