UNIVERSIDADE FEDERAL DO OESTE DO PAR

GENTICA DE TAMBAQUIS COM O USO DE PCR MULTIPLEX

NOME DO CONCLUINTE

Santarm, Par
Outubro, 2016
 NOME DO CONCLUINTE

GENTICA DE TAMBAQUIS COM O USO DE PCR MULTIPLEX

MARIA IRACILDA CUNHA SAMPAIO

Orientador

Trabalho de concluso de curso

apresentado Universidade Federal do
Oeste do Par UFOPA, como parte
dos requisitos para obteno do ttulo
de bacharel em Biologia.

Santarm, Par
Outubro, 2016

ii
FOLHA DE APROVAO

iii
AGRADECIMENTOS

iv
EPGRAFE

At cortar os prprios defeitos pode ser perigoso.

Nunca se sabe qual o defeito que sustenta nosso
edifcio inteiro.

Clarice Lispector

v
RESUMO

vi
ABSTRACT

vii
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Vista lateral de um exemplar adulto de Colossooma macropomum. Fonte: Aguiar (2012). .......17
Figura 2: Vista lateral de um indivduo juvenil de Piaractus brachypomus. Fonte: Aguiar (2012). ............19
Figura 3: Vista lateral de um indivduo adulto de Piaractus Mesopotamicus. Fonte: Aguiar (2012). .........20
Figura 4: Vista lateral de tambacu e de pacu. Fonte: Dairiki et al. s/d........................................................23
Figura 5: Vista lateral de um exemplar de tambatinga. Fonte: Paula (2009). ............................................24
Figura 6: Local de coleta das amostras de tambaquis. Fonte: Google Maps (2016). ................................31
Figura 7: Gel de Agarose (2%) corado com GelRed, mostrando o resultado da PCR Multiplex do gene -
Tropomiosina. ...............................................................................................................................................34

viii
 LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Principais espcies de peixes produzidas no Brasil em tonelada nos anos de 2007 e 2009. ....15
Tabela 2: Produo de pescado (t) da aquicultura continental brasileira por espcie entre 2008 e 2010.
Fonte: MPA, 2010. .......................................................................................................................................16

ix
 LISTA DE ANEXOS

Anexo A 1: Espcime 22 ................................................................................................ 43

Anexo A 2: Espcime 26 ................................................................................................ 43
Anexo A 3: Espcime 28 ................................................................................................ 44
Anexo A 4: Espcime 27 ................................................................................................ 44
Anexo A 5: Espcime 30 ................................................................................................ 44
Anexo A 6: Espcime 29 ................................................................................................ 44

x
 SUMRIO

1. INTRODUO ........................................................................................................... 12
1.1. Reviso Bibliogrfica ............................................................................................ 13
1.1.1. A piscicultura no Brasil................................................................................... 13
1.1.2. Aspectos biolgicos de cultivo de peixes redondos (tambaqui, pirapitinga e
pacu) ........................................................................................................................ 17
1.1.3. Hibridizao entre o tambaqui, pirapitinga e pacu ......................................... 21
1.1.4. A problemtica da hibridizao de espcies .................................................. 24
1.1.5. Gentica e a identificao de espcies comercializadas ............................... 27
2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 30
2.1. Objetivo geral ....................................................................................................... 30
2.2. Objetivos especficos ........................................................................................... 30
3. MATERIAIS E MTODOS.......................................................................................... 31
3.1. Amostras .............................................................................................................. 31
3.2. Extrao de DNA ................................................................................................. 31
3.3. PCR Multiplex ...................................................................................................... 32
4. RESULTADOS ........................................................................................................... 34
4.1. PCR Multiplex ...................................................................................................... 34
5. DISCUSSES ............................................................................................................ 35
REFERNCIAS .............................................................................................................. 37
ANEXOS ........................................................................................................................ 43
ANEXO A Placa de Agarose .................................................................................... 43

xi
1. INTRODUO

A populao mundial tem desenvolvido hbitos alimentares que proporcionem

amplos benefcios sade. Nesse sentido, o consumo de carne de peixe se mostra apto
a essa tendncia por ser rica em protenas, vitaminas hidrossolveis do complexo B e
lipdeos. Alm disso, a carne de peixe uma importante fornecedora de sais minerais
que so indispensveis para a fisiologia do corpo humano.
Dessa forma, a pesca tem essencial importncia tanto para a finalidade
econmica e a social e enfrenta um grande desafio mundial: contribuir para que milhares
de pessoas no mundo tenha o desenvolvimento nutricional adequado. Entretanto, o setor
pesqueiro mundial parece enfrentar seu limite, embora tenha acontecido tentativas de
torn-lo cada vez mais crescente.
Por um lado, em linhas gerais, a piscicultura pode ser definida como a criao de
peixes, que so do interesse humano. A aquicultura, por outro, tem definio mais
abrangente e no se restringe apenas ao cultivo de peixes, engloba a criao de
crustceos, algas e moluscos, geralmente com interveno, como a alimentao artificial,
medicamentos e tcnicas de aumentar a produtividade (SAPKOTA et al., 2008). Alm
disso, so utilizadas tcnicas que geram espcies de alto valor e tambm geram as mais
tradicionais (ASCHE; TVERAS, 2004).
Segundo Ostrensky et al. (2008), pelo fato de o Brasil possuir uma quantidade
muito grande de guas martimas e continentais, a aquicultura se mostra bastante
produtiva. Adicionalmente, ao se aproveitar os recursos hdricos existentes, a piscicultura
tem se desenvolvido consideravelmente, principalmente com a criao de peixes em
tanques-rede, tanque escavado e tambm em audes. Por esta razo, este setor
alternativo, por requerer um investimento menor, pode ser implantado com agilidade, o
que pode aprimorar as condies econmicas, sociais e ambientais de uma determinada
regio. Por ser um setor crescente, com taxas de crescimento de 9%, o consumo de
peixes um dos que mais cresce no Brasil, requerendo assim novos investimentos para
suprir a demanda do mercado.

