UNIVERSIDAD TECNOLGICA DEL SURESTE No.

DC-QI-MP-04
DE VERACRUZ
REVISIN:

MANUAL DE QUMICA INDUSTRIAL FECHA:

PG.____ DE ____

Ttulo: Determinacin de bacterias coliformes.

Tcnica del nmero ms probable. NMX-F-308-1992 No. De prctica: 3

UNIDAD TEMTICA: 2.5

TEMA: Anlisis de Aguas

NO. DE PARTICIPANTES Cinco

LUGAR: Laboratorio de qumica Duracin: 3
Horas

OPERACIONES A Anlisis microbiolgico

REALIZAR:
OBJETIVO: El alumno conocer el mtodo de deteccin de
contaminacin de aguas por materia fecal mediante la
determinacin de bacterias fecales por tcnica de NMP.

Principios:

La tcnica se basa en la determinacin del nmero de coliformes mediante

siembra de distintos volmenes del agua a analizar en series de tubos con
caldo lactosado y resiembra en medios de cultivo selectivos incubando a
temperaturas adecuadas.

El procedimiento comprende las pruebas: 1. presuntiva, de confirmacin de

coliformes totales y 2. de confirmacin de coliformes fecales. Esta prueba se
utiliza en muestras con baja densidad de microorganismos.

Material:

9 tubos

2 matraces

2 pipetas de 10 y 1 ml

Vasos de pp. 250 ml

Esptulas

Vidrios de reloj

Agitadores de vidrio
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Pinzas

9 Campana de Durham

Algodn

Papel estraza

Cinta testigo

Aluminio

Guantes

Cubre bocas

Aza metalica

2 Cajas petri

Reactivos:

Caldo lactosado o lauril sulfato o Verde bilis brillante

Agar EMB

Equipo:

Incubadora de baja temperatura.

Balanza granataria

Aplicaciones: El alumno ser capaz de determinar el contenido de MO

en aguas
Instrucciones:

ACONDICIONAMIENTO DE MUESTRA

1. Si se trata de una muestra congelada de un alimento

originalmente lquido o licuable, fundirla por completo (405-45C
mximo) y homogeneizarla por agitacin vigorosa del recipiente,
segn se indique en la tcnica correspondiente para cada
alimento.
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2. En caso de un alimento slido congelado, se debe congelar a

refrigeracin de 4 a 8C durante 18 horas y no ms de 24 horas
antes de proceder a su anlisis.

3. Si la muestra es lquida o semilquida, agitarla firmemente. Cuando

el producto por analizar llena totalmente el recipiente, es
recomendable vaciarlo en otro (estril) para homogeneizarlo; se
debe tener cuidado de evitar contaminaciones al escurrir el
lquido por el labio de ambos recipientes.

4. Si se trata de alimentos slidos, pesar 10 o 11g de la muestra,

obtenidos de diferentes zonas, auxilindose de cuchara, cucharilla,
abatelenguas, esptula o cuchillo estriles, transferirlos a un vaso
estril de licuadora y agregar 90 o 99ml de solucin diluyente
(segn se haya pesado10 o 11g respectivamente) lentada o no,
segn se indique en la tcnica correspondiente para cada
alimento.

5. Licuar durante 1-2 minutos hasta obtener una suspensin

completa y homognea segn se indique en la tcnica
correspondiente a cada alimento.

6. Puede sustituirse el tratamiento con licuadora haciendo uso de

stomacher y procediendo de tal manera que se logre una
suspensin completa y homognea de la muestra.

7. La anterior constituye la primera dilucin de la muestra.

8. Continuar las diluciones de la muestra con el mismo diluyente,

siguiendo los pasos que ilustran los esquemas 1 y 2, segn
convenga para cada caso.

Prueba presuntiva para coliformes totales

En una gradilla se colocan 9 tubos (tres series de tres tubos) con caldo verde
bilis brillante simple (lactosado o LAURIL SULFATO), con su respectiva
campana de Durham. Los tubos se marcan con las iniciales del grupo, el agua
tratada o no tratada y la dilucin correspondiente (10 -1, 10-2, 10-3).

1. Agitar vigorosamente la muestra por lo menos 20 veces para lograr una

distribucin uniforme de los microorganismos.
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2. Dependiendo del origen de la muestra y el contenido bacteriano

esperado, preparar diluciones.

3. Para preparar las diluciones, con una pipeta estril tomar una alcuota de
1 mL de la muestra original y llevarlo a uno de los tubos conteniendo 9
mL de agua de dilucin estril, obteniendo de esta manera una dilucin
de 10-1.

4. Agitar el tubo de la dilucin 10-1 y con otra pipeta estril tomar una
alcuota de 1 mL y llevarlo a otro tubo con 9 mL de agua de dilucin
estril para obtener una dilucin de 10 -2.

5. Proceder de la misma manera hasta obtener una dilucin de 10 -3 o hasta

donde sea necesario.

6. Inocular aspticamente con 1 mL de muestra por quintuplicado, tubos de

fermentacin conteniendo caldo lactosado o caldo lauril triptosa, a partir
de las ltimas 3 diluciones y conservar todas las anteriores en
refrigeracin por si se requiere su utilizacin posterior.

7. Incubar todos los tubos a una temperatura de 35 C durante 24-48

horas.

8. Despus de 24 horas de incubacin efectuar una primera lectura para

observar si hay tubos positivos, es decir, con produccin de cido, si el
medio contiene un indicador de pH, turbidez y produccin de gas en el
interior de la campana Durham.

