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Diretor
Arnaldo Colozzi Filho
Vice-diretor
Nelson Harger
Tesoureiro
Tiago SantosCassol
Luiz Cezar Telles
Secretrio
LuisAntonio
Marco Csar Cassol
Nogueira
Reitor
Reitor
Zaki Akel Sobrinho
DiretorDiretor dode
do Setor Setor Litoral
Cincias Agrrias
Valdo Jos
Amadeu BonaCavallet
Filho
Chefe do Diretor do SetordedeSolos
Departamento Cincias Agrrias Agrcola
e Engenharia
Eduardo Teixeira
Nerilde da Silva
Favaretto
Curitiba PR
2016
Ncleo Estadual do Paran
Inclui bibliografia.
ISBN: 978-85-69146-00-1
CDU 631.46
Diana Signor
Engenheira-agrnoma, Doutora em Solos e Nutrio de Plantas
Embrapa Semirido (CPATSA)
diana.signor@embrapa.br
Arlei Maceda
Engenheiro-agrnomo, Mestre em Entomologia
Agncia de Defesa Agropecuria do Paran
Laboratrio Marcos Enrieti
arleimaceda@seab.pr.gov.br
PREFCIO
CAPTULO I
Jair Alves Dionsio e Diana Signor
NOES DE SEGURANA EM LABORATRIO ................................... 11
CAPTULO II
Jair Alves Dionsio e Ida Chapaval Pimentel
AMOSTRAGEM E PREPARO DO SOLO ................................................. 14
CAPTULO III
Ida Chapaval Pimentel, Jair Alves Dionsio e Diana Signor
BACTRIAS .............................................................................................. 17
CAPTULO IV
Ida Chapaval Pimentel, Jair Alves Dionsio e Diana Signor
BACTRIAS ESPORULADAS................................................................... 23
CAPTULO V
Ida Chapaval Pimentel, Jair Alves Dionsio e Diana Signor
FUNGOS ................................................................................................... 27
PROTOCOLO III CONTAGEM DE FUNGOS PELO
MTODO DE SEMEADURA EM SUPERFCIE................................ 30
CAPTULO VI
Alessandra Monteiro de Paula
MICORRIZAS ARBUSCULARES ............................................................. 33
CAPTULO VII
Ida Chapaval Pimentel, Jair Alves Dionsio e Diana Signor
ACTINOBACTRIAS ................................................................................ 43
CAPTULO VIII
Ida Chapaval Pimentel, Jair Alves Dionsio e Diana Signor
MICRO-ORGANISMOS CELULOLTICOS ............................................. 49
CAPTULO X
Jair Alves Dionsio, Ida Chapaval Pimentel e Diana Signor
ISOLAMENTO DE RIZBIOS DE RAZES DE LEGUMINOSAS ........... 60
CAPTULO XI
Diana Signor, Jair Alves Dionsio e Ida Chapaval Pimentel
INOCULAO DE SEMENTES DE LEGUMINOSAS ............................. 67
CAPTULO XII
Jair Alves Dionsio, Ida Chapaval Pimentel e Diana Signor
RESPIRAO MICROBIANA .................................................................. 72
CAPTULO XIV
Diana Signor e Jair Alves Dionsio
DECOMPOSIO DE RESDUOS ORGNICOS .................................... 84
CAPTULO XV
Jair Alves Dionsio, Ana Luiza Mattana e Diana Signor
PROTOZORIOS ..................................................................................... 89
CAPTULO XVI
Arlei Maceda
NEMATOIDES .......................................................................................... 96
CAPTULO XVIII
Diana Signor e Jair Alves Dionsio
MACROFAUNA ...................................................................................... 113
CAPTULO XIX
Jair Alves Dionsio e Diana Signor
MINHOCAS ............................................................................................ 119
ANEXO 3
DETERMINAO DA CAPACIDADE DE RETENO DE GUA
DO SOLO CONFORME MONTEIRO E FRIGHUETTO (2000)........145
ANEXO 4
PADRONIZAO DE SOLUO DE HIDRXIDO
DE SDIO 0,5 N........................................................................................ 147
ANEXO 5
SOLUO DESS (250 ML).................................................................149
ANEXO 6
CHAVE PICTRIA PARA IDENTIFICAO DE FAMLIAS
(COLLEMBOLA, ENTOGNATHA) (GISIN, 1960).............................150
ANEXO 7
CHAVE PICTRIA PARA IDENTIFICAO DE FAMLIAS
(COLLEMBOLA; SAUTTER, 1994)....................................................151
ANEXO 8
CHAVE PARA IDENTIFICAO DE ALGUMAS FAMLIAS
DE OLIGOCHAETA (TALAVERA, 1990)...........................................152
11
CAPTULO I
NOES DE SEGURANA EM LABORATRIO
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
1
Disponvel em: http://www.unesp.br/proex/repositorio/programasproex/proema/gere/Guia_de_
neutralizacao_quimicos.htm
13
Instituio Telefone
Corpo de Bombeiros
Polcia Militar
CAPTULO II
AMOSTRAGEM E PREPARO DO SOLO
Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
CAPTULO III
BACTRIAS
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
PROTOCOLO I
CONTAGEM DE BACTRIAS PELO MTODO DE
SEMEADURA EM SUPERFCIE
1. Material
a) Solo mido coletado da camada superficial, obtido conforme o Captulo II
(p. 14);
b) Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio (16 x 1,5 cm) com rosca,
placas de Petri ( 90 mm), ala de Drigalsky e esferas de vidro ( 2,00 mm);
c) Equipamentos: agitador de frasco, estufa de esterilizao, estufa de
incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esteriliza-
dor infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina, agitador de tubos e
microscpio estereoscpio (lupa);
d) Solues: salina esterilizada (NaCl 0,85 %), meio de cultura de Thorton
(Tabela 3);
e) Outros: funil de plstico ( 10,0 cm), micropipeta de volume varivel (10
a 100 L), ponteiras autoclavveis, peneira nmero 10 (abertura de 2,00
mm), lixeira para resduos biolgicos, luvas de proteo (nitrlica descar-
tvel), parafilm e gs butano; e,
f) Alternativos: pipetas de 1,0 mL, algodo hidrofbico e pera insufladora.
2. Metodologia
a) Pesar 10,00 g de solo mido, previamente tamizado, em peneira nmero
10, em duplicata, sendo uma parte destinada contagem de bactrias e a
outra para a determinao da massa de solo seco (item 3);
b) Com um funil, transferir o solo para Erlenmeyer de 250 mL contendo
cinco esferas de vidro e 90,0 mL de soluo salina esterilizada (Anexo 1)
(diluio 1:10);
c) Dispersar as unidades formadoras de colnia (UFC) em agitador de frasco
(usar @ 3,4 G) durante 15 minutos e aguardar a precipitao das partcu-
las maiores;
d) Com uma micropipeta, contendo ponteira esterilizada, transferir 1,0 mL
da suspenso para um tubo de ensaio contendo 9,0 mL de soluo sali-
na esterilizada e dispersar, no agitador de tubos ou manualmente, cinco
vezes (diluio 1:100);
21
K2HPO4 1,0
MgSO4.7H2O 0,2
CaCl2.2H2O 0,1
NaCl 0,1
FeCl3 0,002
KNO3 0,5
Asparagina 0,5
Manitol 1,0
gar 15,0
3. Clculo
4. Resultados
Tabela 4. Densidade populacional de bactrias em diferentes solos.
E
23
CAPTULO IV
BACTRIAS ESPORULADAS
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
PROTOCOLO II
CONTAGEM DE BACTRIAS ESPORULADAS
PELO MTODO DE SEMEADURA EM SUPERFCIE
(CLARK, 1965)
1. Material
a) Solo mido coletado da camada superficial, obtido conforme o Captulo II
(p. 14);
b) Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio (16 x 1,5 cm) com rosca,
placas de Petri ( 90 mm), ala de Drigalsky, esferas de vidro ( 2,00 mm);
c) Equipamentos: agitador de frasco, estufa de esterilizao, estufa de in-
cubao, capela de fluxo laminar, autoclave, banho-maria, peagmetro,
esterilizador infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina, agitador de
tubos e microscpio estereoscpio (lupa);
d) Solues: salina esterilizada (NaCl 0,85 %) e meio de cultura de Thorton
(Tabela 3);
e) Outros: funil de plstico ( 10,0 cm), micropipeta de volume varivel
(10 a 100 L), ponteiras autoclavveis, peneira nmero 10 (abertura de
2,00 mm), lixeira para resduos biolgicos, luvas de proteo (nitrlica
descartvel), parafilm e gs butano; e,
f) Alternativos: pipetas de 1,0 mL, algodo hidrofbico e pera insufladora.
