Manual de Normas y Procedimiento de Microbiologia - Hospital Santa Rosa - 2012.PDF-1

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA
CLINICA Y ANATOMIA PATOLOGICA

AREA DE MICROBIOLOGIA
MANUAL DE NORMAS Y
PROCEDIMIENTOS
DE MICROBIOLOGIA
2012
0
HOSPITAL SANTA ROSA 2012
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA CLINICA Y ANATOMIA PATOLOGICA
MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS
AREA DE MICROBIOLOGIA
1
MANUAL DE NORMA Y PROCEDIMIENTO DEL AREA

DE MICROBIOLOGIA
ELABORADO:
Dra.: SILVIA BELLING SALAS

Patlogo Clnico
Jefa del rea de Microbiologa
REVISADO POR:
Dra.: ISABEL CAMPOS CARPIO
Patlogo Clnico
Jefa del Servicio de Patologa Clnica
Y Anatoma Patolgica
2
COLABORACION EN LA ELABORACION:
Blga. ZOILA AYALA BURGA - Hospital Santa Rosa

Blgo. EDUARDO MLAGA DAZ - Hospital Santa Rosa
TM. MARA CABALLERO SEVILLA - Hospital Santa Rosa
TM. EDWIN SNCHEZ UTANI - Hospital Santa Rosa
Tec. ROSA CASTAEDA DVILA - Hospital Santa Rosa
AGRADECIENDO EL APOYO:
Dr. CESAR BALCZAR BRICEO - Hospital Casimiro Ulloa

Dr. ALFREDO GUILLEN ONEGLIO - Docente UNFV - UPC
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INDICE
I. INTRODUCCIN ................................................................................................................... 7
II. OBJETIVOS ........................................................................................................................... 7
III. BASE LEGAL ......................................................................................................................... 8
IV. ALCANCE ............................................................................................................................. 8
V. NORMAS ADMINISTRATIVAS DEL SERVICIO DE MICROBIOLOGA ........................................... 9
VI. GLOSARIO DE TRMINOS .............................................................................................. 10-11
VII. PROCEDIMIENTOS GENERALES DE OBTENCIN DE MUESTRAS
A) Muestra para Hemocultivo ...................................................................................... 12-14
B) Muestra de Dispositivo intravascular ........................................... 15
C) Muestra para urocultivo ............................................................................................ 16-18
D) Muestra de herida ................................................................................................... 19-20
E) Muestra de fluidos corporales ................................................................................... 21-22
F) Muestra de lquidos biolgicos( peritoneal, pericrdico, pleural, articular) .................. 23-24
G) Muestras de tracto respiratorio inferior ..................................................................... 25-26
H) Muestra de Secrecin Farngea ................................................................................. 27-28
I) Muestra de secrecin Vaginal ..................................................................................... 29-30
J) Muestra de secrecin uretral ...................................................................................... 31-32
K) Muestra para Espermiocultivo ........................................................................................ 33
L) Muestra para coprocultivo ........................................................................................ 34-35
VIII. PROCEDIMIENTOS MEDICOS, ASISTENCIALES
*Cultivo de Orina ( Urocultivo) ....................................................................................... 36-38

*Cultivo de Herida ......................................................................................................... 39-40
*Cultivo de secrecin Vaginal ........................................................................................ 41-42
*Cultivo de secrecin Farngea ....................................................................................... 43-44
*Cultivo de dispositivo intravascular ............................................................................. 45-46
*Cultivo de Esputo ......................................................................................................... 47-48
*Cultivo de vas Respiratorias Bajas.....49-50
*cultivo de secrecin Biliar ............................................................................................ 51-52
*Cultivo de Heces ( Coprocultivo) .................................................................................... 53-54
*Cultivo de Fluidos Corporales ........................................................................................ 55-56
* Examen Micolgico: Directo y Cultivo ........................................................................... 57-59
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*Baciloscopa para el Diagnostico de Tuberculosis ........................................................... 60-62
* Susceptibilidad antimicrobiana por el Mtodo Disco de Difusin ) ................................. 63-65
i) Grupos Antimicrobianos Sugeridos Para Microorganismo de Fcil Desarrollo .......... 66-69
ii) Grupos Antimicrobianos Sugeridos Para Microorganismo de Dificil Desarrollo ......... 70-72
*Tincin Gram ............................................................................................................... 73-74
*Rotavirus ..................................................................................................................... 75-76
*Investigacin De Parsitos en heces .............................................................................. 77-78
*Sangre Oculta en Heces( Thevenon) .............................................................................. 79-80
*Reaccin Inflamatoria ................................................................................................. 81-82
*Test de Graham............................................................................................................ 83-84
*Identificacin de Plasmodium ( Gota Gruesa y Frostis) .................................................. 85-88
*Hemocultivo ................................................................................................................ 89-91
IX. PRUEBAS COMPLEMENTARIAS PARA COCOS GRAM POSITIVOS
A) Identificacin de Estafilococos ................................................................................... 92-93
*Prueba de la Catalasa ................................................................................................... 94
*Prueba de la Coagulasa ............................................................................................ 95-96
*Resistencia a la Novobiocina .................................................................................... 97-98
*Resistencia a la Polimixina B .................................................................................. 99-100
B) Identificacin de Enterococos .......................................................................................... 101
*Prueba de la Esculina en Medio de Bilis ................................................................. 102-103
*Prueba de la Tolencancia al Cloruro de sodio ............................................................... 104
X. PRUEBAS COMPLEMENTARIAS PARA BACILOS GRAM NEGATIVOS
A) Identificacin de Bacilos Gram Negativos Fermentadores ............................................... 105
*Prueba del Metabolismo Bacteriano ..................................................................... 106-110
B) Identificacin de Bacilos Gram Negativos Fermentadores .............................................. 111
*Prueba de Hidrolisis de la Gelatina ............................................................................... 112
XI. MEDIOS DE CULTIVO
1) Clasificacin ............................................................................................................ 113-114
2) Criterios de Calidad .................................................................................................. 115-117
3) Descripcin de los Medios de Cultivo
a) Agar Azul de Bromotimol Lactosa Cistina ( Brolacin o CLED) .................................. 118-119
b) Agar Chocolate..................................................................................................... 120-121
c) Agar Citrato Simmons ........................................................................................... 122-123
d) Agar Lisina Hierro (LIA) ......................................................................................... 124-125
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e) Agar Mc Conkey .................................................................................................. 126-127
f) Agar Manitol Salado............................................................................................ 128-129
g) Agar Saboraud Glucosado 4% ..................................................................................... 130
h) Agar Sangre ....................................................................................................... 131-132
i) Agar Azida Sangre ............................................................................................... 133-134
j) Agar Salmonella, Shigella (SS) ........................................................................... 135-136
k) Agar Tripticasa de Soya (TSA)............................................................................... 137-138
l) Agar Triple Sugar Iron ( TSI ) ............................................................................ 139-140
m) Agar Urea segn Christensen .............................................................................. 141-142
n) Caldo de Tripticasa de Soya ................................................................................ 143-144
o) Medio de Muller Hinton ...................................................................................... 145-146
p) Medio de Transporte Cary Blair .................................................................................. 147
q) Medio Sulfuro, Indol, Movilidad (SIM)..148-149
r) Estndar de Turbidez Escala de Mc Farland ....................................................... 150-151
XII. COLORANTES
A) Coloracin GRAM. ...................................................................................................... 152
B) Coloracin de Kinyou .................................................................................................. 153
C) Coloracin Wayson ..................................................................................................... 154
D) Coloracin Azul de Metileno ....................................................................................... 154
E) Coloracin para Campylobacter .................................................................................. 154
F) Coloracin para Criptosporidium ................................................................................. 155
G) Coloracin de Wright.. ............................................................................................... 156
H) Coloracin Giemsa .................................................................................................... 157
I) Coloracin directo Para Campylobacter ........................................................................ 158
J) Tcnica : Leucocitos Reaccin Inflamatoria . ............................................................... 158
XIII. ANEXOS ................................................................................................................. 159-193
XIV.BIBLIOGRAFIAS .............................................................................................................. 194
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MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS
DEL SERVICIO DE MICROBIOLOGIA
I. INTRODUCCION:
El manual de normas y procedimientos del rea de Microbiologa es un

documento tcnico normativo de gestin que permite orientar y ordenar las
acciones que desarrolla el personal profesional y tcnico del rea.
En este manual describiremos aspectos bsicos de la obtencin de muestra,
envo y transporte para anlisis, diagnstico etiolgico, investigacin y
control microbiolgico, siendo parte de estas el aislamiento, identificacin
como estudio de la susceptibilidad antimicrobiana de los organismos causales
de la enfermedad.
Incluye tambin la investigacin de parsitos en heces, fluxogramas de los
procesos, grficas relacionados a los temas tratados, preparacin de medios de
cultivos, control de calidad y las coloraciones.
Los laboratorios de Microbiologa trabajan con diversas muestras clnicas y
mtodos diagnsticos contando el Hospital Santa Rosa con equipamiento
automatizado de identificacin microbiana y susceptibilidad anti microbiana
correspondiente orientando nuestra labor a una mejora continua en la calidad
de los procedimientos que se efectan en el servicio.
Las normas de bioseguridad se aplican conforme al Manual del Departamento.
II. OBJETIVOS:
1. Establecer formalmente los procedimientos que se realizan en el servicio

detallando sus actividades dentro del marco de las normas establecidas.
2. Contribuir a la ejecucin eficiente de los procedimientos que se llevan a

cabo, siguiendo una metodologa uniforme que norma este Manual y que
permita control sobre los resultados de las actividades realizadas.
Racionalizando los recursos asignados, tomando en cuenta el costo
beneficio institucional que redundar a favor del cliente interno y externo.
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3. Mejoramiento de los procesos existentes en beneficio de los pacientes del
hospital. Contribuyendo con la realizacin de los objetivos institucionales.
III. BASE LEGAL:
Ley 26842- Ley General de Salud.
Ley 27444- Ley de Procedimientos Administrativos.
Ley 27657- Ley del Ministerio de Salud.
D.S. 013-202- SA Aprueba el Reglamento de la Ley 27657
D.S. 023-023-2005-SA Reglamento de Organizacin y Funciones del

Ministerio de Salud.
Resolucin Ministerial 603-2006-SA/ Dm Aprueba Directiva 007-

MINSA/OGPE-V.02 Directiva para la Formulacin de Documentos Tcnicos
Normativos de Gestin Institucional y su modificatoria con la Resolucin
Ministerial 327-2009/ MINSA.
Resolucin Ministerial 1022-2007/MINSA- Aprueban el Reglamento de

Organizacin y funciones del Hospital Santa Rosa.
Resolucin Directoral 0191-2011-SA-DS-HSR-OEPE/DG. Aprueba el Manual

de Organizacin y Funciones del Departamento de Patologa Clnica y
Anatoma Patolgica del Hospital Santa Rosa.
Directiva 007- MINSA/OGPP-V.02 Directiva para la formulacin de

Documentos Tcnicos Normativos de Gestin Institucional Aprobado
mediante RM. 317- 2009/MINSA de 14 de mayo de 2009.
IV. ALCANCE:
Las disposiciones contenidas en el presente manual alcanzan a todos los

trabajadores que laboran directamente en el Servicio de Microbiologa del
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Departamento de Patologa Clnica y Anatoma Patolgica del Hospital Santa
Rosa, estableciendo sus funciones y responsabilidades.
V. NORMAS ADMINISTRATIVAS DEL SERVICIO DE MICROBIOLOGIA:
1.- DE LA ORGANIZACIN DEL SERVICIO:

El Servicio de Microbiologa est conformado por una jefatura, personal
profesional operativo: mdico, bilogos, tecnlogos mdicos, tcnicos de
laboratorio.
2.- DE LA ATENCION EN EL SERVICIO DE MICROBIOLOGIA:

El Servicio de Microbiologa brindar apoyo diagnostico a las reas de
Consulta Externa, Hospitalizacin, Emergencia, Sala de Operaciones, Salas
de Procedimientos y otras.
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VI. GLOSARIO DE TERMINOS:
ABSCESO: Acumulacin localizada de pus en un tejido u rgano.

AEROBICO: Un organismo que requiere oxgeno o aire atmosfrico para su
crecimiento y reproduccin.
AGLUTINACION: Reaccin por la que se provoca la agrupacin de partculas,
bacterias y clulas suspendidas en un medio liquido.
AISLAMIENTO PRIMARIO: Desarrollo inicial del microorganismo.
ANTIMICROBIANO: droga que mata microorganismos o suprime su
multiplicacin o desarrollo.
ASEPSIA: Desinfeccin de un tejido vivo o piel.
BACTERIA: Microorganismo unicelular microscpico perteneciente a los
procariotas que se multiplica por fisin binaria y carece de clorofila.
BACTERIA GRAM POSITIVA: aquella que retiene el colorante primario de la
coloracin de Gram, se tie de color azul prpura.
BACTERIA GRAM NEGATIVA: Aquella que no retiene el colorante primario de
la coloracin de Gram y toman el colorante de contraste, se tie de color rojizo.
BIOSEGURIDAD: Conjunto de medidas preventivas para proteger la salud y la
seguridad humana y del ambiente frente a diferentes riesgos biolgicos,
fsicos, qumicos o mecnicos.
CEPA BACTERIANA: Cultivo puro de microorganismos formada por los
descendientes de un solo aislamiento original.
COLONIA: Desarrollo visible de microorganismos, originado por la
multiplicacin de un solo microorganismo preexistente.
CHORRO MEDIO DE ORINA: Muestra de orina obtenida despus que el
paciente deja discurrir cierta cantidad inicial.
DESINFECCIN: Destruccin de microorganismossobre objetos inanimados
mediante agentes qumicos .
DESINFECTANTE: Agente qumico que se emplea para realizar el proceso de
desinfeccin.
ESTERILIZACIN: Proceso fsico o qumico que destruye toda forma de vida
microbiana incluidas las esporas.
HEMLISIS: Presencia de restos de eritrocitos lisados alrededor de una
colonia desarrollada en una placa de agar sangre de carnero.
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HEMLISIS ALFA: Las colonias estn rodeadas por una destruccin parcial de
los eritrocitos y prdida de algo de hemoglobina en el agar lo que resulta en
una coloracin verde (hemlisis incompleta).
HEMLISIS BETA: Las colonias estn rodeadas por una zona de hemlisis
completa (clara, transparente) debido a una destruccin total de los
eritrocitos.
INCUBACIN: Mantenimiento de cultivos de microorganismos en condiciones
favorables para que puedan desarrollarse y multiplicarse.
INFECCIN: Invasin y multiplicacin de microorganismos en un husped,
pudiendo progresar hacia una enfermedad.
INCULO: Alcuota de una muestra que es colocada en un medio de cultivo.
LIMPIEZA: Es la remocin mecnica de toda materia extraa con el objeto de
disminuir el nmero de microorganismos por arrastre.
MEDIO DE CULTIVO: Medio artificial con sustancias nutritivas optimas que
permiten el crecimiento y multiplicacin de los microorganismos in vitro.
MICROAEROFLICO: Organismo que crece y se reproduce mejor en la
presencia de una tensin del 5% de oxigeno, 10% de anhdrido carbnico y
85% de nitrgeno.
MICROORGANISMO VIABLE: Es aquel que es capaz de reproducirse.
MICROORGANISMO: organismo microscpico, los de inters mdico incluyen:
bacterias, hongos, virus y protozoos.
SEPSIS: Patologa compleja de respuesta sistmica con compromiso
multiorganico, secundaria a la invasin del organismo por alguna bacteria u
hongos.
SIEMBRA PRIMARIA: Inoculacin de una muestra a un medio de cultivo
simple, selectivo o de enriquecimiento.
SUBCULTIVO: Pasaje de bacteria viables derivadas de otro cultivo simple,
selectivo o de enriquecimiento.
UFC: Unidad Formadora de Colonia.
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VII. PROCEDIMIENTOS DE OBTENCIN DE MUESTRAS
La coleccin de las muestras microbiolgicas generalmente se efecta fuera

del ambiente del laboratorio por lo que es importante revisar los procesos de
obtencin de la muestra con los trabajadores de salud encargados.
Es importante estar informados de las normas de toma y transporte de

muestras. Segn recomendacin de las pautas establecidas para la toma de
muestra brindadas a travs de cursos y talleres de capacitacin.
A) OBTENCION DE MUESTRA PARA HEMOCULTIVO
Condiciones especficas
El momento ptimo de obtencin de la muestra para hemocultivo es justo

antes del pico febril ms alto, escalofros y sin tratamiento antibitico, sin
embargo esta situacin ideal no es frecuente. Alternativamente las muestras
pueden obtenerse de acuerdo con el caso. Por ejemplo.
BACTEREMIAS CONTINUAS: En cualquier momento, ejm. Endocarditis,

fistulas arterias - venosas y catteres
BACTEREMIAS INTERMITENTES: Una hora antes del pico febril, ejm.

Brucelosis, abscesos extravasculares o infecciones difusas (celulitis,
peritonitis, artritis sptica)
Cronologa para hemocultivos
En sepsis: Se debe tomar dos a tres muestras de lugares diferentes en un

lapso de diez minutos
En endocarditis aguda: Obtener tres muestras de tres lugares diferentes en
un lapso de 1 a 2 horas.
En endocarditis subaguda: Obtener tres muestras de tres lugares diferentes
a intervalos de al menos quince minutos. Si el cultivo es negativo a las 24
horas, obtener tres muestras ms.
En fiebre de origen desconocido: Obtener dos o tres muestras de lugares
diferentes con diferencia de 1 hora o ms entre una y otra muestra. Si el
cultivo es negativo a las 24 horas, obtener dos a tres muestras.
12
PREPARACION DE LA BOTELLA:
1. Visualmente supervisar aquellas botellas con sospecha de contaminacin o

dao.
2. Remover la tapa protectora
3. Limpiar el septum de goma con Alcohol de 70
4. Dejar secar 1 minuto.
PREPARACION DE LA PIEL
1. Localizar la vena
2. Limpieza con alcohol etlico 70 (etanol), limpiar varias veces hasta que el
algodn salga limpio.
3. Aplicar solucin de iodo o clorhexidina gluconato por 30 segundos en

crculos concntricos de adentro hacia afuera. (Pacientes hipersensibles al
iodo, limpiar con alcohol 70 por 60 segundos).
4. Dejar secar el lugar de venopuncion.
5. No re-palpar la vena luego de haber realizado la antisepsia de la zona.
VENIPUNCION
1. Extraer el volumen recomendado de sangre.

2. Inocular las botellas directamente usando las marcas de volumen de la
jeringa como gua para asignar el volumen correcto.
Volumen de sangre a tomar por cada venopuntura:
Obtencin de muestra de sangre mediante uso de jeringa:
La proporcin entre el volumen de sangre obtenida y el volumen del caldo

de cultivo debe estar en una relacin de 1:5 - 1:10.
El volumen de sangre depender de la edad del paciente; por cada
venopuncion se recomienda:
Neonatos: 0.5 - 1 ml
De un mes a dos aos tomar de 1 ml a 3 ml.
De tres aos a doce aos tomar de 3 ml a 5 ml
Adolescentes y adultos de 10 ml a 20 ml.
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Inoculacin de la muestra de sangre al medio de cultivo
Utilizar un medio bifsico o monofsico para este procedimiento.

Desinfectar el diafragma del frasco de hemocultivo con alcohol etlico
de 70% o alcohol yodado.
Inocular la muestra de sangre al frasco con medio de cultivo a travs del
diafragma. Debe realizarse inmediatamente de obtenida la muestra
para evitar que se coagule.
Mezclar el contenido del frasco inclinndolo suavemente dos o tres
veces. En caso que se use el medio bifsico, baar la fase slida con la
sangre.
Descartar la aguja y la jeringa en un contenedor resistente a las
punturas. No volver a introducir la aguja en su funda.
Limpiar la tapa del frasco. Etiquetar el frasco apropiadamente
indican0000000000000do adems el nmero de hemocultivo.
Transportar el hemocultivo inmediatamente al laboratorio de acuerdo
a la norma establecida. No excediendo las 2 horas.
Se recomienda obtener como mnimo 2 o 3 frascos de hemocultivo por

paciente.
Si por alguna razn se obtiene menor volumen de sangre que el deseado, no debe
descartarse.
No refrigerar los frascos de hemocultivo, mantener a temperatura ambiente.
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B) OBTENCION DE MUESTRA DE DISPOSITIVOS INTRAVASCULARES
Se aplica en la obtencin de muestras para el diagnstico de infecciones asociadas

a dispositivos intravasculares en los que puede realizarse cultivos semi
cuantitativos del torrente sanguneo, tales como: central, Hickman, Brovac,
perifrico, arterial, umbilical, de nutricin parenteral total, Swan Ganz.
Materiales
a) Alcohol etlico 70%
b) Gasa estril
c) Tijera estril
d) Tubo o frasco con tapa rosca estril
e) Guantes de ltex estriles
f) Refrigeradora
g) Estufa de 35 37 C.
h) mechero Bunsen
i) Contenedor de material contaminado.
Procedimiento
a) Limpiar la piel con alcohol de 70 alrededor de la insercin del catter.

b) Retirar el catter en forma asptica, cortar a 5 cm de la punta distal del
catter dejando caer directamente en un tubo o frasco vaco estril con
tapa rosca.
c) Rotular y transportar la muestra inmediatamente al laboratorio de
microbiologa en un perodo NO MAYOR DE 15 MINUTOS A
TEMPERATURA AMBIENTE para prevenir que se seque.
d) Registrar el procedimiento.
e) En el caso de no poder enviarse inmediatamente al laboratorio, la muestra
debe mantenerse refrigerada a 4 C hasta por 24 horas.
CRITERIO DE RECHAZOS DE MUESTRA
Envase, tubo o tapa rosca no estril.

