UNIVERSIDAD AUTNOMA DE ZACATECAS

Francisco Garca Salinas

UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS QUMICAS

PROGRAMA ACADMICO DE QUMICO

FARMACUTICO BILOGO

TESIS

Obtencin e identificacin de carbohidratos

en Agave spp

Que para obtener el Ttulo de:

Qumico Farmacutico Bilogo

Presenta:
LETICIA DE JESS LPEZ HERNNDEZ

Zacatecas, Zac., Febrero de 2016.

 UNIVERSIDAD AUTNOMA DE ZACATECAS
Francisco Garca Salinas

UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS QUMICAS

PROGRAMA ACADMICO DE QUMICO FARMACUTICO BILOGO

TESIS
Obtencin e identificacin de carbohidratos en Agave spp

Que para obtener el Ttulo de:

Qumico Farmacutico Bilogo

Presenta:
LETICIA DE JESS LPEZ HERNNDEZ

DIRECTORES DE TESIS
Dra. en C. Marisol Galvn Valencia
Dr. en C. Edgar Len Esparza Ibarra

ASESORES Y REVISORES
Dra. en C. Luca Delgadillo Ruiz
M. en C. Perla Ivonne Gallegos Flores

Zacatecas, Zac., Febrero de 2016.

 AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Autnoma de Zacatecas en especial a la Unidad

Acadmica de Ciencias Qumicas por darme la formacin en el

programa acadmico de Qumico Farmacutico Bilogo.

A todos los profesores del programa de Acadmica de Qumico

Farmacutico Bilogo, por trasmitirme sus conocimientos, forjando con ellos,
al profesionista que hoy soy.

Al laboratorio de Biotecnologa de la Unidad Acadmica de Ciencias

Biolgicas de la UAZ por brindarme el espacio, equipos, reactivos necesarios
para llevar a cabo esta investigacin.

A mi director de tesis Dr. En. C. Edgar Len Esparza Ibarra que sin
conocerme confi en m, y puso en estas manos la presente investigacin
adems de brindarme sus conocimientos y apoyo.

A mis asesores de tesis, a la Dra. MARISOL GALVN VALENCIA por

aceptar ser mis asesores adems de prestarme su tiempo y rea de trabajo.
De manera muy especial a la Dra. LUCA DELGADILLO RUIZ y M. en C.

PERLA IVONNE GALLEGOS FLORES por su mucha tolerancia, consejos,

apoyo, amistad y por supuesto la incondicional ayuda en el laboratorio.

 DEDICATORIA

A mis padres en especial a mi madre, Ma. Cruz Esperanza Hernndez

Velzquez quien me dio la vida, por sus regaos y consejos: que me han
hecho esforzarme, fuerte, responsable y tolerante adems hizo todo lo
posible por que su hija pequea tuviera una profesin, Gracias mami, te
quiero mucho.

A mis hermanos. Cruz, Alfredo, Yolanda, Laura y Alejandra, por cuidarme,

quererme, protegerme, apoyarme, aconsejarme, por darme todo lo que a
ellos les falto, por ser los amigos que nunca tuve y por su cario.

A mi pap Pablo y a mi ta Mara por consentirme, por darme el apoyo

que a veces me faltaba para salir a delante y por saberme guiar. Los extrao.
QDEP.

A mis tos que siempre de alguna manera me apoyaron, por su paciencia y

confianza.

A mi amiga Bere por apoyarme en las buenas y malas en toda la carrera,

por ser la mejor amiga que eh tenido, por estar siempre a mi lado cuando yo
lo necesito. Gracias.

A todas las personas que me dijeron no poda, porque gracias a ellas no

me rend y segu a delante para demostrarles que si puedo. A las que
entraron en mi vida y se han vuelto importantes porque a su manera se
preocupan y me dan consejos.
 NDICE
LISTA DE FIGURAS. ................................................................................................... I
LISTA DE TABLAS ..................................................................................................... II
RESUMEN ................................................................................................................. III
I. INTRODUCCIN ................................................................................................. 1
II. ANTECEDENTES ................................................................................................ 3
2.1. Azcares ........................................................................................................... 3
2.1.1. Clasificacin de los azcares ..................................................................... 4
2.1.2. Estructura de los azcares ......................................................................... 8
2.2. El Agave............................................................................................................ 9
2.2.1. Macromorfologa de agaves ..................................................................... 11
2.2.2. Agave tequilana Weber ............................................................................ 13
2.2.3. Agave salmiana ........................................................................................ 15
2.2.4. Agave americana...................................................................................... 19
2.3. Metodos de Cromatografa ............................................................................. 21
2.3.1. Clasificacin de cromatografa ................................................................. 22
2.3.2. Clasificacin de la cromatografa liquida .................................................. 22
2.3.3. Cromatografa en capa fina ...................................................................... 23
2.3.4. Cromatografa de lquidos de alta eficacia HPLC ..................................... 28
2.4. Espectrometra IR ........................................................................................... 39
III. JUSTIFICACIN ................................................................................................ 40
IV. HIPTESIS ........................................................................................................ 41
V. OBJETIVOS ....................................................................................................... 41
VI. MATERIALES Y MTODOS ........................................................................... 42
6.1. Obtencin de la muestra ................................................................................. 42
6.2. Cromatografa en capa fina ............................................................................. 45
6.3. La estructura qumica de los extractos mediante la tcnica de FTIR .............. 46
6.4. HPLC .............................................................................................................. 46
VII. RESULTADOS Y DISCUSIN........................................................................ 47
VIII. CONCLUSIONES........................................................................................... 63
IX. LITERATURA CITADA .................................................................................... 64
 LISTA DE FIGURAS.

Figura 1. Morfologa de la planta de agave. .................................................................... 1

Figura 2. Estructura de monosacridos simples ............................................................. 4
Figura 3. Estructura de monosacrido derivado ............................................................. 5
Figura 4. Estructura de Oligosacridos ........................................................................... 6
Figura 5 Estructura de un polisacrido. .......................................................................... 7
Figura 6. Anatoma del Agave. ..................................................................................... 12
Figura 7. Agave tequilana Weber.................................................................................. 13
.Figura 8 Agave salmiana. ............................................................................................ 15
Figura 9 Agave americana ............................................................................................ 19
Figura 10. Orden de elucin y polaridad de compuestos utilizados en cromatografa .. 26
Figura 11 Clculo de Rf ................................................................................................ 26
Figura 12. Esquema de un aparato de HPLC ............................................................... 29
Figura 13. Esquema de un espectrmetro de FTIR. ..................................................... 38
Figura 14. Determinacin del pH por tirilla indicadora. ................................................. 43
Figura 15. Refractmetro. ............................................................................................. 44
Figura 16. Equipo Thermo scientific utilizado para el anlisis de FTIR. ........................ 46
Figura 17. Placa de CCD para revelar los estndares de azcares ............................. 49
Figura 18. Cromatografa en capa fina de Agave salmiana. ......................................... 50
Figura 19. Cromatografa en capa fina de Agave tequilana Weber. .............................. 50
Figura 20. Cromatografa en capa fina de Agave americana. ....................................... 51
Figura 21. Espectro FT-IR de estndares de azcares................................................. 53
Figura 22. Espectro FT-IR del Agave salmiana. ........................................................... 53
Figura 23. Espectro FT-IR del Agave tequilana Weber. ................................................ 54
Figura 24. Espectro FT-IR del Agave americana. ......................................................... 55
Figura 25. Espectros obtenidos por HPLC de los jugos de Agave tequilana Weber. ... 59
Figura 26. Espectros obtenidos por HPLC de los jugos de Agave americana .............. 61
Figura 27. Espectros obtenidos por HPLC de los jugos de Agave salmiana ................ 62

i
 LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Uso tradicional de los agaves en Mxico. ....................................................... 10