12
 Nessa lgica, a pesca uma das principais atividades humanas no Brasil, que
se constitui em fonte de alimento, comrcio renda e lazer para sua populao. Na Regio
Norte do Brasil, onde est situada a maior bacia hidrogrfica de todo o mundo (JUNK,
1983; SIOLI, 1985), observa-se uma grande quantidade de espcies de peixes. De cerca
de 4500 espcies que ocorrem na regio Neotropical, 2000 espcies so endmicas da
Regio Norte segundo estudos feitos por Vari e Malabarba (1998) e Reis et al. (2003).
Nesse sentido, a pesca se configura como uma das mais importantes atividades humanas
na Regio Amaznica.
Segundo Santos e Santos (2005), o processo de colonizao dessa regio
supracitada foi centrado no potencial dos rios da regio, isto , percebeu-se a importncia
dos rios circundantes e dos recursos pesqueiros para a populao da regio. Ainda de
acordo com os autores, a explorao desses recursos j era feita pelos diversos povos
indgenas que viviam e ainda vivem na Regio Amaznica. Nesse sentido, de acordo
com a SUFRAMA (2003), o peixe se torna um dos recursos mais abundantes e tambm
consumidos na Regio Norte do Brasil.
Em linhas gerais, pode-se dizer que a piscicultura tem avanado em todo o
territrio brasileiro, no ficando restrita apenas a uma das cinco regies geogrficas. Essa
expanso se deve questo da rentabilidade, que conseguida mediante o uso de
sistemas que fazem uso de raes balanceadas e de qualidade superior, causando
menor impacto ambiental. O visvel crescimento resulta do interesse de pequenos e
mdios produtores que querem que seu produto seja bem aceito no mercado.
Atualmente, os peixes nativos brasileiros que mais tm interessado para a piscicultura
so o tambaqui (Colossoma macropomum), o pacu (Piaractus mesopotamicus) e seu
hbrido tambacu.

1.1. Reviso Bibliogrfica

1.1.1. A piscicultura no Brasil

13
 Considerando um pas de dimenso continental, sendo o quinto maior pas do
mundo, com uma rea de 8.514.876.599 km e populao acima de 200 milhes de
habitantes, o Brasil possui uma grande diversidade no campo social, econmico e
geogrfico. Nesse sentido, Ostrensky et al. (2008) afirma que o pas possui um grande
potencial para os produtos pesqueiros.
O setor pesqueiro ainda bastante explorado em todo o Brasil. Segundo o Plano
Estratgico da Embrapa Amaznia Ocidental para a Aquicultura, a aquicultura brasileira
relativamente nova, tendo sido criada no incio dos anos de 1968, quando apenas 0,5
tonelada de pescado foi produzido. Entretanto, no ano de 2010, segundo o mesmo Plano,
a produo brasileira de pescado pulou para 479.399 toneladas, colocando o pas no
ranking 17 dos maiores produtores de pescado no mundo.
Nessa perspectiva, com o aumento dessa produo, esse setor se configura
como um dos que mais se expandiu, visando, sobretudo o mercado estratgico para a
produo de alimentos e o desenvolvimento sustentvel. Em relao ao ano de 2011,
houve um aumento de 51,2 % em relao ao ano anterior, totalizando 628.704 toneladas.
E mais de 80% deste percentual vem da aquicultura continental, segundo o Plano
Estratgico da Embrapa. Quando se olha para a porcentagem por regio geogrfica do
Brasil, observa-se que as regies Sul (153.674t) e Nordeste (134.292t) ocupam a primeira
e segunda posio no ranking de produo, respectivamente, e a regio Norte
responsvel por cerca de 94.578 toneladas, permanecendo assim no terceiro lugar.
Na Amaznia em geral, o consumo de peixe tende a ser muito maior do que a
mdia nacional, embora essa taxa seja tambm varivel a depender da Regio
Amaznica. De um lado, segundo o Plano Estratgico da Embrapa, no Brasil, no ano de
2010, o consumo per capita de pescado foi de 9,75 quilogramas (kg). De outro, na
Amaznia esse nmero de cerca de 135 kg, chegando a 292 kg, por exemplo, no Alto
do Solimes. Dessa forma, a produo pesqueira deve ser diversificada para poder
atender o mercado consumidor.
Para satisfazer essa demanda, a indstria de pescado lana mo de diversas
espcies de peixes. As diferentes variedades de peixes cultivadas no Brasil variam
consideravelmente. A tilpia (Oreochronis sp.) e o tambaqui (Colossoma macropomum)

14
representa cerca de 67% de toda produo da piscicultura do pas, representando cerca
de 253.824 e 111.084 toneladas, respectivamente. Entretanto, outras espcies tambm
participam com uma quantidade expressiva como o pacu (Piaractus mesopotamicus) e a
pirapitinga (Piaractus brachypomus), matrinx (Brycon amazonicus), pirarucu (Arapaima
gigas), curimat (Prochilodus scrofa) e tucunar (Cichla spp). Adicionalmente, ainda h
uma grande variedade de espcies hbridas, como o tambacu (cruzamento entre uma
fmea da espcie Colossoma macropomum com o macho da Piaractus mesopotamicus)
obtidas a partir do cruzamento entre as diferentes espcies.
Quando se olha para a piscicultura continental, observa-se que a produo de
tilpias produzida principalmente nas regies Nordeste, Sul e Sudeste, enquanto a
produo de carpas est concentrada mais nas regies Sul e Sudeste. A produo de
peixes redondos, como o tambaqui e tambacu e o pacu se concentra mais nas regies
Norte e Nordeste (OSTRENSKY, et al. 2008).