Muestra con periodo de tiempo de transporte mayor de 15 minutos a
temperatura ambiente.
Solicitud de examen microbiolgico incompleto o ilegible y discrepancia con la
identificacin del paciente o la muestra
15
C) OBTENCION DE MUESTRA DE ORINA PARA CULTIVO
El presente procedimiento se aplica en la obtencin de muestras de orina de

pacientes para el diagnstico de infecciones del tracto urinario.
Condiciones Generales
La orina es un excelente medio de cultivo para la proliferacin bacteriana,

por esta razn, la muestra debe ser procesada dentro de las 2 horas despus
de haber sido obtenida o debe refrigerarse a 4 C (mximo 24 horas) hasta
su procesamiento.
Generalmente el desarrollo de dos o ms tipos de colonias (en pacientes sin

sonda vesical) indica que la muestra se ha contaminado por recoleccin
incorrecta o demora en la siembra.
OBTENCIN DE MUESTRA DE ORINA DEL CHORRO MEDIO

Obtencin de muestras de orina en pacientes mujeres hospitalizadas
Materiales y equipos
a) Guantes descartables
b) Cinco o ms piezas de gasa estril de tamao adecuado pudiendo ser de 4x4
c) Jabn
d) Agua tibia estril
e) Frasco estril de boca ancha para la muestra de orina
Procedimiento
a) Mantener la privacidad de la paciente.
b) Rotular el frasco con el nombre de la paciente, fecha de obtencin de la
muestra, hora y el procedimiento a utilizar para la obtencin de la muestra.
c) Lavarse las manos con jabn y abundante agua, colocarse guantes.
d) Preparar una pieza de gasa para la limpieza de los genitales externos
humedecindola con agua y una pequea cantidad de jabn. Preparar dos
piezas ms de gasa para el enjuague con agua tibia.
e) Separar los labios mayores con dos dedos de una mano y limpiar el rea
expuesta pasando la gasa de adelante hacia atrs.
f) Descartar la gasa.
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g) Con otra gasa humedecida enjuagar el rea de adelante hacia atrs. Repetir el
procedimiento con otra gasa.
h) Finalmente secar el rea de adelante hacia atrs con un trozo de gasa seca.
i) Mantener separados los labios mayores mientras la paciente empieza a orinar.
Luego del chorro inicial colocar el frasco estril para colectar el chorro medio.
j) Al terminar de orinar, inmediatamente tapar el frasco y limpiar la superficie
del mismo.
Obtencin de muestra de orina en pacientes varones
Materiales
b) Cinco o ms piezas de Gasa estril
c) Jabn
d) Agua tibia estril
e) Frasco estril de boca ancha para la obtencin de la muestra
Procedimiento
a) Mantener la privacidad del paciente.

b) Rotular el frasco con el nombre del paciente, fecha, hora y el procedimiento a
utilizar para la obtencin de la muestra.
c) Lavarse las manos con jabn y abundante agua.
d) Preparar una pieza de gasa con agua y una pequea cantidad de jabn.
Preparar dos piezas ms de gasa para el enjuague con agua tibia.
e) Realizar la higiene de los genitales. Retraer el prepucio antes de lavar el glande
con la gasa humedecida con jabn. Descartar la gasa.
f) Enjuagar el glande, usando una gasa hmeda. Repetir el procedimiento con
otra gasa.
g) Secar la zona, usando uno o ms piezas de gasa seca.
h) Indicar al paciente que mantenga el prepucio retirado e inicie la miccin
directamente en un recipiente (orina para descartar).
i) Despus del chorro inicial colocar el frasco estril para colectar la muestra del
chorro medio.
j) Obtenida la muestra, inmediatamente tapar el frasco y limpiar la superficie del
mismo.
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LACTANTES:
a) Hidratar bien al beb con leche y agua. Lavado de la zona genital con agua y
jabn suave, repetir el lavado 3 veces y secar. Colocar una bolsa colectora
estril sobre los genitales para recoger la orina de la miccin espontanea.
b) Colocar el borde de la bolsa engomada sobre la piel, debe retirarse la bolsa tan
pronto como el nio realice su miccin.
c) No debe estar colocada mas de 1 hora la bolsa colectora en caso contrario debe
cambiarse por una nueva.
CRITERIOS DE RECHAZO DE MUESTRA:
Solicitar una nueva muestra de orina cuando la muestra ha sido conservada

por ms de 2 horas, a temperatura ambiente.
Toda muestra que no este adecuadamente rotulada ser rechazada
Rechazar orinas de 24 horas, de coleccin
Rechazar la orina de muestras colectoras en pacientes con sonda Foley.
Rechazar la muestra que llegan en frascos abiertos y derramados.
Rechazar muestras con solicitud de cultivo anaerobios cuando la muestra no
son tomadas por puncin supra pbica.
Rechazar orinas que no hayan permanecido un mnimo de 4 a 5 horas en
vejiga, es decir aquellas orinas emitidas inmediatamente despus de haber
ingerido lquidos, debido a que el paciente ya haba miccionado recientemente,
ya que con toda seguridad los cultivos van a salir negativos.
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D) OBTENCION DE MUESTRA DE HERIDA
En el caso de una herida con sospecha de infeccin, la muestra se obtiene

por aspiracin con aguja.
Materiales
b) Solucin salina estril
c) Jabn
d) Gasa estril
e) Medio de transporte de Stuart, Amies con carbn o Cary Blair.
f) Lmina portaobjeto
g) Tubo estril (opcional)
Obtencin de muestra de absceso por aspiracin con aguja:
El mtodo indicado para obtener muestras de abscesos es por aspiracin

con aguja.
Materiales
b) Jeringa estril
c) Aguja adecuada (recomendable aguja N 18 a 20)
d) Solucin salina estril
e) Jabn
f) Gasa estril
g) Tubo estril (opcional)
h) Medio de transporte de Stuart o Amies con carbn.
Procedimiento
a) Colocarse los guantes descartables
b) Se deber realizar una muy buena limpieza de la herida arrastrando toda la
secrecin por encima de la escara con solucin antisptica (alcohol 70
seguido de solucin de yodo por 1-2 min.) y luego se enjuagar
generosamente con solucin fisiolgica.
c) Desinfeccin de la superficie ser en forma concntrica (de adentro hacia
afuera)
19
d) La muestra debe ser tomada por PUNCIN ASPIRATIVA a travs de
PIEL SANA (utilizando una jeringa de tipo tuberculina o similar)
e) Colocar la muestra en un tubo estril y enviar al laboratorio.
f) Si el transporte de la muestra al laboratorio demora ms de 20 - 30
minutos se debe mantener en medios de transporte como Stuart o Amies
con carbn, Cary Blair.
g) En el medio de transporte, la muestra puede permanecer a temperatura
ambiente hasta 24 horas.
NOTA:
En quemaduras:
Limpiar y retirar el tejido muerto o quemado antes de la obtencin de la
muestra.
Las muestras de tejido deben llevarse al laboratorio en un envase con tapa
rosca.
CRITERIOS DE RECHAZO
Envase no estril
Muestra con mas de 2 horas de coleccin sin refrigeracin
Envase sin rotular
Solicitud de examen microbiolgico incompleto o ilegible y discrepancia
con la identificacin del paciente o la muestra
Muestra derramada
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E) OBTENCION DE MUSTRA DE FLUIDOS CORPORALES
Las muestras deben de ser procesadas inmediatamente, un examen directo es de

mucha utilidad para anticipar los resultados y brinda una valiosa informacin.
Directo: sin centrifugacin

Gram: del sedimento centrifugado
LIQUIDO CEFALORRAQUDEO
LCR POR PUNCIN LUMBAR

Es un procedimiento mdico, requiere consentimiento informado
MATERIAL NECESARIO.
Campos estriles.
Guantes estriles.
Gasas estriles.
Alcohol etlico al 70%.
Yodo povidona al 10%.
Jeringas de 5-10 ml.
Agujas de puncin IM.
Trcares de puncin lumbar de varios tamaos.
Tubos cnicos limpios y estriles con tapn de rosca. No usar frascos que
hayan contenido medicamentos como por ejemplo antibiticos ya que pueden
tener efecto antimicrobiano y pueden ser negativo los cultivos.
OBTENCIN DE LA MUESTRA
1. Se obtendr antes de instaurar cualquier teraputica antibitica.
2. Quien realice la toma de la muestra deber lavarse las manos previas al
procedimiento, colocarse sobre tnica y guantes estriles.
3. Se localiza la zona elegida para la puncin lumbar mediante palpacin de los
espacios intervertebrales una vez colocado el paciente en la posicin
adecuada.
4. Se desinfecta con alcohol al 70% una zona de uso 10 cm de dimetro en el rea
elegida, la aplicacin del desinfectante se hace de forma concntrica del centro
a la periferia.
5. Se coloca campo estril
6. Se repite la operacin con Yodo povidona que se deja secar durante un minuto.
7. Realizar la puncin entre los espacios intervertebrales L3-L4, L4-L5 o L5-S1,
siguiendo las normas de la ms estricta asepsia.
21
8. Al llegar al espacio subaracnoideo retirar el estilete y dejar salir libremente el
lquido cefalorraqudeo que se recoger en tres tubos, sin conservantes, con
tapn de rosca.
9. El primer tubo es el que debe enviarse para el estudio bioqumico, el segundo
para el estudio microbiolgico y el tercero para investigacin de clulas (este
suele ser el ms transparente aunque la puncin haya sido traumtica)
VOLUMEN MNIMO.
Para el estudio bacteriolgico rutinario es suficiente 1 ml, aunque es preferible
disponer de volmenes superiores.
Para hongos o micobacterias se necesitan al menos 2 ml adicionales ms por
cada uno de los estudios, siendo deseable llegar a los 10 ml.
Para estudio de virus se necesita por lo menos 1 ml ms.
TRANSPORTE.
La muestra debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues alguno de los
agentes etiolgicos como S. pneumoniae, pueden lisarse rpidamente a partir
de una hora tras su recogida. Si no es posible se mantendr en estufa a 35-
37C y una parte se incubar en un frasco de hemocultivo. Si no se dispone de
estufas se mantendr a temperatura ambiente. Nunca deber refrigerarse pues
se puede afectar la viabilidad de N. meningitidis y H. influenzae.
En el LCR no se estudian rutinariamente anaerobios. En caso de solicitar esta
investigacin se enviar en un medio de transporte de lquidos para estudio de
anaerobios o en frasco de hemocultivo anaerobios.
Las muestras para el estudio de virus se enviarn en hielo, si el envo se
retrasa ms de 24 horas, se deber de conservar a -70C.
OBSERVACIONES.
Como la meningitis suele surgir por un proceso bactermico se

solicitarn simultneamente hemocultivos.
Es necesario que el mdico seale claramente las investigaciones
solicitadas (bacterias habituales, mico bacterias, anaerobios, hongos o
virus).
Los tubos deben ser cuidadosamente rotulados en el orden que se van
recolectando, como 1, 2 y 3 (muestra inicial, muestra intermedia y
muestra final)
22
F) OTROS LQUIDOS BIOLGICOS: PERITONEAL (ASCITIS),

PERICRDICO, PLEURAL, ARTICULAR
En este apartado trataremos de lquidos orgnicos, habitualmente estriles, salvo

LCR. La toma de muestra, para la obtencin de estos lquidos, es un procedimiento
mdico que requiere de ciertos cuidados para obtener una muestra adecuada para el
examen microbiolgico.
MATERIAL NECESARIO.
Campos estriles.
Gasas estriles.
Guantes estriles.
Jeringas y agujas estriles. No se deben utilizar jeringas heparinizadas, pues la
heparina lleva conservantes que pueden interferir la viabilidad de los
microorganismos.
Yodo povidona al 10%.
Recipientes estriles con tapn de rosca.
Recipientes estriles de boca ancha (ejemplo: el frasco de urocultivo).
Sistemas de transporte de lquidos para estudio de anaerobios.
Alcohol etlico al 70%.
Frascos de hemocultivos.
OBTENCIN DE LA MUESTRA.
Se requiere de consentimiento informado para la toma de muestra, salvo en casos de

emergencia.
Vara dependiendo del lquido corporal que se trate, pero siempre deber seguirse
una tcnica rigurosamente asptica. La muestra se obtiene por puncin y se coloca en
recipientes adecuados para su envo al laboratorio.
1. Realizar antisepsia de piel con alcohol, haciendo crculos concntricos desde el
centro hacia la periferia en una zona de unos 10 cm de dimetro.
2. Repetir el paso anterior con Yodo povidona al 10%, dejando secar durante un
minuto. En pacientes con hipersensibilidad al yodo, realizar la desinfeccin
con alcohol 70%, dos veces consecutivas.
3. La toma se hace por puncin percutnea (toracocentesis, paracentesis,
puncin pericrdica o puncin articular) de forma asptica para evitar la
contaminacin por la flora cutnea o ambiental.
23
4. Una vez realizada la toma se retira la yodo povidona de la piel con un apsito
impregnado en alcohol al 70%.
5. Raramente se pueden realizar tomas de estas localizaciones en el transcurso
de intervenciones quirrgicas. En esta circunstancia debe desaconsejarse el
uso de hisopos, siendo preferible tambin la aspiracin; se utilizarn hisopos
slo si el contenido no puede ser aspirado.
VOLUMEN MNIMO.
Para el estudio bacteriano rutinario es suficiente de 1 a 10 ml. Cuando se requiera la

investigacin de Mycobacterium spp. u hongos se enviar un volumen superior a 10
ml.
TRANSPORTE
Si es necesario evitar la coagulacin de algunos de estos lquidos se usar

heparina sin conservantes; otros anticoagulantes pueden tener accin
antibacteriana.
Los recipientes idneos son tubos estriles de tapn de rosca o de presin
negativa sin conservantes.
Se llenarn hasta cerca del tapn, de esta forma pueden ser tiles para el
estudio de anaerobios, especialmente si la muestra es purulenta.
Los viales o tubos pre-reducidos para el transporte de muestras para el
estudio de anaerobios se emplearn en aquellos casos en que se sospeche este
tipo de microorganismos.
Frascos de Hemocultivos: Este es un sistema adicional a los anteriores. Est
particularmente indicado cuando el envo se puede retrasar o en los lquidos
que pueden coagularse. Si se sospecha anaerobios emplear un medio adecuado
para estas bacterias. Con su uso se ha incrementado el aislamiento bacteriano
en peritonitis espontneas o en las asociadas a dilisis peritoneal ambulatoria
crnica. Tambin se recomienda para el aislamiento de grmenes en lquidos
articulares.
En ningn caso se aceptaran hisopos embebidos en el lquido.
Las muestras deben ser enviadas inmediatamente al laboratorio.
OBSERVACIONES.
Cuando se utilice una anestesia local, hay que cambiar de jeringa y aguja para hacer la
extraccin de la muestra, ya que los anestsicos pueden inhibir el crecimiento
bacteriano.
24
G) OBTENCIN DE MUESTRAS DE SECRECIONES DEL TRACTO
RESPIRATORIO INFERIOR
Condiciones Especficas
Las muestras de lavado broncoalveolar, cepillado bronquial o aspirado
transtraqueal deben ser obtenidas por profesional especializado siguiendo los
procedimientos normativos correspondientes.
Materiales
a. Recipiente estril de boca ancha con tapa rosca.(esputo)

b. Catter de polietileno estril o jeringa(aspirado endotraqueal)
c. Tubo estril con 1 ml. de suero fisiolgico (lavado broncoalveolar, lavado
bronquial y cepillado bronquial)
Procedimiento
ESPUTO POR EXPECTORACION:
Es recomendable que la muestra sea tomada en la maana al levantarse

Debe supervisarse la recoleccin de la muestra
Indicar al paciente que se enjuague la cavidad oral con agua antes de
expectorar, para removerla flora superficial oral.
Si el paciente tiene dentadura postiza indicarle que se la quite
Instruir al paciente para que tosa con fuerza, permitiendo la salida de las
secreciones que provengan desde el tracto respiratorio inferior.
La muestra debe ser recolectada directamente en un envase estril.
No debe colectarse saliva ni fluido post-nasal.
ESPUTO INDUCIDO
Indicar al paciente que se enjuague la boca con agua antes de la obtencin de la
muestra.
Con ayuda de un nebulizador, hacer que el paciente inhale 25 ml. De solucin
de cloruro de sodio estril al 3 - 10 %.
Colectar el esputo inducido en un envase estril
25
ASPIRADO ENDOTRAQUEAL
Colectar el espcimen a travs de una traqueotoma o tubo endotraqueal (tubo
nasotraqueal u orotraqueal), con cuidado (tcnica cuidadosa y asptica)
introduzca el catter de polietileno estril a travs de la traqueotoma o tubo
endotraqueal evitando la contaminacin alta.
Extraer lentamente el catter y simultneamente aspirar en forma
intermitente el material de los bronquios principales izquierdo y derecho y de
la trquea utilizando una jeringa o un succionador intermitente.
Remueva el catter, descarte la jeringa y Colocar en un frasco estril.
Transportar la muestra a Laboratorio de preferencia inmediatamente.
CRITERIO DE RECHAZOS DE MUESTRA

a) Envase tubo o tapa rosca no estril.
b) Envase sin rotular
c) Muestra derramada o rotura del envase
d) Solicitud de examen microbiolgico incompleto o ilegible y discrepancia con la
e) Demora en enviar la muestra al laboratorio
f) Otra solicitud antes de las 72 horas.
26
H) TOMA DE MUESTRA PARA CULTIVO DE SECRECION FARINGEA
Condiciones Especficas
Es el conjunto de acciones que se realizan para la ptima recuperacin de agentes

Patgenos de secrecin farngea.
Materiales:
1. Hisopos de algodn estril en tubos de ensayo, para recolectar las muestras.

2. Un baja lengua estril
3. Una mascarilla protectora
4. Medio de transporte
Procedimiento
1. Es recomendable tomar la muestra antes de ingerir alimento
2. El paciente debe permanecer sentado en la posicin ms cmoda y con la
mejor iluminacin ( se puede usar una linterna)
3. Indicar al paciente que habr la boca sin sacar la lengua y que diga Ahhh
4. Mientras el paciente dice ``Ahhhh``bajar las 2/3 partes anteriores de la
lengua con el baja lengua, empleando la mano izquierda.
5. Se deber observar las amgdalas, el fondo de la faringe limitada por los pilares
y vula.
6. Introducir el hisopo con la mano derecha .Evitar tocar la lengua, que se
encuentra cubierta de microorganismo
7. Ubicar el lugar inflamado de la garganta (amgdalas o papilares. estar
enrojecida o blanca segn sea el caso.
8. Frotar el hisopo con firmeza en la parte inflamadas, hacindolo girar y si
existen membranas, recgelas con el hisopo.
9. Si no se encuentra inflamacin pasar el hisopo por las amgdalas, los pilares,
Evitar tocar la vula
10. Introducir el hisopo con la muestra al medio de transporte.
11. Remitir al laboratorio antes de las 24 horas de la recoleccin.
12. La muestra en el medio de transporte adecuado debe ser mantenida a
temperatura ambiente hasta su procesamiento.
27
a) Envase no estril o inadecuado
b) Medio de transporte inadecuado
c) Envase sin rotular
d) Solicitud de examen microbiolgico incompleto o ilegible y discrepancia
con la identificacin del paciente o la muestra
e) Demora prolongada de enviar la muestra al laboratorio.
28
I) OBTENCIN DE MUESTRAS DE SECRECIN VAGINAL
Esta muestra se utiliza para conocer la etiologa en casos de vaginitis y vaginosis. Los
patgenos mas comunes son: T. Vaginalis, Cndida, Complejo Vaginosis Bacteriana
(Gardnerella, Mobiluncus, etc.)
Los exudados vaginales se obtienen en el Laboratorio de Microbiologa. En el nico
caso que se aceptarn muestras realizadas fuera del Laboratorio es si la paciente se
encuentra internada e imposibilitada de movilizarse.
Materiales
a) Camilla ginecolgica
b) Espculo estril
c) Hisopos de alginato clcico o Dracon, con medio de transporte.
d) Tubo con 1 ml de suero fisiolgico y pipeta descartable.
Condiciones previas: La paciente debe concurrir al laboratorio habindose

higienizado los genitales externos slo superficialmente, no debe tomar antibiticos,
vulos ni pomadas en los das previos a la recoleccin de la muestra. No debe
mantener relaciones sexuales 48 hs antes de la toma de muestra.
En mujeres que no han tenido relaciones sexuales se puede tomar la muestra a travs
del orificio vaginal con un hisopo estril.
Procedimiento
1. Con la paciente en posicin ginecolgica se introducir un espculo sin

lubricante (si fuera necesario lubricar, utilizar solo agua tibia)
2. Recoger la muestra, bajo visin directa, con un hisopo del fondo del saco
vaginal posterior.
3. Repetir la operacin con un segundo hisopo.
4. Recoger con la pipeta una muestra de fondo de saco y descargar en el tubo con
suero fisiolgico.
5. Se obtendrn dos hisopos, uno destinado al estudio microscpico y otro al
cultivo.
6. La muestra en suero fisiolgico se destinar al examen en fresco para
investigacin de Trichomonas vaginalis (test de amina).
29
Transporte y conservacin
El envo de la muestra debe ser inmediato siempre que sea posible. Cuando la
muestra no pueda procesarse antes de 15 minutos debern emplearse hisopos con
medio de transporte tipo Stuart- Amies,Cary-blair que se mantendrn a temperatura
ambiente, que deber ser antes de 3-6 horas. El examen en fresco deber observarse
inmediatamente o de lo contrario mantener en estufa a 37C por no ms de 1 hora.
OBSERVACIONES
Cuando se sospeche la infeccin por Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis,
Mycoplasma hominis o Ureaplasma urealtycum, deber enviarse muestra
endocervical.
Envase sin rotular
Solicitud de examen microbiolgico incompleto o ilegible y discrepancia con la
Hisopos secos
Muestras con ms de 15 min. De coleccin para la investigacin de
Trichomonas vaginalis en fresco.
Muestra sin frotis para Gram.
30
J) OBTENCIN DE MUESTRAS DE SECRECIN URETRAL
Esta muestra se utiliza para conocer la etiologa en casos de uretritis Los patgenos
ms comunes son:
La Chlamydia Trachomatix, el Micoplasma geniatum, el Ureaplasma, la Trichomona
Vaginalis, Neisseria Gonorrhoeae.
Los exudados uretrales se realizan en el Laboratorio de Microbiologa. En el nico
caso que se aceptarn muestras realizadas fuera del Laboratorio es si la paciente se
encuentra internada e imposibilitada de movilizarse.
Materiales
Hisopo estril
Guantes quirrgicos estriles
Tubos esteriles
Laminas portaobjeto
Agar Thayer Martin
Medio de transporte de Amies( hasta 6 horas para gonococo) Stuart,Cary-blair
Medios de transporte para Clamydia
Condiciones previas: La paciente debe concurrir al laboratorio habindose

higienizado los genitales externos slo superficialmente, no debe tomar
antibiticos, ni pomadas en los das previos a la recoleccin de la muestra. No debe
mantener relaciones sexuales 48 horas antes de la toma de muestra.
Procedimiento
1. El paciente debe concurrir al laboratorio con higiene previa de los genitales
(agua y jabn nicamente) y con una retencin de orina de por lo menos 3
horas.
2. Es conveniente no mantener relaciones sexuales durante las 24-48 horas
previas al estudio.
3. Limpiar el meato con algodn tomar la secrecin que exuda de la uretra con un
hisopo estril humedecido en solucin fisiolgica y preparar un extendido.
4. Aplicar una ligera presin (desde atrs), de manera que salga una gota de
secrecin (pus) por el meato.
5. Repetir la operacin con otro hisopo y colocarlo dentro de un medio de
transporte adecuado (Ej. Stuart).
31
6. Si no hubiera secrecin, insertar un hisopo (de pequeo dimetro) 2-3 cm
dentro del canal uretral y rotarlo ligeramente para obtener material.
7. Remitir la muestra DE INMEDIATO al laboratorio. Cuidado: procesar
rpidamente, posibilidad de perder organismos muy lbiles.
8. Mantener a temperatura ambiente. NUNCA refrigerar.
El envo de la muestra debe ser inmediato siempre que sea posible. Cuando la
muestra no pueda procesarse antes de 15 minutos debern emplearse hisopos con
medio de transporte tipo Stuart- Amies,Cary-blair que se mantendrn a temperatura
ambiente, que deber ser antes de 3-6 horas. El examen en fresco deber observarse
inmediatamente o de lo contrario mantener en estufa a 37C por no ms de 1 hora.
OBSERVACIONES
Para el estudio de Chlamydia trachomatis, Micoplasma hominis y Ureaplasma
urealyticum, utilizar medios de transporte especiales que posibiliten la conservacin
de estos microorganismos
Envase no estril
Envase sin rotular
Solicitud de examen microbiolgico incompleto o ilegible
Hisopo seco
Muestra con ms de 15 minutos de coleccin para investigacin de
Trichomonas vaginalis en fresco.
Muestra sin frotis para Gram.
Muestra para clamydia, que no contiene clulas el epitelio uretral.
32
K) OBTENCION DE MUESTRA PARA ESPERMOCULTIVO
Tipo de muestra: semen
El paciente NO DEBE mantener relaciones sexuales 24-48 horas antes de

muestra.
Higienizar cuidadosamente los genitales con agua y jabn
Realizar masturbacin y recoleccin del semen en un frasco estril.
Remitir las muestras dentro de la primera hora de haber sido emitidas.
Envase no estril
Envase sin rotular
Solicitud de examen microbiolgico incompleto o ilegible
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L) OBTENCION DE MUESTRA PARA COPROCULTIVOS
Consiste en el cultivo de materia fecal. Es un mtodo de diagnstico microbiolgico que

permite identificar diferentes organismos causantes de enfermedades gastrointestinales.
Los patgenos ms comunes son: Salmonella y Shigella, Campylobacter, Escherichia
coli Enteropatgena, enteroinvasiva, enterohemorrgica, Vibrio, Yersinia,
Clostridium, etc.
Materiales:
En caso de lactantes se obtendr la muestra en el paal invertido para la
recuperacin de la muestra
Frasco boca ancha con tapa rosca estril.
Hisopos
Medio de transporte de Cary Blair
Guantes de ltex.
Procedimiento
1. El paciente debe evacuar en un recipiente de boca ancha y estril, teniendo

precaucin de no orinar simultneamente.
2. Recoger la materia fecal con hisopo estril de la zona que observe ms
purulenta, sanguinolenta o mucosa (cantidad adecuada: 1 cucharadita 4
ml.) e introducirlo en un tubo estril con medio de transporte adecuado
(Cary-Blair).
3. La muestra debe remitirse al laboratorio lo antes posible.
4. Mantenerla a temperatura ambiente.
5. Es sumamente importante contar con la edad del paciente.
6. Especificar claramente en la orden si se requiere hacer la bsqueda de
Campylobacter spp. (pacientes peditricos e inmunosuprimidos)
7. La deposicin debe hacerla en un recipiente limpio y seco, sin mezclar con
la orina.
La muestra se debe enviar al laboratorio antes de las dos horas, cuando se
sospecha de Shigelosis antes de los 30 minutos. En caso de que el tiempo
de transporte, sea mayor se debe tomar dos hisopos fecales e introducirlos
en el medio de transporte de Cary Blair y mantenerlos a temperatura
ambiente.
34
Para la reaccin inflamatoria debe adems enviarse la muestra emitida.
Para Vibrio spp., el medio recomendable es el agua peptonada alcalina.
OBSERVACIONES
La solicitud del coprocultivo debe informar el uso y tipo de antibiticos.
CRITERIOS DE RECHAZOS
Envase sin rotular