Tabla 2 Descripcin taxonmica de Agave tequilana Weber ........................................ 13
Tabla 3. Caractersticas de la planta agave .................................................................. 16
Tabla 4. Descripcin taxonmica del Agave salmiana. ................................................. 17
Tabla 5. Caractersticas de los detectores de HPLC. ................................................... 32
Tabla 6. Composicin general en la planta de agave. .................................................. 47
Tabla 7. Determinacin de pH y Bx ............................................................................. 48
Tabla 8. Valor de azcares en cromatografa en capa fina. .......................................... 49
Tabla 9. Muestras de jugos de los agaves y su concentracin empleados en HPLC. .. 56
Tabla 10. Estndares y tiempos de retencin ............................................................... 57
Tabla 11. Carbohidratos y concentraciones (mg/ml) determinadas en los jugos de los
Agaves americana, salmiana y tequilana Weber.. ........................................................ 58

ii
 RESUMEN
La inulina es un carbohidrato de reserva en las plantas del gnero Agave. En las
fbricas de mezcal este polisacrido se somete a hidrlisis trmica para liberar
fructosa y glucosa, los cuales son fermentados junto con otros monosacridos y
disacridos para producir alcohol (mezcal). El objetivo de este estudio fue caracterizar
cualitativa y cuantitativamente los carbohidratos presentes en jugos crudos e
hidrolizados de los Agaves tequilana Weber, americana y salmiana. Para la
identificacin cualitativa, se utiliz el mtodo de cromatografa en capa fina (TLC
CCF) y espectroscopa infrarroja con transformada de Fourier (FTIR). Para la
cuantificacin de los carbohidratos, se utiliz la tcnica analtica de Cromatografa
Liquida de Alta Eficiencia O Resolucin (HPLC). FTIR es una de las tcnicas
analticas que permiti identificar grupos funcionales presentes en los compuestos
orgnicos debido a la diferencia en el momento dipolar de los enlaces, esto permiti
identificar y efectuar un anlisis comparativo de dichas molculas presentes en las
diferentes muestras de Agaves, adems de los estndares empleados de
carbohidratos. Las concentraciones de azcares por HPLC se reportaron en mg/ml,
los Agaves tequilana Weber y salmiana presentaron concentraciones bajas, en tanto
que para el jugo de Agave americana crudo present las concentraciones ms altas;
Fructosa (85.24 mg/ml), Dextrosa (87.25 mg/ml), Sacarosa (3.65 mg/ml) y Trehalosa
(6.72 mg/ml). Con los resultados obtenidos se puede concluir que existe presencia de
carbohidratos y metabolitos importantes en los Agaves tequilana Weber, americana y
salmiana, siendo identificados los azucares Xilosa, Arabinosa, Fructosa, Dextrosa,
Sacarosa, Galactosa y Trehalosa, esta ltima slo en Agave americana.

Palabras clave: Jugo de Agave, CCF, HPLC, FTIR

iii
 I. INTRODUCCIN

El gnero Agave, cuyo significado es admirable o noble fue descrito por Carlos
Linneo en 1753 y es uno de los grupos de plantas que se encuentra mayormente
Mxico que en el mundo y que ha jugado un papel importante en el desarrollo de la
cultura Mexicana y de otros pueblos de Amrica (Grentry, 1982).

La familia Agavaceae est compuesta de 8 gneros con 273 especies

aproximadamente; 205 crecen en Mxico (75%) y 151 son endmicas (55%). En
Mesoamrica, el Agave o Maguey ha sido importante desde hace 9,000 aos y desde
el punto de vista de grupos tnicos como los Huicholes, fue la primera planta creada
por Dios. Adems segn descripciones tiene ms de 100 usos y actualmente se
reportan por lo menos 70 formas de empleo, entre las que destacan la produccin de
bebidas como el aguamiel, el pulque, el tequila y el Mezcal entre otros (Granados,
1993).

La planta del agave est conformada por dos partes principales que son: la cabeza o
la pia y las hojas (Figura 1). La cabeza o pia representa la parte comercial de la
planta y se utiliza como materia prima en le proceso de elaboracin de la bebida
espiritual (Iiguez et al., 2001). En esta parte de la planta se almacenan una gran
cantidad de azcares en forma de inulinas entre otras.

[http://tequilasabeapasion.blogspot.mx/] .
Figura 1. Morfologa de la planta de agave.
1
La cantidad y el tipo de azcares que contiene las pias del agave son muy
importantes debido a que stos son utilizados por las levaduras para la obtencin de
etanol y de los compuestos que proveen las caractersticas sensoriales u
organolpticas del producto. Los azcares son los tipos ms sencillos de hidratos de
carbono. Una azcar es un compuesto mixto: o es un aldehdo-alcohol o una cetona
alcohol.

2
 II. ANTECEDENTES

2.1. Azcares

El nombre de azcar, glicido o glcido hace referencia al sabor dulce de los azcares
sencillos y el nombre de hidratos de carbono refleja que, en la gran mayora de ellos,
el hidrgeno (H) y el oxgeno (O) guardan la misma relacin que en el agua (H 2O), es
decir que, aparentemente, son hidratos. Su frmula general es C 6(H2O)m (Marcarolla y
Goi, 1994).

Los azcares sencillos abundan en las frutas (glucosa, fructosa, sacarosa) y en la

leche (lactosa); en cambio, sus polmeros abundan en los cereales, tubrculos y
legumbres (almidn), hgado y carnes (glucgeno). La sustancia orgnica ms
abundante en la biosfera es la celulosa, un azcar fibroso indigerible para el hombre
(Marcarolla y Goi, 1994). Las principales funciones biolgicas de los azcares son
tres:

a) Constituyen el material energtico de uso inmediato: la glucosa es el principal

azcar utilizado por todas las clulas como fuente de energa.

b) Puede constituir un material energtico de reserva: el almidn en los vegetales

y el glucgeno en los animales se acumulan en determinadas clulas para su
utilizacin en el momento oportuno.

c) Cumplen funciones estructurales: la celulosa y otro azcares fibrosos

constituyen la pared externa de las clulas vegetales; las condroitinas forman
fibras en los tejidos conjuntivos, cartilaginosos y seos; adems, los azcares
participan en la estructura de otras biomoleculas, tales como los fosfolpidos,
glicolipidos y glicoprotenas de membrana, cidos nucleicos, etc.

3
 2.1.1. Clasificacin de los azcares
De acuerdo con su naturaleza qumica, los azcares suelen clasificarse en cinco
grupos:

Monosacridos simples
Monosacridos derivados
Oligosacridos
Polisacridos simples
Polisacridos derivados

2.1.1.1. Monosacridos simples

Son los aldehdos o cetonas polihidroxilados. Los monosacridos que tienen un grupo
aldehdo se denomina aldosas y los que tienen un grupo cetona, cetosas. El nmero
de tomos de carbono que integran la molcula del monosacrido se designa con un
prefijo griego que se antepone a la terminacin osa: triosas (3), tetrosas (4), pentosa
(5), hexosas (6) (Marcarolla y Goi, 1994).

Figura 2. Estructura de monosacridos simples

Los monosacridos simples son slidos, blancos, cristalinos, solubles en agua y en

general tienen sabor dulce. Suelen desviar el plano de la luz polarizada por lo que se
dice que tienen poder rotatorio y reducen en determinadas condiciones, el ion cprico
(azul) a cuproso (rojo), es decir, tienen poder reductor. En las frutas abundan la

4
glucosa (una aldohexosa) y la fructosa (una cetohexosa). Tiene inters estructural la
ribosa (una aldopentosa) por formar parte de los cidos ribonucleicos (RNA).

2.1.1.2. Monosacridos derivados

Se obtienen por modificacin qumica de los monosacridos simples: por reduccin,
oxidacin o sustitucin. Por reduccin se originan los desoxiazcares y los alditoles.
Los desoxiazcares carecen de hidroxilo en uno de sus carbonos; as la ribosa origina
la desoxirribosa que forma parte del cido desoxirribonucleico (DNA).

Figura 3. Estructura de monosacrido derivado

Los alditoles se forman por reduccin del grupo aldehdo a alcohol; as las triosas
originan el glicerol, presente en los lpidos. Por oxidacin se forman los azcares
cidos, como el cido glucurnico que facilita la eliminacin renal de sustancias poco
solubles en agua como la bilirrubina y los esteroides. Por sustitucin se forman los
aminoazcares, como la glucosamina, que forma parte de algunos polisacridos
(Marcarolla y Goi, 1994).

2.1.1.3. Oligosacridos
Se forman por condensacin de dos o ms monosacridos simples. En general,
reacciona el grupo aldehdo de un monosacrido con un grupo alcohol (o con el grupo
cetona o aldehdo) de otro, originando as un disacrido. Por sus propiedades

5
qumicas se clasifican en reductores, cuando conservan un grupo aldehdo o cetona
libre, y no reductores, si no les queda libre ningn grupo aldehdo o cetona.
Los ms importantes son:
Reductores: maltosa (glucosa + glucosa) procedente de la digestin parcial del
almidn y del glucgeno; lactosa (galactosa + glucosa) que es el azcar de la
leche.

No reductores: sacarosa (glucosa + fructosa) que es el azcar de mesa,

procedente de la caa, remolacha, etc.

Figura 4. Estructura de Oligosacridos

Las propiedades de los disacridos son semejantes a las de los monosacridos. Basta
considerar un azucar (sacarosa) para comprobar que es slido, blanco, cristalino,
soluble en agua, dulce (Marcarolla y Goi, 1994).

6
 2.1.1.4. Polisacridos simples
Son polmeros lineales o ramificados de monosacridos simples. Se puede encontrar
desde unas cuarenta fructosas consecutivas en una molcula de inulina (polisacrido
de tubrculos), hasta varios centenares de glucosa unida de manera lineal en la
amilosa, e incluso millares de ellas unidades en forma ramificada en la amilopectina y
el glucgeno. Segn sus funciones biolgicas se agrupan en polisacridos de reserva
y polisacridos estructurales.