2. Metodologia
a) Pesar 10,00 g de solo mido, previamente tamizado, em peneira nmero
10, em duplicata, sendo uma parte destinada contagem de bactrias
esporuladas e a outra para a determinao da massa de solo seco (item 3);
b) Transferir o solo, com um funil, para um Erlenmeyer de 250 mL contendo
cinco esferas de vidro e 90,0 mL de soluo salina esterilizada (Anexo 1)
(diluio 1:10);
c) Dispersar as unidades formadoras de colnias (UFC) em agitador de
frasco (usar @ 3,4 G) durante 15 minutos e aguardar a precipitao das
partculas maiores;
d) Aquecer o Erlenmeyer, em banho-maria a 80 C, por, no mnimo, 15
minutos, para que as formas vegetativas das bactrias sejam eliminadas;
26
3. Clculo
Realizar o clculo conforme Captulo III (p. 22).
4. Resultados
Preencher os dados conforme Tabela 4 (p. 22).
27
CAPTULO V
FUNGOS
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
cional, (UFC g-1) de solo, de fungos 7 x 102, em solo contaminado com hexacloro
benzeno (BHC), no entanto quando o solo recebeu adio de bagao de cana-de-
-acar e cal essa densidade atingiu 15,35 x104.
As principais funes dos fungos no solo so atividade quimioheterotr-
fica sobre os restos vegetais, formao de relaes simbiticas mutualsticas (mi-
corrizas) e parasticas (doenas) na maioria das plantas e produo de antibiticos.
So ainda agentes de controle biolgico de fungos fitopatognicos e nematoides
fitoparasitas (ex.: Arthrobotrys, Dactylaria e Dactyella) (GRAMINHA et al., 2001),
como tambm, indicadores de qualidade do solo.
30
PROTOCOLO III
CONTAGEM DE FUNGOS PELO MTODO DE
SEMEADURA EM SUPERFCIE
1. Material
a) Solo mido coletado da camada superficial, conforme o Captulo II
(p. 14);
b) Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio (16 x 1,5 cm) com rosca,
placas de Petri ( 90 mm), ala de Drigalsky e esferas de vidro ( 2,00 mm);
c) Equipamentos: agitador mecnico, estufa de esterilizao, estufa de in-
cubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esterilizador
infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina, agitador de tubos e mi-
croscpio estereoscpio (lupa);
d) Solues: salina esterilizada (NaCl 0,85 %) e meio de cultura de Martin
(Tabela 5);
e) Outros: funil de plstico ( 10,0 cm), micropipeta com ponteiras de 0,1
mL, peneira nmero 10 (abertura de 2,00 mm), luvas de proteo (ni-
trlica descartvel), parafilm, pera insufladora, gs butano, lixeira para
resduos biolgicos; e,
f) Alternativos: pipetas de 1,0 mL, algodo hidrofbico e pera insufladora.
K2HPO4 1,0
MgSO4.7H2O 0,5
Peptona 5,0
Dextrose 10,0
gar 15,0
Obs.: Ajustar o pH para 5,4 com HCl diludo, antes da adio do gar; Adicionar sulfato de estreptomicina (30 mg L -1
de meio) esterilizado por filtrao, dissolvido em 10 mL de lcool etlico a 1 %, antes de verter em placas, com o
meio de cultura temperatura de 45 a 50 C.
31
2. Metodologia
a) Pesar 10,00 g de solo mido, previamente tamizado, em peneira nmero
10, em duplicata, sendo uma parte destinada contagem de fungos e a
outra para a determinao da massa de solo seco (item 3);
b) Transferir o solo, com um funil, para um Erlenmeyer de 250 mL conten-
do cinco esferas de vidro e 90 mL de soluo salina esterilizada (Anexo 1)
(diluio 1:10);
c) Dispersar as unidades formadoras de colnias (UFC) em agitador
mecnico (usar @ 3,4 G) durante 15 minutos e aguardar a precipitao
das partculas maiores;
d) Com uma micropipeta, contendo ponteira esterilizada, transferir 1,0 mL
da suspenso para um tubo de ensaio contendo 9,0 mL de soluo salina
esterilizada e agitar, no agitador de tubos ou manualmente, cinco vezes
(diluio 1:100);
e) Transferir com uma micropipeta, contendo outra ponteira esterilizada,
1,0 mL da soluo anterior para outro tubo de ensaio contendo 9,0 mL
de soluo salina esterilizada e agitar manualmente cinco vezes (diluio
1:1.000);
f) Repetir o item e novamente para atingir a diluio 1:10.000;
g) Aps cada transferncia, descartar a ponteira utilizada em um bquer
contendo soluo de detergente (Anexo 1);
h) Pipetar, com ponteiras diferentes, 0,1 mL das etapas d, e e f e trans-
ferir para placas de Petri contendo o meio de cultura de Martin, espec-
fico para fungos (Tabela 5);
i) Espalhar o inculo na superfcie do meio especfico com o auxlio da ala de
Drigalsky, tomando o cuidado de esteriliz-la por flambagem, inserindo-a
em lcool etlico (95 ou 96 GL) e passando-a imediatamente na chama da
lamparina. Repetir o processo, aps o uso em cada placa de Petri;
j) Identificar as placas de Petri (tratamento, repetio, meio de cultivo, data
e responsvel), selar com parafilm e incub-las em estufa a 25 C, inverti-
das, por aproximadamente uma semana;
k) Selecionar as placas de Petri com as diluies que contenham entre 20 e
200 (UFC) isoladas; e,
l) Contar as UFC com contador de colnias ou a olho nu.
32
3. Clculo
Realizar o clculo conforme descrito no Captulo III (p. 22).
4. Resultados
Preencher os dados conforme Tabela 4 (p. 22).
33
CAPTULO VI
MICORRIZAS ARBUSCULARES
Alessandra Monteiro de Paula
PROTOCOLO IV A
EXTRAO DE ESPOROS DE FUNGOS MICORRZICOS
ARBUSCULARES DO SOLO PELO MTODO DO
PENEIRAMENTO MIDO (GERDEMANN; NICOLSON,
1963) E DETERMINAO DO NMERO DE ESPOROS
DE FMA EM AMOSTRA DE SOLO
1. Material
a) Solo mido coletado da camada superficial, obtido conforme o Captulo II
(p. 14);
b) Vidrarias: provetas de 50 mL, basto de vidro e placas de Petri ( 85 mm);
c) Equipamentos: centrfuga de bancada, de no mnimo 3.000 RPM, e mi-
croscpio estereoscpio (lupa);
d) Soluo: sacarose 50 %; e,
e) Outros: conjunto de peneiras (malhas de 750, 250, 100 e 45 m), com
suporte para sustentar o jogo de peneiras, bqueres plsticos de 50 e
2.000 mL ou recipiente de plstico de volume semelhante, tubos plsti-
cos de 50 mL com rosca para centrfuga, pisseta, luvas de proteo (ni-
trila descartvel) e lixeira para resduos biolgicos.
2. Metodologia
a) Medir 50 mL de solo mido e transferi-lo para um bquer de 2.000 mL ou
recipiente de volume semelhante;
b) Acrescentar 1 L de gua potvel e agitar com um basto de vidro, at for-
mar uma suspenso de solo;
c) Dispensar a suspenso no jogo de peneiras, devidamente disposto da
maior para a menor e abertura das malhas de 750, 250, 100 e 45 m;
d) Transferir, com uma pisseta com gua, o material retido nas peneiras
(malhas de 250, 100 e 45 m) para tubos de centrfuga de 50 mL, devida-
mente identificados, completar o volume para 50 mL e centrifugar, por 3
minutos, a 3.000 RPM;
e) Descartar o sobrenadante, acrescentar soluo de sacarose 50 % para res-
suspender o material depositado no fundo do tubo e centrifugar nova-
mente por 2 minutos a 2.000 RPM;
37
3. Clculo
(N de esporos de FMA) g-1 de solo = [(mdia dos 40 campos visuais x 289) g*
*Obtido aps a secagem do solo mido em estufa (105 C) at massa constante.