Solicitud de examen microbiolgico incompleto o ilegible.
Muestra absorbida en paal
Muestra con ms de 30 minutos de recolectada sin medio de transporte, si se
sospecha de Shigellosis.
Heces formadas, en las cuales es innecesario realizar cultivo, estas solo se
deben realizar en caso de investigaciones epidemiolgicas y previa indicacin
mdica.
35
VIII. PROCEDIMIENTOS MEDICOS, ASISTENCIALES.
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA CLINICA

Y ANATOMIA PATOLOGICA
SERVICIO DE PATOLOGIA CLINICA
HOSPITAL SANTA ROSA MICROBIOLOGIA

Titulo Cultivo de Orina Cdigo: M4
(UROCULTIVO)
Objetivos 1. Describir el procedimiento para el cultivo de la muestra de
orina.
Fundamento Es el conjunto de acciones que se realizan para identificar en
orina la presencia de microrganismos patgenos causantes de
infeccin y determinar su suceptibilidad antimicrobiana.
Alcance Laboratorio de Microbiologa.
Muestra Muestra de orina (criterios explicados en pagina 16-18 )
Materiales
a) Asa Calibrada de 0.001ml (1ul), factor de dilucin
1/1000.
b) Guantes de ltex.
c) Pinza
d) Medios de cultivo: placas con agar sangre de carnero
(AS), placas con agar McConkey (Mck), placas con agar
Mueller Hinton (MH)
e) Medios y pruebas de identificacin para grmenes
Gram positivos y Gram negativos.
f) Discos para la prueba de susceptibilidad
antimicrobiana
g) Cepa de Bacillus subtilis
Equipos a) Estufa a 35C-37C

b) Microscopio ptico.
c) Mechero de Busen
Procedimiento 1. Realizar todo el procedimiento dentro de una cabina de

bioseguridad frente a un mechero de Bunsen.
2. Mezclar bien la muestra, introducir de manera vertical el
asa de siembra dentro del frasco para obtener una muestra
para la siembra.
3. Se inocula en el centro de una placa de Agar Sangre se
extiende la muestra hacia arriba y hacia abajo, luego se
36
estra mediante una serie de pases perpendiculares a la
siembra original.
4. Mediante la tcnica de estra por agotamiento sembrar
una placa de agar Mc Conkey para conseguir colonias
aisladas. Se puede usar placas descartables divididas en 2,
usando una mitad con Agar Sangre y otra mitad con Agar
Mc Conkey.
5. Para la determinacin de agentes bacteriosttico, se har
uso de una placa de Agar Mueller - Hinton la cual se
inocular con una cepa de Bacillus subtilis ATCC 6633 en
una dilucin de 0.5 en la escala de Mc Farland, tratando de
ocupar toda la superficie de la placa.
6. Sobre la superficie de la placa de Muller - Hinton colocar
discos de papel filtro de 6 mm de dimetro, sobre estos
discos se debe colocar una gota de la muestra de orina. La
presencia o ausencia de algn agente bacteriosttico se
representara con la presencia o ausencia, respectivamente
de un halo de inhibicin.
7. Incubar las placas inoculadas a 35-37 C en condiciones
aerbicas por 24 horas. En caso de presencia de antibitico
se observar un halo de inhibicin.
8. Centrifugar 10 ml de orina a 2500 rpm por 5 minutos,
decantar el sobrenadante y realizar el estudio del
sedimento urinario y anotar resultado.
9. Colocar 1l de orina y extenderla sobre una lmina
portaobjeto, dejar secar, fijar y realizar coloracin Gram.
10. A las 24 horas observar el crecimiento de
microorganismos, si no hay colonias incubar hasta las 48
horas.
11. Si existe crecimiento, se realiza el recuento de colonias y se
multiplica por el factor de dilucin para obtener el total de
Unidades Formadoras de Colonias (UFC) por ml.
12. Si se usa un asa de 1 l, el nmero de colonias contadas se
multiplica por 1000.
13. Si se usa un asa de 10 l. el nmero de colonias contadas se
multiplica por 100.
14. Identificacin del microrganismo en medios diferenciales:
sembrar por estras empezando por el agar Citrato, urea,
(en la superficie), TSI, LIA, (introduciendo el asa por el
centro hasta tocar el fondo del tubo, retirar por el mismo
trazo y sembrar por estra la parte inclinada).
15. Sembrar por puntura en el centro del agar SIM hasta una
profundidad aproximada de 1.5 cm.
16. incubar de 35 C 37 C de 18 -24 horas.
37
17. Dar lectura ver anexo 92-112
18. Suceptibilidad Antimicrobiana del microorganismo
(Antibiograma)
19. Transcribir el resultado del examen microbiolgico.
20. Validacin y firma de resultados.
Interpretacin :
a) En pacientes sin sonda vesical, la cuenta significativa de
bacterias en orina es la presencia de mas de 10 5 UFC/ml.
De un solo germen.
b) Los recuentos intermedios (103 104 UFC/ml. ) indica
infeccin si el procedimiento de recoleccin de orina fue
realizado correctamente.
c) Generalmente, el aislamiento de tres o mas especies
bacteriana indica que la muestra se han contaminado por
recoleccin o demora en la siembra(dependiendo de la
edad del paciente)
d) En pacientes con sonda vesical, cuentas bacterianas
menores de 100,000 UFC/ml. Puede tener significado, as
tambin se puede encontrar bacteriurias polimicrobianas
hasta en casi 15 % de enfermos.
e) En pacientes sin catter se puede comprobar si el
procedimiento de obtencin de muestra fue correctamente
observado la frecuencia con la cual se informan recuentos
de colonias intermedias entre 1000 y 10,000UFC/ml. En
pacientes sin infecciones del tracto urinario, el recuento es
nulo o se reduce a pocas colonias.
f) En muestras obtenidas por puncin suprapbica, el
desarrollo de una sola colonia en el medio de cultivo indica
infeccin del tracto urinario.
38
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA CLINICA Y

ANATOMIA PATOLOGICA
MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo Cultivo de Herida Cdigo: M7

Objetivos Describir los procedimientos de muestra de herida abierta y
abscesos.
heridas y abscesos la presencia de microorganismos
patgenos causantes de infeccin y determinar el diagnostico
bacteriolgico y suceptibilidad antimicrobiana
Alcance Laboratorio de Microbiologa
Muestra Muestra de herida (criterios explicados en pgina 19-20)
Materiales
a) Asa de siembra calibrada.
b) Guantes descartables.
c) Pinza
d) Mascarilla
e) Medios de cultivo: placas con agar sangre de carnero
(AS), agar chocolate (ACH), agar Mc Conkey (Mck), agar
Manitol Salado (MS), placas con agar Muller
Hinton(MH), tubos con agar Saboraud (SAB)
f) Medios y pruebas de identificacin para grmenes Gram
positivos y Gram negativos.
g) Discos de sensibilidad antimicrobiana
h) Jarra de anaerobiosis
c) Mechero de Busen
Procedimiento
1. La muestra debe llegar al laboratorio en una jeringa estril
o en un medio de transporte.
2. Realizar todo el procedimiento dentro de una cabina de
bioseguridad frente a un mechero de Bunsen.
3. Con asa de siembra inocular en un extremo de la placa de
39
agar Sangre, agar Chocolate, agar Mac Conkey, agar Manitol
y en el tubo de agar Saboraud.
4. Luego con el asa de siembra estril realizar estriacin por
agotamiento en cuatro cuadrantes de la placa, con el
propsito de obtener colonias aisladas. Concluida la
siembra, cerrar la placa y colocarla con la parte que tiene el
medio de cultivo hacia arriba.
5. Las placas de agar Sangre y Chocolate se deben incubar en
una jarra de anaerobiosis CO2. La incubacin para todos los
medios de cultivo ser de 24 horas.
6. Con el resto de la muestra realizar un frotis sobre 2 lminas
portaobjetos, el cual se coloreara mediante Tincin Gram.
7. Posterior a la incubacin observar el crecimiento de las
colonias y realizar la identificacin del patgeno.
8. Sensibilidad Antimicrobiana del microorganismo
9. Transcribir el resultado del examen microbiolgico
40
HOSPITAL SANTA ROSA
MICROBIOLOGIA
Titulo Cultivo de Secrecin Vaginal Cdigo: M5
Objetivos 1.-Determinar la existencia de infeccin vaginal.
2.-Identificar microorganismos patgenos.
3.-Determinar la sensibilidad antimicrobiana del patgeno
encontrado
secreciones vaginales la presencia de microorganismos
patgenos causantes de infeccin e inflamacin y determinar su
sensibilidad antimicrobiana.
Alcance Laboratorio de microbiologa
Muestra Muestra de secrecin vaginal (criterios explicados en pgina 29-
30)
Materiales a) Mechero de Bunsen
b) Asa Calibrada.
c) Hisopos (algodn o Dracon)
d) Tubo con 1 ml. de suero fisiolgico y pipeta descartable.
(20ul.)
e) Guantes descartables.
f) Pinza
g) Medio de transporte Stuart o Cary Blair
h) Medios de cultivo: placas con agar sangre de carnero (AS)
agar McConkey (Mck), agar Manitol Salado (MS) y tubos
con agar Saboraud(SAB) y placas con agar Muller Hinton
(MH)
i) Medios y pruebas de identificacin para grmenes Gram
positivos y Gram negativos.
j) Discos de sensibilidad antimicrobiana
k) Solucin salina fisiolgica estril
l) Tubos de tapa rosca de vidrio estril
m) Laminas para Gram.
41
Procedimiento 1. Se toman 02 muestras de hisopado (una en medio de

transporte y otro en un tubo estril con tapa rosca) y frotis
en 2 lminas porta objetos.
2. En el tubo estril que no posee ningn medio, agregar
solucin salina fisiolgica estril.
3. Del tubo con medio de transporte, retirar el hisopo y
colocar la muestra en un extremo de la placa de agar sangre
de carnero.
4. Realizar el proceso de estriacin por agotamiento de la
muestra en los 4 cuadrantes de la placa.
5. En forma semejante sembrar en placa de agar Mc Conkey,
agar Manitol Salado y tubos con agar Saboraoud.
aerbicas por 24 horas.
7. Identificacin del microorganismo.
8. Sensibilidad antimicrobiana del microorganismo
42
HOSPITAL SANTA ROSA
MICROBIOLOGIA
Titulo Cultivo De Secrecin Cdigo: M11
Farngea
Objetivos 1.-Determinar la existencia de faringitis bacteriana.
3.-Determinar la sensibilidad antimicrobiana del patgeno
encontrado
Fundamento En el cultivo de secrecin farngea el objetivo primordial es la
determinacin del agente causante de la faringitis bacteriana.
Muestra Muestra de secrecin farngea (criterios explicados en pgina

27-28 )
Materiales a) Mechero de Bunsen y cabina de Bioseguridad.
b) Estufa
c) Asa calibrada.
d) Hisopos de algodn o Dracon
e) Guantes de ltex.
f) Mascarilla
g) Pinza
h) Medios de cultivo: placas con agar sangre de carnero
(AS), agar Chocolate, agar Mc Conkey (Mck), agar
Manitol Salado (AM) y placas con agar Muller Hinton
(MH)
i) Discos de Sulfametoxazol y Trimetropim (STX)
j) Discos de sensibilidad antimicrobiana
Procedimiento 1. Se toman 01 muestra de hisopado farngeo y realizar

dos frotis en las lminas porta objeto.
2. Poner una porcin de la muestra, proveniente del
hisopado, en un extremo de la placa de agar Sangre de
43
Carnero.
3. Realizar el proceso de estriacin por agotamiento de la
muestra en los 4 cuadrantes de la placa.
4. Practicar cortes en el agar para ver hemolisis.
5. Repetir estos pasos en las placas o tubos de agar
Chocolate, agar Mc Conkey (McC) y agar Manitol Salado
(MS), agar Saboraud.
6. Colocar un disco de Sulfametoxazol y Trimetropim
(STX) en la placa de Agar Sangre en la zona de mayor
concentracin de muestra.
aerbicas por 24 horas.
8. Colorear la lmina de frotis mediante coloracin Gram.
9. Observar el crecimiento de microorganismos, si no hay
colonias incubar hasta las 48 horas.
44
Titulo Cultivo De Dispositivo Cdigo: M7
Intravascular
Objetivos 1.-Diagnosticar infecciones locales o sistmicas
2.-Identificacin de microorganismos en catteres
intravasculares.
3.-Determinar su sensibilidad antimicrobiana.
dispositivos intravasculares la presencia de microorganismos
patgenos causantes de infeccin local o del torrente
sanguneo y determinar su sensibilidad antimicrobiana.
Muestras de dispositivos intravasculares (criterios explicados
Muestra en pgina 15)
Materiales a) Pinza estril
b) Mechero Bunsen o Cabina de Flujo laminar
c) Guantes descartables
d) Mascarila
e) Contenedor de material contaminado
f) Discos de sensibilidad Antimicrobiana
Procedimiento 1. La tcnica que se describir es la de Maki y colaboradores

(mtodo semicuantitativo).
2. La placa de agar sangre de carnero debe encontrarse a
temperatura ambiente.
3. Flamear la pinza y dejar enfriar.
4. Colocar el segmento del catter sobre la superficie del
agar sangre de carnero, el mismo sobre agar Mac Conkey,
agar Manitol Salado y agar Saboraoud dextrosa.
45
5. Rodar la porcin del catter a travs de la placa, cuatro
veces mientras se ejerce presin hacia abajo con la pinza.
6. Con la misma pinza hacer un frotis del catter sobre una
lmina portaobjetos para su coloracin GRAM.
7. Incubar la placa a 35 - 37 C por 24 horas.
46
DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA CLINICA

Y ANATOMIA PATOLOGICA
HOSPITAL SANTA ROSA
MICROBIOLOGIA
Titulo Cultivo De Esputo Cdigo: M7
Objetivos 1.-Diagnstico de infecciones del tracto respiratorio bajo.
2.-Identificacin del germen causal.
3.-Determinacin de sensibilidad antimicrobiana.
Fundamento El cultivo de las muestras de Esputo es utilizado para el diagnstico
de infecciones del tracto respiratorio inferior.
Muestra Muestras de dispositivos intravasculares (criterios explicados en
pgina 25-26)
Materiales a) Estufa de 35 37 C
b) Mechero Bunsen o Cabina de Flujo laminar
c) Guantes de ltex
d) Mascarilla
e) Agar sangre de carnero (AS) , agar Chocolate, Agar Mc Conkey
(Mck). Agar Manitol salado (MS) y Agar Saboraoud dextrosa
(SAB)
Procedimiento 1. Seleccionar la muestra ms purulenta o que contenga sangre.
2. Utilizando el asa de siembra colocar la muestra en un extremo de
la superficie de las placas con los medios de cultivo.
3. Realizar la siembra por dispersin agotamiento en cuatro
cuadrantes de la placa, con el propsito de obtener colonias
aisladas.
4. Incubar las placas con los medios de cultivo a 35 37 C por 24 a
48 horas.
5. Si no hay crecimiento a las 24 horas seguir incubando hasta por
48 horas.
6. Seleccionar una parte de la muestra ms purulenta suavemente
extenderla en tres lminas portaobjetos.
7. Dejar secar el frotis al aire, de preferencia dentro de una cabina
de flujo laminar.
47
8. Fijar con metanol y colorearlo por Gram.
9. Usar bajo aumento (10x) para examinar el frotis y la
determinacin de polimorfo nucleares y clulas escamosas.
10. En una lamina extendida colocar una gota de KOH y cubrirla con
una laminilla para observar la presencia de Hongos.
11. Identificacin del patgeno.
12. Sensibilidad Antimicrobiana del microorganismo
14. 13. Validacin y firma de resultados.
48

Titulo Cultivo De Secrecin de Vas Cdigo: M7
Respiratorias Bajas
Objetivos 1.-Diagnstico de infecciones del tracto respiratorio bajo.
Fundamento El cultivo de las muestras del tracto respiratorio bajo es
utilizado para el diagnstico de infecciones del tracto
respiratorio.
Muestra Muestras de dispositivos intravasculares (criterios explicados

en pgina 25-26)
Materiales a) Mechero Bunsen en la Cabina de Flujo laminar
b) Guantes de ltex
c) Mascarilla
d) Contenedor de material contaminado
e) Agar sangre de carnero (AS), agar Chocolate, agar Mc
Conkey (Mck). Manitol salado (MS) y Saboraud (SAB)
Procedimiento 1. Seleccionar la muestra ms purulenta o que contenga
sangre.
2. Utilizando el asa de siembra y tomando como referencia
central el inculo de la muestra, realizar la siembra por
dispersin agotamiento en cuatro cuadrantes de la placa,
con el propsito de obtener colonias aisladas.
3. Incubar las placas con los medios de cultivo a 35 37 C
por 24 a 48 horas.
4. Si no hay crecimiento a las 24 horas seguir incubando
hasta por 48 horas.
5. Para realizar el frots seleccionar la porcin ms purulenta
de la muestra que contenga sangre.
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6. Suavemente extenderla en la lmina portaobjetos y
colorearlo por Gram.
7. Identificacin del patgeno
8. Sensibilidad antimicrobiana del microorganismo.
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Titulo Cultivo De Muestras de Cdigo: M7
Secrecin Biliar
Objetivos 1.-Diagnstico de infecciones de la Vescula Biliar.
Fundamento El cultivo de las muestras de secrecin biliar es utilizado para
el diagnstico de infecciones en la Vescula Biliar.
Muestra Muestra de secrecin (Ver especificaciones pgina 23-24 )

Materiales a) Mechero Bunsen
b) Guantes de ltex
c) Mascarilla
e) Agar Sangre (AS), agar Chocolate, agar Mc Conkey
(Mck), caldo selenito (Sel) y Agar Salmonella Shigella
(SS), placa de Agar Muller-Hinton (MH)
f) Hisopos estriles
Procedimiento 1. Tomar la muestra de la bilis con el asa de siembra estril
introducindola y sacndola del frasco en forma vertical
2. Sembrar la muestra sobre las placas de agar Sangre, agar
Mac Conkey, por agotamiento.
3. Con ayuda de un hisopo estril tomar una muestra de la
bilis e inocular el caldo Selenito.
4. Incubar ambos medios de cultivo a 35 C por 24 horas.
5. Realizar un frotis sobre una lmina portaobjetos, para
coloracin Gram.
6. Observar si hay crecimiento en el agar Mac Conkey, y
tomar una muestra del caldo selenito con un asa de
51
siembra y sembrarla en una placa de agar Salmonella-
Shigella.
7. Incubar medios de cultivo a 35 C por 24 horas.
8. Realizar la identificacin bacteriana.
9. Sensibilidad Antimicrobiana del microorganismo.
52
Titulo Cultivo De Heces Cdigo: M1
(COPROCULTIVO)
Objetivos 1.-Diagnstico de diarrea infecciosa.
2.-Identificar el germen causal.
3.-Determinar sensibilidad antimicrobiana.
Fundamento Procedimientos de cultivo para la identificacin de entero
patgenos en muestras de heces, pertenecientes a la Familia
Enterobacteriaceae de los gneros: Salmonella, Shigella, E. Coli
(entero patgena, entero invasiva, entero hemorrgica), Vibrio
cholerae, Campylobacter as como determinar su sensibilidad
antimicrobiana.
Muestra Ver especificaciones pgina 34-35
Materiales a) Mechero Bunsen
b) Guantes descartables.
c) Mascarilla
e) Agar Mc Conkey (Mck), caldo selenito (Sel) y Agar
Salmonella Shigella (SS), placa de Agar Muller-Hinton
(MH)
f) Hisopos estriles
Equipos a) Cabina de flujo laminar

b) Microscopio ptico
c) Estufa de 35 37 C
Procedimiento 1. Tomar la muestra de heces con el asa de siembra estril

introducindola y sacndola del frasco en forma vertical
2. Sembrar la muestra sobre las placas de agar Mac Conkey,
por agotamiento.
3. Con ayuda de un hisopo estril tomar una muestra de heces
53
e inocular al caldo Selenito.
4. Incubar ambos medios de cultivo a 35 C por 24 horas para
entero patgenos
5. Realizar un frotis sobre 2 lminas portaobjetos, para
bsqueda de campylobacter y diferencial de reaccin
inflamatoria.(Coloraciones pgina.)
6. Observar si hay crecimiento en el agar Mac Conkey
7. Identificacin del microrganismo ( en medios diferenciales
sembrar por estras empezando por el agar Citrato, urea, (
en la superficie ), TSI, LIA, ( introduciendo el asa por el
centro hasta tocar el fondo del tubo , retirar por el mismo
trazo y sembrar por estra la parte inclinada),
8. Sembrar por puntura en el centro del agar SIM hasta una
profundidad aproximada de 1.5 cm.
9. incubar de 35 C 37 C de 18 -24 horas.
10. Dar lectura ver anexo (105-112)
11. Tomar una muestra del caldo selenito con un asa de
siembra y sembrarla en una placa de agar Salmonella-
Shigella por agotamiento
12. Incubar medios de cultivo a 35 C por 24 horas.
13. Realizar la identificacin bacteriana.
(Antibiograma)
54

Titulo Cultivo de Fluidos Cdigo: M1
Corporales
Objetivos 1.-Diagnstico de infeccin de fluidos corporales estriles,
identificar el microorganismo causal, determinar la
sensibilidad antimicrobiana.
Fundamento Procedimientos de cultivo para la identificacin de
microorganismos en lquidos biolgicos, as como
determinacin de la sensibilidad antimicrobiana.
Muestra Ver especificaciones pagina 21-22
a) LCR
b) Liq.Pleural
c) Liq. Peritoneal
d) Liq. Asctico
e) Liq. Articular (sinovial)
Materiales a) Asa de siembra
b) Tubos estriles
c) Mechero Bunsen.
d) Guantes de ltex
e) Mascarilla
f) Medios de Cultivo: Agar sangre, agar chocolate, agar
Manitol salado, agar Mac Conkey y agar Saboraud, agar
Mueller-Hinton
g) Tinta china
h) Set de coloracin Gram
Procedimiento 1. Colocar 10 ml de muestra en un tubo y centrifugar a 3500

rpm por 5 minutos.
2. Retirar el sobrenadante, dejando 0.5 ml en el tubo.
Guardar sobrenadante para otros estudios.
55
3. Resuspender el sedimento, agitando el tubo, y sembrar en
agar Chocolate, agar Sangre, agar Manitol salado, agar Mac
Conkey y agar Saboraud.
4. Colocar 1 gota (50 l del sedimento en lmina portaobjetos
y dejar secar, fijar con una gota de metanol y colorear con
Gram.
5. Observar al microscopio con lente de inmersin 100x
6. Otra gota del sedimento (de LCR), se coloca en una lmina
y se agrega una gota de Tinta China, cubrir con laminilla y
observar al microscopio con objetivo de 40x.
7. Realizar la identificacin del patgeno.
8. Sensibilidad antimicrobiana del microorganismo.
Validacin y firma de resultados.
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MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo Examen Micolgico, Cdigo: M6
Directo Y Cultivo
Objetivos 1.-Determinar la etiologa mictica de una infeccin.
2.-Orientar el tratamiento adecuado.
3.- Control evolutivo de la infeccin.
Fundamento Es el conjunto de procedimientos que se realizan para la
determinacin de estructuras micticas causantes de
infeccin.
Muestra Obtencin de diversos tipos de muestras a fin de detectar la

presencia de hongos.
15 das antes no aplicarse medicamentos antimicticos.
Materiales a) Lminas y laminillas

b) Mechero Bunsen
c) Asa de siembra
d) Placas Petri
e) Envase estril.
f) Pinza y Tijera
g) Guantes de latex.
h) Mascarilla
i) Agar Saboraud+ Antibiticos, Medios Cromognicos
j) (Chromoagar Cndida), Hidroxido de Potasio (KOH) al
40%, Coloracin de Gram y Giemsa, tinta China, Azul
de Lactofenol , agar Sangre (Dimrficos)