Figura 5 Estructura de polisacridos.

Polisacridos de reserva
Los ms importantes estn constituidos por numerosas unidades de glucosa. La
amilosa o almidn lineal consta de unas 200 glucosas, con enlaces entre el carbono 1
de una glucosa y el 4 de la siguiente. Es soluble en agua y de fcil digestin para el
hombre. La amilopectina o almidosa ramificado consta de un nmero mayor de
unidades de glucosa. Las ramificaciones se producen por enlaces entre los carbonos
1 y 6 de dos glucosas. Es soluble en agua caliente y tambin se digiere. El glucgeno
o almidn animal es semejante a la amilopectina pero tiene mayor nmero de
unidades de glucosa y est ms ramificado. Es tambin soluble en agua y digiere
bien. En el laboratorio se diferencia estos polmeros por su reaccin con el iodo
(Marcarolla y Goi, 1994).

Polisacridos estructurales
Forman fibras, en general lineales, por la unin de muchas unidades de
monosacrido. El polisacrido ms importante es la celulosa constituida por ms de
un millar de glucosas enlazadas linealmente. Por la naturaleza especial de su

7
estructura, la celulosa es insoluble en agua e indigerible por el hombre. Los alimentos
ricos en celulosa, como las verduras, suelen considerarse de escaso valor calrico, al
no poder aprovecharse este azcar (Marcarolla y Goi, 1994; Ibarra et al., 2010).

2.1.1.5. Polisacridos derivados

Son polmeros de monosacridos derivados. Pueden estar constituidos: por un solo
monmero, por dos monmeros repetidos en secuencia alternante o por ms
componentes.

2.1.2. Estructura de los azcares

Todos los monosacridos simples tienen una estructura qumica semejante. Los
tomos de carbono suelen formar una cadena lineal; el primero o el segundo tienen
una fusin oxo (aldehdo o cetona) (=O) y los dems estn hidroxilados (>CHOH).
Suelen agruparse en las familias de las aldosas y de las cetosas.

La aldosa de tres carbonos es el gliceraldehido. En general conviene utilizar la frmula

simplificada que omite los tomos de hidrogeno (que se presuponen) y representa los
grupos qumicos. El carbono 2 del gliceraldehido est unido a cuatro grupos
diferentes:-H, -OH, -CHO y CH2OH. Como su disposicin espacial es tetradrica,
carece de plano de simetra. En consecuencia, la molcula del gliceraldehido es
asimtrica y presentara poder rotatorio. Los azcares ms importantes pertenecen a
la serie D por considerarlos derivados de la D-gliceraldehido. El OH de referencia
corresponde al penltimo tomo de carbono (Marcarolla y Goi, 1994).

8
 2.2. El Agave.

El Maguey o Agave, fue llamada planta del siglo, Aloe del siglo y Aloe
americana, su nombre proveniente de la palabra griega agavos que significa ilustre o
admirable, apta para describir algunas plantas nobles y magnificentes. En el Mxico
prehispnico para las diversas etnias que lo habitaban el maguey o agave las enlazaba
con la divinidad, as por ejemplo los huicholes la consideraban la primera planta de la
creacin, para los Aztecas era la representacin de Mayhuel diosa de la fecundidad,
mientras que los diferentes pueblos del altiplano adoraban a los Centzon y Totochtin
dioses de la embriaguez [SEDECO, 2004]. De manera general a lo largo de la
milenaria historia de Mxico el agave ha formado parte del desarrollo cultural y hasta
nuestros das se le dan diversos usos como alimento, para fines medicinales, religioso
y textil, y como elemento de construccin e incluso ornamental [Narvez y Snchez,
2009].

El agave ha sido utilizado para la fabricacin del aguamiel, produciendo en su vida

productiva (que es de unos cuantos meses) de 500 a 1000 L, al fermentarse el
aguamiel se convierte en pulque considerado como la bebida ms antigua y de ms
tradicin que an se produce. Ambas bebidas tienen propiedades alimenticias por su
contenido de azcares, aminocidos esenciales y vitaminas. Con el agave se obtienen
diferentes usos como se describe en la Tabla 1.

Sin duda alguna uno de los productos ms demandados del agave es el tequila, el
licor mexicano ms consumido en el mundo, reportndose en el primer trimestre del
ao en curso la elaboracin de 56.5 millones de litros de destilado exportando un
17.7% de este [CRT, 2015]. La materia prima est restringida por ley al agave azul, es
decir la especie: Agave tequilana Weber (gnero Agave, familia agavaceae, orden
asparagales, Subclase liliidae, clase liliopsida, divisin magnoliophyta, reino plantae)
que se cultiva principalmente en el estado de Jalisco, en el oeste-centro de Mxico.

9
 Tabla 1. Uso tradicional de los agaves en Mxico.

Concepto Uso Partes y productos que se obtienen

a partir de la planta
Alimenticio Aguamiel Pia del maguey
Jugo dulce Quiote
Atoles Aguamiel
Jarabe Aguamiel concentrada
Mezcales Pia de los agaves mezcaleros
Pulque Aguamiel fermentada
Aguardiente Pulque destilado
Miel Aguamiel concentrada
Vinagre Aguamiel fermentada
Tequila Pia del agave tequilero
Condimento y Gusanos blancos Pencas
comida Gusanos rojos (chinicuiles) Races
Sal de gusano Pia
Postre Quiote asado, pia horneada
Saborizante de tamales y Aguamiel y pia
pan
Levadura Residuos del pulque
Tortilla Quiote
Condimento Pulque
Tejido y Hilos para Costales, bolsas, Fibras de las pencas
Vestuario mantas, telas, lazos,
cuerdas para instrumentos
musicales, cuerdas para
arcos de caza, redes de
pesca
Construccin Techos a modo de tejado Pencas frescas
Vigas Quiote seco
Aditivo para mezcla Baba de la penca
Uso domstico Jabn para ropa Races y pencas
Recipiente para agua Pia
Recipiente para comida Penca
Ornato Adornos de navidad Maguey completo
Juguetes para nios Semillas
Agrcola Deslinde de terrenos Maguey completo
Abono Cenizas de pencas y pias secas
Proteccin contra la erosin Maguey completo
Forraje Alimento para aves Residuos del pulque
Religioso Bebida ritual Aguamiel y pulque
Fuente: Grentry (1982).

10
 El mezcal y el tequila, se obtienen fermentando los azcares presentes en la
cabeza (pias) del agave con alto contenido de frtanos que son oligmeros
constituidos principalmente de unidades de fructosa unidas a una molcula de
sacarosa, siendo fcilmente hidrolizados por tratamiento trmico o enzimtico,
generndose los azcares libres para su fermentacin en alcoholes. Una gran cantidad
de procesos se han publicado y otros tantos patentado para extraer y purificar los
polisacridos del agave, as como para utilizar algunos otros de sus componentes
[Narvez et al., 2009].

2.2.1. Macromorfologa de agaves

El gnero Agave cuenta con 197 taxones, es una panta monocrpica dado que
solo florea una vez en su vida para despus finalizar su ciclo de vida. Sus hojas se
disponen en rosetas y tienen forma lanceolada (forma de lanza), rgidas, carnosas,
acabadas en espina con los mrgenes dentados y espinosos, sin tallo o con tronco
corto. La zona donde reside la base de las hojas tiene el nombre de corazn o pia.
Posee inflorescencias en espigas o racimos situados sobre un largo escapo. El
perianto tiene forma tubular con los estambres sobresaliendo a ste. Su fruto se
encuentra en cpsula, con semillas negras achatadas [Aguirre et al., 2001].

Son plantas hermafroditas y monocotiledneas, es decir, que su semilla es

indivisible como la del maz. Se reproducen de dos formas, una es cortar sus flores y
de cada ptalo se forma una yema que da origen a un hijuelo, la otra es a partir de un
rizoma que surge de la base de la planta que al encontrarse al ras del suelo, le da el
sol y entonces crece una yema que da origen a un hijuelo (Figura 6). En los dos casos
se siembran estos hijuelos en invernaderos hasta que salgan races (de 3 a 4 aos).
Posteriormente son trasplantados al lugar definitivo hasta que alcance el tamao
necesario para cosecharlos. Tambin puede realizarse la reproduccin in vitro, en
donde los hijuelos se obtienen a partir del Maguey, mediante tratamiento realizado a
nivel laboratorio. Por germinacin de semillas que se cultivan en viveros previamente
acondicionadas para despus ser trasplantadas a otra zona de cultivo [Aguirre et al.,
2001].
11
 Figura 6. Anatoma del Agave [Arrizaga et al., 202].