38
4. Resultados
Tabela 6. Densidade de esporos de fungos micorrzicos arbusculares (FMA) nos diferentes
solos.
Esporos (n g-1)
Solo Total
250 mm 100 mm 45 mm
E
39
PROTOCOLO IV B
CLARIFICAO E COLORAO DE RAZES
DE PLANTAS DE ACORDO COM (BRUNDRETT
et al., 1996A) PARA AVALIAO DA TAXA DE
COLONIZAO MICORRZICA PELO MTODO DE
GIOVANNETTI E MOSSE (1980)
1. Material
a) As razes da planta que ser avaliada devero ser lavadas em gua cor-
rente para retirar o excesso de terra. A partir das razes limpas, retirar
de 1,00 a 2,00 g de razes finas e jovens para conduzir os processos de
clarificao e colorao;
b) Vidrarias e materiais: bqueres de 25 ou 50 mL, placas de Petri ( 85 mm),
lminas e lamnulas;
c) Equipamentos: banho-maria, autoclave ou chapa aquecedora e mi-
croscpio estereoscpio (lupa);
d) Solues: soluo de KOH 10 % (utilizar recipiente resistente ao calor).
Essa soluo utilizada para clarificao das razes (soluo de tinta de
caneta tinteiro azul 5,0 %). Essa soluo pode ser utilizada em substitu-
io soluo de azul de tripano, como soluo de colorao; soluo de
hipoclorito de sdio 3 % (para retirar o excesso de corante das razes);
soluo de 50 % de glicerol/gua para retirar o excesso de corante e arma-
zenar as razes coloridas; e,
e) Outros: pinas e agulhas, pisseta, luvas de proteo (nitrila descartvel)
e lixeira para resduos biolgicos.
2. Metodologia
a) Colocar as amostras de raiz em bquer de 25 ou 50 mL, individuais, para
cada amostra ou em cpsulas plsticas perfuradas que permitam a en-
trada da soluo, ou ainda, em redes de nilon com malha que possibi-
litem a entrada da soluo e dispostas em recipiente maior que agrupe
todas as cpsulas imersas na soluo. A raiz deve permanecer imersa na
soluo de KOH 10 % (Anexo 1) e aps aquecida em banho-maria, em
40
Fonte: http://mycorrhizas.info/method.html#am1.
Fonte: http://mycorrhizas.info/method.html#am1.
3. Clculo
% de colonizao micorrzica = [pontos de razes colonizadas
(pontos de razes colonizadas + pontos de razes no-colonizadas)] * 100
4. Resultados
Tabela 7. Taxa de colonizao micorrzica em plantas.
E
43
CAPTULO VII
ACTINOBACTRIAS
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
PROTOCOLO V
CONTAGEM DE ACTINOBACTRIAS PELO MTODO
DE SEMEADURA EM SUPERFCIE
1. Material
a) Solo mido coletado da camada superficial, obtido conforme o Captulo II
(p. 14);
b) Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio (16 x 1,5 cm) com rosca,
placas de Petri ( 90 mm), ala de Drigalsky e esferas de vidro ( 2,00 mm);
c) Equipamentos: agitador de frasco, estufa de esterilizao, estufa de in-
cubao, capela de fluxo laminar, autoclave, banho-maria, peagmetro,
esterilizador infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina e agitador
de tubos; e,
d) Solues: salina esterilizada (NaCl 0,85 %) e meio de cultura casenato-
dextrose-gar (Tabela 8);
e) Outros: funil de plstico ( 10,0 cm), micropipeta de volume varivel (10
a 100 L), ponteiras autoclavveis, peneira nmero 10 (abertura de 2,00
mm), parafilm, lixeira para resduos biolgicos, luvas de proteo (nitr-
lica descartvel) e gs butano; e,
f) Alternativos: pipetas de 1,0 mL, algodo hidrofbico e pera insufladora.
Amido 10,0
Casena 0,3
KNO3 2,0
NaCl 2,0
K2HPO4 2,0
MgSO4.7H2O 0,05
FeSO4.7H2O 0,01
gar 15,0
2. Metodologia
a) Pesar 10,00 g de solo mido, previamente tamizado, em peneira nmero
10, em duplicata, sendo uma parte destinada contagem de fungos e a
outra para a determinao da massa de solo seco (item 3);
b) Transferir o solo, com um funil, para um Erlenmeyer de 250 mL contendo
cinco esferas de vidro e 90,0 mL de soluo salina esterilizada (Anexo 1)
(diluio 1:10);
c) Aquecer, em banho-maria a 50 C, por 15 minutos;
d) Dispersar as unidades formadoras de colnias (UFC) em agitador
mecnico (usar @ 3,4 G) durante 15 minutos e aguardar a precipitao
das partculas maiores;
e) Com uma micropipeta, contendo ponteira esterilizada, transferir 1,0 mL
da suspenso para um tubo de ensaio contendo 9,0 mL de soluo salina
esterilizada e agitar, no agitador de tubos ou manualmente, cinco vezes
(diluio 1:100);
f) Transferir com uma micropipeta, contendo outra ponteira esterilizada,
1,0 mL da soluo anterior para outro tubo de ensaio contendo 9,0 mL
de soluo salina esterilizada e agitar manualmente cinco vezes (dilu-
io 1:1.000);
g) Repetir o item e duas vezes consecutivas para atingir as diluies
1:10.000 e 1:100.000;
h) Aps cada transferncia, descartar a ponteira utilizada em um bquer
contendo soluo de detergente (Anexo 1);
i) Pipetar, com ponteiras diferentes, 0,1 mL das etapas f e g e transferir
para placas de Petri contendo o meio de cultura casenato-dextrose-gar
(Tabela 8);
j) Espalhar o inculo na superfcie do meio especfico com o auxlio da ala de
Drigalsky, tomando o cuidado de esteriliz-la por flambagem, inserindo-a
em lcool etlico (95 ou 96 GL) e passando-a imediatamente na chama da
lamparina. Repetir o processo, aps o uso em cada placa de Petri;
k) Identificar corretamente as placas de Petri, selar com parafilm e incub-
las em estufa a 25 C, invertidas, durante uma semana;
l) Selecionar as placas de Petri com as diluies que contenham entre 20 e
200 (UFC) isoladas; e,
m) Contar as UFC com contador de colnias ou a olho nu.
48
3. Clculo
Realizar o clculo conforme descrito no Captulo III (p. 22).
4. Resultados
Preencher os dados conforme Tabela 4 (p. 22).
49
CAPTULO VIII
MICRO-ORGANISMOS CELULOLTICOS
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
PROTOCOLO VI
CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS
CELULOLTICOS PELO MTODO DE SEMEADURA
EM SUPERFCIE
1. Material
a) Solo mido coletado da camada superficial, obtido conforme o Captulo II
(p. 14);
b) Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio de 15 mL com rosca,
placas de Petri e ala de Drigalsky;
c) Equipamentos: agitador mecnico, estufa de esterilizao, estufa de in-
cubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esterilizador
infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina e agitador de tubos;
d) Solues: salina esterilizada (NaCl 0,85 %) e meio de cultura celulose-
gar (Tabela 9);
e) Outros: funil plstico ( 10,0 cm), micropipetas com ponteiras de 0,1 mL,
peneira nmero 10 (abertura de 2,00 mm), lixeira para resduos biolgicos,
luvas de proteo (nitrlica descartvel), parafilm, pera insufladora e gs
butano; e,
f) Alternativos: pipetas de 1,0 mL, algodo hidrofbico e pera insufladora.