57
Procedimiento EXAMEN CON KOH:
1. Con la ayuda de un asa de siembra o con una pinza estril

tomar la muestra y colocarlo sobre una lmina porta
objetos.
2. Agregar una gota de solucin de Hidrxido de Potasio -
KOH o hidrxido de sodio NAOH al 10%, cubrir con una
laminilla y observar al microscopio con objetivo de 40X.
3. Coloracin Gram, para el gnero Cndida. (Chromoagar
Cndida)
4. Coloracin Giemsa, para Histoplasma y Pneumocystis
jirovecii.
5. Tinta China, para Criptococcus.
CULTIVO
Para realizar el cultivo de los hongos debemos tomar la

muestra y colocarlo por puncin o de manera de estriacin
sobre el medio de cultivo (Agar Saboraud con Cloranfenicol)
incubar a 30C, hasta por 15 das.
1. Dermatofitos: Cuando desarrollan las colonias realizar un
directo con KOH y observar esporulacin, Chromoagar si
es Levaduras, pruebas complementarias se puede utilizar
el Test de Ureasa.
2. Levaduras: observar la morfologa, para precisar la cpsula
y seudohifas.
3. Tubo Germinativo: en 0.5 ml de suero humano inocular
una colonia e incubar por 2 horas a 35 C, luego observar
la presencia de prolongaciones como hifas iniciales cortas.
4. Sembrar una porcin de las colonias levaduriformes en
Chromoagar para la identificacin.
a) Hongos dimrficos: producen hifas a 25C y se
convierten en levaduras en los tejidos o medios de
cultivo a 35C. Son de crecimiento lento, incubar a 37C
por 7 das con humedad.
b) Hyphomicetos oportunistas: son ambientales, debe
demostrarse repetidas veces y observarse en los
58
tejidos. No usar Cicloheximida, puede usarse
Cloranfenicol y Gentamicina.
c) Agentes de Zygomicosis: la muestra no debe
refrigerarse y debe sembrarse en bloque (no picarse).
No usar Cicloheximida. La mayora desarrollan a las 24-
48 horas.
d) Agentes de Micetomas Eumicticos: la pus o biopsia
debe ser examinada para encontrar la presencia de
grnulos debiendo anotarse el tamao color,
textura y forma. Los grnulos deben lavarse con
suero fisiolgico para cultivarse, incubar 6 semanas.
5. Transcribir el resultado del examen microbiolgico.
59

Titulo Baciloscopa Para Cdigo:
Diagnstico de
Tuberculosis
Objetivos 1.-Diagnstico de infeccin de microorganismos Acido Alcohol
Resistentes
2.-Identificar el microorganismo causal de la Tuberculosis.
Fundamento Procedimientos para la determinacin directa de Bacilos
Alcohol Acido Resistentes. (BAAR) a travs de la coloracin
diferencial de Ziehl-Neelsen que permite la tincin de los
microrganismos que poseen elevado contenido de lpidos
como es el caso del genero Mycobacterium.
Muestra Esputo ( Ver especificaciones pgina 25-26 )
Materiales a) Aplicador de madera

b) Tubos estriles
c) Mechero de bunsen
d) Guantes descartables
e) Mascarillas N95
f) Laminas portaobjetos nuevas
g) Fenol al 5%
h) Lpiz marcador de cera o de diamante
i) Mechero de alcohol
j) Dos varillas de vidrio unidas por los extremos por un
tubo de goma.
k) Encendedor
l) Cuaderno de registro
Reactivos para coloracin

a) Fucsina bsica Fenicada
b) Azul de metileno
c) Fenol de cristales(al 5%)
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d) cido clorhdrico (alcohol acido)
e) Alcohol de 95
f) Agua destilada
Equipos a) Cabina de flujo laminar ( Bioseguridad)
b) Estufa a 35C-37C
c) Microscopio ptico.
d) Centrifuga
Procedimiento
1. Antes de empezar a trabajar debemos verificar todos los
materiales a utilizar, encender la cabina de flujo laminar
10 antes de trabajar y 10 despus de trabajar.
2. Con ayuda del aplicador de madera tomar una muestra
significativa de la regin ms purulenta de la muestra de
esputo. Una alternativa es usar un gotero descartable, con
la cual se coge la parte grumosa aproximadamente 100 l.,
con lo cual se hace el frotis.
3. Aplicarla sobre la lmina portaobjetos previamente
rotulada con el cdigo del paciente.
4. Frente al mechero y dentro de una cabina de flujo laminar,
realizar un frotis de manera circular, flamendolo para que
se vaya secando.
5. Dejar que termine de secar la lmina dentro de la cabina de
flujo laminar.
6. Cuando trabajamos con muestras de orina u otro tipo de
lquido corporal, es recomendable que se centrifugue la
muestra a 3500 RPM por 5 minutos.
7. Una vez centrifugada descartar el sobrenadante y colocar el
sedimento sobre la lmina portaobjetos, cumpliendo todas
las medidas de bioseguridad.
8. Realizar un frotis como anteriormente lo explicamos.
9. Una vez haya secado la lmina con orina o lquidos
corporales, esta se debe fijar con alcohol de 96 por 5 y
luego dejar secar.
10. Cuando hemos conseguido que las lminas estn secas en
su totalidad, realizaremos la Coloracin de Ziehl Neelsen.
11. Colocar Fucsina bsica fenicada al 5 % sobre la lmina.
12. Calentar suavemente con la llama del mechero de alcohol
por debajo de cada lmina porta objeto, hasta la emisin de
61
vapores, repetir el procedimiento tres veces. No debe
hervir la preparacin, si el volumen del colorante
disminuye por evaporizacin agregar ms colorantes hasta
cubrir el extendido y dejar enfriar el tiempo mnimo es de 5
minutos.
13. Enjuagar la lmina con agua corriente, dejar caer a baja
presin sobre la parte que no tiene el extendido.
14. Cubrir la totalidad de la superficie con la solucin del
alcohol acido durante 2 minutos hasta obtener una
coloracin rosa plido, de ser necesario de colocar
nuevamente y dejar reposar por 1 minuto.
15. Lavar nuevamente la lmina con agua corriente a baja
presin cuidado de no desprender el extendido.
16. Cubrir la superficie del extendido con el colorante azul de
metileno durante 30 segundos a 1 minuto, eliminar el azul
de metileno y lavar cada lamina con agua a baja presin,
por ambos caras de la lmina porta objeto.
17. Colocar en orden numrico y dejar secar al medio
ambiente.
18. Realizar la lectura de las lminas (determinar la presencia
o ausencia )y hacer el recuento de los Bacilos Acido Alcohol
Resistentes.
siguiendo los patrones del PCT.
62
MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo Susceptibilidad Cdigo:
antimicrobiana por el
mtodo de Disco
Difusin.
Objetivos 1.-Determinar in vitro la susceptibilidad de un
microorganismo a diversos antimicrobianos.
2.-Orientar al mdico tratante en la teraputica
Fundamento Es el conjunto de acciones que se realizan para determinar in
vitro la susceptibilidad de un microorganismo identificado a
diversos antimicrobianos. El recomendado es el de Kirby-
Bauer con el que se ha logrado uniformizar los conceptos de
concentracin mnima inhibitoria (MIC) y de la concentracin
en sangre de las drogas frecuentemente usadas
Muestra Se trabajaran con cepas que se cultivaron de las muestras de
estudio.
Materiales a. Discos de sensibilidad impregnados con diferentes
antibiticos y quimioterpicos.
b. Tubos estriles
c. Mechero de bunsen
d. Guantes de ltex
e. Pinzas estriles
f. Solucin Salina Fisiolgica
g. Escala de Mac Farland de 0.5
h. Placas con Agar Mueller -Hinton
i. Para el control de calidad:
E. Coli ATCC 25922,
S. Aureus 25923,
P. Aeruginosa ATCC 27853,
E. Coli ATCC 35218,
Enterococcus faecalis ATCC 29212
63
j. Hisopos esteriles
k. Asa de siembra
Procedimiento 1. En un tubo de vidrio estril agregar solucin salina Estril.

2. Agregar con un asa estril una muestra de la bacteria a
probar.
3. Suspender la muestra bacteriana hasta obtener una
turbidez comparada con la nivel 0.5 de la escala de Mac
Farland, por comparacin visual con el estndar para
realizar este paso usar una luz apropiada y mirar contra
un fondo blanco con lneas negras como contraste.
4. Dejar reposar la dilucin por un periodo mximo de 5
minutos.
5. Embeber un hisopo estril en la suspensin, rotar el
hisopo varias veces presionando firmemente sobre la
pared interior del tubo por encima del nivel del lquido
para remover el exceso del inoculo
6. Inocular la superficie seca de la placa Mueller Hinton,
estriando con el hisopo en tres direcciones para asegurar
un distribucin uniforme del inoculo. ante de colocar los
discos dejar secar la placa a temperatura de ambiente
entre 3 - 5 minutos para que cualquier exceso de humedad
superficial sea absorbida.
7. Proceder a colocar los discos de los diferentes antibiticos
de manera circular y ordenada, respetando una distancia
25mm aprox. entre disco y disco. (el dimetro de los discos
segn la norma del OMS debe ser de 6 mm.) no debe de
colocarse no ms de 12 discos en la placa de 150mm. , ni
ms de 6 en la placa de 100mm de dimetro interno, para
evitar la superposicin en la zona de agar debido a que
algunos antibiticos se difunden rpidamente.
8. Incubar las placas en posicin invertida a 35 - 37 C de
los 15 minutos posteriores de la aplicacin de los discos
por 18 a 24 horas.
9. Despus del tiempo recomendado de incubacin examinar
la placa y medir los dimetros de los halos de inhibicin
alrededor de cada disco.
64
10. Para determinar la susceptibilidad de la cepa bacteriana
es necesario medir el tamao del halo, de esta manera
podremos determinar si la cepa es Resistente, Intermedia
o Sensible frente a un determinado antibitico.
65
COMENTARIOS IMPORTANTES
Adaptado de: NCCLS 2001 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility
Testing: Eleventh Informational Supplement. M100- S11 Vol 21 N1 NCCLS, Wayne,
Pa.
La eleccin de que antimicrobianos deben probarse y reportarse es decisin del
laboratorio de microbiologa en coordinacin con el comit de control de infecciones,
farmacia, e infectologa, considerando la prevalencia de resistencia, eficacia clnica,
prevencin de la resistencia, recomendaciones de consenso y el costo.
i) Grupos de Antimicrobianos Sugeridos para Microorganismos de

Fcil Desarrollo (no exigentes):
Grupo A: considerados para un reporte rutinario.
Enterobacteriaceae P. aeruginosa y Staphylococcus spp Enterococcus spp

Acinetobacter spp.
Ampicilina Ceftazidime Oxacilina
Cefazolina o Gentamicina Penicilina Penicilina o

Cefalotina Ampicilina
Gentamicina Mezlocilina
Grupo B: incluye agentes importantes principalmente para

infecciones nosocomiales.
Enterobacteriaceae P. aeruginosa y Staphylococcus spp Enterococcus spp

Acinetobacter spp.
Amikacina Amikacina Eritromicina o Quinupristin/
azitromicina Dalfopristin
Amoxicilina/ Aztreonam Clindamicina Vancomicina
Ac. Clavulnico
Cefuroxime
Cefepime Cefepime Sulfametoxazol /
trimetoprim
Cefoxitina Ciprofloxacina Vancomicina
Cefotaxime o Imipenem o
ceftriaxona meropenem
66
Ciprofloxacina o
Levofloxacina Tobramicina
Imipenem o
meropenem
Sulfametoxazol
/trimetoprim
Grupo C: comprende agentes alternativos que pueden ser necesarios

probar cuando existan cepas resistentes
Enterobacteriaceae P. aeruginosa y Staphylococcus Enterococcus spp.

Acinetobacter spp. spp.
Aztreonam Cefotaxime o Cloranfenicol Gentamicina
Ceftazidime Ceftriaxona (despistaje para
resistencia de alto
nivel)
Cloranfenicol Cloranfenicol Ciprofloxacina o Estreptomicina
levofloxacina (despistaje para
resistencia de alto
nivel)
Tetraciclina Sulfametoxazol Quinupristin/ Cloranfenicol
/trimetoprim Dalfopristin Eritromicina
Tetraciclina
Rifampicina
(Estos agentes
pueden ser probados
para Enterococo
resistente a la
vancomicina. VRE)
Tobramicina Gentamicina
Rifampicina
Tetraciclina
67
Grupo D: comprende los agentes antimicrobianos que se usan
nicamente o primariamente para el tratamiento de infecciones
urinarias.
Enterobacteriaceae P. aeruginosa y Staphylococcus Enterococcus spp.

Acinetobacter spp. spp.
Carbenicilina Carbenicilina Lomefloxacina o Ciprofloxacina
norfloxacina Levofloxacina
Norfloxacina
Lomefloxacina o Levofloxacina o Nitrofurantoina Nitrofurantoina
norfloxacina lomefloxacina o
norfloxacina
Loracarbef Sulfisoxazol Sulfisoxazol Tetraciclina
Nitrofurantoina Tetraciclina Trimetoprim
Sulfisoxazol
Trimetoprim
1.- Para aislamientos de Salmonella y Shigella spp. : Ampicilina, una

Quinolona y Sulfametoxazol/ Trimetoprim, deben ser probados rutinariamente.
Adicionalmente, Cloranfenicol y una Cefalosporina de 3era. Generacin deberan ser
probados en los casos de aislamiento extraintestinal de Salmonella spp.
Cefalotina puede ser usada para representar a Cefalotina, Cefradina, Cefalexina,

Cefaclor y Cefradoxil. Cefazolina, cefuroxime, Cefpodoxime, Cefprozil y Loracarbef
(aislamientos urinarios) pueden ser probados individualmente, porque algunos
aislamientos pueden ser susceptibles a estos agentes cuando es resistente a
Cefalotina.
3.-Staphylococcus.- Los estafilococos Penicilino sensibles son tambin sensibles a

otras penicilinas, Cefepems y Carbapenems. Las cepas Penicilino resistentes pero
Oxacilino sensibles, son resistentes a las penicilinas lbiles a beta Lactamasa pero
sensibles a otras penicilinas estables a la beta Lactamasa, combinaciones de
inhibidor de Betalactamasa, Cefepems relevantes y Carbapenems. Los estafilococos
Oxacilino resistentes son resistentes a todos los antibiticos Betalactmicos
disponibles. De esta manera la sensibilidad o resistencia de un amplio grupo de
antibiticos beta lactmiCos puede ser deducida al probar nicamente penicilina y
Oxacilina. El ensayo rutinario de otras penicilinas, combinaciones de inhibidores de
beta Lactamasa, Cefepems y Carbepenems no es recomendado.
68
Histricamente, la resistencia de las penicilinas Antiestafilococicas estables a la
Betalactamasa han sido referidas como resistencia a la Meticilina, por eso las siglas
MRSA (S. Aureus Meticilino resistente) tambin se usan al referirse a la resistencia a
la Oxacilina.
4.- Enterococcus: Para Enterococcus spp. Ceflosporinas, Aminoglicosidos (excepto

para despistaje de resistencia de alto nivel), Clindamicina, y Sulfametoxazol /
Trimetoprim pueden aparecer activos in vitro pero no son efectivos clnicamente y
los aislamientos no deberan ser reportados como susceptibles.
a) Susceptibilidad a la penicilina puede ser usada para predecir la susceptibilidad a
Ampicilina, Amoxicilina, Ampicilina / Sulbactam, amoxicilina / ac. CLAVULNICO,
Piperacilina y Piperacilina/ Tazobactam para Enterococos no productores de
Betalactamasa. Sinergia entre Ampicilina, Penicilina, o Vancomicina y un
Aminoglicosido puede predecirse utilizando una prueba de despistaje de alto nivel
de Aminoglicsido (Gentamicina y estreptomicina). Una terapia combinada de
Penicilina o Ampicilina ms un Aminoglicsido es usualmente indicada para
infecciones serias por enterococos como la endocarditis bacteriana.
b) Debe reportarse en los casos de Enterococcus faecium resistente a vancomicina
c) Tetraciclina es la representativa para todas las tetraciclinas, y los resultados
pueden aplicarse para doxiciclina y - minociclina. Doxiciclina y minociclina
pueden ser probadas en lugar de, o adems de, tetraciclina. Sin embargo ciertos
microorganismos pueden ser ms susceptibles a minociclina y doxiciclina que a
tetraciclina.
5.- En otras No Enterobacteriaceae que no sean P. aeruginosa y Acinetobacter spp.
Debera ser utilizando el mtodo de dilucin.
P. aruginosa puede desarrollar resistencia durante terapia prolongada con todos

los antibiticos. Por lo tanto aislamientos que son inicialmente susceptibles pueden
llegar a ser resistentes despus de tres a cuatro dias de iniciada la terapia. Se justifica
realizar pruebas de susceptibilidad en los aislamientos sucesivos.
6.- Enterobacter, Citrobacter y Serratia pueden desarrollar resistencia

durante terapia prolongada con cefalosporinas de tercera generacin. Por lo tanto
aislamientos que son inicialmente susceptibles pueden tornarse resistentes despus
de tres a cuatro das de iniciada la terapia. Pruebas de susceptibilidad de los
aislamientos sucesivos pueden ser justificadas.
69
ii.- Grupos de Antimicrobianos Sugeridos para Microorganismos de

Difcil Desarrollo:
Grupo A: considerados para un reporte rutinario.
Haemophilus spp. Neisseria Streptococcus Streptococcus

gonorrhoeae pneumoniae spp.otros
diferentes a S.
Pneumoniae
Ampiclina Eritromicina Eritromicina
Sulfametoxazol/ Penicilina Penicilina o
trimetoprim (disco de oxacilina) ampicilina
Sulfametoxazol /
trimetoprim
Grupo B: incluye agentes importantes principalmente para

infecciones nosocomiales

diferentes a S.
Pneumoniae
Cefotaxime o Clindamicina Cloranfenicol
ceftazidime o
ceftriaxona
Cefuroxime sdico Gatifloxacina o Clindamicina
(parenteral) levofloxacina
Cloranfenicol Tetraciclina Vancomicina
Meropenem Vancomicina
Grupo C: comprende agentes alternativos que pueden ser necesarios

probar cuando existan cepas resistentes.

diferentes a S.
Pneumoniae
Azitromicina Cefotaxime o Cloranfenicol Cefotaxime o
ceftriaxona ceftriaxona
Cefepime
70
Aztreonam Cefoxitina Rifampicina Levofloxacina
Cefuroxima Ofloxacina
Cefaclor o loracarbef Ciprofloxacina o Quinupristin/
Cefpodoxime gatifloxacina Dalfopristin
Cefuroxime axetil Penicilina
(oral)
Ciprofloxacina o Spectinomicina
levofloxacina
Imipenem Tetraciclina
Rifampicina
Tetraciclina
1.- nicamente los resultados de probar con Ampicilina, una Cefalosporina de tercera
generacin, cloranfenicol y meropenem deberan ser reportados rutinariamente en
todos los aislamientos de H. Influenzae de sangre y LCR provenientes de pacientes
con infecciones graves como meningitis, bacteremia, epiglotitis y celulitis facial.
2.-Los resultados de las pruebas de susceptibilidad a la ampicilina deberan ser
usados para predecir la actividad de la amoxicilina .La mayora de los H. Influenzae
que son resistentes a la ampicilina y amoxicilina producen beta lactamasa tipo TEM .
En la mayora de los casos una prueba de beta lactamasa directa puede detectar
rpidamente resistencia a ampicilina y amoxicilina.
3.- Amoxicilina, ampicilina, cefepime, cefotaxime, ceftriaxona, cefuroxime, imipenem
y meropenem pueden ser usados para tratar infecciones neumoccicas; sin embargo
pruebas de difusin de disco confiables an no existen. Sus actividades in vitro son
mejor determinadas usando un mtodo de concentracin inhibitoria mnima.
4.- Susceptibilidad y resistencia a azitromicina, claritromicina y diritromicina puede
predecirse probando con eritromicina.
5.- Los Estreptococos viridans aislados de sangre y lugares normalmente estriles
(sangre, LCR, hueso, etc.) debern ser probados para susceptibilidad a la penicilina
usando un mtodo MIC.
6.- Pruebas de susceptibilidad para penicilinas y otros beta lactmicos, para
tratamiento de Streptococcus pyogenes o S agalactie, no es necesario para propsitos
clnicos y no necesita realizarse rutinariamente, as como para vancomicina, ya que
no se han descrito cepas resistentes a estos antimicrobianos.
7.- Penicilina, cefotaxime o ceftriaxona y meropenem debern ser probados por un
mtodo MIC y reportados rutinariamente en aislamientos de S. pneumoniae de sangre
o LCR. Estos aislamientos deben tambin ser probados para vancomicina usando
mtodos MIC o de disco. En aislamientos de otros sitios, la prueba de despistaje con
71
disco de oxacilina puede ser usado. Si el tamao de la zona de oxacilina es igual o
menor de 19 mm, debe realizarse MIC para penicilina, cefotaxime y ceftriaxona.
8.- Amoxiclina/ ac.clavulnico, azitromicina, claritromicina, cefaclor, loracarbef,
cefpodoxime, y cefuroxime axetil son agentes orales que pueden ser usados como
terapia emprica para infecciones respiratorias debidas a Haemophilus spp. Los
resultados de pruebas de susceptibilidad con estos agentes a menudo no son tiles
para el manejo de pacientes individuales, sin embargo s pueden ser apropiadas para
encuestas o estudios epidemiolgicos.
72
MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo TINCION DE GRAM Cdigo:
Objetivos Clasificar las bacterias en dos grupos: Gram positivos y Gram
negativos.
Fundamento La coloracin Gram se basa en las diferencias entre las

paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram
negativas.
Bacterias Gram positivas, que se tien de azul
violceo oscuro.
Bacterias Gram negativas, que se tien de rojo,
grosella o rosado
Muestra Lamina con la muestra en frotis para estudio en el

microscopio con el objetivo de 100X.
Materiales a) Solucin de Cristal Violeta al 1%
b) Solucin de safranina.
c) Solucin de Lugol
d) Alcohol acetona
e) Agua corriente
Procedimiento 1. Fijar el frotis por calor suave y dejarlo enfriar.
2. Cubrir el frotis con cristal violeta al 1%, dejando que el
colorante actu por 1 minuto.
3. Enjuagar suavemente la preparacin con agua corriente y
dejarla escurrir.
4. Cubrir el frotis con solucin de lugol dejando actuar por 2
minutos.
5. Enjuagar suavemente la preparacin con agua corriente.
6. Cubrir el frotis con alcohol acetona por 1 minuto.
7. Enjuagar suavemente con agua corriente.
73
8. Cubrir el frotis con safranina, por 30 segundos.
9. Enjuagar suavemente con agua corriente y dejar secar la
preparacin al aire libre.
74
MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo ROTAVIRUS Cdigo:
Objetivos Identificar el agente infeccioso de la diarrea por rotavirus.
El diagnostico de laboratorio de las infecciones por rotavirus
desempea un importante papel en el tratamiento de los
pacientes, y permite tratar y contener de manera eficaz los
brotes.
Fundamento Los rotavirus son virus de ARN desnudos de simetra
icosadrica que consisten en un ncleo interior esfrico y dos
cpsides exteriores. Se han identificado 7 grupos principales
de rotavirus, denominados con las letras de la A a la G,
siendo los grupos A, B y C los que infectan a los seres
humanos, siendo el grupo A, el ms importante.
Muestra Muestra fecal adecuada (5-10mL de heces)
Las muestras se pueden almacenar a una temperatura de
2-8C hasta por 5 das.
Durante el transporte de las muestras se debe usar bolsas
de hielo para mantenerlas a temperatura de 2-8C.
Materiales a) Recipiente para el desecho de residuos

b) Micro pipetas y puntas desechables.
c) Temporizador
d) Lector de micro placas.
e) Kit de Rotavirus
Equipos a) Lector de micro placas
b) Temporizador
Procedimiento Proceder de acuerdo a las instrucciones del kit de