Este gnero tiene un metabolismo de tipo CAM (metabolismo cido de las

crasulceas), esta fisiologa se le atribuye por ser una planta con escasa disponibilidad
de humedad o de CO2 [Andrade et al., 2007]. Utilizan de manera eficiente el H2O al
perder de 50 a 100 g por 1 g de CO2, el cual es absorbido durante la noche con la
apertura de los estomas y accin de la enzima fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC) y
es guardado en las vacuolas como cido mlico, durante el da el cido mlico es
descarboxilado por medio de la enzima rubulosa bifosfato carboxilasa (Rubisco),
obteniendo as carbono el cual es utilizado por la planta para la produccin de
carbohidratos [Dood et al., 2002]. Dentro de las especies del agave las que presentan
este tipo de metabolismo tenemos al A. americana, A. fourcroydes, A. lechuguilla y A.
tequilana. (Garca, 2007)

12
 2.2.2. Agave tequilana Weber

El gnero agave se considera originario de Mxico, donde se encuentran 272 de las

310 especies reportadas, con 135 especies endmicas. Varias especies son
econmicamente importantes, entre ellas el Agave tequilana Weber var. azul (Figura
7), el cual constituye la materia prima para la produccin de tequila (Pea et al., 2004).

Figura 7. Agave tequilana Weber

2.2.2.1. Clasificacin Taxonmica.

Tabla 2 Descripcin taxonmica de Agave tequilana Weber

Reino: Plantae
Divisin: Magnoliophyta
Clase: Liliopsida (Monocotiledneas)
Subclase: Liliidae
Orden: Liliales
Familia: Agavaceae
Gnero: Agave
Subgnero: Agave
Seccin: Rigidae
Especie: tequilana Weber
Fuente: Bravo y Snchez, 1989.

13
 2.2.2.2. Descripcin

Fsicamente est integrada por dos fracciones principales: hojas y tallo. El tallo y las
bases de las hojas que se unen a l comprenden la porcin conocida con el nombre
de cabeza o pia (Iiguez et al., 2001). Sus hojas son delgadas, largas, fibrosas, en
forma lanceolada, planas, color azulado; se encuentran dispuestas en forma de
roseta, generalmente con espinas en los mrgenes o dientes y una espina terminal.

Los elementos ms importantes que la forman son fibras, azcares, sales minerales y
agua alrededor del corazn del agave se encuentra las pencas que son los tallos de
las hijas. En el centro de la pia se acumula el jugo natural, el cual tiene a los
contenidos de fructosa y otras propiedades vitamnicas, adems de partculas grasas
que le dan su distinguido sabor y olor. Su reproduccin puede ser sexual o asexual
mediante los vstagos que emergen de rizomas de la planta madre (Rodrguez, 2004).
En condiciones ptimas de madures de la planta, tiene un rico contenido de azcar,
un ingrediente bsico para producir el tequilla. Presenta metabolismo acido de las
crasulceas. Este tipo de metabolismo se descubri en especies de la familia
crasulacea, razn por la cual a los vegetales que lo presentan se les denomina planta
CAM

El Agave tequilana Weber azul es la nica variedad admitida para la elaboracin de

tequila y debe ser cultivada dentro del territorio comprendido en la declaracin y estar
inscrito en registro de plantacin de predios, inscripcin que debe hacerse como
mximo durante el ao calendario siguiente a su siembra.

Los meses clidos son ideales para la siembra del agave variedad azul (marzo, abril,
mayo y mitad de junio), despus de esta temporada llega las lluvias que permiten
enraizar el agave, y con la temporada de calor, empieza el desarrollo normal y la
mayor concentracin de azcares. El ciclo biolgico del cultivo oscila entre 6 y 8 aos
contando los dos aos que permanece con la madre antes del desarrollo como una
planta sola. Durante este tiempo, el crecimiento de la pia o cabeza, la cual puede
llegar a pesar entre 35 y 120 Kg, depende del cuidado dado por el agricultor: quita

14
parsitos, malezas y agrega abonos, de ms del control de las precipitaciones que se
presenten en la zona de cultivo, puesto que las lluvias excesivas no permiten el buen
desarrollo de la especie.

En una plantacin, para ofrecer un buen manejo, la condicin ideal es mantener en el

cultivo una distancia de un metro entre planta y planta de una misma hilera y tres
metros como mnimo entre hileras. Se han realizado anlisis a las pias del Agave
tequilana weber y estos muestran que contienen aproximadamente un 75% de
carbohidratos, de los cuales se han identificado glucosa, dextrinas, almidn y
principalmente inulina (Arrazola, 1969).

2.2.3. Agave salmiana

Los agaves son de gran importancia econmica y social en nuestro pas,

desafortunadamente el A. salmiana est en peligro de extincin. A partir del Agave se
producen aglomerados, fructosa, azcar natural de mayor poder edulcorante, en otros
pases se usa para elaborar alimentos, sueros y medicamentos para los diabticos
(Martnez, 2003 y Nikam, 1997).

.Figura 8 Agave salmiana.

15
 2.2.3.1. Descripcin
Las especies A. salmiana, Otto, (maguey de pulque) pertenecen al grupo salmianae y
son originarias del Altiplano Mexicano, conocido como grupo central y su cultivo se
desarrolla entre los 1,200 a 2,500 m de altitud con lluvias de 350 a 1,000 mm
anuales. Algunas caractersticas relacionadas con su descripcin botnica, se
presentan en la tabla 2.

2.2.3.2. Caractersticas de la planta del agave.

Tabla 3. Caractersticas de la planta agave

Parte de la planta: Caractersticas:

Raz Rizomas subterrneos
Tallo Tallos cortos a grandes
Hojas Angostas, gruesas y carnosas, que nacen del tallo y
rematan en una espina fuerte y oscura
Flor Inflorescencias paniculadas con flores hermafroditas
Frutos Cpsulas o bayas que contiene numerosas semillas
comprimidas

Las hojas comnmente conocidas como pencas se distribuyen en forma de espiral

alrededor del tallo; adems, almacenan sustancias que en su momento intervendrn
en el espectacular crecimiento de la inflorescencia. En el caso de los magueyes, las
pencas constituyen un mecanismo de defensa de la planta, pues tanto las espinas de
los bordes como las terminales las protegen de los animales que desean comerse el
tallo y las flores. Tal disposicin de las hojas permite, captar con el mximo de
eficiencia, las pocas y errticas lluvias que caen en su hbitat. Los agaves florecen
slo una vez y mueren al poco tiempo. La edad de maduracin depende de muchos
factores, en particular de la especie. En el centro de la planta crecer un tallo que
puede llegar a 10 m de altura en un lapso de dos a cuatro meses, en la cspide
16
surgen racimos de flores verde- amarillentas; que en muchas especies, contienes
nctares que atraen aves e insectos, que contribuyen a la polinizacin e hibridacin de
las especies (Grentry, 1982).

2.2.3.3. Descripcin taxonmica del Agave salmiana

La descripcin taxonmica del agave pulquero se presenta en la Tabla 4.

Tabla 4. Descripcin taxonmica del Agave salmiana.

Reino Vegetal
Divisin Fanergamas
Subdivisin Angiospermas
Clase Monocotiledneas
Familia Agavceae
Gnero Agave
Especie salmiana

2.2.3.4. Antecedentes y usos

El Agaves salmiana pueden alcanzar 2 o ms metros de altura y pueden vivir entre 10
y 15 aos. La superficie verde total de la planta puede llegar a 75,000 cm 2. Las clulas
de su epidermis regulan la transpiracin y evitan la prdida de agua, con lo cual
estabilizan la temperatura interna. De esa manera, an en las pocas de sequa son
ricas en jugos. El principal producto que se ha obtenido hasta la fecha de esta planta
es el aguamiel, destinado exclusivamente a la elaboracin de pulque el cual es una
bebida alcohlica nutritiva (Snchez y Hope, 1953 y Ruiz et al., 1999). El
aprovechamiento de los agaves en el territorio mexicano ha presentado varias etapas
en este siglo.

Hace cinco aos, la Organizacin de las Naciones Unidas para la Alimentacin y la

Agricultura (FAO) declar a la planta en peligro de extincin, sto debido a que la
actual poblacin productora de maguey es muy reducida y se estima que posee

17
alrededor de poco ms de 50 mil ejemplares. Se ha detectado adems, que se han
venido perdiendo a lo largo de la historia productiva, variedades de alto rendimiento
(Garca, 1994).

Entre otros usos vigentes de los magueyes se encuentra el empleo de la cutcula de la

hoja (penca) y la inflorescencia (quiote) en la elaboracin de algunos platillos
culinarios regionales; as mismo, la parte central de la planta es utilizada en la
elaboracin de dulces. A pesar del estado actual que guarda su cultivo y los beneficios
que aportan los agaves a los pobladores de estas reas marginales, la importancia
agroindustrial del maguey es aun extensa, no obstante de factores limitantes como
son largo periodo de cultivo, las pobres prcticas culturales de los vstagos para
renovar las poblaciones y sobre todo, el deterioro gentico de material lite (Grentry,
1982).