NaNO3 0,5
K2HPO4 1,0
MgSO4.7H2O 0,5
FeSO4.7H2O 0,01
Celulose* 12,0
gar 15,0
2. Metodologia
a) Pesar 10,00 g de solo mido, obtido conforme o Captulo II (p. 14), previ-
amente tamizado, em peneira nmero 10, em duplicata, sendo uma parte
destinada contagem de micro-organismos celulolticos e a outra para a
determinao da massa de solo seco (item 3);
b) Transferir o solo, com um funil, para um Erlenmeyer de 250 mL con-
tendo 90,0 mL de soluo salina esterilizada (Anexo 1) (diluio 1:10);
c) Dispersar as unidades formadoras de colnias (UFC) em agitador mecni-
co (@ 3,4 G) durante 15 minutos e aguardar a precipitao das partculas
maiores;
d) Com uma micropipeta, contendo ponteira esterilizada, transferir 1,0 mL
da suspenso para um tubo de ensaio contendo 9,0 mL de soluo salina
esterilizada e agitar, no agitador de tubos ou manualmente, cinco vezes
(diluio 1:100);
e) Transferir com uma micropipeta, contendo outra ponteira esterilizada,
1,0 mL da soluo anterior para outro tubo de ensaio contendo 9,0 mL
de soluo salina esterilizada e agitar manualmente cinco vezes (dilu-
io 1:1.000);
f) Repetir o item e novamente para atingir a diluio 1:10.000;
g) Aps cada transferncia, descartar as ponteiras utilizadas em um bquer
contendo soluo de detergente (Anexo 1);
h) Pipetar, com ponteiras diferentes, 0,1 mL das etapas d, e e f e trans-
ferir para placas de Petri contendo o meio de cultura celulose-gar;
i) Espalhar o inculo na superfcie do meio especfico com o auxlio da ala de
Drigalsky, tomando o cuidado de esteriliz-la por flambagem, inserindo-a
em lcool etlico (95 ou 96 GL) e passando-a imediatamente na chama da
lamparina. Repetir o processo, aps o uso em cada placa de Petri;
j) Identificar corretamente as placas de Petri, selar com parafilm e incub-
las em estufa a 25 C, invertidas, durante 7 dias;
k) Aps 7 dias, considerar somente as colnias que formarem, ao seu redor,
um halo transparente, que corresponde celulose degradada;
l) Selecionar as placas de Petri com as diluies que contenham entre 20 e
200 (UFC) isoladas; e,
m) Contar as UFC com contador de colnias ou a olho nu.
53
3. Clculo
Realizar o clculo conforme descrito no Captulo III (p. 22).
4. Resultados
Preencher os dados conforme Tabela 4 (p. 22).
54
CAPTULO IX
MICRO-ORGANISMOS SOLUBILIZADORES DE
FOSFATO
Ida Chapaval Pimentel
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
UFC g-1 de solo, de solubilizadores de fosfato foi: 13 x 104; 48 x 104 e 53 x 104, res-
pectivamente, solo erodido, plantio convencional e solo em recuperao.
Os micro-organismos solubilizadores de fosfatos inorgnicos represen-
tam um grande potencial para a agricultura em clima tropical, porm atualmente
no possvel contar com essa tecnologia.
57
PROTOCOLO VII
CONTAGEM DE MICRO-ORGANISMOS
SOLUBILIZADORES DE FOSFATO PELO MTODO
DE SEMEADURA EM SUPERFCIE
1. Material
a) Solo mido coletado da camada superficial, obtido conforme o Captulo II
(p. 14);
b) Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, tubos de ensaio de 15 mL com rosca,
placas de Petri, ala de Drigalsky;
c) Equipamentos: agitador mecnico, estufa de esterilizao, estufa de in-
cubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esterilizador
infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina, agitador de tubos;
d) Solues: salina esterilizada (NaCl 0,85 %), Meio de cultura dextrose-
extrato de levedura (Tabela 10);
e) Outros: funil de plstico ( 10 cm), micropipetas com ponteiras de 0,1 mL,
peneira nmero 10 (abertura de 2,00 mm), parafilm, lixeira para resduos
biolgicos, luvas de proteo (nitrlica descartvel); gs butano; e,
f) Alternativos: pipetas de 1,0 mL, algodo hidrofbico e pera insufladora.
2. Metodologia
a) Pesar 10,00 g de solo mido, obtido conforme o Captulo II (p. 14), previ-
amente tamizado, em peneira nmero 10 em duplicata, sendo uma parte
destinada contagem de micro-organismos solubilizadores de fosfato e a
outra para a determinao da massa de solo seco (item 3);
b) Transferir o solo, com um funil, para um Erlenmeyer de 250,0 mL con-
tendo cinco esferas de vidro e 90,0 mL de soluo salina esterilizada (An-
exo 1) (diluio 1:10);
c) Dispersar as unidades formadoras de colnias (UFC) em agitador
mecnico (usar @ 3,4 G) durante 15 minutos e aguardar a precipitao
das partculas maiores;
d) Com uma micropipeta, contendo ponteira esterilizada, transferir 1,0 mL
da suspenso para um tubo de ensaio contendo 9,0 mL de soluo salina
esterilizada e agitar, no agitador de tubos ou manualmente, cinco vezes
(diluio 1:100);
58
Glicose 10,0 g
Fe-EDTA 10,0 mL
KNO3 0,1 g
gar 15,0 g
3. Clculo
Realizar o clculo conforme descrito no Captulo III (p. 22).
4. Resultados
Preencher os dados conforme Tabela 4 (p. 22).
60
CAPTULO X
ISOLAMENTO DE RIZBIOS DE RAZES
DE LEGUMINOSAS
Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
Diana Signor
N2 + 3 H2 2 NH3.
PROTOCOLO VIII
ISOLAMENTO DE RIZBIO DE RAZES
DE PLANTAS LEGUMINOSAS
1. Material
a) Razes de plantas recm-colhidas, com ndulos frescos;
b) Vidraria: placas de Petri, tubos de ensaio, basto de vidro e lminas;
c) Equipamentos: microscpio fotnico, estufa de esterilizao, estufa de
incubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esterilizador
infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina;
d) Solues: meio de cultura extrato de levedura-manitol-gar-YMA (Ta-
bela 11); e,
e) Outros: bico de Bunsen ou lamparina, gs butano, pina, peneira nmero
10 (abertura de 2,00 mm) p, saco plstico, papel toalha e luva de pro-
teo (nitrlica descartvel).
Manitol 10,0
K2HPO4 0,5
MgSO4.7H2O 0,2
NaCl 0,1
gar 15,0
Obs.: Ajustar o pH final para 6,8; 1Acrescentar azul de bromotimol (5 mL L -1 de meio de cultura, Anexo 1)
64
2. Metodologia
2.1. Coleta de ndulos
a) Selecionar a planta leguminosa;
b) Demarcar um crculo ao redor da planta, correspondente rea do siste-
ma radicular;
c) Para leguminosas herbceas como soja, feijo e guandu, recomenda-se
fazer um crculo, em volta da planta, com cerca de 15 cm de raio;
d) Para arbreas, so necessrios dois crculos: um prximo raiz principal
e outro mais distante, que se aproxime das razes secundrias;
e) Cavar a uma profundidade de 30 cm para plantas herbceas e a uma pro-
fundidade maior para arbreas;
f) Remover a terra cuidadosamente para no danificar o sistema radicular; e,
g) Retirar o excesso de solo com as mos sobre uma peneira, cuidando para
que os ndulos no se percam.
3. Resultados
Algumas caractersticas morfolgicas e culturais do rizbio em meio de
cultura YMA com azul de bromotimol.
Obs.: Para a confirmao que o isolado rizbio, deve ser realizada a ino-
culao na leguminosa hospedeira, observando-se a formao de ndulos, ou a
identificao por biologia molecular.
67
CAPTULO XI
INOCULAO DE SEMENTES DE LEGUMINOSAS
Diana Signor
Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
Para que uma leguminosa seja cultivada, sem adio de adubo nitrogena-
do, mineral ou orgnico, preciso que forme uma associao simbitica mutualsti-
ca com uma bactria denominada rizbio. Nessa associao, formam-se ndulos nas
razes da planta, que fornece energia na forma de carboidrato para a bactria, que
cede, em troca, nitrognio amoniacal, fixado a partir do N2 atmosfrico.
A maneira mais prtica de transferir rizbio para a semente por meio da
inoculao. Segundo Brasil (2004), inoculante todo material que possui micro-or-
ganismos, atua favoravelmente no desenvolvimento das plantas e contm bactrias
vivas, especficas para cada espcie ou grupo de leguminosas.
Os inoculantes brasileiros para leguminosas devem atender s normas
definidas pelo Ministrio da Agricultura, Pecuria e Abastecimento (MAPA), con-
forme recomenda Embrapa (2011):
incio do sculo XX, e fludos (lquidos, com a bactria estabilizada em seus pro-
cessos metablicos por protetores celulares). No incio dos anos 1990, comearam
a surgir os inoculantes lquidos, que hoje representam a maior parte do mercado
nacional, em funo da facilidade de sua aplicao.