Tabela 1: Principais espcies de peixes produzidas no Brasil em tonelada nos anos de 2007 e 2009.
Fonte: MPA, 2010

Conforme a tabela acima do Boletim Estatstico de Pesca e Aquicultura 2008-2009 (MPA,

2010), a produo de tilpia tem uma parcela significativa na produo pesqueira do
Brasil, seguida pela produo de carpa (Cyprinus carpio). A tabela mostra ainda a
tendncia brasileira concernente produo, que vem crescendo no decorrer dos anos.
Embora a piscicultura continental parece concentrar sua produo em nmero
pequeno de espcies de peixes, outros dados desse mesmo boletim mostra que h
tambm uma diversidade maior de peixes sendo cultivados no Brasil no sistema de
aquicultura. A tabela 2 a seguir apresenta os dados referente produo de pescado no
Brasil, considerando a aquicultura continental.

15
 Tabela 2: Produo de pescado (t) da aquicultura continental brasileira por espcie entre 2008 e
2010. Fonte: MPA, 2010.

Nesse sentido, pode-se observar que a tilpia, a carpa, o tambaqui, o tambacu e o pacu
so espcies ainda bastante presentes na produo dentro da aquicultura brasileira e os
dados desta se assemelham com os dados da piscicultura continental, j que as mesmas
espcies esto nas duas tabelas com valores parecidos. Entretanto, chama-se a ateno
para outras espcies cultivadas, como piau (Leporinus sp.), tambatinga (espcie hbrida
a partir do cruzamento da fmea da espcie Colossoma macropomum e o macho da
espcie Piaractus brachypomus) e a truta (oncorhynchus mykis).
Embora o boletim do MPA traz uma grande variedade de peixes, Aguiar (2012),
tomando como base o relatrio da FAO (2009), argumenta que a explorao pesqueira,
especialmente na Amaznia, tende a se concentrar em poucas espcies, tais como o
tambaqui, o surubim (Pseudoplatystoma sp.) e o jaraqui (Semaprochilodus sp.), logo, h
um risco grande de sobreexplorar essas espcies. De uma maneira geral, pode-se
observar que h um aumento da produo na aquicultura nacional devido ao cultivo das
espcies mais comuns mostradas na Tabela 1. Adicionalmente, h o cultivo de espcies

16
hbridas, principalmente o tambacu, o paqui e a patinga, uma vez que so bem aceitos
no mercado (cf. AGUIAR, 2012).

1.1.2. Aspectos biolgicos de cultivo de peixes redondos (tambaqui, pirapitinga e

pacu)

Dentro da Taxonomia, os peixes redondos mais comuns cultivados, tais como o

tambaqui, a pirapitinga e o pacu pertencem subfamlia Serrasalminae, que possui cerca
de 15 gneros e 80 espcies, que se distribuem pela regio Neotropical.
Hierarquicamente, essa subfamlia se inclui na famlia Characidae, Ordem
Characiformes, Classe Actinopterygii e filo Chordata (cf. REIS, et al., 2003). Alm disso,
Kubitza (2004) informa que esses peixes se caracterizam por ser reoflicos, isto , migram
durante o perodo reprodutivo.
O peixe da espcie Colossooma macropomum (Figura 1 abaixo), comumente
conhecido como tambaqui, nativo da bacia dos rios Amazonas, Orinoco e afluentes.
Essa espcie pode alcanar at 100 cm de comprimento e ter peso acima de 30kg.
Segundo Arajo-Lima e Goulding (1998), na natureza o tambaqui atinge sua maturidade
sexual por volta do quarto ou quinto ano de vida. Entretanto, quando criado em cativeiro,
esse peixe atinge sua maturidade sexual por volta do terceiro ano de vida.

Figura 1: Vista lateral de um exemplar adulto de Colossooma macropomum. Fonte:

Aguiar (2012).

17
A alimentao do tambaqui variada, mas normalmente se restringe a frutas e micro
crustceos planctnicos. Segundo estudos de Goulding e Carvalho (1982) e Isaac e
Ruffino (2000), essa espcie de peixes pode ser tolerante a baixas concentraes de
oxignio da ordem de 1mg/L.
Aguiar (2012) pontua que o tambaqui pode ter sua cor variada a depender de sua
localizao. Os exemplares encontrados nas guas escuras tendem a ter cores mais
escuras e os encontrados em guas turvas tendem a ser mais claros, o que indica que a
sua colorao pode ser influenciada pela cor da gua. No geral, os tambaquis
apresentam cor preta na parte dorsal e de amarelo a verde oliva na regio ventral. Ainda
de acordo com Aguiar (2012), baseado nos estudos de Vieira et al. (1999) e Arajo-Lima
e Gomes (2005), a presena do tambaqui indica gua rica em nutrientes, cuja variao
de temperatura fica entre 25 e 34 C. Concernente reproduo, o tambaqui possui
fecundao externa e o perodo da desova coincide com o perodo das chuvas.
Em relao ao cultivo de tambaqui, segundo dados do IBAMA (2005, 2007),
excetuando os trs estados da Regio Sul, o cultivo dessa espcie de peixes ocorre em
praticamente em todos os outros estados do pas. A vantagem de criao do tambaqui
se d por causa do seu excelente potencial para a produo intensiva, isto, pelo bom
potencial de crescimento, alta produtividade, resistncias a baixos nveis de oxignio
dissolvido e pela utilizao de alimentos, conforme dados dos estudos de Arajo-Lima e
Gouldin (1998).
A produo brasileira de tambaqui apresenta um contnuo crescimento,
passando de 8 mil toneladas em 1994 e atingindo a cifra de 46 mil toneladas em 2009.
Atualmente, cerca de 20% da piscicultura continental oriunda da criao de tambaqui.
Sua produo realizada em viveiros escavados ou semiescavados, com fundo de argila.
Segundo Marinho-Pereira et al. (2009), esse mtodo permite muito mais vantagens do
que o mtodo de barragem, por ter uma maior produo de biomassa por unidade de
volume, riscos baixos de patologias, melhor controle da gua, entre outros.
A pirapitinga, Piaractus brachypomus (Figura 2 abaixo), uma espcie de peixe
que tem seu habitat nas bacias Amaznica e Araguaia-Tocantins. Pode atingir at 80 cm

18
e pesar cerca de 20 kg. Sobrinho et al. (1984) afirma que esta a nica espcie do gnero
que encontra na Bacia Amaznica.