La etapa productiva del maguey empieza cuando ste es capado; es decir, cuando
se le corta el conjunto de pencas ms tiernas del centro de la planta para que al cabo
de cuatro meses, inicie a dar sus volmenes iniciales de aguamiel, produccin que
generalmente dura por un periodo de 3-4 meses, en el que alcanza a producir en
promedio 300 litros. De la fermentacin del aguamiel, que tarda menos de 24 horas,
se obtiene la bebida alcohlica conocida como pulque. El aguamiel es un lquido
dulce, ste puede ser cido o ligeramente alcalino, incoloro y transparente. Posee un
ligero olor herbceo y contiene diversos minerales, adems de ser rico en
carbohidratos y protenas (Grentry, 1982). De acuerdo a Ruiz et al. (1999) la
composicin qumica de aguamiel se conoce rudimentariamente desde 1858.
Destacan la humedad, glucosa, fructuosa, maltosa, sacarosa, sustancias minerales y
protenas. La composicin del aguamiel vara en funcin de los factores ambientales,
la edad del maguey en su poca de produccin.

18
 2.2.4. Agave americana.

La pita o agave americana es una planta crasa o suculenta, perenne, pertenece a la

familia agavecea (Agavceas), de origen mexicano, su nombre procede del griego
agaue que significa admirable; este es la especie ms conocida dentro de los
agaves. Apenas tienen tallo y las hojas nacen desde el suelo, unidas por la base en
roseta. Las hojas son azuladas, carnosas, lanceoladas, coriceas, puntiagudas, y
bordeadas de fuertes espinas, emite un tallo floral de 10 o 12 metros de altura cuando
la planta llega su madurez entre los 10 y 20 aos de edad. Cuando termina la vida de
este escapo floral (meses) la planta muere. La remplazan mltiples hijos a su
alrededor que se trasplantan bien. El tallo floral emergerse a principios de primavera,
crece y crece, para florecer en verano, las flores son numerosas, tubulares y
amarillentas. El jugo de las hijas puede producir ceguera en contacto con los ojos; en
la piel produce irritacin. Las formas jaspeadas de la Agave americana suelen ser las
nicas comercializadas. Son las siguientes, entre otras:

Figura 9 Agave americana

Agave americana mediopicta (agave variegado): ancha banda blanca cremosa

en el centro de la hoja.
Agave americana Variegata: bordes color blanco cremoso
Agave americana Marginata: hojas con anchos bordes amarillos.

19
 2.2.4.1. Usos
Crece asilvestrada en taludes y sitios incultos de la regin mediterrnea y es plantada a
menudo en jardines. En Mxico se hace una bebida fermentada llamada "pulque" con el
jugo azucarado que se obtiene de cortar los escapos jvenes. De sus hojas se extrae
una fibra que se usa para fabricar hilos, cuerdas y sogas; Tambin tiene algunos usos
en la medicina popular tales como laxante o para tratar las heridas e irritaciones de la
piel; Para adornar jardines rocosos, laderas, taludes, o bien en grandes macetas para
adornar entradas, parques, etc. Al ser grandes, las pitas son adecuadas para las zonas
ms silvestres del jardn.

2.2.4.2. Cultivo
El Agave americana requiere de mucha iluminacin por lo que debe cultivarse en una
posicin muy soleada (aunque tambin crece bien a pesar de que no est a pleno sol),
puede tolerar temperaturas por debajo de los 0C, sin embargo la temperatura ideal es
entre los 20 y 30 C. El lugar de cultivo debe estar bien ventilado, el suelo ideal es
arenoso, bien drenado an que tolera bien la sequa, en verano debe regarse de forma
regular y moderada, una frecuencia recomendada es 1 vez por semana si se encuentra
en maceta o una vez cada 15 das si est plantada directamente en el suelo. En invierno
debe disminuirse el riego, regar sol para humedecer el sustrato 1 vez al mes a un ms
espaciado dependiendo de la intensidad del fro. El agave no tolera el encharcamiento
por lo que se recomienda eliminar el exceso de agua que pudiera quedar en el plato de
la maceta. Evite echar agua en la roseta ye que esto puede contribuir a la aparicin de
hongos. Durante el verano, se recomienda realizar 2 aportes de abono cada 30 das
utilizando un fertilizante lquido bajo en nitrgeno diluido en agua de riego.

El Agave americana puede multiplicarse por semilla durante la primavera a una

temperatura de 20 C o por separacin de los vstagos que crecen alrededor de la
planta madre dejando cicatrizar el corte durante 2 o 3 das para despus proceder
sembrndolo. Para separar los vstagos, utilice un cuchillo bien afilado y desinfectado.

20
 2.3. Mtodos de Cromatografa

Keulemans propuso la siguiente definicin de cromatografa: es un mtodo fsico de

separacin en el que los componentes a desglosar se distribuyen entre dos fases, una
de las cuales constituye un lecho estacionario de gran desarrollo superficial y otra es
un fluido que pasa a travs o a lo largo del lecho estacionario

De forma general podemos decir que es una tcnica de anlisis qumico que permite
fraccionar los componentes de una mezcla y obtener sustancias puras. En la
actualidad son muchos los tipos y los usos de la cromatografa en el laboratorio,
habindose especializado la determinacin de diferentes sustancias dependiendo del
tipo de cromatografa. Se debe tener en cuenta una serie de conceptos a la hora de
hablar de cromatografa (Silva et al., 2006):

Fase mvil: se denomina fase mvil al fluido que se utiliza como portador de la
mezcla, es decir, es un gas, lquido fluido supercrtico que arrastras a la
muestra.
Fase estacionaria: se denomina fase estacionaria a un slido o lquido
colocado sobre un slido que sirva como soporte a la prueba.
Adsorcin: segn la RAE podemos definir la absorcin como: la
concentracin sobre la superficie de una sustancia de gases, lquida o cuerpo
disueltos, materiales dispersos o coloides.
Absorcin: penetracin, incorporacin o acepcin de lquido, gases, luz o
calor. Tendencia que presentan ciertos materiales para incorporar energa en
forma de radiacin electromagntica.
Cromatrograma: plasmacin grfica de la cromatografa.

Esta tcnica ha tenido un papel fundamental en el desarrollo de la bioqumica se basa

en la distinta capacidad de las sustancias para:
Ser arrastradas por la fase mvil
Ser retenidas por un soporte fijo o fase estacionaria.

Es decir que, consideradas varias sustancias semejantes, siempre hay algunas ms

21
solubles en la fase mvil, y otras con mayor afinidad por la fase estacionaria, como
consecuencia, las primeras se desplazarn a mayor velocidad que las segundas, y en
ltimo trmino, se podr conseguirla separacin de todas ellas (Silva et al., 2006).

2.3.1. Clasificacin de cromatografa

Podemos realizar diferentes clasificaciones dependiendo de las caractersticas en las
que nos basemos para realizar la clasificacin (Silva et al., 2006):

Dependiendo de la interaccin de la sustancias que se separan con la fase

estacionaria.
o De absorcin
o De reparto
o De intercambio inico
o De exclusin
o De afinidad
Dependiendo del sistema que se utiliza como soporte.
o Columna
o Papel
o Capa fina
Dependiendo de la forma de evidenciar los componentes una vez separados
o En el espacio
o En el tiempo

2.3.2. Clasificacin de la cromatografa liquida

Los diferentes tipos de cromatografa se pueden clasificar de diferentes maneras, pero
la forma ms habitual de clasificacin es la realizada en base a la naturaleza de la
fase estacionaria, ya que es esta la que impone fundamentalmente el mecanismo de
separacin; de este modo, se puede enumerar cuatro tipos de tcnicas.
Cromatografa de adsorcin (liquida-solido). La fase estacionaria es una
adsorbente y la separacin se basa en repetidas etapas de adsorcin-
desorcin

22
 Cromatografa de reparto/adsorcin (fases ligadas qumicamente). La
separacin en este caso, se basa en un reparto del soluto entre la fase mvil y
la fase estacionaria.
Cromatografa de intercambio inico. Este tipo de cromatografa se da cuando
la fase estacionaria presenta en su superficie grupos ionizados capaces de
retener selectivamente a iones de signo contrario que circulan en la fase
mvil.
Cromatografa de exclusin molecular. la fase estacionaria, en este caso, es
un material poroso de tamao de poro controlado, que permite la entrada de
ciertas molculas de manera selectiva, dejando fuera otras de mayor tamao.