So consagradas as seguintes vantagens do uso de inoculantes:
nutrientes e o uso de fungicidas. Para a cultura da soja, recomenda-se de 2,0 a 3,0 g ha-1
de cobalto e de 12,0 a 30,0 g ha-1 de molibdnio via semente ou em pulverizao
foliar, nos estdios de desenvolvimento V3 (3 interndio) a V5 (5 interndio)
(EMBRAPA, 2013).
Para minimizar o efeito de doenas do solo e outras transmitidas pelas
sementes, necessrio, na maioria das vezes, utilizar fungicidas. Porm, muitos
apresentam toxicidade ao rizbio, causando expressiva mortalidade. Como alter-
nativa menos prejudicial ao rizbio, so recomendadas pela Embrapa (2013) as
seguintes misturas:
Carboxin + Thiram;
Difenoconazole + Thiram;
Carbendazin + Captan;
Thiabendazole + Tolylfluanid; e,
Carbendazin + Thiram.
PROTOCOLO IX
INOCULAO DE SEMENTES DE LEGUMINOSAS
1. Material
a) Sementes de soja e trevo;
b) Inoculante turfoso e lquido;
c) Solues: goma caseira 7,0 % (adesivo) e sacarose (10,0 %); e,
d) Outros: bandejas, sacos plsticos, calcrio ou fosfato de rocha, esptula,
luva de proteo (nitrlica descartvel) e lixeira para resduos biolgicos.
2. Metodologia
2.1. Inoculao Simples Inoculante turfoso
a) Misturar separadamente a soluo de sacarose a 10,0 % (Anexo 1) ao in-
oculante em um bquer de 500 mL;
b) Adicionar esta pasta s sementes, misturando-as em betoneira ou tam-
bor com eixo excntrico, at que apresentem uma camada de revestimen-
to uniforme do inoculante envolvendo-as;
c) Espalhar as sementes e deix-las secando em local sombreado, fresco e
arejado; e,
d) Semear imediatamente em vasos ou no campo.
Tabela 12. Quantidades de material utilizado em funo do tamanho das sementes de le-
guminosas a serem peletizadas (FARIA et al., 1984 citado por DE-POLLI, 1985).
Calcrio ou
Leguminosa Goma arbica
calcrio +
40 % ou goma Inoculante (g) Semente (kg)
micronutrientes
caseira 7 % (mL)
(1:1) (kg)
Sementes
grandes:
soja, feijo,
fava, caupi, 500 100 25 5
amendoim,
guandu, leucena,
ervilha, etc.
Sementes
mdias:
calopognio,
500 100 10 08
siratro, soja
perene,
centrosema, etc.
Sementes
pequenas:
estilosantes, 500 100 5 10
lotononis,
desmodium, etc.
72
CAPTULO XII
RESPIRAO MICROBIANA
Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
Diana Signor
PROTOCOLO X
RESPIRAO BASAL DO SOLO EM SISTEMA
ESTTICO, MTODO DE ALEF (1995)
1. Material
a) Solo mido coletado da camada superficial, obtido conforme o Captulo II
(p. 14);
b) Vidraria: bureta automtica de 10,0 mL, frascos de vidro escuros de 1,0 L
com tampa, tubos de ensaio de 15,0 mL e Erlenmeyer de 125,0 mL;
c) Equipamentos: estufa de incubao, balana de preciso centesimal, gela-
deira e agitador magntico;
d) Solues: fenolftalena (0,1 %), HCl 0,5 N, BaCl2 (50 %) e NaOH 0,5N;
e) Outros: micropipetas com ponteiras de 1,0 mL e 10,0 mL, trado cala-
dor, peneiras nmero 10 (abertura de 2,00 mm) e nmero 20 (abertura
de 0,85 mm), luvas de proteo (nitrlica descartvel), pera insufladora,
balde plstico de 5,0 L ou 8,0 L, esptula, substratos orgnicos: aveia,
milho, soja, alfafa, hmus, serragem, celulose, esterco bovino; e,
f) Alternativos: pipetas de 1,0 mL e 10,0 mL.
2. Metodologia
2.1. Respirao basal do solo (RBS)
a) Pesar 10,00 g de solo mido para determinar a massa de solo seco (item 3);
b) Determinar a capacidade de reteno de gua (CRA) e corrigir a umidade
para 60,0 % da CRA, com gua destilada (Anexo 3);
c) Pesar 100,00 g de solo mido, previamente tamizado, em peneira nme-
ro 10 (abertura de 2,00 mm), em triplicata, e transferir para um frasco de
vidro com tampa hermtica;
d) Colocar dentro do frasco de vidro um tubo de ensaio contendo 15,0 mL
de NaOH 0,5 N padronizado (Anexos 1 e 4) para capturar o CO2 produ-
zido e outro tubo de ensaio contendo 10,0 mL de gua destilada para
manter a umidade do ambiente;
e) Para cada dez frascos de vidro a serem incubados, realizar uma prova em
branco, que corresponde a um frasco contendo apenas um tubo de ensaio
com 15 mL de NaOH 0,5 N padronizado (Anexos 1 e 4) e outro contendo
10,0 mL de gua destilada;
76
3. Clculo
1. Calcular a respirao basal do solo (RBS) de acordo com Stotzky (1965):
Onde:
b: Volume de HCl gasto na prova em branco;
a: Volume de HCl gasto na amostra;
E: Equivalente do carbono;
N: Normalidade do HCl;
g: massa de solo seco; e,
h: horas de incubao.
4. Resultados
Tabela 13. Respirao microbiana do solo (mg C-CO2 kg-1 h-1) acumulada em funo da adi-
o de resduos orgnicos.
Repeties
Tratamento Mdia
I II III IV
2. ST + palha de aveia
3. ST + palha de milho
4. ST + palha de alfafa
5. ST + palha de soja
6. ST + p de serragem
7. ST + celulose
8. ST + esterco bovino
9. ST + hmus de minhoca
78
CAPTULO XIII
BIOMASSA MICROBIANA
Jair Alves Dionsio
Ida Chapaval Pimentel
Diana Signor
PROTOCOLO XI
MTODO DE RESPIRAO INDUZIDA (RIS) PELO
SUBSTRATO (ANDERSON; DOMSCH, 1978 DESCRITO
POR HOPPER, 2006)
1. Material
a) Solo mido coletado da camada superficial, conforme o Capitulo II, gli-
cose anidra;
b) Vidraria: pipetas de 10 mL, bureta automtica de 10,0 mL, frascos de
vidro escuros (1.000 mL) com tampa, tubos de ensaio de 15,0 mL, Erlen-
meyer de 125 mL e dessecador;
c) Equipamentos: estufa de incubao, balana de preciso centesimal, gela-
deira e agitador magntico;
d) Outros: peneira de nmero 10 (abertura de 2,00 mm), luva de proteo e
papel toalha;
e) Solues: BaCl2 50 %, fenolftalena (0,1 %), NaOH 0,1 N e HCl 0,1 N; e,
f) Alternativos: pipetas de 1,0 mL, algodo hidrofbico e pera insufladora.
2. Metodologia
Esse mtodo, proposto por Anderson e Domsch (1978), baseado no au-
mento inicial da taxa de respirao da populao microbiana, at o mximo, quando
uma fonte de carbono, prontamente decomponvel, adicionada em excesso ao solo.
3. Clculo
Calcular a biomassa microbiana do solo conforme Anderson e Domsch
(1978) descrito por Hoper (2006).
Onde:
BMS: carbono da biomassa microbiana (g C g-1);
30: constante (mg Cmic h mL CO2-1);
b: mdia do volume (mL) de HCl gasto para titular as provas em branco;
a: mL HCl gastos para titular as amostras;
K: concentrao da soluo de HCl;
22: fator de converso (1,0 mL HCl 1,0 M corresponde a 22,0 mg de CO2);
1.000: fator de converso de kg de solo para g de solo;
1,8295: densidade do CO2 a 22 C;
PA: massa da amostra (g de solo seco); e,
4: fator de converso para transformao de 4 para 1 h.
83
4. Resultados
Tabela 14. Carbono da biomassa microbiana do solo (g C g-1) em diferentes solos.