Figura 2: Vista lateral de um indivduo juvenil de Piaractus brachypomus. Fonte: Aguiar

(2012).

Kubitza (2004) pontua que a pirapitinga o terceiro maior peixe de escama da

Amaznia, ficando atrs apenas do pirarucu (Arapaima gigas) e o tambaqui. Fernandes
et al (2004) destaca que a pirapitinga uma espcie onvora, se alimentando tanto de
nutrientes vindas de fonte animal quanto vegetal, como pequenos peixes, frutas e
sementes. Essa espcie tem crescimento rpido e resiste a elevadas temperaturas, ao
manuseio, a enfermidades e, assim como o tambaqui, a baixos nveis de oxignio diludo
na gua. Caracteristicamente, o pirapitinga possui corpo romboidal, que alto e
comprido, tem colorao cinza arroxeado uniforme nos adultos e cinza claro nos jovens;
estes ainda podem apresentar manchas amareladas. Geralmente, os peixes dessa
espcie entram em ciclo reprodutivo por volta do terceiro ou quarto ano de vida, cuja
desova acontece entre os meses de novembro e fevereiro.
Do ponto de vista da produo em cativeiro, a pirapitinga tem vantagens
interessantes como se adaptar aos mais diversos tipos de rao industrializada, por ter
altas taxas de eficincia alimentar, crescer uniforme e aceleradamente e essa espcie
bem aceita no mercado (SILVA et al. 1986; VSQUEZ-TORRES, 2005).

19
 Petrere (1989) mostra que o pacu, Piaractus mesopotamicus (Figura 3), uma
espcie nativa encontrada nas bacias do Rio Paran, Paraguai e Uruguai e tem sua
presena mais marcante nos rios da regio Centro-Oeste, especialmente no Pantanal
Mato-Grossense. Por se adaptar alimentao artificial, seu cultivo pode ser observado
tambm na regio Sudeste do Brasil (BICUDO, 2008). De acordo com Urbinati e
Gonalves (2005), essa espcie extremamente importante para a piscicultura porque
apresenta um elevado crescimento, rstico quanto ao manejo e tambm bastante
aceito no mercado consumidor.

Figura 3: Vista lateral de um indivduo adulto de Piaractus Mesopotamicus. Fonte: Aguiar

(2012).

O pacu um peixe de escamas, tem corpo romboide e possui colorao uniforme

que vai do castanho ao cinza escuro e tem ventre amarelado. Os indivduos adultos dessa
espcie podem alcanar at os 70 cm. Sua alimentao explora uma diversidade grande
que vai desde flores, folhas, frutos a insetos, aracndeos, pequenos moluscos e pequenos
peixes (URBINATI; GONALVES; TAKAHASHI 2005). Em relao ao cativeiro,
Fernandes et al (2000) argumenta que essa espcie desperta interesse por aproveitar os
ingredientes de origem vegetal. Alm disso, o pacu digere e metaboliza carboidratos e
lipdeos, reservando, assim, a protena para o crescimento, conforme estudo de Silva
(2008). O perodo de desova dessa espcie acontece entre os meses de outubro e

20
dezembro, tendo o ms de novembro como pice do processo (URBINATI;
GONALVES; TAKAHASHI, 2005).

1.1.3. Hibridizao entre o tambaqui, pirapitinga e pacu

Considerando o grande potencial pisccola, preciso haver uma definio de

tecnologias que melhorem as condies de criao, o manejo alimentar e tambm o
melhoramento gentico das espcies. Com as modernas tcnicas genticas, tem-se
obtido peixes que engordam mais facilmente e com converso alimentar. Nesse sentido,
a hibridizao ou hibridao uma das tcnicas que mais tem sido emprega
geneticamente visando elevao dos rendimentos produtivos no setor pesqueiro.
Segundo Senhorini et al. (1988), a hibridizao objetiva o melhor aproveitamento
do vigor de heterose, por meio da juno de duas espcies diferentes. Wang e Xia (2002)
afirma que esse mtodo tambm utilizado para obter variedades novas, cuja utilizao
da heterose se torna imprescindvel para aumentar a produo em aquicultura. Heterose
ou vigor hbrido, de acordo com Pereira (1996), pode ser conceituado como
caracterizao da superioridade mdia de um carter quantitativo em combinaes
hbridas. Na literatura, so encontrados trs tipos de heterose: materna, paterna e
individual. A hibridizao pode ser utilizada visando obter indivduos hbridos entre
espcies e entre gneros, com o intuito de trazer caractersticas desejadas, tais como
melhor adaptao ao cultivo, maior produtividade, precocidade, entre outras (PINHEIRO
et al., 1991; SILVA et al., 2000; BOTERO et al., 2004).
Chevassus (1983) aponta que os estudos sobre hibridizao comearam a
acontecer no final do sculo XIX e se desenvolveram principalmente na America do Norte
a partir do incio da segunda dcada do sculo XX. Os primeiros estudos voltaram-se
para a espcie do gnero Epomis e o processo de hibridizao passou a ser melhor
compreendidos, bem como seus fatos bsicos, tais como as vantagens resultantes deste
processo. Alm disso, os hbridos apresentaram caractersticas intermedirias entre as