Rotavirus vigente.
Prueba ELISA
Es vlida para identificar antgenos del virus en
muestras de materia fecal.. Se enfrenta la muestra
75
diluida con los anticuerpos VP6 (Protenas de la
cpside) que se encuentran fijados en los pocillos de la
micro placa. Si la muestra contiene antgenos virales de
rotavirus., estas se unirn al Ac y al aplicar el
conjugado se formara un complejo Ac/Ag/Ac marcado
que posteriormente ser revelado con una solucin
substrato/cromgeno desarrollando un color azul.
Al agregar la solucin de parada cambia a color
amarillo siendo la intensidad proporcional a la
cantidad de antgenos virales presentes en la muestra.
La lectura se realiza en un espectrofotmetro para
determinar la Densidad ptica de la muestra.
76
MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo Investigacin de Cdigo: P1 - 2
parsitos en heces
Objetivos 1.- Determinar la existencia de enfermedad parasitaria.
2.- Identificar huevos, quistes, formas vegetativas o
especmenes adultos de enteroparsitos.
Fundamento Realizar el diagnostico parasitolgico de las infecciones y/o
enfermedades producidas por los parsitos intestinales.
Muestra La recoleccin debe hacerse en un recipiente limpio y seco,
con tapa, sin mezclarla con orina.
Cada muestra debe contener por lo menos 4ml.
Entregar la muestra al laboratorio en un tiempo no mayor de
dos horas, en caso contrario refrigerarla (no congelarla) por
un tiempo mximo de 8 horas.
Materiales a) Guantes
b) Laminas portaobjetos y cubreobjetos
c) Bajalenguas de madera
d) Lugol
e) Solucin salina fisiolgica
f) ter etlico
g) Gasa
h) Tubos de centrifuga graduados.
Equipos a) Microscopio ptico.
Procedimiento Mtodo Directo

1. Mezclar la muestra y colocar una gota en ambos
extremos de una lmina portaobjeto
2. Adicionar una gota de solucin salina fisiolgica a un
extremo y lugol al otro, homogenizar.
3. Cubrir con laminillas respectivamente.
4. Examinar al microscopio con objetivos de 10X y 40X.
77
Mtodo de Concentracin
1. Diluir aproximadamente 2g de heces en 10 ml de agua
destilada, homogenizar con bagueta.
2. Filtrar a travs de gasa doble, en tubos de centrfuga
graduados de 15 ml.
3. Centrifugar a 1500-2000 RPM por 2 minutos.
4. Decantar el sobrenadante y suspender el sedimento
con agua destilada.
5. Centrifugar a 1500-2000 RPM por 2 minutos y
decantar
6. Adicionar suero fisiolgico hasta completar 9ml.
7. Ajustar bien la tapa de los tubos y agitarlos
enrgicamente.
8. Centrifugar a 1500-2000 rpm por 2 minutos y
decantar.
9. Con una pipeta Pasteur aspirar el sedimento colocar
una gota en una lmina, y agregar una gota de lugol
10. Examinar al microscopio, utilizando objetivos de 10X y
40X.
Parsitos ms frecuentes: Giardia lamblia,
Entamoeba coli, Blastocystis hominis.
Investigacin de Coccidios (Ziehl- Neelsen modificado)
1. Utilizar muestras frescas o preservadas en formol,

hacer mtodo de concentracin y del sedimento hacer
frotices para colorear.
2. Dejar secar el frotis al aire.
3. Aplicar el colorante de Ziehl-Neelsen, calentar y dejar
por 3 minutos
4. Decolorar con cido sulfrico al 1% por 2 minutos
5. Contrastar con azul de metileno por 2 minutos.
6. Observar con objetivo de 40X y 100X.
7. Transcribir el resultado del examen microbiolgico al
Sistema de Gestin Hospitalaria o mecanografiar el
resultado.
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MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo SANGRE OCULTA EN Cdigo:
HECES (THEVENON)
Objetivos Encontrar la sangre en materia fecal.
Fundamento Cuando la hemoglobina de la sangre se pone en contacto con
perxido de hidrogeno se libera oxigeno. Este oxigeno
liberado reacciona con aminofenazona y se forma una
coloracin azul.
Muestra La recoleccin debe hacerla en un recipiente limpio y seco,
Cada muestra debe contener por lo menos 4ml
Entregar la muestra al laboratorio en tiempo no mayor de
Materiales a) Tubos cnicos para centrifugacin

b) Aplicadores
c) Una probeta de 20 ml
d) Tubos de ensayo.
e) Acido actico al 10%
f) Perxido de hidrogeno, de 10 vol.
g) Etanol al 95%
h) Aminofenazona cristalina
Equipos a) Una centrifuga
Procedimiento 1. Inmediatamente antes de llevar a cabo el ensayo

preparar una solucin de aminofenazona.
2. Colocar una porcin de la muestra de heces de 4ml
(4cm3) para un tubo de centrifugacin.
3. Agregar 7ml de agua destilada y mezclarla
completamente.
79
4. Centrifugar a baja velocidad aprox. Durante 5 minutos,
o hasta que se precipiten los solidos.
5. Decantar el lquido flotante en otro tubo de ensayo y
conservarlo.
6. Aadir al tubo que contiene el liquido flotante, sin
mezclar:
- 10 gotas de cido actico al 10%
- 5ml de la solucin de aminofenazona.
7. Agregar 10 gotas de solucin de perxido de
hidrogeno.
No mezclar dejar reposar 1 minuto.
REACCION POSITIVA
Azul plido = Reaccin positiva +

Azul oscuro = Reaccin positiva intensa ++
Azul negro = Reaccin positiva muy intensa +++
REACCION NEGATIVA
No ocurre cambio alguno en el color
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MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo Reaccin inflamatoria Cdigo: P3
Objetivos 1.- Determinar la presencia de leucocitos en heces diarreicas.
2.- Cuantificar la cantidad de leucocitos en heces diarreica.
3.- Determinar la diferenciacin entre polimorfonucleares y
mononucleares y el porcentaje de cada uno
Fundamento El concepto de reaccin inflamatoria, radica principalmente
en la presencia o ausencia de leucocitos en heces, que son
clulas que generalmente aparecen cuando el microorganismo
causante de la infeccin es una bacteria.
Muestra La recoleccion debe hacerla en un recipiente limpio y seco,
Cada muestra debe contener por lo menos 4ml
Entregar la muestra al laboratorio en tiempo no mayor de
b) Laminas porta objetos y cubre objetos
c) Bajalenguas de madera
d) Azul de Metileno
e) Lugol
Equipos a) Microscopio ptico.
Procedimiento 1. Sobre un extremo de una lmina porta objetos agregar

una gota de Azul de Metileno y en otro extremo una
gota de lugol.
2. Con un bajalenguas de madera agregar una pequea
porcin de la muestra de heces sobre cada gota en la
lmina porta objetos.
3. Observar al microscopio para la determinacin de
enteroparsitos y leucocitos.
81
4. En el espacio que posee Azul de Metileno se puede
realizar la cuantificacin de leucocitos y haciendo un
porcentaje entre Polimorfonucleares y mononucleares.
resultado.
Validacin y firma de resultados
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MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo Test de Graham Cdigo: P4
Objetivos Determinar la presencia de los huevos de los parsitos
causantes de la Oxiuriasis y cuantificar la cantidad de huevos
del parasito.
Fundamento Tcnica utilizada para el hallazgo de huevos de Enterobius
vermicularis, mediante un examen directo.
Muestra Pegar la cinta adhesiva en la lmina portaobjeto, adhiriendo
una porcin pequea a ambos extremos, dejando un lengeta
al poner la cinta de la lmina porta objeto cuando se va a
tomar la muestra.
La obtencin de la muestra se realiza en la noche 2 a 3 horas
despus que el paciente (generalmente nios) est dormido o
a la maana siguientes adhiere la cinta haciendo toques en la
regin perianal en sentido horario o anti horario. Concluida la
aplicacin, extender la cinta adhesiva i volver a pegar en la
lmina porta objeto.
Materiales a. Guantes
b. Laminas porta objetos y cubre objetos
c. Bajalenguas de madera
d. Cinta adhesiva
Equipos a) Microscopio ptico
Procedimiento 1. El paciente recibe informacin y pautas que deber

tener en cuenta para tomar la muestra.
2. Cuando llega la muestra al servicio de microbiologa
del hospital debe estar envuelta en una hoja de papel
para evitar la propagacin de los huevos del
Enterobius vermicularis en el medio ambiente.
3. Se aplica 1 2 gotas de solucin salina, solucin de
83
tolueno, hidrxido de sodio.
4. En ocasiones se puede observar huevos de otros
helmintos.
5. Se procede a la lectura de la lmina conteniendo la
cinta adhesiva en un microscopio ptico a 40x de
aumento.
6. Se realiza un recorrido total de la cinta y se hace un
recuento de los huevos de parasito hallados.
resultado.
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MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo IDENTIFICACION DE Cdigo: P3
PLASMODIUM
GOTA GRUESA Y FROTIS
Objetivos Detectar la presencia de PLASMODIUM la especie y la
densidad parasitaria
El Plasmodiun es un parasito causante de la Malaria o
Paludismo que se adquieren la infeccin en las zonas
endmicas
Fundamento Hacemos uso para la gota gruesa y el extendido la coloracin
GIEMSA.
GOTA GRUESA: Este procedimiento, comprende la eliminacin

de la hemoglobina (que retiene el colorante) a travs de la
deshemoglobinizacin que facilitara la deteccin de los
parsitos que pudieran estar presentes en el interior de
algunas clulas sanguneas, principalmente cuando se tratan
de densidades parasitarias bajas. La gota gruesa, es tambin
un procedimiento que sirve para la cuantificacin de la
densidad parasitaria.
FROTIS O EXTENDIDO SANGUNEO. Es un procedimiento
tcnico con el que se separan los elementos formes de la
sangre en una capa delgada de clulas separadas entre s, las
cuales una vez coloreadas facilitaran la observacin de las
caractersticas morfolgicas ( tamao glbulo rojo, su forma y
color , grnulos de Schuffner se pueden ver como un moteado
en lo glbulos rojos, el pigmento malarico) de los parsitos
presentes en el interior de los glbulos rojos, sobre todo
permitir identificar la especie del parsito y otras
caractersticas relacionadas con los estadios y especie de los
mismos.
85
Requisitos Solicitud del examen parasitolgico debidamente llenado y
registrado.
Muestra adecuada, la recoleccin de la sangre se debe hacer
en el momento que se presenta la fiebre y antes que se
administre medicamento antipaldico.
Materiales a) Probeta de 10, 50 y 100 ml.
b) Beaker o vaso plstico de trabajo
c) Un agitador de vidrio
d) Una gradilla para portaobjeto
e) Un cronometro o reloj con segundero
f) Un frasco gotero con metanol
g) Colorante GIEMSA ( solucin madre)
h) Agua amortiguadora tampn.
Procedimiento 1. Se utiliza la probeta de vidrio para preparar el colorante

de GIEMSA diluido al 5 % con agua amortiguadora de
pH7.2( en la proporcin 1 gota/ 1 gota)
2. Mezclar suavemente con una varilla de vidrio.
3. Si se colorea dos laminas, se necesita 3 gotas de solucin
GIEMSA (solucin madre) por cada 3 ml. De agua
amortiguador.
4. Verificar si las claves de la lmina coinciden con las
solicitudes de investigacin.
5. Cubrir suavemente con el colorante GIEMSA diluido.
Nunca echar el colorante muy alejado de las lminas
porque puede formar espuma.
6. Dejar reposar las lamina con el colorante por 10 MINUTOS.
7. Lavar suavemente el colorante aadiendo un chorro suave
de agua limpia.
8. Colocar en una gradilla las lminas con el lado de sangre
teida hacia abajo para eliminar el exceso de agua y
facilitar el secado.
86
MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo EXAMEN MICROSCOPICO DEL Cdigo: P3
PLASMODIUM
Procedimiento Durante el examen microscpico se debe anotar las
caractersticas de los estadios del plasmodium segn especie,
observando los glbulos rojos, aspecto general y
caractersticas de :
Trofozoito joven (anillos)
Trofozoito mediano
Trofozoito adulto o maduro.
Esquizonte pre segmentado
Esquizonte segmentado
Gametocito.
El examen de frotis es recomendable:
Cuando no es posible examinar la gota gruesa por ser muy
pequea.
Cuando es necesario la identificacin de la especie.
LAMINAS TEIDAS
La cromatina (ncleo del parasito) es redonda y se colorea de

un rojo intenso. El citoplasma del parasito toma diferentes
formas, desde una forma de anillo a una totalmente irregular..
Se colorea siempre azul, aunque la tonalidad puede variar
entre las diferentes especies de Plasmodium.
EL EXAMEN DE GOTA GRUESA:

Es mejor para detectar la presencia de parsitos
Debe ser examinada primero
Los glbulos rojos han desaparecido
Los grnulos de Schffner se pueden observar alrededor
del parasito.
87
Lectura:
Se debe leer 100 campos, si se encuentra el parasito, se debe
identificar la especie.
Las caractersticas diferenciales entre especie y estadios del
plasmodium en la gota gruesa (Trofozoitos), Esquizonte y
gametocito de Plasmodium Vivax, Falciparum y Malarie.
88
MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo HEMOCULTIVO Cdigo: M2
Objetivos Confirmar la etiologa infecciosa en la sangre
Identificar el microrganismo patgeno y su antibiograma.
Fundamento Prueba analtica para aislar en la sangre la presencia de

microrganismos patgenos causantes de infecciones
(bacterias y hongos)
Los frascos que presenten hemlisis, turbidez, presin

excesiva de gas, sensores amarillos o signos de crecimiento
deben considerarse positivo.
Los frascos de hemocultivos son analizados dependiendo la

existencia de microrganismos presentes en la muestra. El CO2
producto del metabolismo de estos, produce cambios de pH
del medio el cual se indicar por medio del sensor
colorimtrico ubicado en el fondo de la botella. El color del
sensor permeable a gas cambia de azul-verdoso al amarillo
dependiendo la produccin de CO2 del microrganismo.
El equipo automatizado monitoriza y registra la reflectancia

del frasco cada 10 minutos en fondo de la botella y analizar
cada cambio de color evidenciando estos cambios en una
curva de crecimiento.
Muestra 1. Solicitud del examen debidamente llenado y
registrado.
2. Muestra adecuadas: De preferencia el paciente no debe
estar recibiendo antimicrobianos. Rigurosa asepsia en
el lugar de la venopuncion, evitar contaminar con la
flora de la piel.
89
3. Se requiere un mnimo de tres hemocultivos seriados
por paciente.
4. Muestra de orina (criterios explicados en pagina 12-14
)
Materiales a) Frascos para hemocultivos de adultos y peditricos (

segn edad del paciente)
b) Jeringa con aguja hipodrmica estril
c) Yodopovidona en lquido.
d) Alcohol etlico al 70 %
e) Algodn
f) Guantes de ltex.
g) Mechero de bunsen
h) Jarra con sobre generador de CO2 al 5%
i) Medios de cultivo: Agar sangre de carnero,, Agar
chocolate, Agar Mac Conkey
Equipos a) Estufa 35 C-37 C
b) Microscopio ptico
Procedimiento 1. Recepcin y registro: Observar la integridad de los

frascos y el volumen de sangre adecuado.
Incubacin 35C- 37C, sino se puede llevar inmediatamente
a la estufa debe mantenerse a temperatura ambiente (20-23
C) un tiempo no superior a 2 horas. En ningn caso se
colocara en la heladera.
El nmero de muestras no ser menor de tres para tener
mayor posibilidad de recuperacin del microrganismo
causal.
2. Observacin del hemocultivo: Debe visualizar el cultivo

despus de 24 hrs. de incubacin.
La presencia de turbidez, cambio de color o lisis indica
crecimiento bacteriano, entonces se realiza un Gram y un
subcultivo.
En caso contrario continuar la observacin diaria de los
frascos hasta por 7 das.
Ante sospecha o evidencia de desarrollo en cualquier frasco
debe realizarse coloracin Gram y subcultivo.
90
Se desinfecta la tapa del frasco con alcohol de 70
Extraer con jeringa estril a travs del tapn de la muestra
del frasco.
Inocular una gota de la muestra en placa de agar Chocolate,
agar Sangre, agar Manitol salado y agar Mac Conkey, agar
Saboraud se siembra por dispersin agotamiento y otra gota
en lminas para Gram.
Incubar la placa de A Chocolate. a 35-37C en CO2 por 24-
48 horas.
Observar el GRAM.
Si no hay crecimiento hasta el 7 da se cultiva nuevamente
para identificacin del microorganismo
Interpretacin de El desarrollo de un microorganismo de flora de piel debe

resultados obtenerse en por lo menos dos hemocultivos para que tenga
significacin clnica.
91
IX) PRUEBAS COMPLEMENTARIAS PARA

IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:
Staphylococcus y Enterococcus
CONDICIONES GENERALES
Morfologa microscpica
Para la misma se debe realizar un frotis, de preferencia a partir de medio lquido,
realizando luego la tincin de Gram lo que nos permitir apreciar la forma,
agrupacin y comportamiento al Gram de la cepa en estudio. En este grupo
encontramos 2 gneros los Staphylococcus y los Streptococcus que presentan una
disposicin en racimo y en cadena respectivamente.
Morfologa macroscpica
Existe morfologa macroscpica en medio lquida y en medio slida. En medio lquido
debemos observar la turbidez que se desarrolla luego de incubar 18-24 horas. En
medio slido debemos contar con un aislamiento de la cepa a estudiar en una placa
Petri. El aislamiento nos permitir observar las caractersticas de las colonias, que
son las estructuras macroscpicas que forman las bacterias cuando crecen en medios
slidos. As mismo debemos observar la hemolisis que presentan cada cepa sobre las
placas de Agar Sangre.
A) IDENTIFICACIN DE ESTAFILOCOCOS
Lectura de Cultivos en Agar sangre
a)Morfologa de las colonias
Las colonias de la mayora de Staphylococcus son lisas, enteras, algo elevadas. Miden
aproximadamente de 1 a 3mm. De dimetro a las 24 horas. Si las placas se siguen
incubando tres das a 34 - 37C las colonias pueden medir de 3 - 8 mm. Dependiendo
de las especies.
Las colonias de Staphylococcus aureus normalmente son grandes, estas siguen
desarrollando si se deja en incubacin por unos das ms. Son de borde entero, de
92
superficie lisa, la mayora de ellas presentan un pigmento que va desde el amarillo
crema hasta el naranja.
Las colonias de Staphylococcus epidermidis son algo ms pequeas dependiendo de
las cepas, usualmente no se detecta pigmentos. Las colonias de Staphylococcus
saprofhyticus son ms grandes que Staphylococcus epidermidis, son lustrosas y ms
convexas que otras colonias de estafilococos. Un 50% de las cepas son pigmentadas.
b)Coloracin Gram
Hacer una coloracin Gram de las colonias sospechosas y observar al

microscopio: Si se observan cocos Gram positivos en racimos, realizar la
prueba de catalasa. (Ver Coloraciones)
c)Prueba de la catalasa
93
MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo Prueba de la catalasa Cdigo:
Objetivos Separar la Familia Micrococacceae (catalasa +) de los
Gneros Streptococcus y Enterococcus (catalasa -).
Fundamento La enzima catalasa descompone el perxido de hidrgeno

(H2O2) en agua y oxgeno bajo la
Frmula 2 H2O2----2 H2O + O2. De esta manera las bacterias
se protegen del efecto txico del H2O2, que es un producto
final del metabolismo aerobio de los azcares.
Muestra Una asada de la cepa problema

Materiales a) Reactivo: Perxido de hidrgeno 3%
b) Guantes de ltex
c) Asa de siembra
d) Lamina portaobjetos
e) Gotero o pipeta Pasteur.
Procedimiento
1. Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura
de 18 a 24 horas y colocar sobre un portaobjetos limpio.
2. Agregar una gota de H2O2 al 3% usando un gotero o una
pipeta Pasteur.
3. No es necesario mezclar el cultivo con el H2O2
4. Observar una inmediata efervescencia (formacin de
burbujas) lo que indica una prueba positiva, de lo contrario
se considera una prueba negativa.
5. Desechar el portaobjetos colocndolo en un desinfectante
6. Realizar este procedimiento en forma paralela con cepas
controles
I. Control positivo: Staphylococcus aureus
II. Control negativo: Streptococcus sp.
94
NOTA: Al coger la colonia con el asa de siembra tener cuidado de no llevar algo del
medio de agar sangre debido a que la catalasa presente en los eritrocitos, puede dar
resultados falsos positivos.
No invertir el orden del mtodo porque pueden producirse resultados de falsos
positivos.
Si son catalasa positivas primeramente determinar si el organismo es o no
Staphylococcus aureus para ello se realiza la prueba de coagulasa.
d)Prueba de la coagulasa
Se realiza para comprobar la facultad de la bacteria de coagular el plasma por accin
de la enzima coagulasa, la cual aumenta la velocidad de coagulacin del plasma. El
resultado final es la formacin de un cogulo de fibrina. Prueba en tubo (detecta
coagulasa libre y ligada)
La prueba de coagulasa en tubo es definitiva para el Diagnostico de Staphylococcus
aureus.
MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo Prueba de la coagulasa Cdigo:
Objetivos 1.- Permite separar S. aureus, que posee coagulasa, de las
otras especies de estafilococos que genricamente se
denominan coagulasa negativos.
Fundamento a. Una endocoagulasa o coagulasa ligada o "clumping factor"

que est unida a la pared celular. Esta acta directamente
sobre el fibringeno provocando la formacin de cogulos
o grumos cuando se mezcla una suspensin bacteriana con
plasma citratado (test en lmina).
b. Una exocoagulasa o coagulasa libre que acta mediante la
activacin de un factor (CRF), formndose un complejo
coagulasa-CRF, el cual reacciona con el fibringeno
producindose un cogulo de fibrina (test en tubo).
95
Alcance Laboratorio de microbiologa.
b) Tubo de vidrio estriles
c) Asa de siembra
d) Mechero de bunsen
e) Pipeta Pasteur
f) Reactivo: Plasma de conejo deshidratado (reconstituir
de acuerdo a las instrucciones del fabricante)
Procedimiento 1. Transferir una colonia aislada del agar sangre de carnero

a 0.5 ml. de plasma reconstituido (en un tubo de vidrio
estril de 13x100).
2. Girar el tubo suavemente para lograr la suspensin del
organismo. No agitar.
3. Incubar la mezcla a 35-37C (en bao mara de
preferencia) por 4 horas; observar si hay formacin de
cogulo inclinando lentamente el tubo.
4. Observar cuidadosamente si hay formacin de cogulo
inclinado lentamente el tubo (sin agitar) en intervalos,
hasta 4 horas. Cualquier grado de coagulacin es una
prueba positiva.
5. La mayora de los S. aureus formarn cogulo dentro de
una hora.
6. Si es negativa a las 4 horas, seguir incubando el da
siguiente a temperatura ambiente. Esto es recomendado
porque un pequeo nmero de cepas de Estafolococos .
pueden requerir ms de cuatro horas para la formacin del
cogulo. Considerar que Staphylococcus produce
fibrinolisina, la cual puede lisar el cogulo.
7. Realizar el control de calidad del reactivo utilizando
controles positivos y negativos. Si es coagulasa positiva se
identifica como Staphylococcus aureus.
8. Si son estafilococos coagulasa negativos, realizar las
pruebas de resistencia a la polimixina B y novobiocina
(disco de 5ug) para tener una identificacin presuntiva. S.
saprophyticus es resistente a la novobiocinay S.
epidermidis es resistente a la polimixina B.
96
e) Resistencia a la Novobiocina
Varias especies del genero Staphylococcus son resistentes a la novobiocina (disco de

5 g).
CLINICA Y ANATOMIA
PATOLOGICA

Titulo Resistencia a la Cdigo:
Novobiocina
Objetivos Separar Staphylococcus saprophyticus (resistente a la
novobiocina) de los dems estafilococos de importancia
clnica.
Fundamento Muchas especies del gnero de los Staphylococcus poseen

resistencia a la novobiocina.
Alcanse Laboratorio de Microbiologa.
Materiales a) TSA con sangre de carnero o Agar Mueller Hinton
b) Suero fisiolgico o caldo tripticasa soya
c) Discos de novobiocina (5 ug por disco)
d) Escala 0.5 de Mc Farland.
e) Incubadora a 35-37C
f) Vernier o regla.
Procedimiento 1. A partir de colonias aisladas y cultivadas por 24 horas

hacer una suspensin equivalente a la escala 0.5 de Mc
Farland.
2. Sumergir un hisopo estril dentro de la suspensin
ajustada y rotarlo varias veces presionando sobre la pared
interior del tubo por encima del nivel del lquido. Esto
remover el exceso de inculo del hisopo.
3. Inocular sobre la superficie seca de una placa con agar
sangre de carnero estriando homogneamente con el
97
hisopo sobre la superficie del agar. Repetir el
procedimiento dos veces ms rotando la placa 90.
4. Dejar de 3 a 5 minutos a temperatura ambiente para que
cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido.
5. Colocar el disco de novobiocina y presionar suavemente
con una pinza estril.
6. Incubar a 35- 37 toda C la noche o 24 horas.
7. Medir el halo de inhibicin. Un halo menor o igual 16 mm
es resistente a la novobiocina, si es mayor es sensible.
8. La resistencia a Novobiocina es intrnseca en S.
saprophyticus.
INTERPRETACION
Medir el halo de inhibicin. Un halo menor o igual a 16 mm. Es resistente a la

novobiocina, y si es mayor es sensible.
La resistencia a Novobiocina es intrnseca a Staphylococcus saprophyticus.
98
e)Resistencia a la Polimixina B
MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo Resistencia a la Cdigo:
polimixina B
Objetivos Separar Staphylococcus saprophyticus de los dems
estafilococos coagulasa negativos.
Fundamento Muchas especies del gnero de los Staphylococcus poseen

resistencia a la polimixina B.
Alcance Laboratorio de microbiologa.