Repeties
Solo Mdia
I II III IV
B
C
Repeties
Solo Mdia
I II III IV
Repeties
Solo Mdia
I II III IV
E
*COT: carbono orgnico total do solo.
84
CAPTULO XIV
DECOMPOSIO DE RESDUOS ORGNICOS
Diana Signor
Jair Alves Dionsio
Temperatura;
Umidade;
Teor de matria orgnica do solo;
Localizao e quantidade de material adicionado;
pH;
Concentrao de O2 livre no solo; e,
Presena de adubos verdes, fertilizantes, araes, gradagens, mane-
jo do solo e uso de herbicidas.
Carbono/nitrognio (C/N);
Carbono/fsforo (C/P);
Nitrognio/fsforo;
Lignina; e,
Polifenis.
PROTOCOLO XII
DETERMINAO DA TAXA DE DECOMPOSIO DE
RESDUOS ORGNICOS
1. Material
a) Equipamentos: estufa e balana de preciso centesimal; e,
b) Outros: serapilheira de diferentes reas, sacola plstica para coleta, saco-
las de nilon (malhas de 0,2; 0,5; 1,0 e 2,0 mm), p de corte, bquer de
200 mL, pina, pincel fino e luva de proteo (nitrlica descartvel).
2. Metodologia
a) Coletar, em sacola plstica, aproximadamente 500 g serapilheira de dife-
rentes reas;
b) Determinar a umidade da serapilheira em estufa a 65 C por 48 h;
c) Calcular fator de correo para umidade do item anterior (massa mida
massa seca-1);
d) Colocar 10 g de serapilheira de cada amostra em sacolas de nilon (15 x
10 cm) com diferentes espessuras (malhas de 0,2; 0,5; 1,0 e 2,0 mm), para
evidenciar a ao dos diferentes componentes da fauna edfica em funo
do dimetro do corpo dos animais;
e) Fazer, no mnimo, cinco repeties para cada amostra analisada;
f) Identificar devidamente as sacolas de nilon e distribu-las na superfcie
do solo;
g) Aps perodos variveis de tempo (30, 60 e 90 dias), recolher as sacolas
de nilon, tomando cuidado para no danificar o material;
h) Levar as sacolas para laboratrio, retirar cuidadosamente, com um pincel
fino, o solo que ficou aderido s partculas da serapilheira de diferentes
reas; e,
i) Colocar a serapilheira em bquer de 200 mL e secar em estufa a 65 C por
48 h e pesar.
3. Clculo
a) Fitomassa remanescente (%) = (massa seca final/massa seca inicial) x 100; e,
88
Wt = WO-ekt
Onde:
Wt: fitomassa remanescente (%);
WO: massa inicial do material (utilizado sempre como 100 %);
e: exponencial;
k: taxa de decomposio; e,
t: tempo em que o material ficou no campo (dias).
4. Resultados
Tabela 17. Porcentagem de biomassa residual com diversas coberturas vegetais em funo
da malha das sacolas de decomposio (litter bags) e do tempo.
Repeties (%)
Tratamento (mm) Mdia
I II III IV V
1. Malha 0,2
2. Malha 0,5
3. Malha 1,0
4. Malha 2,0
Repeties (%)
Tratamento (mm) Mdia
I II III IV V
1. Malha 0,2
2. Malha 0,5
3. Malha 1,0
4. Malha 2,0
89
CAPTULO XV
PROTOZORIOS
Jair Alves Dionsio
Ana Luiza Mattana
Diana Signor
PROTOCOLO XIII
MTODO CULTURAL PARA CONTAGEM DE
PROTOZORIOS DO SOLO, ADAPTADO
DE SINGH (1946)
1. Material
a) Solo mido, coletado conforme o Captulo II (p. 14);
b) Vidrarias: Erlenmeyer de 250 mL, pipetas de 1 mL, tubos de ensaio de
15 mL com rosca, placas de Petri e ala de Drigalsky;
c) Equipamentos: agitador mecnico, estufa de esterilizao, estufa de in-
cubao, capela de fluxo laminar, autoclave, peagmetro, esterilizador
infravermelho ou bico de Bunsen ou lamparina, microscpio tico, gs
butano e agitador de tubos;
d) Solues: soluo salina (NaCl 0,85 %), safranina 0,5 % (Anexo 1) e meio
de cultura gar nutriente (Tabela 19); e,
e) Outros: micropipetas com ponteiras de 0,1 mL, peneira de nmero 10
(abertura de 2,00 mm) e luva de proteo (nitrlica descartvel).
Caldo nutritivo
2. Metodologia
2.1. Cultivo bacteriano
a) Utilizar bactria digervel (Aerobacter aerogenes, Azotobacter chroococcum,
Escherichia coli ou Rhizobium phaseoli);
b) Cultivar a bactria em tubo de ensaio, inclinado, contendo o meio gar
nutriente por, no mnimo, 72 h a 25 C;
c) Preparar placas de Petri com meio gar nutriente;
d) Acrescentar cinco anis de vidro (10 x 20 mm), esterilizados, de forma
equidistante, no meio de cultura;
e) Suspender o cultivo bacteriano em soluo salina esterilizada;
f) Pipetar 0,1 mL da suspenso e inocular uma gota em cada anel; e,
g) Incubar a 25 C por, no mnimo, trs dias.
g) Inocular de cada diluio (10-1; 10-2; 10-3, 10-4 e 10-5) uma gota (@ 0,05 mL)
no centro do anel, realizando-se quatro repeties/diluio;
h) Incubar a 25 C por 14 dias;
i) Realizar as contagens, com uma lupa, considerando-se como casos posi-
tivos os anis que apresentam clareamento do cultivo bacteriano;
j) Contar os casos positivos e obter os valores correspondentes na Tabela
do Nmero Mais Provvel2; e,
k) Dos casos positivos, transferir com ala de platina uma poro do cresci-
mento para uma lmina de vidro, contendo gua deionizada, homogenei-
zar e realizar a identificao das classes de protozorios por microscopia
tica, com auxlio das ilustraes (Figura 4).
3. Clculo
(N de protozorios) g-1 = diluio x n cdigo (NMP)* x 10 g-1*
*Obtido aps a secagem do solo mido em estufa (105 C) at massa constante.
4. Resultados
Estimar a densidade de protozorios pelo mtodo do Nmero Mais Prov-
vel (NMP) (Anexo 5) e completar a Tabela 20.
Classes*
Solo Total
Sarcodina Mastigofora Ciliata
E
96
CAPTULO XVI
NEMATOIDES
Arlei Maceda
Bacterifagos;
Fitfagos;
Micfagos;
Onvoros; e,
Predadores.
Fitonematoides: 40 %;
Onvoros: 30 %;
Bacterifagos: 20 %;
Micfagos: 7 %; e,
Predadores: 3 %.
97
PROTOCOLO XIV
MTODO DE AVALIAO DA DENSIDADE DE
NEMATOIDES NO SOLO
H uma variao muito grande nos mtodos de extrao de nematoides
de solos ou de tecidos/rgos vegetais. O mtodo flotao centrfuga em soluo
de sacarose internacionalmente aceito e utilizado, pois relativamente fcil e de
rpida execuo (JENKINS, 1964).
Para se estimar a populao de nematoides no solo com mais preciso,
aconselha-se fazer, no mnimo, trs repeties do mtodo por amostra.
AMOSTRAGEM E ACONDICIONAMENTO DE
AMOSTRAS
Coletar o solo com os mesmos princpios da amostragem para fins de fer-
tilidade, ou seja, amostras compostas, representativas e de reas homogneas, nas
camadas de 0 a 30 cm, descartando-se a camada de 0 a 5 cm.
Acondicionar as amostras (aproximadamente 1 L) em sacos plsticos e
identific-las externamente. Coletar solos com a umidade prxima capacidade de
campo, evitando-se solos muito secos ou excessivamente encharcados. Durante o
procedimento de coleta da amostra, no exp-la a altas temperaturas, caso seja
necessrio, mant-la em caixa de isopor. Enviar o mais rapidamente possvel ao
laboratrio, no sendo vivel mant-la em refrigerador a temperaturas de 4 a 8 C.
O ideal ter uma amostra por hectare, entretanto, em grandes reas, uma amostra
pode representar at 20 hectares.