21
espcies parentais, mas as superavam em diversos outros aspectos, como crescimento
mais rpido, intensidade na colorao, domnio no ambiente, etc.
Nos dias atuais, percebe-se que a hibridizao se tornou bastante comum entre
os peixes, j que esse grupo de vertebrados apresenta uma srie de caractersticas que
tornam o processo de hibridizao mais fcil, os peixes possuem fertilizao externa,
competem por territrios na desova, so abundantes em espcies e sobrevivem em
ambientes limitados. Todavia, a maior parte de hibridizao ocorre por meio da
interveno humana e volta-se, principalmente, quelas espcies que so essenciais
para a aquicultura.
Assim, a hibridizao tem sido utilizada em piscicultura em diversas espcies de
peixes com o objetivo de conseguir indivduos com caractersticas superiores quelas
dos parentais. Com esse processo, tem-se conseguido peixes que tem alta taxa de
crescimento, com qualidade superior da carne, que so resistentes a doenas e com
diversas caractersticas que os tornem mais proveitosos para o cultivo. Segundo o IBAMA
(2008), no ano de 2006, o Brasil produziu quase 14 mil toneladas de pescado hbrido,
cujos representantes mais fortes so a tambatinga e o tambacu. O cultivo desses peixes
se d em razo de eles terem crescimento rpido em cativeiro, hbito alimentar
diversificado, rusticidade e carne de boa qualidade (KUBITZA et al., 2007).
Considerando que o tambaqui, o pacu e o pirapitinga no consegue se reproduzir
naturalmente em cativeiro, os estudos de Crepaldi et al. (2006) e Zaniboni e Weingartner
(2007) mostram que necessrio induzir a desova por meio da aplicao de hormnios
naturais presentes na hipfise de peixes maduros. Esse procedimento tem utilizado,
principalmente, o extrato da hipfise de carpa. Em relao s fmeas, o procedimento de
hipofisao acontece em duas etapas com intervalos de 8 a 12 horas, sendo que na
primeira aplicao a concentrao do extrato de hipfise de 0,5 mg por kg e segunda
entre 4,5 e 5 mg/kg. Para os machos, a aplicao feita apenas uma vez. Geralmente,
levando em considerao a temperatura da gua, a desova acontece entre 8 e 10 horas
depois da aplicao da segunda dose (KUBITZA et al., 2004).
Assim, na piscicultura brasileira, o tambaqui, o pacu e a pirapitinga, juntamente
com seus hbridos, tambacu, tambatinga e pirati, so espcies mais cultivadas por uma

22
srie de fatores que as tornam mais produtivas e de fcil manuseio; alm da converso
alimentar, alta produtividade, resistncia a patologias, entre outros.
O tambacu (Figura 4) um peixe de espcie hbrida, que resulta do cruzamento
de uma fmea do Colossoma macropomum com um macho da espcie Piaractus
mesopotamicus (BALDISSEROTTO; GOMES, 2005). No geral, o tambacu mistura
caractersticas, tais como a resistncia ao frio e a rusticidade do pacu e a maior taxa de
crescimento do tambaqui. uma espcie que tem grande importncia para a piscicultura
brasileira, pois apreciado como peixe para pesca esportiva e tambm pelo fato de
ganhar peso e crescer rapidamente.

Figura 4: Vista lateral de tambacu e de pacu. Fonte: Dairiki et al. s/d.

A tambatinga (Figura 5) outra espcie de peixe obtida por meio da hibridizao

a partir do cruzamento da fmea da espcie Colossoma macropomum e o macho da
espcie Piaractus brachypomus. Guerra et al. (1992) aponta que a tambatinga tem
rastros branquiais que so mais desenvolvidos do que a pirapitinga, fazendo com que
esses indivduos filtrem melhor o plncton presente no meio ambiente.

23
 Figura 5: Vista lateral de um exemplar de tambatinga. Fonte: Paula (2009).

Silva-Acua e Guevara (2002) mostraram que a tambatinga tem facilidade para

ganhar peso comercial em relativo espao de tempo, mesmo que a quantidade de
protena da dieta tenha nveis bem baixos. Dessa forma, esse hbrido se mostra
interessante para a aquicultura j que uma economia na quantidade de rao necessria
para a criao. Alm disso, apesar de os estudos serem poucos a respeito dessa
temtica, os piscicultores da regio Norte preferem a tambatinga porque apresenta
desempenhos produtivos mais altos do que as outras espcies.

1.1.4. A problemtica da hibridizao de espcies

Embora o processo de hibridizao tem sido utilizado como forma de aumentar

a produo pesqueira no mundo, h uma srie de riscos quando se trata da hibridizao
de peixes nativos. Apesar de ser um fenmeno natural, a hibridizao est entre as
principais causas de ameaas biodiversidade. Mallet (2005) considera que a
hibridizao interespecfica acontece entre 6 e 10% das espcies animais. Entretanto, o
indivduo resultante deste processo ineficiente tanto do ponto de vista reprodutivo,
quanto ecolgico, bioqumico, fisiolgico e comportamental (HELFMAN et al. 2009).

24
 Os estudos de Downling e Secor (1997), Willis et al. (2012) e Mirimin et al. (2014)
tm mostrado que h evidncias fortes de que ocorre a hibridizao interespecfica nos
peixes na natureza, tanto em zonas onde h barreiras de contato entre espcies ou em
zonas de quebra de barreiras. Segundo os estudos desses autores, a hibridizao pode
causar a extino local das espcies puras. Entretanto, Arnold e Hodges (1995)
argumentam que a hibridao natural se torna importante para a evoluo das espcies
na medida em que possibilita que surjam gentipos que estabeleam outras linhagens
evolutivas.
Na ictiologia, a hibridizao natural acontece mais frequentemente e mais
comum nas espcies que habitam ambientes de gua doce (EPIFANIO, NIELSEN, 2001).
O processo artificial de hibridizao entre espcies resulta em indivduos que so
considerados como espcies exticas, isto , no pertencem naturalmente quela
determinada rea e geralmente so introduzidos intencional ou acidentalmente. Essa
introduo objetiva-se, muitas vezes, o aumento da produo local, sem nenhuma
reflexo acerca do uso dessas espcies fora de seu habitat natural. Geralmente, no h
os cuidados necessrios para prevenir riscos futuros. Seguindo a lgica do mercado
consumidor que aumenta cada vez mais a demanda, as espcies hbridas so
introduzidas visando apenas o aumento dessa produo (SHELTON; ROTHBARD,
2010).
Como se tem notado, apesar da introduo de espcies hbridas visando o
aumento da produo de pescado, a sua sustentabilidade pode ficar comprometida. De
um lado, a domesticao de espcies nativas algo relativamente novo e, por isso, a
maior parte da produo resulta de espcies silvestres. De outro, a produo sem
controle de hbridos tem pontencializado a contaminao gentica dos planteis que
formam os reprodutores. Alm disso, Alves et al. (2014) mostram que os reprodutores
hibridizados, com o passar do tempo, no conseguem mais garantir a heterose desejada
das espcies parentais. Por no haver uma correta identificao da hibridizao, a
produo legtima de espcies puras fica limitada. A domesticao de espcies nativas
s pode acontecer mediante o sucessivo cruzamento entre a mesma espcie objetivando
conseguir as caractersticas desejadas para a piscicultura. Nesse sentido, a maior
dificuldade apresentada a domesticao das espcies nativas, j que a produo em