El mecanismo de retencin en los dos primeros casos es similar, variando nicamente

el tipo de interaccin que se producen y cul de ellas es la predominante; por esta
razn en la prctica se realiza otra divisin de los dos primeros tipos de cromatografa
atendiendo a polaridad de la fase estacionaria:

Cromatografa de fase normal. La fase estacionaria presenta puntos activos

de alta polaridad y las interacciones que se producen con el soluto son
especficas del grupo activo. Las fases estacionarias puede ser un slido
adsorbente (slice o almina), o bien, un soporte al que se unen qumicamente
molculas orgnicas que presentan grupos funcionales de alta polaridad
(ciano, amino, etc).
Cromatografa de fase reversa (inversa). La fase estacionaria tiene una
naturaleza apolar (cadena hidrocarbonadas, grupos fenilo) y las interacciones
que se producen son inespecficas (efecto solvofobo).

2.3.3. Cromatografa en capa fina

La cromatografa en capa fina (en ingls thin layer chromatography o TLC) es una
tcnica analtica rpida y sencilla, til para la separacin y caracterizacin de
pequeas cantidades de compuesto; es muy utilizada en un laboratorio de Qumica
Orgnica. Entre otras cosas permite:

23
 Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar as,
por ejemplo, la efectividad de una etapa de purificacin.
Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podran ser
idnticas. Si, por el contrario, corren distinto entonces no son la misma
sustancia.
Realizar el seguimiento de una reaccin. Es posible estudiar cmo
desaparecen los reactivos y cmo aparecen los productos finales o, lo que es
lo mismo, saber cundo la reaccin ha acabado.

La muestra a analizar se deposita cerca de un extremo de una lmina de plstico o

aluminio que previamente ha sido recubierta de una fina capa de adsorbente (fase
estacionaria). Entonces, la lmina se coloca en una cubeta cerrada que contiene uno
o varios disolventes mezclados (eluyente o fase mvil). A medida que la mezcla de
disolventes asciende por capilaridad a travs del adsorbente, se produce un reparto
diferencial de los productos presentes en la muestra entre el disolvente y el
adsorbente.

2.3.3.1. Adsorbentes y eluyentes

Los dos adsorbentes (fase estacionaria) ms ampliamente utilizados son la gel de
slice (SiO2) y la almina (Al2O3), ambas de carcter polar. La almina anhidra es el
ms activo de los dos, es decir, es el que retiene con ms fuerza a los compuestos;
por ello se utiliza para separar compuestos relativamente apolares (hidrocarburos,
haluros de alquilo, teres, aldehdos y cetonas). El gel de slice, por el contrario, se
utiliza para separar sustancias ms polares (alcoholes, aminas, cidos carboxlicos).
El proceso de adsorcin se debe a interacciones intermoleculares de tipo dipolo
dipolo o enlaces de hidrgeno entre el soluto y el adsorbente. El adsorbente debe ser
inerte con las sustancias a analizar y no actuar como catalizador en reacciones de
descomposicin. El adsorbente interacciona con las sustancias mediante interaccin
dipolodipolo o mediante enlace de hidrgeno si lo presentan.

El orden de elucin de un compuesto se incrementa al aumentar la polaridad de la fase

mvil o eluyente. Este puede ser un disolvente nico o dos miscibles de distinta
24
polaridad. En seguida se recoge por orden creciente de fuerza eluyente los disolventes
ms comnmente empleados.

Hexano < tetraclorometano < cloroformo < diclorometano < acetato de etilo < acetona
< 2propanol < metanol <agua

En general, estos disolventes se caracterizan por tener bajos puntos de ebullicin y

viscosidad, lo que les permite moverse con rapidez. Raramente se emplea un
disolvente ms polar que el metanol. Usualmente se emplea una mezcla de dos
disolventes en proporcin variable; la polaridad de la mezcla ser el valor promediado
en funcin de la cantidad de cada disolvente empleada. El eluyente idneo para cada
caso ha de encontrarse por "el mtodo del ensayo y del error".

2.3.3.2. Determinacin del Rf

La retencin se puede explicar en base a la competencia que se establece entre el
soluto a separar y la fase mvil por adsorberse a los centros activos polares de la fase
estacionaria. As, las molculas de soluto se encuentran adsorbidas en la fase
estacionaria y a medida que se produce la elucin van siendo desplazadas por la fase
mvil. La retencin y la selectividad en la separacin dependen de los valores
respectivos de las constantes de los diferentes equilibrios qumicos que tienen lugar,
que estn en funcin de:

la polaridad del compuesto, determinada por el nmero y naturaleza de los grupos

funcionales presentes. Los solutos ms polares quedarn ms retenidos puesto que
se adsorben ms firmemente a los centros activos de la fase estacionaria, mientras
que los no polares se eluirn con mayor facilidad.

naturaleza del disolvente. As, para un mismo compuesto, un aumento en la

polaridad del disolvente facilita su desplazamiento en la placa.

La relacin entre las distancias recorridas por el soluto y por el eluyente desde el
origen de la placa se conoce como Rf, y tiene un valor constante para cada
compuesto en unas condiciones cromatogrficas determinadas (adsorbente,
disolvente, tamao de la cubeta, temperatura, etc.). Debido a que es prcticamente

25
imposible reproducir exactamente las condiciones experimentales, la comparacin de
una muestra con otra debe realizarse eluyendo ambas en la misma placa.

Para calcular el Rf se aplica la siguiente expresin:

Rf = distancia recorrida por el compuesto (X) / distancia recorrida por el eluyente (Y)

Figura 10. Orden de elucin y polaridad de compuestos utilizados en cromatografa

Figura 11. Clculo de Rf

La distancia recorrida por el compuesto se mide desde el centro de la mancha. Si sta
es excesivamente grande se obtendr un valor errneo del Rf.

Se recomienda elegir un eluyente en el que los componentes de la mezcla presenten

un Rf medio en torno a 0.30.5. Para compuestos poco polares, se debe utilizar un
disolvente apolar como el hexano. En el caso de compuestos con polaridad media, se
aconseja utilizar mezclas hexano/acetato de etilo en distintas proporciones. Los
productos ms polares, requieren disolventes ms polares como mezclas de
diclorometano/metanol en distintas proporciones.
26
 2.3.3.3. Revelado de las placas
La mayor parte de las placas de cromatografa llevan un indicador fluorescente que
permite la visualizacin de los compuestos activos a la luz ultravioleta (254 nm). El
indicador absorbe la luz UV y emite luz visible. La presencia de un compuesto activo
en el UV evita que el indicador absorba la luz en la zona en la que se encuentra el
producto, y el resultado es la visualizacin de una mancha en la placa que indica la
presencia de un compuesto. En el caso de compuestos que no absorben luz UV, la
visualizacin (o revelado) del cromatograma requiere utilizar un agente revelador. Este
tiene que reaccionar con los productos adsorbidos proporcionando compuestos
coloreados.

27
 2.3.4. Cromatografa de lquidos de alta eficacia HPLC

En las primeras etapas del desarrollo de la cromatografa de lquidos, los cientficos se

dieron cuenta de que se podan conseguir grandes aumentos en la eficacia de la
columna disminuyendo el tamao de las partculas de los rellenos. Sin embargo, no
fue sino hasta finales de los aos sesenta cuando se desarroll la tecnologa
adecuada para producir y utilizar rellenos de tamao de partcula del orden de los 3 o
10 m. Esta tecnologa requiere una instrumentacin sofisticada, que contrasta con
las simples columnas de vidrio de la cromatografa de lquidos clsica. Para distinguir
estos procedimientos ms nuevos de los mtodos bsicos, que todava se utilizan
con fines preparativos, se emplea la denominacin de cromatografa de lquidos de
alta resolucin (HPLC).

El HPLC es una cromatografa de reparto tipo lquido-liquido, donde se puede apreciar

una fase estacionaria constituida por un slido recubierto por un lquido, que
generalmente es polar (agua y etilenglicol), y una fase mvil constituida por otro
lquido, que generalmente no es polar (hexano metanol u hexano/isopropanol). Los
lquidos que componen ambas fases deben ser inmiscibles entre s.

Las razones de la popularidad de esta tcnica son su sensibilidad, su fcil adaptacin

a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separacin de
especies no voltiles o termolbiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias
que son de primordial inters en la industria, en muchos campos de la ciencia y para
la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los
aminocidos, protenas, cidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, drogas,
terpenoides, plaguicidas, antibiticos esteroides, especies organometlicas y una
cierta variedad de sustancias inorgnicas.

2.3.4.1. Instrumentacin
Si bien es cierto que para realizar una cromatografa lquida tan solo es necesario
disponer de las dos fases implicadas en el proceso y de la columna, las modernas
cromatografas de lquidos de alta eficacia, debido al pequeo dimetro de las

28
partculas de la fase estacionaria que se utilizan, requieren de la utilizacin de unos
dispositivos que constituyen el cromatgrafo.