2. Metodologia
2.1. Peneiramento
Fundamentao da fase: separar fisicamente os nematoides (tamanhos
diferentes) dos componentes do solo, utilizando diferentes aberturas de peneiras.
3. Clculo
Estimativa da densidade final de nematoides.
Onde:
N: nmero de nematoides/1,0 mL da lmina de Peters; e,
4: volume final do lquido concentrado na extrao.
4. Resultados
Realizar a identificao dos nematoides em grupos trficos e preencher a
Tabela 21.
Grupos trficos
5
103
CAPTULO XVII
MESOFAUNA
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
Arthropoda Aranae;
Pseudoescorpione;
Acari;
Diplura;
Protura;
Collembola;
Coleoptera;
Diptera;
Hymenoptera; e,
Annelidae Oligochaeta.
Agricultura;
Sade;
Produtos armazenados;
Controle biolgico; e,
Esttica.
pH;
Umidade;
Temperatura do solo;
Textura;
Porosidade;
Matria orgnica;
Fauna e flora edficos;
Cobertura vegetal;
Interferncia do homem;
Clima;
Regio geogrfica; e,
Eventos naturais.
Palha + vinhaa;
Sem palha e sem vinhaa;
Palha sem vinhaa;
Sem palha e sem vinhaa; e,
Mata nativa.
PROTOCOLO XV
EXTRAO DA MESOFAUNA EDFICA PELO MTODO
DO FUNIL DE BERLESE-TULLGREN MODIFICADO
1. Material
a) Vidraria: frasco de vidro (100 mL) e placa de Petri (90 mm);
b) Equipamentos: mesa extratora, microscpio estereoscpio (lupa) e mi-
croscpio tico3;
c) Soluo preservativa (Tabela 22); e,
d) Outros: funil de Berlese-Tullgren, modelo da UFPR: dimenses: dimet-
ro (7,5 cm), profundidade (4,5 cm), comprimento (28,0 cm) e abertu-
ra (malha de 2,0 mm), lmpadas de 25 W, estilete entomolgico, pina
cirrgica, elstico de borracha, caixa plstica vazada e luva de proteo
(nitrlica descartvel).
lcool 70 % 700,0
Glicerina 20,0
2. Metodologia
a) Determinar previamente o nmero de amostras de solo a ser coletado
(no mnimo 10);
b) Realizar a amostragem, com o funil de Berlese-Tullgren, de forma repre-
sentativa para a rea em estudo;
c) Separar serapilheira do solo e coletar a amostra de solo na camada super-
ficial (0,0 a 5,0 cm);
d) Revestir o funil de Berlese-Tullgren com saco plstico limpo e prend-lo
com elstico de borracha, para evitar perda de solo e, consequentemente,
de animais;
3
Informaes complementares disponveis em: http://ainfo.cnptia.embrapa.br/digital/bitstream/
CNPAB-2010/34090/1/cit017.pdf
108
Identificao da amostra:
Filo
1. Arthropoda
Subfilo
Chelicerata
Classe
Arachnida
Subclasse Indivduos/
Acari funil
Superordem
Parasitiforme
Acariforme
Ordem
Aranae
Pseudoscorpiones
Subfilo
Hexapoda
109
Continua.
Tabela 23. Continuao.
110
Classe
Ordem
Entognatha
Diplura
Protura
Collembola Subordem
Symphypelona
Arthropleona
Classe
Ordem
Insecta
Coleoptera
Diptera
Hymenoptera Famlia
Subfilo
Formicidae
Myriapoda
Classe
Chilopoda
Pauropoda
Symphyla
2. Annelidae
Classe
Clitellata
Continua.
Tabela 23. Continuao.
Subclasse
Oligochaeta
Ordem
Haplotaxida
Subordem
Tubificina
Famlia
Enchytraeidae
Outros
Total
Fonte: Maral (2009).
111
112
3. Clculo
O clculo para estimativa da densidade da mesofauna feito com base na
rea do crculo do funil de Berlese-Tullgren.
S = (.d2)/4
Onde:
: 3,14...;
d: dimetro do crculo 7,5 cm;
S: rea do crculo 44,18 cm2;
1 m2 = 10.000 cm2; e,
Fator de transformao: 10.000 cm2/44,18 cm2 = 262,35.
4. Resultados
Expressar os termos absolutos (indivduos/funil) e evitar extrapolar os
dados para nmero de organismo por hectare ou m2.
113
CAPTULO XVIII
MACROFAUNA
Diana Signor
Jair Alves Dionsio
PROTOCOLO XVI
MTODO DE EXTRAO DA MACROFAUNA EDFICA
(ANDERSON; INGRAM, 1993)
1. Material
a) Vidraria: frasco de vidro (250 mL);
b) Equipamentos: microscpio fotnico e microscpio estereoscpio (lupa);
c) Soluo preservativa: lcool 70 % (Anexo 1); e,
d) Outros: p de corte, saco plstico, bandeja, pina cirrgica e luva de pro-
teo (nitrlica descartvel).
2. Metodologia
Avaliador:
Coleta: Leitura:
Coletor:
Indivduo
Grupo Nome comum Grupo funcional
(nmero m-2)
Besouros, larvas, Rizfagos, predadores,
1. Coleoptera
cors detritvoros
Gefagos, detritvoros,
2. Oligoqueta Minhocas
onvoros
Gefagos, detritvoros,
3. Isoptera Trmitas, cupins
rizfagos
Fitfagos, predadores,
4. Formicidae Formigas
detritvoros, onvoros
Milipeias, piolho
6. Diplopoda Detritvoros
de cobra
Borboletas,
12. Lepidoptera Fitfagos
mariposas
Detritvoros, predadores,
13. Diptera Moscas
parasitos
Detritvoros, fitfagos,
14. Blattaria Baratas
onvoros
3. Resultados
Apresentar os dados obtidos em forma de tabela, conforme a Ficha de
Avaliao (Tabela 24), calculando a quantidade e, dentro do possvel, realizar a
identificao dos organismos da macrofauna edfica encontrados nas amostras,
conforme literatura especializada.
Expressar os resultados de densidade populacional (indivduo m-2) em
termos absolutos e relativos. Evitar extrapolar os dados para nmero de organis-
mos por hectare ou m2.
119
CAPTULO XIX
MINHOCAS
Jair Alves Dionsio
Diana Signor
Idade;
Tamanho;
Estrutura da populao;
poca do ano;
Qualidade da matria orgnica ingerida;
Temperatura;
Disponibilidade de gua; e,
Textura do solo.
Umidade;
Aerao;
Temperatura;
Material alimentar; e,
pH.
PROTOCOLO XVII
MTODO DE EXTRAO DE MINHOCAS DO SOLO
COM EXTRATO DE CEBOLA (STEFFEN et al., 2010)
1. Material
a) Equipamentos: microscpio estereoscpio (lupa), microscpio fotnico,
relgio, anel metlico (modelo da UFPR: 0,108 m de altura, 0,407 m de
dimetro e 0,1301 m2 de rea) e balana de preciso centesimal;
b) Solues: extrato de cebola 17,5 % e lcool 70 % (Anexo 1); e,
c) Outros: bquer de polietileno, galo de 5 L, pina metlica, pisseta, luva
de proteo (nitrlica descartvel), papel toalha e enxada.
2. Metodologia
3. Clculo
N ou biomassa fresca m-2 = mdia dos cinco anis (Rep.1+ ...+ Rep.5)/5 *fc1
1
fc 1 m2/rea do anel (0,1301 m-2) = 7,7
4. Resultados
Estimar a densidade populacional (Tabela 25) e a biomassa fresca (Tabela
26). De acordo com o Anexo 8, possvel realizar a identificao de algumas fam-
lias de minhocas.
Densidades (N m-2)
Solo Mdia
I II III IV V
Biomassas (g m-2)
Solo Mdia
I II III IV V
E
125
REFERNCIAS
AIDAR, M. P. M. et al. Dinmica da produo e decomposio da serapilheira do
ararib (Centrolobium tomentosum Guill. ex Benth Fabaceae) em uma mata ciliar,
Rio Jacar-Pepira, So Paulo. Revista Brasileira de Botnica, So Paulo, v. 26,
n. 2, p. 193-202, 2003.