25
aquicultura fica dependente das espcies exticas e hbridas, que podem trazer danos
ao meio ambiente e at mesmo as matrizes do plantel.
Segundo Chevassus (1983), hbridos de peixes podem ser ou completamente
estreis ou possuir gnadas sexuais, que maturam normalmente em ambos os sexos.
No caso de hbridos frteis, pode haver contaminao gentica do ambiente natural ou a
competio de espao e alimento com as espcies parentais (BARTLEY et al. 2001).
Dessa forma, Epifanio e Nielsen (2001) argumentam que pode acontecer a extino local
dos estoques naturais. Adicionalmente, a hibridizao ainda coloca outro problema que
a utilizao errnea dos reprodutores, que produzem hbridos de segunda gerao e
tambm o retrocruzamento com as espcies parentais, que pode contaminar as matrizes
e diminuir a qualidade da produo.
Outro problema que pode surgir o escape de indivduos hbridos e este um
dos principais meios que dispersam espcies exticas. Toledo-Filho et al. (1992)
destacam que a hibridizao tem um risco e, por essa razo, as estaes de criao
devem ter um controle rigoroso e os autores pontuam que as espcies hbridas no
devem ser distribudas para as pisciculturas particulares onde existem populaes
naturais de parentais, por haver poucos estudos sobre a hibridizao das espcies
nativas brasileiras.
Considerando a gentica, Aguiar (2012) enfoca que as populaes de cativeiros
podem ser diferentes das populaes selvagens em razo das presses seletivas. Nesse
sentido, quando h interao entre os hbridos e as espcies nativas, pode haver um
impacto negativo nas populaes selvagens, aumentando a competitividade e reduzindo
as populaes nativas. Logo, deve-se evitar as formas de escape ou liberaes
intencionais de espcies hbridas de modo a no interferir de modo irreversvel nas
populaes nativas ou silvestres.
Assim, com o intuito de aumentar a produo, h o uso recorrente da hibridizao
artificial interespecfica. Entretanto, tal hibridizao oferece srios riscos tanto para as
populaes naturais quando para as cultivadas, pois os indivduos resultantes desse
processo podem ser estreis ou apresentar um grau de esterilidade muito baixo, que
ocasiona a reduo demogrfica. Adiciona-se a isso que pode haver tambm as perdas
das caractersticas adquiridas entre uma gerao e outra e at mesmo a extino dessas

26
espcies. Apesar do uso da hibridizao ser frequente no Brasil, h uma grande
preocupao de que ocorra perda de variabilidade gentica nas populaes naturais e
nas cultivadas.

1.1.5. Gentica e a identificao de espcies comercializadas

Segundo Aguiar (2012), o tambaqui tem despertado grande interesse para as

pesquisas, principalmente aquelas relacionadas ao manejo gentico. Dessa forma, a
gentica uma das reas da biologia de extrema importncia para os recentes estudos
acerca do tambaqui, pois identificar geneticamente e conhecer a variabilidade gentica
dos estoques da aquicultura so de grande relevncia para o correto manuseio das
espcies. Liu e Cordes (2004) argumentam que h uma variedade muito grande de
marcadores moleculares, tais como Aloenzinas, DNA mitocondrial, RFLP, RAPD, AFLP,
microssatlites, SNP e marcadores EST.
Consegue-se identificar os hbridos interespecficos, que so geralmente
morfologicamente indistinguveis das espcies parentais, atravs de marcadores
genticos nucleares e tambm mitocondriais. Para que a identificao de hbridos e puros
seja devidamente feita de modo correto, utiliza-se os marcadores nucleares ou
marcadores mendelianos, pois, segundo Anderson e Thompson (2002), eles so de
origem biparental e que a primeira gerao heterozigota para todos os loci com alelos
em populao especfica, por isso eles so indispensveis para a correta identificao
dos indivduos hbridos. Para complementar a identificao, pode-se lanar mo do teste
que utiliza o DNA mitocondrial, que de origem materna e serve para indicar qual a
direo a hibridizao est seguindo (RHYMER; SIMBERLOFF, 1996).
Nos anos recentes, tem-se utilizado uma variante da PCR tradicional, que a
PCR Multiplex. Segundo Hashimoto et al (2009), esta tcnica foi desenvolvida na UNESP
Bauru e, primeiramente, tinha o objetivo de identificar os hbridos entre as espcies
Leporinus macrocephalus e L. elongatus. A PCR Multiplex funciona utilizando primes
espcie-especfica para gene -tropomiosina do DNA nuclear. Aguiar (2012) pontua que