Materiales a) TSA con sangre de carnero
b) Suero fisiolgico o caldo tripticasa soya
c) Discos de polimixina B (300 U. Por disco)
d) Escala 0.5 de Mc Farland.
e) Vernier o regla
Procedimiento 1. A partir de colonias aisladas y cultivadas por 24 horas

hacer una suspensin equivalente a la escala 0.5 de Mc
Farland.
2. Sumergir un hisopo estril dentro de la suspensin
ajustada y rotarlo varias veces presionando sobre la pared
interior del tubo por encima del nivel del lquido. Esto
remover el exceso de inculo del hisopo.
3. Inocular sobre la superficie seca de una placa con agar
sangre de carnero estriando homogneamente con el
hisopo sobre la superficie del agar. Repetir el
procedimiento dos veces ms rotando la placa 90.
4. Dejar de 3 a 5 minutos a temperatura ambiente para que
cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido.
5. Colocar el disco de Polimixina B y presionar suavemente
99
con una pinza esteril.
6. Incubar a 35- 37 toda C la noche o 24 horas.
7. Medir el halo de inhibicin. Un halo menor o igual 16 mm
es resistente a la polimixina B, si es mayor es sensible.
INTERPRETACION
La resistencia a la polimixina B se define por una zona de inhibicin menor de 10 mm
S. aureus y S. epidermidis son usualmente resistentes.
COMPARAR LOS RESULTDAOS CON LA TABLA ADJUNTA
TABLA
Pigmento Hemolisi Coagula Resistenci Resistenci Acidez
de na sa aa aa De
Colonia Novobioci Polimixina manitol
na B
S. aureus + + + _ + +
S. _ (d) _ _ + _
epidermidis
S. d _ _ + _ d
saprophyticu
s
+ : 90% o ms especies o cepas positivas

_ : 90% o ms especies o cepas negativas
d : 11 a 89% de especies o cepas positivas
(d): No hay hemlisis o es retardada
100
B) IDENTIFICACIN DE ENTEROCOCOS
Los enterococos pueden presentarse como clulas nicas, en pares o en cadenas

cortas. Se ven de forma cocobacilar cuando la coloracin de Gram se realiza de una
placa de agar y pueden verse en cadenas cuando se prepara la coloracin de Gram a
partir de caldo Tioglicolato. Son anaerobios facultativos y su crecimiento ptimo es a
35 C. Muchas cepas crecen a 10 y 45 C.
Lectura de cultivos en agar sangre de carnero y agar Columbia CNA
a) Apariencia de las colonias
Usualmente son alfa hemolticas o no hemolticas en agar sangre de carnero 5%

aunque tambin pueden haber especies beta hemolticas como algunas cepas de
Enterococcus durans.
b) Coloracin Gram
Si se observan cocos Gram positivos y se presentan solos, en pares o en cadenas

cortas, algunas veces cocobacilares realizar la prueba de la Optoquina. (Ver
coloraciones)
c) Prueba de la Catalasa
Seguir los procedimientos descritos en la identificacin de Staphylococcus

Enterocuccus es catalasa negativo.
NOTA: Algunas veces se produce una seudocatalasa y se puede observar una dbil
efervescencia. Esto ocurre cuando E. faecalis desarrolla en medios que contienen
sangre, en este caso sub cultivo la colonia en estudio en TSA o agar Muller Hinton y
repetir la prueba.
101
MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo Prueba de la esculina Cdigo:
en medio con bilis
Objetivos Identificar Enterococos
Fundamento La prueba de la bilis-esculina est basada en la capacidad de

ciertas bacterias, particularmente los estreptococos del grupo
D, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis al 1 o 4%. La
esculina es, qumicamente, un derivado de la cumarina (6-b-
glucsido-7-hidroxicumarina), que por su estructura
pertenece a los glucsidos
Las bacterias capaces de desarrollar en bilis y tambin

hidrolizar esculina, producen glucosa y esculetina (7,7
dihidroxicumarina) y sta puede visualizarse en un medio con
una sal de hierro, por formacin de un complejo marrn
oscuro o negro.
Alcance Laboratorio de Microbiologia.
Materiales a) guantes de ltex

b) asa de siembra
c) placa de agar bilis esculina
d) mechero de bunsen
Procedimiento 1. Inocular el cultivo en estudio haciendo estras sobre la

superficie del pico de flauta o de la placa de agar bilis
esculina.
2. Incubar a 35-35 C hasta 72 horas.
3. Se puede controlar peridicamente y esperar hasta las 72
horas antes de informar como negativo.
4. Lectura
I. Positivo:
102
a) En tubo: ennegrecimiento difuso en agar inclinado
b) En placa: se observa un halo negro o marrn
alrededor de las colonias en la placa.
II. Negativo: No se produce ennegrecimiento o
ennegrecimiento en menos de la mitad del tubo
despus de 72 horas de incubacin,
III. Controles-
a) Control negativo: Stafilococcus aureus
b) Control positivo: Enterococcus spp.
Interpretacin
La esculetina difunde hacia el medio de agar por ser hidrosoluble. La reaccin es
positiva si se observa un ennegrecimiento difuso del tubo o un halo marrn oscuro o
negro alrededor de las colonias en placa.
Controles
I. Positivo: estreptococo del grupo D
II. Negativo: estreptococo no del grupo D
103

Titulo Tolerancia al cloruro Cdigo:
de sodio.
Objetivos 1. Identificar Enterococos
Fundamento Determinar la facultad de un organismo de desarrollar en

presencia de una concentracin de 6.5% de cloruro de sodio.
Muestra Cepa bacteriana
Materiales a) caldo tripticasa soya con cloruro de sodio.

b) asa de siembra
c) mechero de bunsen
d) guantes de ltex
Procedimiento 1. Inocular un caldo tripticasa soya con cloruro de sodio un

cultivo de 18 a 24 hrs. De incubacin.
2. Incubar a 35C por 24 horas
3. Se puede controlar peridicamente y esperar hasta 72
horas.
4. Lectura:
a) Positivo: Presencia de desarrollo bacteriano
b) Negativo: no se objetiva crecimiento en el caldo
5. Controles:
a) Control negativo: E. coli
b) Control positivo: S. aureus
INTERPRETACION
El 95% de los enterococos son esculina positivos y crecen en
medio de 6.5% de NaCl. Cinco al diez % de Estreptococos del
grupo viridans son bilis esculina positivos.
104
X) PRUEBA COMPLEMENTARIA PARA BACILOS GRAM

NEGATIVOS
A) IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS

FERMENTADORES
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae y Enterobacter
Lectura de cultivos en Agar Mac Conkey
En agar Mc Conkey, Escherichia coli lactosa positiva son colonias de borde

entero, de color fucsia, opaco, de 2 mm - 3 mm de dimetro, usualmente
rodeadas de una zona opaca alrededor de la colonia (bilis precipitada). Las
cepas de E. coli que son lactosa negativas dan colonias incoloras de 3 - 4 mm.
En agar Mc Conkey, K. pneumoniae son colonias de borde entero, de color

rosado a rosado oscuro, de 3 - 4 mm de dimetro y mucoide.
En agar Mc Conkey Enterobacter spp. Son colonias de borde entero, de color

rosado de 2 4 mm de dimetro, no tan mucoides como K. Pneumonia.
Las colonias con estas caractersticas son subcultivadas en medios diferenciales.
105
MICROBIOLOGIA
HOSPITAL SANTA ROSA
Titulo Pruebas de metabolismo Cdigo:
Bacteriano
Objetivos Reconocer, diferenciar e identificar las Enterobacterias. (Bacilos
Gram negativos fermentadores )
Fundamento Los microrganismos durante la actividad metablica realizan

una serie de actividades bioqumicas, de las diferentes
reacciones se obtienen la energa que se consume en sntesis,
crecimiento y otras actividades. Los productos formados por
microorganismos durante su metabolismo: cidos, productos
de putrefaccin, toxinas, enzimas, etc.
Se busca demostrar mediante medios de cultivo la utilizacin de
lactosa, utilizacin de glucosa, produccin de gas de glucosa,
descarboxilacin de lisina, produccin de cido sulfhdrico,
utilizacin del citrato, produccin de ureasa, prueba MR- VP,
Motilidad Produccin de indol.

Materiales a) Asa de siembra en punta
b) Medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, Citrato de Simmons,
urea, caldo indol y MR-VP
d) Guantes de ltex
Procedimiento 1. Identificar la colonia sospechosa que se encuentra en la

placa de agar Mac Conkey.
2. Esterilizar al rojo vivo el asa de siembra recta en un
mechero de Bunsen.
3. Enfriar el asa.
106
4. Obtener la colonia seleccionada con el asa recta, tratando de
no tocar el fondo del medio de cultivo ni otra colonia vecina.
5. Sembrar por estra en los medios diferenciales empezando
por el agar citrato, urea (en la superficie), TSI, LIA
(introduciendo el asa por el centro hasta tocar el fondo del
tubo, retirar por el mismo trazo y sembrar en estra la parte
inclinada), caldo para la prueba de indol, MRVP.
6. Sembrar por puntura en el centro del agar movilidad hasta
una profundidad aproximada de 1.5cm.
7. Incubar a 35 37 C de 18 a 24 horas.
Agar TSI
En estos medios se determina la capacidad de la bacteria de

utilizar la lactosa, glucosa y sacarosa (en TSI), con produccin o
no de gas y la produccin de cido sulfhdrico.
Lectura
Es importante hacer la lectura entre las 18 - 24 horas para no
obtener resultados errneos. Se hace sobre la base de tres
caractersticas: Utilizacin de hidratos de carbono, produccin
de gas y produccin de cido sulfhdrico.
Utilizacin de hidratos de carbono:
Utilizacin de lactosa: Reaccin cida en el pico de flauta (color
amarillo) Abreviatura: (A).
Utilizacin de glucosa: Reaccin cida en la columna del medio
(color amarillo) Abreviatura: (A).
No hay utilizacin del carbohidrato: Se puede observar una
reaccin alcalina (color rojo) o que no hay cambio de color
(permanece del mismo color que el medio no inoculado)
Abreviaturas: (K) o (N) respectivamente.
La produccin de gas de glucosa es positiva con la presencia de
una sola burbuja de gas o desplazamiento completo del fondo
del tubo.
La produccin de Acido sulfihidrico (H2S) se manifiesta por un
color negro distribuido por toda la columna del medio.
En ambos casos la lectura es por cruces (+)
107
Controles:
Superficie Fondo
E. coli (lactosa positiva) amarillo/gas
Shigella amarillo/rojo
Salmonella amarillo/negro/gas/rojo
Agar Lisina Hierro
En este medio se determina simultneamente la produccin de

lisina descarboxilasa y de la formacin de cido sulfhdrico
Lectura
Es importante hacer la lectura entre las 18 - 24 horas; si la
lectura se realiza antes podemos obtener resultados falsos
positivos, as como falsos negativos si se lee despus de las
24horas.
Realizar la lectura en la columna y en la superficie inclinada y
observar la formacin de cido sulfhdrico el cual se evidencia
por una coloracin negra.
Controles:
Superficie Fondo
E. coli amarillo/violeta
Proteus mirabilis amarillo/negro/rojo parduzco
Utilizacin de citrato
Algunas bacterias pueden obtener energa por va distinta de

fermentacin de hidratos de carbono utilizando el citrato
como nica fuente de carbono para su metabolismo.
La prueba de utilizacin del citrato (el medio de citrato
Simmons) es positiva si hay viraje del medio hacia el color azul
o si se nota desarrollo aunque no haya viraje de color.
108
Hidrlisis de la urea (produccin de ureasa)
Es til para determinar la capacidad de un organismo de

degradar la urea, formando dos molculas de amoniaco por
accin de la enzima ureasa.
Este efecto se manifiesta debido a la presencia de un indicador
de pH que es el rojo de fenol. Una reaccin positiva confiere
reaccin alcalina al medio, virando el indicador a rosado; si no
ha habido metabolismo de la urea, el medio se queda
amarillento.
Rojo de metilo
Permite comprobar la capacidad del microorganismo para

producir y mantener estables los productos terminales cidos
de la fermentacin de la glucosa determinando
cualitativamente el pH del medio.
Incubar 48 hrs.
El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio
indica que la produccin del acido es suficiente como para bajar
el ph a 4.4.
Prueba Positiva: Color Rojo

Prueba Negativa: Color amarillo o naranja
Control Positivo: E. Coli
Control Negativo: Klebsiella
Voges Proskauer
Es til para determinar la capacidad de algunos

microorganismos de degradar la glucosa hasta
acetilmetilcarbinol (acetona) a travs de un proceso de
fermentacin.
Prueba positiva : Color Rojo

Prueba negativa: Ausencia de color.
Control Positivo: Klebsiella
109
Control Negativo: E. Coli
Motilidad (Medios SIM, o MIO o agar movilidad)
Para determinar si un organismo es mvil o inmvil. Es positivo

cuando migra de la lnea de siembra provocando turbidez y
negativo cuando se observa un crecimiento a lo largo de la lnea
de siembra.
Control Positivo: E. Coli
Control Negativo: Klebsiella
Prueba de indol
Es til para determinar la capacidad de un microorganismo de
producir indol a partir del aminocido triptfano ( presente en
la peptona)
El indol se detecta en el medio observndose el desarrollo del
color rojo (en forma de anillo) luego de aadir un reactivo que
contiene p-dimetilamino benzaldehdo (reactivo de kovac).
110
B) IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS NO

FERMENTADORES
CONDICIONES GENERALES
Los bacilos Gram negativos no fermentadores de glucosas ms comunes aislados en

nuestro medio son Pseudomonas, Acinetobacter y Alcaligenes, se les debe realizar
una prueba de oxidasa y pasarlos al equipo automatizado para su identificacin y
sensibilidad.
Pseudomona aeruginosa es fcilmente reconocida en medios de aislamiento
primario por sus caractersticas:
Morfologa de las colonias, algo extendidas, bordes aserrados y presencia de brillo
metlico .
Pigmento difusible, que puede faltar.
Olor caracterstico.
En las lneas que siguen se tratar sobre la identificacin de P. aeruginosa
Detectada la colonia sospechosa. Realizar las siguientes pruebas:
a) Utilizacin de lactosa
b) Utilizacin de glucosa
c) Prueba de oxidasa
d) Crecimiento a 42 C
e) Utilizacin de citrato
f) Reduccin de nitrato
g) Hidrlisis de la gelatina
Para esto se har uso de las pruebas antes descritas para enterobacterias.
111

Titulo Prueba de hidrlisis de Cdigo:
la gelatina
Objetivos Identificar Bacilos Gram Negativos No Fermentadores
Fundamento Determina la capacidad de un microorganismo de producir

gelatinasas (enzimas de tipo proteoltico) que lican la
gelatina

Materiales a) Gelatina nutritiva pH 6,8
b) Asa de siembra
d) Guantes de ltex
Procedimiento 1. Utilizando una asa de siembra en punta y a partir de un
cultivo puro de 18 a 24 horas coger un inculo abundante
y hacer una puncin en el centro y en forma vertical en el
medio de gelatina hasta una profundidad de 1.5 a 2.5 cm.
2. Utilizar un tubo con medio de gelatina sin inocular como
control de la prueba.
3. Incubar los cultivos en estudio y de control a 22 25 C
por 24 - 48 horas y hacer la lectura.
4. Evaluar diariamente el cultivo durante 14 das.
5. Al trmino de cada perodo de 24 horas colocar el tubo
control y el de estudio en el refrigerador o en un recipiente
con hielo durante 2 horas aproximadamente para
determinar si se ha producido o no la digestin de la
gelatina (licuefaccin).
Controles
Positivo: Serratia marcescens
Negativo: E.coli
Resultados
Positivo: medio de cultivo semilquido
Negativo: medio de cultivo slido
112
X) MEDIOS DE CULTIVO
Son sustancias nutritivas lquidas y slidas que se utilizan para el crecimiento de los
microorganismos. Sus componentes bsicos deben satisfacer las mnimas exigencias
nutricionales para el desarrollo microbiano y vara segn el tipo de bacterias.
Bsicamente los nutrientes de muchos medios de cultivos son: Extractos de carne,
carbohidratos, sales inorgnicas, productos de degradacin protica (gelatina,
albuminosas, peptonas, proteosas), aminoacidos y otras fuentes de nitrgeno como
creatina, carnosina, anserina, purinas. Tambin contienen sales (KCl, H2PO4 y Na Cl).
Factores de crecimiento (tiamina, cido nicotnico, riboflavina, piridoxina, cido
pantotnico).
El Agar es el agente solidificante; este se prepara a partir de una variedad de algas
(gelididium, euchema, pterocladia) en estado seco por procesamiento con agua
caliente, se compone de un polisacarido de cadena larga, tambin sales inorgnicas,
pequea cantidad de protenas, trazas de cidos grasos y minerales como Mg. y Ca.
1) Clasificacin
Los medios de cultivo pueden ser clasificados en:
1. 1 Por su estado fsico en:
a) Slidos cuando contiene entre 1,2 a 1,5% de agar

b) Semislidos, que tienen entre 0,3 a 0,8% de agar
c) Lquidos, llamados caldos, cuya concentracin de agar es 0 a 0,1%
2.1 De acuerdo a su aplicacin en:
a) Medios comunes o simples: que permiten el desarrollo de la mayora de

las bacterias sobre todo las no exigentes, como el caldo peptonado, el caldo
nutritivo o el agar nutritivo.
b) Medios especiales: que se forman a partir de un medio simple y se les

aade diversas sustancias de acuerdo a la finalidad deseada.
113
c) Medios de enriquecimiento: permiten el crecimiento de un mayor
nmero de bacterias, se utiliza cuando el inculo o muestra tiene un nmero
reducido de ellas, ej. caldo tripticasa soya, caldo selenito, medio de
hemocultivo.
d) Medios enriquecidos: cuando se les adiciona sustancias de mayor

contenidos nutritivo como sangre de carnero, sangre de conejo, sangre de
caballo, huevo, extracto de levadura, etc., permitiendo cultivar bacterias que
son exigentes en sus necesidades nutricionales, Ejs.: Agar sangre de carnero
para el desarrollo de Streptococcus; Medio de Ogawa para el aislamiento de
Mycobacterium tuberculosis; Agar chocolate para el crecimiento de Neisseria.
e) Medios selectivos: tienen la finalidad de favorecer el desarrollo de un tipo

de bacterias y al mismo tiempo inhibir el crecimiento de otras. Para esto se les
aade al medio de cultivo sustancias llamadas inhibidores, como pueden ser
las sales biliares, colorantes, sustancias qumicas e inclusive antibiticos.
Ejemplos con el agar SS para el aislamiento de Salmonella y Shigella, Agar
TCBS para el cultivo de Vibrio cholerae, y el agar Mac Conkey donde solo
crecen enterobacterias.
f) Medios diferenciales: son los que permiten identificar y/o clasificar a las
bacterias, observando la actividad del microorganismo frente a uno o ms
substratos y observando su actividad viendo el crecimiento, o el cambio de un
indicador de pH. Ejemplos son el agar Triple Sugar Iron (TSI), el Lysine Iron
agar (LIA) y el agar Citrato de Simmons, que se utilizan en la identificacin de
enterobacterias.
g) Medio de Transporte: se utiliza para trasladar las muestras desde el sitio

de obtencin de la muestra hasta el laboratorio para ser procesado. Ejemplos:
Medio de Amies con Carbn y el medio de Cary y Blair.
En muchas veces, se combinan las caractersticas de cada uno de estos tipos de
medios y tener uno que puede ser, por ejemplo, enriquecido y selectivo a la
vez como el Medio de Thayer Martin, que es un agar chocolate al cual se
aadido un suplemento de antibiticos que permite aislar Neisseria
gonorrhoeae y evitar la flora bacteriana acompaante.
114
2) CRITERIOS DE CALIDAD DE LOS MEDIOS PREPARADOS
Como cualquier reactivo o procedimiento de laboratorio, los medios de cultivo deben

pasar controles de calidad para asegurar que en la preparacin o conservacin de los
medios se han seguido los pasos necesarios para que el producto no sea alterado y
evitar resultados que pueden conducirnos hacia un diagnstico errado. Para eso se
debe utilizar medios de casas comerciales que cumplan normas de calidad, buenas
prcticas de manufactura y una adecuada distribucin que garantice sus productos.
En el laboratorio se debe contar con un programa de control de calidad que es parte
del sistema de aseguramiento de la calidad del laboratorio.
1. Control de calidad de los medios preparados
El laboratorio de microbiologa deber realizar el control de calidad para comprobar si

las caractersticas del medio estn dentro de la especificacin y si la metodologa de
preparacin del medio resulta satisfactoria. Cada lote de medio debera someterse a
un programa mnimo de ensayo que asegure su aceptacin:
a) pH: Comprobar el pH del medio preparado al final cuando este alcance la

temperatura ambiente (25C), que debe coincidir con lo sealado en la
etiqueta.
b) Esterilidad: Se toma una muestra representativa de cada lote, que es

incubado de 2 a 5 das. Despus de la incubacin no debe haber desarrollo
microbiano. Las muestras deben ser descartadas.
c) Capacidad de crecimiento y presencia de reacciones tpicas:

sembrar el medio con cepas conocidas o cepas de referencia como las ATCC.
d) Estabilidad: el medio preparado debe mantener por un tiempo razonable

(dependiendo del tipo de medio) sus caractersticas siempre que se guarde de
una manera apropiada.
Si el medio no rene las condiciones deseadas, se debe anotar la naturaleza del

problema, el mtodo de preparacin, el nmero de lote y la fecha de recepcin
y comunicarse con el departamento de Servicio Tcnico del proveedor.
115
2. Control de calidad de la conservacin de medios preparados
Los medios preparados deben descartarse cuando se observen cualquiera de estas

caractersticas. Es importante investigar porque se han producido pues en algunos
casos se puede remediar en la preparacin de los siguientes lotes.
a) Rajadura de las placas: se han colocado demasiadas placas una encima

de otra o se ha ejercido un aumento de peso sobre ellas.
b) Rajadura en la superficie del medio: medio se ha conservado
demasiado tiempo o ha estado en algn lugar con una temperatura alta.
c) Variaciones en el volumen del medio: el medio se ha secado.
d) Hemlisis: tiempo de conservacin muy prolongado.
e) Cristales en el medio.
f) Presencia de burbujas: contaminacin.
g) Presencia de cogulos de agar: temperatura de plaqueo muy baja.
h) Cambio de color normal.
i) Contaminacin.
j) Falla en la inhibicin de microorganismos saprofitos .
3. Fallas y causas en la preparacin de medios de cultivo:
a) Valor de pH incorrecto:
Medir el pH por encima de los 25C.