Los componentes bsicos de un cromatgrafo de lquido de alta eficacia son:

Recipientes para la fase mvil y sistemas para el tratamiento de los

disolventes.
Sistema de bombas.
Columnas para cromatografa de lquidos.
Detector.

La Figura 12, muestra un esquema de los componentes fundamentales de un

cromatgrafo de lquidos de alta resolucin tpico. Cada uno de los componentes se
trata en los prrafos que siguen a continuacin.

Figura 12. Esquema de un aparato de HPLC

29
Una separacin que utiliza un solo disolvente de composicin constante se denomina
una elucin isocrtica. Con frecuencia, la eficiencia de la separacin se aumenta
notablemente por una elucin con gradiente. En este caso se utilizan dos (y a veces
ms) disolventes con una polaridad significativamente distinta. Una vez comienza la
elucin, se vara la relacin de los disolventes de forma programada, a veces
continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas. Los
instrumentos en la moderna HPLC a menudo estn equipados con unos dispositivos
que permiten introducir los disolventes desde dos o ms recipientes en una cmara de
mezcla a una velocidad que vara continuamente y la relacin de volumen de los
disolventes se puede modificar lineal o exponencialmente con el tiempo.

2.3.4.2. Sistemas de bombeo

Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen: (1) la

generacin de presiones por encima de 400 kg/cm 2, (2) un flujo libre de pulsaciones,
(3) un intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min, (4) el control y reproducibilidad del
caudal mejor del 0,5% relativo y (5) componentes resistentes a la corrosin (juntas de
acero inoxidable o tefln). Debe subrayarse que las altas presiones que generan las
bombas de HPLC no constituyen un riesgo de explosin, debido a que los lquidos no
son muy compresibles. De este modo, la rotura de un componente del sistema slo
supone una prdida de disolvente. Es evidente que esta prdida puede suponer un
riesgo de incendio.

2.3.4.3. Sistemas de inyeccin de muestra

A menudo, el factor limitante en la precisin de las medidas en cromatografa de
lquidos es la reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna.
El problema se agrava por el ensanchamiento de banda que acompaa a la
sobrecarga de las columnas. Por ello, los volmenes que se emplean han de ser muy
pequeos, de unas pocas dcimas de microlitro a tal vez 500 L. Adems, se ha de
poder introducir la muestra sin despresurizar el sistema.

30
 2.3.4.4. Columnas para cromatografa de lquidos
Las columnas para cromatografa de lquidos se construyen de ordinario con tubo de
acero inoxidable de dimetro interno uniforme. Cientos de columnas empaquetadas
que difieren en tamao y relleno se comercializan por distintos fabricantes y su coste
oscila, por lo general, de 30 000 a 100 000 pesetas.

2.3.4.5. Detectores
A diferencia de la cromatografa de gases, en la cromatografa de lquidos no hay
detectores tan aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de
ionizacin de llama y de conductividad trmica. Uno de los mayores retos en el
desarrollo de la cromatografa de lquidos ha sido el perfeccionamiento de los
detectores.

Un detector ideal para cromatografa de lquidos debera poseer todas las

propiedades listadas en relacin con la cromatografa de gases, con la excepcin de
que un detector para cromatografa de lquidos no es necesario que sea sensible en
un intervalo tan grande de temperaturas. Adems, un detector de HPLC debe tener un
volumen interno mnimo a fin de reducir el ensanchamiento de banda.

Los detectores en cromatografa de lquidos son de dos tipos bsicos. Los detectores
basados en una propiedad de la disolucin responden a una propiedad de la fase
mvil, tal como el ndice de refraccin, la constante dielctrica, o la densidad, que se
modifica por la presencia de los analitos. Por contraste, los detectores basados en una
propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades del soluto, como la
absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusin, que no son propias de la fase
mvil. En la Tabla 5 se indican los detectores ms comunes empleados en HPLC y
algunas de sus propiedades ms importantes.

31
 Tabla 5. Caractersticas de los detectores de HPLC.

Disponible LOD de masa LOD de

Detector LC comercialmente (detectores masa

Absorbancia Si 100pg-1 ng 1 pg
Fluorescencia Si 1-10 pg 10 fg

Electroqumico Si 10 pg -1 ng 100 fg

ndice de refraccin Si 100 ng-1 10 ng

Conductibilidad Si g
500 pg-1ng 500 pg

Espectrometra de Si 100 pg-1ng 1 pg

masas

FT-IR Si 1g 100 ng
Dispersin de luz Si 10g 500 ng

Actividad ptica No - 1 ng

Selectivo de No - 10 ng
elemento
fotoionizacin No - 1 pg-1
ng

2.3.4.6. Interpretacin del cromatograma

La cromatografa es bsicamente un mtodo de separacin, tal vez el ms potente de
que se puede disponer en un laboratorio, aun que debe considerarse que la
cromatografa, a efecto analtico, es una tcnica ciega. Los mtodos cromatogrfico
por s mismo, puede informar, en el mejor de los casos, del nmero de compuestos
qumicos que estn presentes en una mezcla, pero nunca de proporcionar informacin
sobre su naturaleza.

2.3.4.7. Anlisis cualitativo

A pesar de la limitacin mencionada, ya desde los primeros trabajos publicados sobre
tcnicas cromatogrficas instrumentales, se indican que los parmetros de retencin
32
(tiempo o volumen) de un compuesto, eran constantes para un sistema
cromatogrficos dado, por lo que poda ser utilizado de forma cualitativa para
identificar compuestos.

Evidentemente, los parmetros de retencin de un compuesto depende de un gran

nmero de variables, por lo que la identidad entre analitos y patrones solamente
pueden ser establecida para un sistema dado y en un momento dado, lo que hace
difcil la identificacin de una sustancia por este mtodo. Aunque existen en la
bibliografa colecciones de datos de retencin para diversos compuestos, estos datos
tienen un valor puramente orientativo, ya que resulta muy difcil reproducir los datos
de retencin (de unos laboratorios a otros e incluso dentro del mismo laboratorio)
debido a la irreproducibilidad de los sistemas cromatogrficos. De forma anloga, las
ecuaciones empricas desarrolladas para correlacionar datos de retencin con la
estructura qumica de diversos compuestos es utilizable para la identificacin de
compuestos pertenecientes a series homologas muy bien definidas.

Teniendo en cuenta estas limitaciones, el mejor mtodo para realizar un anlisis

cualitativo, es, todava la comparacin directa de los parmetros de retencin de los
picos de la muestra con los de sustancias patrn, trabajando en ambos casos con el
mismo sistema cromatogrfico. A la hora de realizar la comparacin, es conveniente
utilizar determinados parmetros, que si bien no elimina todas las posibilidades de
variabilidad de los resultados, si permiten al menos corregir la variabilidad inducida
por determinadas condiciones; como parmetros de retencin utilizados
frecuentemente para anlisis cualitativo, los ms utilizados son:
Tiempos o volmenes de retencin corregidos
Factores de capacidad
Tiempos de retencin relativos

De entre estos parmetros, los dos primeros permiten corregir las diferencias de
retencin debidas a los volmenes muertos de cada sistema.

Los tiempos de retencin se definen mediante la ecuacin: Tr = t/Tp

33
Donde t es el tiempo de retencin del compuesto que se trata de identificar y Tp el
tiempo de retencin de un compuesto que se toma como patrn. La utilizacin de los
tiempos de retencin relativos, permite eliminar todos los factores de variabilidad,
salvo los que pueden afectar los valores de K (naturaleza de la fase estacionaria,
naturaleza de la fase mvil y temperatura), por lo que este parmetro es el ms
adecuado para la identificacin cualitativa de compuesto en base a los datos
bibliogrficos.

Una ltima consideracin sobre la utilizacin de las tcnicas cromatogrficas para el

anlisis cualitativo, es que esta tcnica permiten realizar una identificacin negativa,
es decir, permiten asegurar con absoluta certeza que un compuesto determinado no
se encuentra presente en una mezcla pero, por el contrario, no permite nunca
asegurar la presencia de un compuesto, ya que no se puede excluir la posibilidad de
que dos compuestos diferentes presenten los mismos parmetros de retencin sobre
un sistema dado. Este problema puede soslayarse en parte realizando la identificacin
sobre diversas columnas, con diferentes fases estacionarias. Por supuesto, es obvio
que los resultados cualitativos son ms fiables cuanto mayor nmero de columnas se
utilicen, pero el mtodo es largo y tedioso; como norma general se puede decir que la
identificacin de un compuesto sobre tres columnas, aunque no proporciona una
certeza absoluta, ofrece una finalidad suficiente a todos los efectos.