27
a PCR Multiplex permite que duas ou mais sequencias podem ser amplificadas com mais
de um par de primes e desde que foi descrita em 1988 tem sido utilizada para diversos
fins por ser de execuo rpida (MARKOULATOS, et al., 2002).
Markoulatos et al. (2002) que o sucesso dessa tcnica depende de uma srie de
fatores, tais como a concentrao relativa dos primes, concentrao do tampo da PCR,
o balano entre o cloreto de magnsio e a concentrao de desoxinucleotdeos,
temperatura dos ciclos, quantidade de DNA molde e da Taq polimerase. Segundo Aguiar
(2012), se esses fatores estiverem devidamente equilibrados, pode-se conseguir que a
reao tenha uma otimizao adequada, j que o equilbrio parece ser a principal
dificuldade do sucesso dessa tcnica. Para o tambaqui, a PCR Multiplex teve de ser
adaptada. O estudo empreendido por Cunha (2010) para a identificao de indivduos de
tambaqui puros e hbridos mostrou excelente sucesso, mesmo quando a identificao
realizada pelos piscicultores era discordante.
Para a anlise da variabilidade gentica, o DNA mitocondrial tem sido altamente
utilizado para verificar o grau de divergncia gentica, estudar a estrutura gentica, a
biogeografia, entre outros. No caso dos vertebrados, as sequncias do DNA mitocondrial
possuem geralmente somente uma regio controle, no codificante, que responsvel
por iniciar a replicao, 13 regies codificantes de polipeptdeos, 22 RNAs
transportadores e dois RNAs ribossmicos.
Para Aguiar (2012), de um lado, a maioria dos estudos para a identificao de
Colossoma macropomum na Bacia Amaznica tem mostrado que h uma grande
diversidade halotpica, mas baixa diversidade nucleotdica nas sequncias da regio D-
loop do DNA mitocondrial. De outro, com o uso de DNA mitocondrial, a diversidade
gentica baixa. Esses estudos tambm apontam para comportamento dessa espcie,
como sendo uma espcie panmtica e migratria. Na natureza, o estudo feito por Santos
(2010) mostra que os tambaquis apresentam grande variabilidade gentica. Em relao
queles criados em cativeiro, Calcagnotto e Toledo-Filho (2000) e Castro (2008)
chegaram a concluses que a variabilidade gentica desses indivduos baixa.
Portanto, h as tcnicas que permitem a correta identificao dos indivduos
puros e os hbridos. Esses estudos so importantes porque, uma vez sabendo quais so
as espcies, os produtores podem melhor manusear, visando o aumento da produo,

28
bem como evitando formas de contaminao tanto dentro da rea da piscicultura quanto
na natureza.

29
2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral

Identificar os indivduos hbridos do tambaqui Colossoma macropomum criados

no lago da Usina Hidreltrica de Tucuru.

2.2. Objetivos especficos

Verificar se os indivduos criados no lago da Usina Hidreltrica de Tucuru so

formados s por hbridos ou puros ou uma mistura dos dois;
Comparar os resultados encontrados com a literatura acerca do tema.

30
3. MATERIAIS E MTODOS

3.1. Amostras

Foram coletadas 30 amostras de 30 indivduos pr-identificados como tambaqui.

As amostras foram extradas do msculo branco dos peixes. Os espcimes foram
coletados nos tanques-rede do Projeto de Ictiologia do Instituto Federal do Par (IFPA),
localizados no lago da Hidreltrica de Tucuru, na bacia do Tocantins-Araguai, onde os
tambaquis so considerados uma espcie extica, sito , introduzida pelo homem. Foi
utilizado o Laboratrio de Ictiologia do IFPA campus Tucuru.

Figura 6: Local de coleta das amostras de tambaquis. Fonte: Google Maps (2016).

3.2. Extrao de DNA

31
 Para extrair totalmente o DNA, utilizou-se o Wizard Genomic DNA Purification
Kit da Promega, EUA. Em suma, o protocolo da extrao se d da seguinte forma: lise
do tecido com EDTA e Nuclei Lysis Solution; digesto das protenas com Proteinase K;
degradao do RNA com RNase; separao das protenas com Protein Precipitation
Solution; precipatao do DNA com Isopropanol; purificao do DNA com Etanol; e
hidratao do DNA com Rehydration Solution (AGUIAR, 2012).
O produto da extrao de DNA foi submetido eletroferese em gel de agarose a
1% corado com GelRed 10.000X diludo conforme recomendao do fabricante, e
visualizado no transiluminador de luz ultravioleta, para serem avaliadas e estimadas a
qualidade e a quantidade do DNA resultante da extrao (AGUIAR, 2012).

3.3. PCR Multiplex

A tcnica de PCR Multiplex do gene -Tropomiosina foi utilizada para a

identificao molecular de todos os 30 espcimes coletados, usando o seguinte conjunto
de primes descritos por Gomes et al. (2012): Tropo Serra F (5`-
GAGTTGGATCGGGCTCAG- 3`), comum para as trs espcies, e Tropo Cm R (5`-
ATACAACAATGCCATCGCT- 3`), Tropo Pm R (5`-CTTCAGCTGGATCTCCTGA-3`), e
Tropo Pb R (5`-TTGACTTTATGCCACACAAAT-3`), especficos respectivamente para o
Colossoma macropomum, Piaractus mesopotamicus e Piaractus brachypomus
(AGUIAR, 2012).
As reaes de PCR Multiplex foram preparadas para um volume final de 20l
contendo 12,35l de ddH20, 1,5l de dNTPs (concentrao), 2l de Tampo10X (20mM
Tris-HCl pH 8.4, 500 mMKCl), 0,75l de MgCl2 (50 mM), 1,5lde DNA, 0,2 de Taq
polimerase (5UI/l), 0,3l Tropo Serra F, 0,3l de Tropo Pm R, 0,3l de Tropo Pb R e
0,8l de Tropo Cm R (AGUIAR, 2012).
As condies da reao foram otimizadas em desnaturao inicial 95 C por 5
minutos, seguido de 35 ciclos de desnaturao inicial a 95 C por 30 segundos,

32
anelamento a 59 por 30 segundos e extenso a 72 por 5 segundos (PCR) e extenso
final por 5 minutos (Ps PCR).
Os fragmentos de DNA gerados pela PCR multiplex, juntamente com ladder para
a determinao do tamanho dos fragmentos, foram aplicados em gel de agarose a 2%
corado com GelRed 10.000X diludo conforme recomendaes do fabricante, sendo
submetido eletroforese de 100 Volts durante 50 minutos e visualizado no
transiluminador de luz ultravioleta, e documentado por meio do sistema de imagem
KODAK Gel Logic 112.