Sobrecalentamiento en la esterilizacin, vuelta a fundir o calentamiento
prolongado a50C.
Solucin incompleta del medio.
Mala calidad del agua.
Recipiente mal lavado o con residuos qumicos.
Mala conservacin del medio deshidratado o vencido.
b) Turbidez o precipitacin:
Mala calidad del agua.

Sobrecalentamiento.
pH incorrecto.
116
Solucin incompleta.
c) Oscurecimiento:
Sobrecalentamiento.
Solucin incompleta.
Alteracin del pH.
Foto. Se observa dos tubos de agar lisina hierro de diferentes marcas, una de ellas es de color
violeta mientras que el otro presenta un color rojizo que dificulta la observacin de las reacciones
bioqumicas.
d) Gel blando:
Bajo porcentaje de agar en el medio.

Errores en la pesada del medio deshidratado o en los suplementos.
Sobrecalentamiento.
Mala homogenizacin del medio.
Exceso de agua.
e) Crecimiento bacteriano pobre:

Exceso de calentamiento.
Substancias inhibidoras en el agua o en el recipiente.
Alteracin en el Ph.
FOTO: Conservacin de medios diferenciales en tubos de vidrio con tapn de jebe
117
3) DESCRIPCION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
a) AGAR AZUL DE BROMOTIMOL LACTOSA CISTINA

(BROLACIN O CLED)
1) Aplicacin
Es un medio con lactosa y cistina, deficiente en electrolitos. Se utiliza para el

aislamiento, identificacin presuntiva y recuento del nmero de bacterias en orina;
favorece el crecimiento de todos los MO existentes en orina y proporciona una buena
diferenciacin morfolgica de las distintas colonias.
2) Frmula
Extracto de 2 gr Peptona 7g
carne
L-cistina 0.28g Estracto de levadura 2g
Lactosa 10 Azul de bromotimol 0.03g
Agar 12g
pH final = 7.3 aprox. a 25 C
3) Preparacin
1. Se suspenden 33g en un litro de agua destilada y se hierve hasta disolver el

medio completamente.
2. Se esteriliza en la autoclave a 121C durante 15 minutos. Se mezcla bien antes
de verter en placas.
3. Las placas con medio son de color azul verdoso y claras.
4. Marcar las placas con BR o CLED
4) Fundamento
El medio favorece el crecimiento de las bacterias existentes en orina por no contener

sustancia sin hibidoras y por los nutrientes que contiene. La lactosa permite
diferenciar organismos fermentadores de lactosa, que al degradarla viran el indicador
de azul verdoso a amarillo; las lactosa
118
Negativas alcalinizan el medio produciendo un viraje a verde o azul intenso. La
deficiencia de electrolitos del medio evita el crecimiento en velo o "swarming" de
especies de Proteus. El crecimiento de Streptococcus se puede visualizar si se aade
suero o plasma al medio.
5) Interpretacin:
Se realiza a las 18 a 24 h. de incubacin a 37 C. Teniendo en cuenta que las bacterias

lactosa positivas dan colonias amarillas y las lactosa negativas son azules; los
estreptococos yStaphylococcus dan colonias amarillas pequeas.
6) Control de calidad
Cepas de Ensayo % de Viraje

recuperacin
Escherichia coli >70% Amarillo
Proteus mirabilis >40% Azul
Pseudomonas aeruginosa >70% Azul
Staphylococcus aureus >70% Amarillo
119
b) AGAR CHOCOLATE
1) Aplicacin
Para el aislamiento de microorganismos exigentes. Es efectivo para el aislamiento de

Neisseria y con adicionamiento de ciertos suplementos (por ej. Suplemento B ver
Medio de Thayer-Martin y/o agar Columbia) para el crecimiento de Haemophilus
influenzae.
2) Frmula
Se utiliza como base cualquier agar nutritivo sin inhibidores: por ej. Agar tripticasa
soya, Agar Columbia base, Medio GC base, Agar Brucella, etc. al cual se le adiciona 5%
de sangre desfibrinada estril.
3) Preparacin
1. Disolver y esterilizar el medio base segn sea el caso.

2. Enfriar hasta 50 a 60C y agregar 5-10% de sangre desfibrinada estril de carnero.
3. Colocar en un bao Mara a 75 a 80C y mantener a esta temperatura por 10 a 20
minutos agitando constantemente.
4. El medio va a cambiar a un tono pardo (chocolate).
5. Enfriar hasta 50C.
6. Repartir en placas o tubos segn se desee.
7. Marcar los tubos o placas con CHOC
4) Fundamento
El medio base no tiene inhibidores por lo que permite el crecimiento de cualquier

microorganismo. Para lograr el crecimiento de microrganismos que necesitan factor X
(hematina) y factor V (NAD) se hace hemolizar a los eritrocitos por accin del calor,
para que se libere estos factores al medio. La adicin de suplementos o aditivos
enriquecen ms an el medio, de acuerdo al fin buscado. Opcionalmente, la adicin de
suplementos antibiticos inhibe la flora acompaante no deseada. La temperatura del
bao mara no debe exceder los 80 C porque si no el agar pierde los factores
nutricionales.
120
Cepas de Ensayo Recuperacin del agente

Neisseria Gonorrhoeae Buena
Neisseria meningitidis Buena
Haemophilus influenzae Buena
121
c) AGAR CITRATO DE SIMMONS
1) Aplicacin
Para la diferenciacin e identificacin de Enterobacteriaceas sobre las bases de

utilizacin del Citrato como nica fuente de Carbono.
2) Formula
Sulfato de magnesio 0,2 g Fosfato amnico de 0,8 g

sodio
Fosfato de amonio 0,2 g Citrato de sodio, 2g
dihidrato tribsico
Cloruro de sodio 5g Azul de Bromotimol 0,08 g
Agar 15 g
pH final: 6.8
3) Preparacin
1. Se suspende 23 g en 1 L de agua destilada

2. Hervir hasta disolver el medio por completo.
3. Distribuir 2.5 ml. en tubos de 12 x 75 con tapn de algodn.
4. Esterilizar en la autoclave a 121C durante 15 minutos y 15 lb de presin.
5. Dejar enfriar los tubos en forma inclinada de tal manera que se obtenga un buen
plano inclinado y poco fondo.
6. Cambiar los tapones de algodn por tapones de jebe.
7. El medio preparado es verde.
8. Marcar los tubos con CIT
4) Fundamento
Organismos que son capaces de utilizar el citrato (como nica fuente carbonada)
pueden crecer en este medio. La degradacin del Citrato da lugar a la alcalinizacin
del medio de cultivo el medio, el cual vira a un color azul oscuro por el indicador Azul
de Bromo timol.
122
Cepas de ensayo Color del medio Recuperacin

Enterobacter Azul Bueno
aerogenes
Escherichia coli Verde Crecimiento Inhibido
Shigella flexneri Verde Crecimiento Inhibido
123
d) AGAR LISINA HIERRO (LIA)
1) Aplicacin
Este medio, basado en la decarboxilacin y desaminacin oxidativa de la lisina, la

fermentacin de la glucosa y la formacin de sulfuros, se usa para diferenciar las
especies de Salmonella y Shigella de especies de Citrobacter.
2) Frmula (en gramos por litro)
Peptona de gelatina 5g Extracto de levadura 3g

Glucosa 1g Lisina 10 g
Citrato de hierro y 0,5 g Tiosulfato de sodio 0,04 g

amonio
Prpura de bromocresol 0,02 Agar 13 g
g
pH final: 6.7 0.2
3) Instrucciones
1. Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar

embeber unos 15 minutos.
2. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto
hasta la disolucin completa.
3. Distribuir 2,5 ml en tubos de 13 x 100 con tapa rosca.
4. Esterilizar a 121C durante 15 minutos con las tapas parcialmente abiertas.
5. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la puncin.
6. Marcar los tubos con LIA
4) Fundamento
La lisina presente en el medio es decarboxilada a cadaverina y dixido de carbono; en

el proceso interviene la lisina decarboxilasa y el medio aumenta de pH haciendo virar
el indicador hacia el prpura, en la totalidad del tubo. En aquellas cepas en que el
proceso es de desaminacin (Proteus, Providencia, Morganella spp.) se produce un
124
color rojo sobre el pico de flauta, por el uso de las peptonas. Los organismos que no
decarboxilan la lisina, producen una zona alcalina en la zona inclinada y una zona
cida en el fondo del tubo. El hidrgeno sulfurado producido ennegrece el medio.
Siembra Por puncin profunda con aguja de inoculacin.

Incubacin 24 horas a 35C.
BACTERIA REACCIOON INDOL
Shigella flexneri K/A -

Salmonella paratyphi B K/K -
Proteus mirabilis R/A -
Escherichia coli K/K +
125
e) AGAR MAC CONKEY
1) Aplicacin
Para aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos y diferenciacin entre

enterobacterias fermentadoras y no fermentadoras de la lactosa. Se usa tambin para
el recuento de coliformes y para aislamiento de bacterias patgenas en agua, aguas
residuales, productos alimenticios, etc.
2) Frmula
Peptona 17 g Proteosa peptona 3g

Lactosa 10 g Sales Biliares 1.5 g
Cloruro de Sodio 5g Rojo Neutro 0,03 g
Cristal Violeta 0.001 g Agar 13,5 g
pH final = 7.1
3) Preparacin
1. Se suspende 50 g en 1 L de agua destilada.

2. Se hierve hasta disolver por completo.
3. Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 minutos y 15 lb de presin.
4. Se deja enfriar hasta 50 a 55 C y se distribuye en placas.
5. La superficie de las placas debe estar seca antes de sembrar.
6. El medio preparado es claro y de color rojo parduzco.
7. Marcar los tubos o placas con MC
4) Fundamento
Las colonias que fermentan la lactosa producen una acidificacin del medio, lo cual
hace que el indicador Rojo Neutro acte impartiendo un color rojo a la colonia. Las
que no fermentan la lactosano varan de color y por lo tanto las colonias se apreciarn
incoloras. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el crecimiento de bacterias
Gram positivas.
126
Cepas de ensayo Color de Recuperacin

colonias
Escherichia coli ATCC 25922 Rojas Buena
Shigella sonnei Incoloras Buena
Staphylococcus aureus ATCC Nula
25923
127
f) AGAR MANITOL SALADO
1) Aplicacin
Es un medio selectivo recomendado por Chapman para el aislamiento de

estafilococos presuntamente patgeno a partir de alimentos y muestras clnicas. En
muchos laboratorios es llamado tambin como Medio Hipertnico o Agar manitol sal
rojo de fenol.
2) Frmula
Extracto de carne 1g Peptona 10 g

d-Manitol 10 g Cloruro de sodio 75 g
Agar 15 g Rojo de fenol 0.025 g
pH final: 7.4 0.2
3) Preparacin
1. Suspender 111 g de polvo por litro de agua destilada.

2. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos.
3. Distribuir y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.
4. Distribuir en placas o en tubos anchos (18 x 150 o mayores)
5. Marcar como MS.
4) Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. Los

estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las
colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos
coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura. Las
colonias sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso de cloruro de sodio para
efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.
128
Cepas de ensayo Color de Recuperacin

colonias
Staphylococcus aureus Amarillas Exelente
Staphylococcus epidermidis Rojas Escaso-bueno
Escherichia coli -- No crece
Vibrio parahaemolyticus Amarillas Exelente
129
g) AGAR SABOURAUD GLUCOSA 4%
1) Aplicacin
Medio utilizado para el cultivo y diferenciacin de hongos, proporciona un medio

favorable en pH y contenido de glucosa, los hongos crecen fidedignamente
manteniendo sus estados culturales descritos por Sabouraud.
2) Frmula
Neopeptona 10 g Dextrosa 40 g
Agar 15 g
pH final= 5.6 aprox .
3) Preparacin
1. Se suspende 65 gramos en 1 litro de agua destilada

2. Se hierve hasta disolver el medio por completo.
3. Se esteriliza en autoclave a 121C durante 15 minutos y 15 libras de presin.
4. Se distribuye en placas o tubos
5. El medio preparado es mbar ligeramente opalescente.
6. Marcar los tubos o placas con SAB
4) Fundamento
Para el aislamiento primario utilizado en micologa, el contenido de glucosa y el pH

que ofrece el medio son favorables para el crecimiento de los diferentes hongos,
levaduras y mohos.
Cepas Recuperacin
Aspergillus niger Bueno a excelente
Candida albicans Bueno a excelente
Lactobacillus casei Bueno a excelente
Saccharomyces cerevisiae Bueno a excelente
130
h) AGAR SANGRE
1) Aplicacin
Es un medio no selectivo, para fines generales, especialmente el aislamiento de

organismos exigentes; la adicin de sangre permite determinar si el organismo es
hemoltico o no.
2) Frmula
Agar tripticasa soya, 1L Sangre 50 -100 mL

agar Columbia, o base desfibrinada de
de agar sangre carnero
pH final: 6.8 aprox.
3) Preparacin
1. Disolver agar en cantidad suficiente para un litro de agua destilada

2. Calentar hasta disolver completamente
3. Esterilizar en autoclave por 15 min. a 121 C y 15 lbs. De presin.
4. Enfriar hasta 45 o 50 C
5. Aadir 5 a 10 % de sangre de carnero desfibrinada estril, mezclar bien.
6. Verter en placas.
7. El medio con sangre es del color de la misma y no hemolizado.
8. Marcar las placas con AS
4) Fundamento
Es un medio sin inhibidores por lo que puede crecer cualquier microorganismo, la

adicin de sangre lo hace un medio enriquecido para el crecimiento de
microorganismos exigentes y para la determinacin de hemlisis. El pH ligeramente
cido favorece la conservacin de los eritrocitos, las reacciones hemolticas y el
crecimiento de ciertos microorganismos como estreptococos y neumococos. El medio
no debe tener glucosa porque esta inhibe el desarrollo de hemlisis.
131
Cepa de ensayo Recuperacin Hemolisis

Staphylococcus aureus Buena Variable
Streptococcus pyogenes Buena Beta
Streptococcus Buena Alfa
pneumoniae
132
i) AGAR SANGRE AZIDA
1) Aplicacin
El medio es utilizado para el aislamiento de estreptococos y estafilococos. El medio se

puede utilizar con o sin sangre.
2) Frmula
Agar 15 g Extracto de carne 3g

Triptosa 10 g Azida de sodio 0.2 g
Cloruro de sodio 5g
pH final: 7.2
3) Preparacin
1. Se suspende 33 gramos en un litro de agua destilada.

2. Se hierve hasta disolver completamente.
3. Se esteriliza en autoclave a 121C por 15 minutos y a 15 libras de presin.
4. Si se desea aadir sangre, se enfra el medio a 50C y se aade sangre desfibrinada
de carnero a una concentracin final del 5%.
5. El medio preparado es de color rojo cereza.
6. Marcar las placas con AZ o en el caso de usar sangre con AS Az
7. Si se cuenta con azida de sodio, se puede pesar 0,2 g y colocarlo en tubos para
aadirlos a un litro de agar tripticasa soya, obtenindose un medio similar. La azida
de sodio es txica, por lo que debe manejarse con cuidado siguiendo las indicaciones
de la hoja MSDS.
4) Fundamento
Este medio permite el crecimiento de microorganismos exigentes. La azida inhibe a la

flora Gram negativa, en tanto que la flora Gram-positiva se desarrolla ms o menos
indemne. La adicin de sangre al medio favorece la interpretacin de hemlisis.
133
Cepa de ensayo Crecimiento Hemolisis

Streptococcus pyogenes Excelente Beta
Streptococcus Excelente Alfa
pneumoniae
Enterococcus faecalis Excelente Alfa/Gama
Staphylococcus Excelente Gama
epidermidis
Escherichia coli ATCC Nulo
25922
134
j) AGAR SS (SALMONELLA SHIGELLA)
1) Aplicacin
Es un medio diferencial y selectivo para aislamiento de Salmonella y Shigella a partir

de heces, alimentos y otros.
2) Frmula
Extracto de carne 5g Proteosa peptona 5g

Lactosa 10 g Sales biliares 8.5 g
Citrato sdico 8.5 g Tiosulfato sdico 8.5 g
Citrato frrico 1g Verde brillante 0.33
g
Rojo neutro 0.025g Agar 13.5
g
pH final: 7.0
3) Preparacin
1 Suspender 60 g en 1 L de agua destilada

2 Calentar hasta disolver.
3 NO SE DEBE AUTOCLAVAR.
4 Verter a placas.
5 Las placas con medio son color rojo cereza.
6 Marcar las placas con SS
4) Fundamento
La bilis de buey, el verde brillante y la elevada concentracin de tiosulfato y citrato

inhiben la flora acompaante (Gram + y algunos coliformes) permitiendo el
crecimiento de Salmonella y Shigella. Con el tiosulfato e iones de hierro se evidencia
la formacin de H2S con el consecuente ennegrecimiento de la colonia. Los coliformes
que fermentan la lactosa viran el pH a cido y por el indicador rojo neutro se aprecian
colonias rojas. Shigella, Salmonella y otros no fermentadores de lactosa producen
colonias transparentes. Las colonias lactosa negativas son incoloras y las lactosa
positivas son rosadas hasta rojas.
135
Cepas de ensayo Color de Centro Recuperacin

colonias negro
Escherichia coli Rojo No Mala
Shiguella flexneri Incoloras No Buena
Salmonella enteritidis Incoloras Si Buena
Salmonella typhi Incoloras Si Buena
Salmonella paratyphi A Incoloras No Buena
Staphylococcus aureus Incoloras Ausente
136
k) AGAR TRIPTICASA SOYA (TSA)
1) Aplicacin
Es un medio de uso frecuente y general, utilizado como base frecuente del agar
sangre. La bondad del medio es que pueden crecer tanto aerobios como anaerobios, el
medio carece de inhibidores, por eso se utiliza para el cultivo de una gran variedad de
microorganismos.
2) Frmula
Triptona 15 g Peptona de Soya 5g

Cloruro de sodio 5g Agar 15 g
pH final = 7.3
3) Fundamento
El medio carece de inhibidores, el contenido de peptonas favorece el crecimiento de

una gran variedad de microorganismos
4) Preparacin
1. Se suspenden 40 gramos en 1 litro de agua destilada

2. Se hierve hasta disolver el medio por completo.
3. Se esteriliza en la autoclave a 121 C por 15 minutos.
4. Distribuir en placas o tubos
5. Marcar los medios con TSA
6. El medio preparado es de color blanquecino nacarado.
137
5) Control de Calidad
Cepas de ensayo Crecimiento Crecimiento con Hemlisis

sin 5%
sangre sangre de carnero
Neisseria Excelente Excelente Ninguna
meningitidis
Staphylococcus Excelente Excelente Beta
aureus
Streptoccoccus Regular Excelente Alfa
pneumoniae
Streptococcus Regular Excelente Beta
pyogenes
138
l) AGAR TSI (TRIPLE SUGAR IRON)
1) Aplicacin
Medio empleado para la clasificacin de enterobacterias que permite investigar la

capacidad de fermentar glucosa, lactosa, sacarosa y detectar la presencia de
hidrgeno sulfurado.
2) Formula
Extracto de 3g Peptona 20 g
carne
Cloruro de sodio 5g Glucosa 1g
Lactosa 10 g Sacarosa 10 g
Sulfato de hierro 0.2 g Tiosulfato de 0.2 g
y amonio sodio
Rojo de fenol 0.025 g Agua destilada 1L
pH final: 7,3 0.2
3) Instrucciones
1. Suspender 62,5 g del polvo en un litro de agua destilada.

2. Calentar a ebullicin hasta completa disolucin.
3. Distribuir en tubos 13 x 100 con tapa rosca o con tapn de algodn
4. Esterilizar en la autoclave por 15 minutos a 121C.
5. Enfriar dejando un fondo de 2 cm con un plano inclinado corto.
6. El medio es de color rojo
7. Marcar los tubos con las iniciales TSI
4) Fundamento
La fermentacin de los azcares da lugar a una produccin de cido, que se detecta

por medio del indicador rojo de fenol, los cambios de color al amarillo por una
acidificacin y a rojo por una alcalinizacin. La menor concentracin de glucosa
(0,1%) hace que el cambio sea leve y solo se produzca el cambio en el fondo del tubo,
mientras que al estar la lactosa y la sacarosa en mayor concentracin el cambio a
139
acidez se ve en fondo y en el plano inclinado. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro
de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico
sulfuro de hierro de color negro.
Cepas de Fondo Plano Gas H2S

ensayo
Escherichia A inclinado 2+ -
coli
Shigella K A - -
flexneri
Proteus K A - -
mirabilis
Pseudomonas K A - -
aeruginosa
140
m) AGAR UREA SEGN CHRISTENSEN
1) Aplicacin
Para la diferenciacin de bacterias productores de ureasa (degradadores de urea).
2) Frmula
Peptona 1g Dextrosa 1g
Cloruro de 5g Fosfato 2g
Sodio monopotsico
Rojo de fenol 0.012g Urea 15 g
Agar 15 g
pH final: 6,8
3) Preparacin del medio:
1. Se disuelve 29 g de la base de agar urea (que tiene todos los componentes de la

frmula menos el agar) en 100 ml de agua destilada
2. Se esteriliza por filtracin.
3. Aparte, se disuelve 15 g de agar en 900 ml de agua destilada estril.
4. Se esteriliza el agar en autoclave por 15' a 121C.
5. Se enfra a 50-55C y aspticamente se le agrega los 100 ml de concentrado de la
base de agar urea.
6. Se mezcla bien y se distribuye 1,5 a 2 ml. en tubos estriles 12 x 75.
7. Se inclina los tubos en pico de flauta (aprox. 0,5 cm de profundidad y 1cm de
pendiente).
8. El medio de cultivo es claro y de color amarillo-naranja.
9. Se marcan los tubos con AU
10. Se taponan los tubos y se guardan en refrigeracin.
4) Fundamento
La urea es desdoblada por la enzima ureasa producida por ciertos microorganismos,

formando dixido de carbono y amoniaco, este ltimo alcaliniza el medio lo que se
141
comprueba por el viraje de amarillo a rojo-prpura por el indicador rojo de fenol. El
agar urea (segn Christensen) es menos tamponado a comparacin del caldo rea
(fuertemente tamponado) por lo que puede detectar no slo microorganismos
potentes formadores de ureasa (como Proteus) sino tambin los formadores dbiles
como Klebsiella, Enterobacter, ciertos micrococos, etc.
Cepas de ensayo Hidrlisis de la urea Crecimiento

Escherichia coli No - Amarillo Bueno
Klebsiella Si Rojo lento Bueno
pneumoniae
Proteus vulgaris Si Rojo rpido Bueno
142
n) CALDO TRIPTICASA SOYA (TSB)
1) Aplicacin
El medio es utilizado como caldo de enriquecimiento por la gama de nutrientes que

posee; es muy utilizado para recuperar aquellos microorganismos que se tengan poco
inculo.
2) Frmula
Triptona (digerido 17 g Soytona (digerido 3 g

pancretico de papaico de soya)
caseina)
Cloruro de sodio 5g Fosfato de potasio 2.5 g

dibsico
Dextrosa 2.5 g
pH final: 7.3
3) Preparacin
1. Se aade 30 gramos a 1 litro de agua destilada.