9. Al hacer esta verificacin es importante asegurarse que la produccin de

gas sea resultado de la fermentacin de la lactosa, en cuyo caso se
observar turbidez en el medio de cultivo, y no confundir con burbujas
de aire.

10. Para evitar este tipo de confusiones es recomendable revisar las

campanas Durham antes de proceder a la inoculacin y desechar
aquellos tubos cuyas campanas contengan burbujas de aire de alguna
manera eliminar stas y as poder utilizarlos.

11. De los tubos que en la primera lectura den positivos, ya se pueden

hacer las pruebas confirmatorias para coliformes totales y coliformes
fecales.

12. En caso de no apreciarse crecimiento en el resto de los tubos,

continuarn en incubacin 24 horas ms.
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13. Despus de 48 horas (2h) a partir de la inoculacin, se hace la

lectura final.

14. Si pasadas 48 h tampoco se aprecia crecimiento ni produccin de

gas, los tubos se toman como negativos.

INTERPRETACION:

Si el total de tubos son

NEGATIVOS: El examen se da
por terminado, reportando la
AUSENCIA DE COLIFORMES
TOTALES Y FECALES en la
muestra analizada.

Todos aquellos tubos que den

POSITIVOS para prueba
presuntiva se anotarn
convenientemente y se
proceder a realizar la PRUEBA
CONFIRMATORIA para
Coliformes Totales y Fecales.

Los Coliformes son enterobacterias lactosa positiva, es decir, son capaces de

fermentar la lactosa con produccin de cido y gas en un perodo de 48 horas y con
una temperatura de incubacin comprendida entre 30-37C.

La ausencia del gas al cabo de 48 h se considera como prueba negativa.

Se cuentan los tubos positivos y se consulta la tabla del NMP. Los resultados se
presentan como ufc/100ml de muestra (NMP)
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Prueba confirmativa de Coliformes totales

Se resiembran en placa de
Petri con medio Agar EMB
solidificado de los tubos que
hayan resultado positivos en
la prueba presuntiva 0,1 ml
de medio lquido.

El EMB contiene eosina y

azul de metileno que inhiben
parcialmente el crecimiento
de los microorganismos Gram negativos, adems la combinacin de azul de metileno y
eosina permitir diferenciar los microorganismos lactosa positiva de los negativos.
Luego se incuban en estufa a 37C las placas invertidas durante 48 horas.

Lectura e interpretacin de resultados Sobre este medio las bacterias fermentadoras

de la lactosa dan colonias caractersticas opacas y pigmentadas en rosa, azul o violeta
oscuro con o sin reflejo metlico. Las colonias no fermentadoras de la lactosa
aparecern como colonias incoloras

Para el clculo del NMP de coliformes totales se contabilizarn como positivos aquellos
tubos de la serie elegida que hayan dado una prueba de confirmacin positiva

* Prueba confirmativa para coliformes fecales

Es un procedimiento mediante el cual una reaccin negativa excluye la presencia de

coliformes fecales, mientras que una reaccin positiva indica su presencia inequvoca.
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Deben someterse a esta prueba todos los tubos que hayan resultado positivos en la
prueba presuntiva. Esta prueba debe llevarse a cabo simultneamente a la de
confirmacin de coliformes totales.

Se debe resembrar cada tubo positivo de la presuntiva en medio EC mediante un asa

o dos gotas de pipeta Pasteur. Llevar a estufa o bao mara antes de transcurrir 30
minutos. Incubar a 44C durante 24 h.

Lectura e interpretacin de resultados

Si se observa crecimiento bacteriano con produccin de gas a las 24 h o antes, la

presencia de bacterias coliformes fecales se considerar confirmada. Para el clculo del
NMP de coliformes fecales se contabilizarn como positivos aquellos tubos de la serie
que hayan dado prueba de confirmacin positiva.

* Por cuestiones de tiempo esta prueba no la realizaremos.

Tratamiento de residuos: Vaciar residuos en contenedores que indique el

docente.

Criterio de desempeo que se evaluar: Manejo de equipo de laboratorio e

interpretacin de resultados
Lista de cotejo
Clculos

No. de tubos positivos x 100

NMP/100 Ml = ------------------------------------------------------------------------------------------------------
(Mls de muestra en todos los tubos x Mls. De muestra en los tubos negativos)
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Lista de Verificacin
RASGOS EVALUATIVOS: VALOR:
PROCEDIMENTAL: 4
Procedimiento
Manejo de material
Manejo de reactivos
Mediciones
ACTITUDINAL: 2
Orden y limpieza
Trabajo en equipo
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Participacin
Ortografa
Puntualidad
CONCEPTUAL: 4
Manejo de datos
Presentacin
Clculos y resultados
Responde adecuadamente
Observaciones, discusin y conclusin
Dibujos o esquemas
Cuestionario
Bibliografa

Resultados : expresarlos segn formula y segn tabla; compararlos con los que
marca la norma E INTERPRETAR DICHOS RESULTADOS.
EJEMPLO:

Observaciones
Esquemas
Discusin
Conclusiones
Cuestionario.

PRE- LAB

1. Investigar sobre el lauril sulfato de sodio caldo o lauril sulfato caldo:

Fundamento, Caractersticas, etc.

POST-LAB
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1. En qu consiste la inoculacin o siembra? Qu tcnica de siembra utilizaras

para cultivar una bacteria anaerobia?
2. Define los siguientes trminos: Infeccin. Enfermedad infecciosa. Patogeneidad.
Toxicogenicidad.
3. En qu caractersticas de las bacterias se basan las pruebas bioqumicas de
identificacin? Seala algn ejemplo