BAKER, G. H. et al. The life history and abundance of the introduced earthworms
Aporrectodea trapezoides and Aporrectodea caliginosa in pasture soils in the Mount
Lofty Range, South Australia. Soil Biology & Biochemistry, Oxford, v. 24, n. 12,
p. 1389-1395, 1996.
CERRI, C. C.; VOLKOFF, B.; EDUARDO, B. P. O ciclo do carbono (C) no solo. In:
CARDOSO, E. J. B. N.; TSAI, S. M.; NEVES, M. C. P. (Ed.). Microbiologia do solo.
Campinas: Sociedade Brasileira de Cincia do Solo, 1992. p. 59-71.
JASTROW, J. D.; MILLER, R. M. Methods for assessing the effects of biota on soil
structure. In: CROSSLEY JUNIOR, D. A. et al. (Ed.) Modern techniques in soil
ecology. Amsterdam: Elsevier Science, 1991. p. 279-303.
LAVELLE, P. et al. The relationship between soil macrofauna and tropical soil
fertility. In: WOOMER, P. L.; SWIFT, M. J. (Ed.). The biological management of
tropical soil fertility. New York: Wiley-Sayce, 1994. p. 137-169.
TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 12. ed. Porto Alegre:
Artmed, 2013.
WAID, J. S. Biological and biochemistry analysis of soils. Plant and Soil, The
Hague, v. 76, n. 1-3, p. 127-137, 1984.
ANEXO 1
Preparo de solues diversas.
ANEXO 2
Teste de Gram em solubilidade com KOH (RYU, 1940)
a) Selecionar colnias bacterianas puras (isoladas) das placas de Petri em
meio de cultivo com no mximo 24 h;
b) Limpar as lminas de vidro previamente com lcool etlico;
c) Pingar na lmina de vidro trs gotas de KOH 3 % (Anexo 1);
d) Transferir, com a ala de semeadura, uma colnia ou parte dela para a
lmina de vidro;
e) Misturar com a ala de semeadura at formar uma mistura homognea e
aguardar 30 segundos; e,
f) Colocar a ala de semeadura sobre a mistura previamente obtida, erguer
1 a 2 cm e verificar se h formao de fios viscosos.
ANEXO 3
Determinao da capacidade de reteno de gua do solo
conforme Monteiro e Frighuetto (2000)
Dentre os fatores limitantes da atividade dos micro-organismos no solo,
tem-se a capacidade de reteno de gua, que extremamente varivel entre os
solos, em funo principalmente dos teores de argila e matria orgnica. Dessa for-
ma, a determinao desse atributo fundamental para interpretao das anlises
microbiolgicas, porm, para que seja aplicado corretamente, necessrio que os
solos estejam nas mesmas condies de umidade, ou seja, na mesma capacidade
de reteno de gua. Os valores de capacidade de reteno de gua so variveis de
acordo com a metodologia, podendo ser superiores a 100 %.
1. Material
a) Solo mido coletado da camada superficial (0 a 10 cm);
b) Vidrarias: funil plstico (dimetro 10 cm), pipetas* de 1 mL, frasco de
vidro de 150 mL, bquer de 200 mL;
c) Equipamentos: balana analtica com preciso de dcimo de grama, estu-
fa de secagem; e,
d) Outros: papel filtro quantitativo, faixa preta, filtragem rpida (dimetro
15 cm), suporte de madeira, filme plstico, esptula e luvas de proteo
(nitrlica descartvel).
2. Metodologia
a) Para cada amostra, separar um conjunto formado por funil de vidro,
papel filtro e frasco de vidro e determinar a massa. Realizar a avaliao
em duplicata;
b) Acoplar, em um suporte de madeira, o funil contendo o papel filtro e
posicionar corretamente o frasco coletor abaixo do funil;
c) Pesar 20,0 g de solo mido, obtido conforme o Captulo II (p. 14), previa-
mente tamizado em peneira no 10 (abertura de 2,00 mm) e transferi-lo
com auxlio de uma esptula para o funil;
d) Em um bquer, pesar em balana analtica 100 g de gua destilada e adi-
cion-la ao solo em pequenos volumes. Cobrir o funil com filme plstico
e deixar temperatura ambiente;
146
e) No dia seguinte, retirar a gua retida na haste do funil, com batidas sua-
ves no suporte de madeira e pesar o frasco coletor contendo a gua per-
colada; e,
f) Para cada amostra, necessria a realizao da prova em branco (sem a
adio de solo).
3. Clculo
Onde:
AP: gua percolada (g);
AS: gua existente no solo (g); e,
SS*: massa do solo seco (g), obtido aps a secagem do solo mido (20 g)
em estufa (105 C) at massa constante.
ANEXO 4
Padronizao de soluo de hidrxido de sdio 0,5 N
1. Introduo
O NaOH no padro primrio, porque higroscpio e sempre contm
uma quantidade indeterminada de gua e carbonato de sdio adsorvida no slido.
Isso significa que as solues de NaOH devem ser padronizadas com um reagente
padro primrio. O padro primrio mais utilizado nessa determinao o ftalato
cido de potssio ou biftalato de potssio HKC6H4(COO)2. Pela estequiometria, um
mol de biftalato neutraliza um mol de hidrxido de sdio.
As solues de hidrxido de sdio atacam o vidro e dissolvem a slica com
formao de silicatos solveis. A presena de silicatos solveis causa erros e as solu-
es de hidrxidos devem ser conservadas em frascos de polietileno.
2. Material
a) Equipamento: balana analtica, agitador magntico;
b) Vidraria: bureta de 25 mL, balo volumtrico de 100 mL, bqueres de
250 e 500 mL, funil de vidro, conta-gotas, Erlenmeyer de 250 mL, pipeta
de 10 mL;
c) Reagentes: KHC8H4O4, PM = 204,224 e NaOH, PM = 40,0; e,
d) Outros: pisseta, suporte universal, garras e conta-gotas.
3. Metodologia
3.3 Titulao
A soluo de biftalato de potssio, aps adio do indicador, ser posicio-
nada no sistema como titulado e o NaOH como titulante, a titulao terminar com
a mudana de cor de incolor para rosa avermelhada.
4. Clculo
Molaridade real do NaOH
m = (g/M)*v
Onde:
m: molaridade real do NaOH;
g: massa do biftalato de potssio (g);
M: massa molar do biftalato de potssio (g); e,
v: volume de NaOH gasto na titulao (L).
1.
2.
3.
ANEXO 5
Soluo DESS (250 mL)
a) Pesar 26,23 g de EDTA sdico (com peso molecular de 372, 24 g mol-1,
certificar-se de que o EDTA seja dissdico, a massa pode variar, depen-
dendo do peso molecular), passar para um bquer e acrescentar gua
deionizada at completar 50 mL;
b) Ajustar o pH da soluo com NaOH (hidrxido de sdio) 1 molar (o pH
inicial da soluo est em torno de 3 a 4), adicionar a soluo at atingir
pH 7,5 (consumir aproximadamente 50 mL, o EDTA comear a dissol-
ver lentamente, pode-se aquecer a 30 C para facilitar a dissoluo);
c) Depois de dissolvido todo o EDTA, acrescentar gua deionizada at
200 mL;
d) Acrescentar 50 mL de soluo DMSO a 20 % (Anexo 1);
e) Agitar manualmente durante alguns minutos;
f) Adicionar NaCl at a saturao (formao de cristais no fundo do reci-
piente); e,
g) Passar a soluo para um frasco, tomando o cuidado de no verter os cris-
tais precipitados no fundo, identificar e armazenar em lugar adequado.
150
ANEXO 6
Chave pictria para identificao de famlias (Collembola,
Entognatha) (GISIN, 1960)
1. Corpo comprido. Os segmentos do trax e abdmen visivelmente dividi-
dos (no mximo, os 2-3 fundidos) (Subordem Arthropleona)..................2
- Corpo arredondado. Trax e os primeiros segmentos do abdmen
unidos (Subordem Symphypleona)....................................................5
ANEXO 7
Chave pictria para identificao de famlias
(COLLEMBOLA; SAUTTER, 1994)
152
ANEXO 8
Chave para identificao de algumas famlias de
Oligochaeta (TALAVERA, 1990)
1. Prstatas ausentes. Poros masculinos preclitelares..................Lumbricidae
Prstatas presentes. Poros masculinos no preclitelares..........................2
ISBN 85-69146-00-0
9 788569 146001