2. Se mezcla bien y se distribuye en los recipientes definitivos.
3. Se puede colocar 2,5 ml. en tubos 12 x 75 con tapn de algodn
4. Se esteriliza en la autoclave a 121C durante 15 minutos.
5. Se marcan los tubos con TSB
4) Fundamento
El medio contiene una muy buena gama de nutrientes lo que lo hace un buen
enriquecedor y recuperador de bacterias que se encuentran en pocas cantidades
como es en el caso de los hemocultivos. El caldo presenta una buena base para la
adicin de diferentes agregados para la recuperacin de bacterias aerobias como
anaerobias de diferentes tipos de muestras.
143
Cepas de ensayo Recuperacin

Neisseria meningitidis Bueno
Streptococcus pneumoniae Bueno
Streptococcus pyogenes Bueno
Staphylococcus epidermidis Exelente
144
o) MEDIO DE MUELLER HINTON
1) Aplicacin
Es un medio que no posee inhibidores, por lo cual crece todo tipo de bacterias. El
medio es utilizado en los antibiogramas y para el aislamiento de especies patgenas
de Neisseria.
2) Frmula
Infusin de carne 300 g

Casamino cidos 17.5 g
pH final: 7.4
1. Se suspenden 38 g en 1 L de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio por

completo.
2. Se esteriliza por autoclave a 121C durante 15 minutos.
3. Se distribuye en placas en cantidad suficiente para que de una profundidad de
aproximadamente 4 mm.
4. El medio preparado es mbar claro ligeramente opalescente.
5. Marcar las placas con pH.
4) Fundamento
El medio no posee inhibidores, la inclusin de almidn asegura que los factores

txicos que se encuentran durante el crecimiento sean absorbidos, siendo su
presencia a menudo esencial para que se establezca el crecimiento a partir de
inculos muy pequeos.
Se debe utilizar el mismo tipo de placas y determinar la cantidad de medio necesario
para obtener la profundidad de medio necesaria.
145
Cepas de ensayo Crecimiento

Escherichia coli ATCC Excelente
Staphylococcus aureus Excelente
Pseudomonas aeruginosa Excelente
Neisseria meningitidis Excelente
Por las caractersticas del uso de este medio necesita pruebas adicionales en el control
de calidad
pH Utilizar un potenciometro, 7,4

0,1
Medir la profundidad del agar Debe ser de 4 0,5 mm
Evaluar el nivel de timidina Crecimiento de E. faecalis ATCC
29212 con
disco de SXT
Evaluar concentracin de Ca y Mg Crecimiento de P. aeruginosa ATCC
27853 con
146
p) MEDIO DE TRANSPORTE DE CARY Y BLAIR
1) Aplicacin
El medio de Cary-Blair es un medio de transporte semislido para muestras clnicas,

sobre todo cuando se tenga que transportar hisopos rectales a un laboratorio de
diagnstico. Para recoger la muestra se usan hisopos de madera con punta de
algodn, se toma la muestra y se introduce el hisopo en el tercio inferior del medio, se
rompe la varilla de manera que cuando se apriete el tapn de rosca el hisopo se
encuentre en el fondo del medio; luego se cierra fuertemente el tapn del frasco.
2) Frmula
Fosfato disdico 1.1 g Tioglicolato de 1.5 g

sodio
Cloruro de 5g Cloruro de calcio 0.09 g
sodio
Agar 6g
pH final: 8.4
1. Se suspenden 12.7 g en 1 L de agua destilada y se calienta hasta disolver el medio

completamente.
2. Se distribuye 5 mL en tubos 13 x 100 con tapa rosca.
3. Se esterilizan en autoclave a 121C por 15'.
4. Se deja que enfren y se aprietan los tapones de rosca para impedir la desecacin.
Se puede utilizar tambin viales con tapa de jebe.
5. Se marcan los tubos con CB.
4) Fundamento
El bajo contenido nutritivo del medio y el uso de fosfato como buffer en el medio
impide el sobre crecimiento de las enterobacterias. El bajo potencial de oxido-
reduccin del medio asegura una supervivencia bacteriana durante buen tiempo.
Existen diversas modificaciones, esta es la que utiliza la marca DIFCO, que puede ser
esterilizada en la autoclave, mientras que otras formulas son ms difciles de preparar
y solo se calientan en Bao Mara, lo que no garantiza una esterilizacin adecuada.
147
q) MEDIO SIM (SULFURO, INDOL, MOVILIDAD)
1) Aplicacin
Este medio sirve para ver la produccin de sulfuro de hidrgeno, la movilidad y la

produccin de indol a partir de triptfano.
2) Frmula
Peptona 20 g Extracto de 3g
carne
Citrato de 0.2 g Tiosulfato de 0.2 g
amonio y hierro sodio
(II)
Agar 3g
pH final: 7,3
3) Preparacin
1. Se suspenden 26,4 g en 1 L de agua destilada y se hierve hasta disolver el medio

por completo.
2. Se distribuye en 3 ml. en tubos 12 x 75
3. Se esteriliza en la autoclave a 121 C durante 15 min. y 15 lbs. de presin.
4. El medio preparado es claro y de color amarillo.
5. Se marcan los tubos con SIM.
4) Fundamento
El medio combina tres tipos de prueba: movilidad, para ello utiliza un medio
semislido con un poco concentracin de agar; la produccin de sulfuro de hidrgeno
a partir de la degradacin del sulfato, lo que da lugar a sulfuro ferroso (al combinarse
con el hierro) que se forma a lo largo del inoculo, o en partes del medio donde se ha
movilizado la bacteria (color negro); la produccin de indol a partir del triptofano
(de la peptona) del medio, da como resultado un color rojo al adicionar reactivo de
Kovacs, de Ehrlich o de Gilles.
148
Cepas de ensayo H2S Movilidad Indol
Escherichia coli - + +
Klebsiella - - -
pneumoniae
Proteus + + -
mirabilis
Proteus + + +
vulgaris
149
r) ESTANDAR DE TURBIDEZ - ESCALA DE Mc FARLAND
1) Aplicacin
Este es un patrn de turbidez muy utilizado en la pruebas de susceptibilidad

antibitica (tubo 0,5), en algunas pruebas de identificacin semiautomatizada y en la
preparacin de antgenos para inoculacin de animales.
2) Reactivos
1. Solucin de cloruro de bario 0,048 M p/v: Pesar 1,175 g de BaCl2.2H2O, Colocar

en una fiola de 100 ml y aadir agua destilada c.s.p. 100 ml.
2. Solucin de cido sulfrico 0,18 M v/v: Medir 1 ml de cido sulfrico Q.P., Colocar
en una fiola de 100 ml y aadir agua destilada c.s.p. 100 ml.
3) Preparacin
1. Aadir las cantidades que se indican en la tabla para conseguir el patrn que se
necesita:
Tubo Cloruro de Acido Equivalente Densidad

barrio Sulfrico de millones ptica a 625
1% de bacterias nm.
X ml.
0.5 0.05 9.95 150 0,08 - 0,1
1 0,1 9,9 300 0,16 - 0,2
2 0.2 9,8 600 0,32 - 0,4
3 0.3 9,7 900 0,48 - 0,6
4 0.4 9,6 1200 0,64 - 0,8
5 0.5 9,5 1500 0,8 - 1
6 0.6 9,4 1800
7 0.7 9,3 2100
8 0.8 9,2 2400
9 0.9 9,1 2700
10 1.0 9,0 3000
150
2. Si solo se va a preparar el estndar 0,5: Retirar con una pipeta 50 l de 10 ml. de la
solucin de cido sulfrico, aadir 50 l de la solucin de cloruro de bario y mezclar
bien.
3. Si se cuenta con un espectrofotmetro, verificar la densidad correcta del estndar,
cuya absorbancia a 625 nm debe ser la indicada en la tabla.
4. Colocar la solucin preparada en los tubos que se van a utilizar para comparacin,
sellarlos y etiquetarlos indicando el tipo de solucin, la fecha de preparacin y la
fecha de expiracin (6 meses).
5. Guardar los tubos en oscuridad a temperatura ambiente.
6. El tubo de uso rutinario se debe utilizar durante un mes para luego descartarlo y
usar otro del stock.
7. Existen estndares preparados comerciales que estn compuestos por agua ultra
pura que contiene microesferas de styrene di-vinyl benzene en tubos de borosilicato.
151
XI) COLORACIONES
A ) Mtodo rpido: GRAM
Reactivos.-
1. Cristal violeta
Cristal violeta _ 10 gr.
Alcohol metlico absoluto _ 500 ml.
2. Solucin Yodo
Cristales de Yodo _ 6 gr.
Yoduro potasio _ 12 gr.
Agua destilada _ 1,800 ml.
3. Alcohol Acetona
Acetona _ 400 ml.
Alcohol etlico _ 1,200 ml.
4. Safranina
Safranina _ 10 gr.
Agua destilada _ 1000 ml.
Tcnica:
1. Preparar un frotis delgado.
2. Fijar la lmina con el mechero.
3. Cubrir la lmina con cristal violeta. 10 segundos. Lavar.
4. Cubrir con Yodo. 10 segundos. Lavar.
5. Decolorar con alcohol-acetona. Lavar INMEDIATAMENTE.
6. Cubrir con saframina. 10 segundos. Lavar.
7. Secar.
8. Examinar la lmina con aceite de inmersin 100x.
152
B) Coloracin de Kinyou, para bacilos Alcohol-Acido-Resistentes:
Fundamento: Los grmenes que se tien con fucsina y resisten a decolorantes
potentes como el alcohol - cido, se denominan alcohol - cido resistentes, mientras
que otros se decoloran y se tien posteriormente con el colorante de contraste azul
metileno.
Reactivos:
1. Kinyou
Fucsina bsica _ 40 gr.
Cristales de fenol _ 80 gr.
Alcohol etlico 95 _ 200 ml.
H2O destilada csp. _ 1000 ml.
Filtrar antes de usar.
2. Alcohol cido
cido clorhdrico qp. _ 30 ml.
Alcohol corriente csp. _ 1000 ml.
3. Azul metileno
Solucin madre: Disolver aproximadamente 50 gr. de colorante
en 1000 ml. de alcohol sdico de 95, hasta que se sature la
solucin.
Solucin trabajo: Solucin madre _ 100 ml.
H2O destilada 1000 ml.
Tcnica:
1. Calentar la lmina y aplicar el colorante de Kinyou x 5 min.
2. Lavar con agua.
3. Decolorar con alcohol cido (hasta que no quede colorante Kinyou).
4. Aadir al frotis Azul metileno x 5 min.
5. Lavar.
6. Observar con aceite de inmersin.
153
C) Coloracin Wayson (morfologa)
Fucsina bsica _ 0,2 gr.
Azul metileno _ 0,75 gr.
Alcohol etlico _ 20,9 ml.
Fenol 5% en agua _ 200 ml.
Teir el frotis x 15 seg.
D) Coloracin de azul de metileno (morfologa)
Es excelente para la observacin de la morfologa de las bacterias particularmente

gonococos, bacilos deftricos y el examen de lquido cfalo raqudeo.
Reactivo:
Azul de Metileno 3g
Teir el frotis x 5 min.
E) Coloracin para Campylobacter:

Reactivos:
1. Safranina
Safranina _ 0,5 gr.
2. Violeta de genciana
I. Violeta de genciana _ 10 gr.
II. Sol. Saturada de Violeta de genciana
Violeta de genciana _ 10 gr.
Alcohol absoluto _ 100 ml.
154
Solucin trabajo: Solucin saturada _ 100 ml.
Agua destilada csp _ 1000 ml.
Tcnica:
1. Fijar con el mechero (frotis delgado)
2. Colorear con:
a) Safranina _ 2 min.
Lavar
b) Violeta genciana _ 3 min.
Alternativa:
Fucsina 1% - 10 seg.
Observar al microscopio con lente de inmersin.
F) Coloracin para Criptosporidium

Reactivos:
1. Metanol
2. Hidrxido de sodio
Hildroxido de sodio 1N
40 gr. _ 1000 ml. de agua destilada.
3. Colorante Ziehl Neelsen
Fucsna bsica _ 0,3 gr.
Alcohol etlico _ 10 ml.
Fenol _ 5 gr.
4. Azul metileno
155
Tcnica: Frotis ligeramente grueso
1. Fijar con metanol _ 1 min.
2. Lavar.
3. Solucin Hidroxido Na 1N _ 1min.
4. Lavar
5. Ziehl Neelsen (flamear 3 veces con el mechero x 5 min.)
6. Lavar
7. Decolorar con alcohol cido
8. Lavar
9. Azul metileno 5 min.
10. Lavar
11. Observar con lente de inmersin.
G) Coloracin de Wright
Principio: Coloracin diferencial de material basfilo y acidfilo.
Reactivos:
Wright _ 2 gr.
Alcohol metlico _ 1000 ml.
Agua temperada aproximadamente pH 7
Preparacin:
Disolver el colorante en un mortero, echando el alcohol a pocos, triturar bien por 20-
30 minutos, hasta verter todo el alcohol. Guardar por un da en frasco oscuro; filtrar
antes de usar, almacenar siempre en frasco oscuro.
156
Tcnica: (L.C.R.)
1. Wright _ 1min.
2. Agua tamponada _ 3 min.
Lavar.
Dejar secar.
3. Lectura con aceite de inmersin.
H) Coloracin Giemsa
Aplicacin: Deteccin de parsitos en sangre, viral , inclusiones en Chlamydias,
Pneumocystis carinii.
Reactivos:
Giemsa polvo _ 600 mg.
Metano (libre de acetona) _ 50 ml.
Glicerina neutra _ 50 ml.
Preparacin:
En un mortero pulverizar porciones del colorante aadiendo glicerina e ir vertiendo
en un matraz de 100 ml., hasta disolver todo el colorante. Tapar el matraz con
algodn y papel.
Colocar en bao mara de agua 60C x 2 hrs. Agitando cada 20 min. Enfriar y aadir
el metanol, guardar en frasco oscuro. Dejar madurar por 2 semanas y filtrar antes de
usar.
157
I) Coloracin Directa para Campylobacter
Tcnica:
1. Fijar con el mechero (frotis delgado del moco preferentemente)
2. Colorear con:
a) Safranina _ 2 min.
Lavar
b) Violeta genciana _ 3 min.
Alternativa:
Fucsina 1% - 10 seg.
Lavar y dejar secar
3.- Observar al microscopio con lente de inmersin, objetivo de 100x
Informar: se observan bacilos de morfotipo compatible con Campylobacter spp.
J) Tcnica: (Leucocitos - reaccin inflamatoria)
1. Wright _ 5 min.
2. Agua tamponada _ 10 min.
Lavar.
Dejar secar.
Alternativa
Azul de Metileno 4 minutos
Lavar y dejar secar
3,- Lectura con objetivo de 40x
Informar: nmero de leucocitos por campo
158
ANEXO
FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA UROCULTIVO
Recepcin de la Determinacin de agente

muestra bacteriosttico
Siembra en agar Sangre y Mc Centrifugar, leer sedimento y

Conkey coloracin GRAM
Incubacin por 24 horas a

35 37 C Validacin y reporte
de los resultados
Identificacin del patgeno

Validacin y reporte
de los resultados
Suceptibilidad
antimicrobiana
159
FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA CULTIVO DE

HERIDA
Recepcin de la Frotis y coloracin GRAM

muestra
Siembra en AS, Mck, MS,

ACH,Sab..
Validacin y reporte
Incubacin por 24 horas a de los resultados
35 37 C
Suceptibilidad Validacin y reporte

antimicrobiana de los resultados
160

SECRECION VAGINAL
Recepcin de la
muestra Coloracin GRAM y lecturas
de lmina
Siembra en AS, Mck, MS, Examen directo:

ACH,Sab. Determinar presencia de
Hongos y Trichomonas

de los resultados

Validacin y reporte
de los resultados
Suceptibilidad
antimicrobiana
161

SECRECION FARINGEA
Recepcin de la
muestra Coloracin GRAM y lecturas
de lmina

ACH, Sab.

de los resultados

Validacin y reporte
de los resultados
Suceptibilidad
antimicrobiana
162

DISPOSITIVO INTRAVASCULAR

muestra
Siembra en AS, Mck

,MS,ACH,Sab.
Validacin y reporte
Incubacin por 24 horas a de los resultados
35 37 C

163

ESPUTO

muestra
Siembra en AS,
Mck,MS,ACH,Sab.

de los resultados

164

MUESTRAS DEL TRACTO RESPIRATORIO BAJO

muestra
Siembra en AS,
Mck,MS,ACH,Sab
.

de los resultados

165
FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA CULTIVO DE SECRECION

BILIAR

muestra
Siembra en AS,
Mck,MS,ACH,Sab,Sel..

35 37 C
Sembrar del Sel. al SS Validacin y reporte

de los resultados

166
FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA COPROCULTIVOS

muestra
Siembra en, Mck, Sel.

35 37 C
Sembrar del Sel. al SS Validacin y reporte

de los resultados

167
FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARA CULTIVO DE LIQUIDOS

BIOLOGICOS

muestra
Centrifugar la muestra a
3,8000 rpm. Por 20 minutos

ACH,Sab.(multibiotico)

Validacin y reporte
35 37 C
de los resultados

168

LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO
Recepcin de la Frotis y coloracin GRAM y

muestra tinta China
Centrifugar la muestra a
3,8000 rpm. Por 20 minutos

ACH,Sab (glucosado)

Validacin y reporte
35 37 C
de los resultados

169
FLUJOGRAMA DE TRABAJO EXAMEN MICOLOGICO,

DIRECTO Y CULTIVO
Recepcin de la Examen directo con KOH

muestra
Siembra en Sab. (multibiotico) Coloracin GRAM, Giemsa,
Incubacin por 1 15 das a

temperatura ambiente. Validacin y reporte
de los resultados
Identificacin del Hongo
Validacin y reporte
de los resultados
170
FLUJOGRMA DE TRABAJO PARASITOLOGICO DIRECTO
Recepcin de la
muestra
Examen directo con SSF y

Lugol
Validacin y reporte
de los resultados
171
FLUJOGRAMA DE TRABAJO PARASITOLOGICO

CONCENTRADO
Recepcin de la
muestra
Diluir la muestra en agua

destilada
Filtrar
En tubos cnicos con triple
filtro
Centrifugar a 1,500-2,000
RPM por 2 minutos
Decantar el sobrenadante
Resuspender sedimento con

solucin formolada al 5 %
1 gota de sed. + 1 gota de

lugol en la lmina Validacin y reporte
de los resultados
172
FLUJOGRAMA DE TRABAJO BACILOSCOPIA
Recepcin de la
muestra
Orina o Liq. Corporales

Esputo
Centrifugar 3,500 RPM por 5

minutos
Realizar el frotis sobre una

lmina portaobjeto
Realizar el frotis sobre una

lmina portaobjeto
Secar
Secar
Coloracin Ziehl - Neelsen
LECTURA
Validacin y reporte
de los resultados
173
METODO DE SIEMBRA ESTRIA POR AGOTAMIENTO
174
METABOLISMO BACTERIANO
E. coli
Klebsiella oxytoca
175
Shigella sp.
Proteus mirabilis
176
BACTERIAS MS FRECUENTES EN UN COPROCULTIVOS
Agar Mac Conkey
Shigella Salmonella
Plesiomonas
Aeromonas
177
Agar XLD
Shigella Salmonella
Aeromonas Plesiomonas
178
TOMA DE MUESTRA DE HONGOS
179
PARASITOS
Trofozoito de Blastocystis hominis Quiste en Entamoeba coli
Quiste de Entamoeba hystolitica Quiste de Iodamoeba butchlii
180
THEVENON
POSITIVO 1+ POS 2+ POS 3+
181
182
PRUEBA DE COAGULASA EN TUBO
PRUEBA DE CATALASA
183
REACCIONES BIOQUMICA
AGAR TSI.
AGAR LIA
184
AGAR CITRATO
PRODUCCIN DE UREASA
185
PRUEBA DEL ROJO DE METILO
PRUEBA DE VOGES PROSKAUER.
186
PRUEBA DE MOVILIDAD
PRUEBA DE INDOL
187
PRUEBA DE LA OXIDASA
188
MEDIO CHROMOAGAR
189
HEMOPARASITOS
190
191
HEMOCULTIVO
192
XIV . BIBLIOGRAFIA
Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos de laboratorio para el diagnstico
de infecciones respiratorias agudas. Curso Terico Prctico. En: Diagnstico de laboratorio
de infecciones respiratorias agudas y enterovirus. Lima. 1999.
Koneman E, Allen S, Dowell V, Sommers H. Diagnstico microbiolgico. 3a ed Buenos Aires.
Editorial Mdica Panamericana. 1992.
Miller J. Michael, Holmes H. Specimen collection, transport and storage. En: Murray PR,
Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC. Yolken RH. Manual of Clinical Microbiology. 7a ed.
Washington DC: American Society for Microbiology; 1999. pp 33 63.
OMS Manual for the National Surveillance of Antimicrobial Resistance of S. pneumoniae and
H. influenzae: Epidemiological and Microbiological methods. Programme for the Control of
Acute Respiratory Infections. Atlanta.1994.
193

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DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA

CLINICA Y ANATOMIA PATOLOGICA

DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA CLINICA Y ANATOMIA PATOLOGICA

MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS

MANUAL DE NORMA Y PROCEDIMIENTO DEL AREA

Dra.: SILVIA BELLING SALAS

Blga. ZOILA AYALA BURGA - Hospital Santa Rosa

Dr. CESAR BALCZAR BRICEO - Hospital Casimiro Ulloa

*Cultivo de Orina ( Urocultivo) ....................................................................................... 36-38

MANUAL DE NORMAS Y PROCEDIMIENTOS

DEL SERVICIO DE MICROBIOLOGIA

El manual de normas y procedimientos del rea de Microbiologa es un

1. Establecer formalmente los procedimientos que se realizan en el servicio

2. Contribuir a la ejecucin eficiente de los procedimientos que se llevan a

III. BASE LEGAL:

Ley 26842- Ley General de Salud.

Ley 27444- Ley de Procedimientos Administrativos.

Ley 27657- Ley del Ministerio de Salud.

D.S. 013-202- SA Aprueba el Reglamento de la Ley 27657

D.S. 023-023-2005-SA Reglamento de Organizacin y Funciones del

Resolucin Ministerial 603-2006-SA/ Dm Aprueba Directiva 007-

Resolucin Ministerial 1022-2007/MINSA- Aprueban el Reglamento de

Resolucin Directoral 0191-2011-SA-DS-HSR-OEPE/DG. Aprueba el Manual

Directiva 007- MINSA/OGPP-V.02 Directiva para la formulacin de

Las disposiciones contenidas en el presente manual alcanzan a todos los

V. NORMAS ADMINISTRATIVAS DEL SERVICIO DE MICROBIOLOGIA:

1.- DE LA ORGANIZACIN DEL SERVICIO:

2.- DE LA ATENCION EN EL SERVICIO DE MICROBIOLOGIA:

ABSCESO: Acumulacin localizada de pus en un tejido u rgano.

La coleccin de las muestras microbiolgicas generalmente se efecta fuera

Es importante estar informados de las normas de toma y transporte de

A) OBTENCION DE MUESTRA PARA HEMOCULTIVO

El momento ptimo de obtencin de la muestra para hemocultivo es justo

BACTEREMIAS CONTINUAS: En cualquier momento, ejm. Endocarditis,

BACTEREMIAS INTERMITENTES: Una hora antes del pico febril, ejm.

Cronologa para hemocultivos

En sepsis: Se debe tomar dos a tres muestras de lugares diferentes en un

1. Visualmente supervisar aquellas botellas con sospecha de contaminacin o

3. Aplicar solucin de iodo o clorhexidina gluconato por 30 segundos en

1. Extraer el volumen recomendado de sangre.

Volumen de sangre a tomar por cada venopuntura:

Obtencin de muestra de sangre mediante uso de jeringa:

La proporcin entre el volumen de sangre obtenida y el volumen del caldo

Utilizar un medio bifsico o monofsico para este procedimiento.

Se recomienda obtener como mnimo 2 o 3 frascos de hemocultivo por

No refrigerar los frascos de hemocultivo, mantener a temperatura ambiente.

Se aplica en la obtencin de muestras para el diagnstico de infecciones asociadas

a) Limpiar la piel con alcohol de 70 alrededor de la insercin del catter.

CRITERIO DE RECHAZOS DE MUESTRA

Envase, tubo o tapa rosca no estril.

El presente procedimiento se aplica en la obtencin de muestras de orina de

La orina es un excelente medio de cultivo para la proliferacin bacteriana,

Generalmente el desarrollo de dos o ms tipos de colonias (en pacientes sin

OBTENCIN DE MUESTRA DE ORINA DEL CHORRO MEDIO

Obtencin de muestra de orina en pacientes varones

a) Mantener la privacidad del paciente.

CRITERIOS DE RECHAZO DE MUESTRA:

Solicitar una nueva muestra de orina cuando la muestra ha sido conservada

En el caso de una herida con sospecha de infeccin, la muestra se obtiene

Obtencin de muestra de absceso por aspiracin con aguja:

El mtodo indicado para obtener muestras de abscesos es por aspiracin

Las muestras deben de ser procesadas inmediatamente, un examen directo es de

Directo: sin centrifugacin