33
4. RESULTADOS

4.1. PCR Multiplex

A reao de PCR Multiplex amplificou diferentes tamanhos de fragmento do gene

-Tropomiosina. Para mostrar que o PCR Multiplex uma ferramenta poderosa para a
identificao de vrios tipos de peixes, alm das amostras do Colossoma macropomum,
fez-se tambm o sequenciamento do Piaractus mesopotamicus, Piaractus brachypomus,
com respectivas bases em 200, 300 e 150, e de seus hbridos (Figura 7).

Figura 7: Gel de Agarose (2%) corado com GelRed, mostrando o resultado da PCR Multiplex do gene -
Tropomiosina.

A amplificao dos fragmentos de DNA dos espcimes mostra indivduos puros Pacu (3),
Tambaqui (2) e Pirapitinga (5) e de seus hbridos Tambacu (4 e 6). A coluna 1 mostra o
Ladder de 1 KB. As amostras 7 a 18 so os espcimes coletados nos tanques-rede do
lago da Hidreltrica de Tucuru. Nessas ltimas amostras, pode-se ver que a amplificao
marca 200 bases, mostrando que os indivduos analisados so espcies puras de
tambaqui; portanto, no houve hibridizao.

34
5. DISCUSSES

Sabendo que a aquicultura tem uma importncia fundamental para a alimentao

humana, o homem cada vez mais tem criado formas para aumentar sua produo. A
hibridizao, ento, se configura como uma dessas formas, j que possibilita o
cruzamento gentico entre espcie visando trazer caractersticas para os indivduos
hbridos que facilitem o manuseio, bem como aumentar a produtividade de forma a no
tornar a produo demasiadamente cara. Entretanto, essas aes humanas precisam ser
repensadas uma vez que esses programas de aquicultura causam srios impactos
biodiversidade. Nesse sentido, tem-se feito diversos estudos para analisar qual o
impacto para das populaes hibridas para a biodiversidade natural e tambm os estudos
genticos servem para mostrar quais as melhores aes a serem tomadas.
As tabelas trazidas na reviso de literatura mostram que a aquicultura brasileira
tem se expandido com o passar dos anos, crescendo cerca de 10,2% entre os anos de
2006 e 2007. Esse crescimento reflete as intervenes humanas na rea, como a
hibridizao entre espcies visando ganhar produtividade e aceitao no mercado. O
tambaqui e seus hbridos tambacu e tambatinga esto entre as espcies mais produzidas
dentro da aquicultura nacional. Alm disso, mesmo o tambaqui sendo originrio da
Amaznia, observa-se seu cultivo em praticamente todo o territrio brasileiro
(GOULDING; CARVALHO, 1982; VALENTI et al., 2000).
Com o avano da aquicultura, tem-se necessitado da ajuda da gentica para a
correta identificao das espcies e ela tem se mostrado bastante relevante para a
discriminao entre os indivduos puros e hbridos. Adiciona-se a isso o fato de esses
estudos tambm possibilitar uma viso da variabilidade gentica dos estoques nativos e
dos criados em cativeiros. Considerando o tambaqui, que uma espcie central, a
literatura sobre o tema mostra que s h uma espcie existente na bacia amaznica a
Colossoma macropomum, segundo os estudos de Santos et al. (2007) e Farias et al.
(2010). Dessa forma, esses estudos contribuem para aumentar o arcabouo terico sobe
as populaes de peixes e, logo, so importantes para a compreenso da prpria
biodiversidade natural e das tcnicas de cultivo.

35
 Aguiar (2012) argumenta que a tcnica de PCR Multiplex tem sido descrita como
uma ferramenta bem vantajosa, porque rpida, utiliza uma pequena parte de tecido de
animal vivo, seu baixo custo, etc. (HASHIMOTO et al., 2010; MAGNUSSEN et al., 2007).
Para este trabalho, a tcnica de PCR Multiplex foi altamente adequada para a
identificao das amostras coletadas no lago da Hidreltrica de Tucuru, na Bacia do
Tocantins-Araguaia. Todas as amostras analisadas so de indivduos puros, no sendo
detectado nenhum indivduo hbrido entre os trinta espcimes coletados e analisados
para esta pesquisa. Os resultados obtidos mostram que nos tanques-rede da Hidreltrica
de Tucuru parece no haver problemas graves em relao hibridizao, j que no
ocorreram espcies hbridas, embora talvez a utilizao de um nmero maior de
espcimes possa trazer concluses diferentes acerca das espcies da regio onde as
amostras foram coletadas.
Em suma, o cultivo de hbridos tem despertado interesses dos cientistas. Sabe-
se que os indivduos hbridos podem escapar do cativeiro e contaminar as espcies
nativas da Regio Amaznica. Esta tem sido a principal razo de diversos estudos do
processo de hibridizao bem como das espcies puras e hbridas e de seu potencial de
ameaa biodiversidade natural, uma vez que no processo de hibridizao tem se
utilizado espcies nativas.
guisa de concluso, a correta identificao dos indivduos puros e hbridos
utilizados na aquicultura importante para poder se conhecer os riscos. Alm disso, os
estudos mostram as implicaes comerciais e econmicas dessas espcies cultivadas.
Por isso, a necessidade da identificao das espcies comercializadas. Embora os
procedimentos genticos para identificao sejam caros, a tcnica de PCR Multiplex,
como afirma Hashimoto et al. (2010), uma alternativa mais barata e simples, que pode
ser rotineiramente utilizada para identificar as espcies tanto em cativeiro quanto na
natureza. Enfim, precisa-se tambm de uma legislao ambiental mais eficiente em se
tratando da criao e cultivo de peixes hbridos, esclarecendo toda a problemtica
envolvendo essa questo.

36
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42
 ANEXOS

ANEXO A Imagens de alguns espcimes de tambaqui coletados

Anexo A 1: Espcime 22

Anexo A 2: Espcime 26

43
Anexo A 4: Espcime 27

Anexo A 3: Espcime 28

44
Anexo A 6: Espcime 29

Anexo A 5: Espcime 30

45