2.3.4.8. Anlisis cuantitativo

Si bien, como se ha mencionado en el apartado anterior, las tcnicas de anlisis
cromatogrfico ofrecen escasas posibilidades para la realizacin de anlisis
cualitativo, sus posibilidades como tcnica cuantitativa son enormes. la cromatografa
permite separar mezclas muy complejas de productos, aun cuando estos sean de
naturaleza muy semejante, lo que permite un anlisis directo que se utilizan en
cromatografa ofrece una respuesta muy fcil de relacin con la cantidad de analito
contenida en disolucin inyectada, y con una sensibilidad que, en ocasiones, es casi
imposible de alcanzar por medio de cualquier otra tcnica.
La medida del rea o de la altura del pico cromatogrfico es el factor ms importante a

34
la hora de realizar un anlisis cualitativo. La utilizacin de la altura de pico para la
cuantificacin es de gran comodidad, pero nicamente proporciona una exactitud
aceptable en cromatograma que presenten picos agudos, estrechos, claramente
definidos y muy simtricos; este procedimiento de cuantificacin es interesante para
anlisis de rutina, en los que se puede sacrificar la exactitud en favor de la sencillez y
rapidez de las cuantificaciones, la utilizacin para el anlisis cuantitativo de las reas
de los picos, es el procedimiento de uso ms general cuando se requiere exactitud en
la cuantificaciones.

Existen multitud de mtodos que permiten medir las reas bajo los picos
cromatogrficos, aunque la medida por medio de integracin electrnica es con
mucho la ms utilizada; de entre los restantes mtodos, solo se mencionara el de la
altura por la mitad de la anchura, un mtodo muy sencillo y que ofrece muy buenos
resultados. Este mtodo consiste en medir la anchura del pico cromatogrfico a la
mitad de su altura (W1/2), el producto de este valor por su altura:

A=W1/2h

Ofrece un valor A, que es proporcional al rea del pico. Este mtodo proporciona muy
buenos resultados para picos de forma aproximadamente gaussiana, pero los
resultados son menos satisfactorios para picos no simtricos o para picos pequeos y
anchos.

Al menos de cualquier otro mtodo de medida de reas, el sistema ms utilizado

actualmente es el integrador electrnico; un dispositivo de estar naturaleza digitaliza
la seal analgica proporcionada por el detector, detecta el comienzo y el final de
cada pico cromatogrfico, integra digitalmente el ara bajo la curva y corrige
automticamente la lnea de base. El nico problema que presenta los integradores
digitales se plantea a la hora de integrar picos parcialmente resultados, ya que
muchos integradores tienen limitadas sus posibilidades de medir en estos casos a
muy pocos mtodos, llegado a realizar en algunos casos extremos integracin
totalmente disparadas. Este problema, no obstante, se resuelve bastante bien
mediante la utilizaciones integradores basados en ordenadores personales, que
permite al usuario tanto la visualizacin de integradores basados en ordenadores
35
personales, que permiten al usuario tanto la visualizacin de integradores basados en
ordenadores personales, que permiten al usuario tanto la visualizacin de la forma en
que se han integrado los picos, como la posibilidad de modificar la forma de
integracin en los casos de ser necesario.

2.3.4.9. Tipos de cromatografa HPLC

Cromatografa de reparto

La cromatografa de reparto ha llegado a ser el tipo de cromatografa de lquidos ms

ampliamente utilizado. En el pasado, la mayora de las aplicaciones se han referido a
compuestos polares no inicos de baja a moderada masa molecular < 3000). Sin
embargo, recientemente se han desarrollado algunos mtodos que han extendido las
separaciones de reparto a los compuestos inicos.

La cromatografa de reparto se puede subdividir en cromatografa lquido-lquido y

cromatografa con fases unidas qumicamente (enlazadas). La diferencia entre estas
tcnicas radica en la forma como se retiene la fase estacionarla sobre las partculas
soporte del relleno. En lquido-lquido, la fase estacionaria lquida se retiene sobre la
superficie del soporte por adsorcin fsica. En fase unida qumicamente, la fase
estacionaria se une qumicamente a la superficie del soporte. La cromatografa de
reparto, al principio era del tipo lquido-lquido; sin embargo, en la actualidad los
mtodos de fase enlazada son los que predominan debido a las desventajas de los
sistemas lquido-lquido. Una de esas desventajas es la prdida de fase estacionaria
por disolucin en la fase mvil, lo que hace necesario un peridico recubrimiento de
las partculas del soporte. Por otra parte, el problema de la solubilidad de la fase
estacionaria impide el uso de los rellenos de fase lquida en la elucin con gradiente.
La discusin se centrar exclusivamente en la cromatografa de reparto con fases
unidas qumicamente.

Cromatografa de adsorcin

La cromatografa de adsorcin, o lquido-slido, es la forma clsica de cromatografa

de lquidos que introdujo Tswett por vez primera a principios de este siglo. Ms
36
recientemente, se ha convertido en un mtodo importante de HPLC.

Las nicas fases que se utilizan en HPLC lquido-slido son la slice y la almina,
siendo la primera la que se prefiere para casi todas las aplicaciones debido a su
mayor capacidad de carga y a su mayor diversidad de presentaciones. Con pocas
excepciones, las caractersticas de adsorcin de los dos adsorbentes son similares.
Con ambos, el orden de tiempos de retencin es: olefinas < hidrocarburos aromticos
< haluros = sulfuros < teres < nitrocompuestos < esteres = aldehdos = cetonas <
alcoholes = aminas < sulfonas < sulfxidos < amidas < cidos carboxlicos.

Cromatografa inica

La cromatografa inica est relacionada con los mtodos modernos y eficaces para la
separacin y determinacin de iones que se basan en el uso de las resinas de
intercambio inico. La cromatografa inica empez a desarrollarse a mediados de los
aos setenta, cuando se demostr que mediante las columnas de HPLC rellenas con
resinas de intercambio catinico o aninico, se podan resolver fcilmente mezclas de
cationes o aniones. Por entonces, la deteccin se realizaba por lo general con
medidas de conductividad.

La cromatografa inica se desarroll durante el proyecto Manhattan que optimizaba la

separacin con resinas de intercambio catinico de los cationes de las tierras raras
estrechamente relacionados. Este espectacular trabajo, en el cual se basa la teora de
las separaciones por intercambio inico, se extendi tras la 2 Guerra Mundial a
muchos otros tipos de materiales y al final condujo a los mtodos automatizados para
la separacin y deteccin de aminocidos y otras especies inicas en mezclas
complejas. El desarrollo de la HPLC moderna empez a finales de los aos sesenta,
pero su aplicacin a la separacin por intercambio inico se retras debido a la
inexistencia de un mtodo general y sensible para la deteccin de especies como los
cationes alcalinos y alcalinotrreos, y aniones como los haluros, acetato y nitrato. Esta
situacin se remedi en 1975 al desarrollarse por tcnicos de Dow Chemical Company
la tcnica de supresin del efluente, la cual hace posible la deteccin conductimtrica
de los iones eludos

37
 Cromatografa de exclusin por tamaos

La cromatografa de exclusin por tamaos, que tambin se ha denominado

cromatografa en geles permeables o de filtracin en geles, es una tcnica muy
valiosa que se aplica particularmente a especies de alto peso molecular. Los rellenos
para la cromatografa de exclusin por tamaos estn constituidos por pequeas
partculas (de unas 10 m) polimricas o de slice que contienen una red uniforme de
poros en los que pueden difundir las molculas del soluto y del disolvente. En los
poros, las molculas son atrapadas efectivamente y eliminadas del flujo de la fase
mvil. El tiempo de residencia medio en los poros depende del tamao efectivo de las
molculas de los analitos. Las molculas que son ms grandes que el tamao medio
de poros del relleno son excluidas y de esta forma, esencialmente no se retienen y,
por tanto, son las primeras que eluyen. Las molculas que tienen dimetros que son
significativamente menores que los poros, pueden penetrar a travs del laberinto de
poros y as resultan atrapadas durante ms tiempo; stas son las ltimas en eluir.
Entre estos dos extremos, estn las molculas de tamao intermedio cuya
penetracin media en los poros depende de su dimetro. Dentro de este grupo, tiene
lugar el fraccionamiento, que est directamente relacionado con el tamao molecular y
en cierto modo con la forma molecular. Obsrvese que las separaciones por exclusin
por tamaos difieren de los otros procedimientos que se han considerado, en que no
implican una interaccin qumica o fsica entre los analitos y la fase estacionaria. De
hecho, se procura evitar este tipo de interacciones dado que originan una mala
eficacia de la columna.

38
 2.4. Espectrometra IR

El espectrofotmetro infrarrojo consta de una fuente emisora que origina un haz de luz
compuesto de todas las frecuencias de la radiacin infrarroja, cuya absorcin se
desea medir. Este haz se hace pasar a travs de la muestra y luego a un
monocromador, en el que se seleccionan las frecuencias de una en una y se hacen
pasar al detector, sistema capaz de emitir una seal electrnica proporcional a la
intensidad de la luz que recibe. En la prctica, el detector recibe dos haces- uno que
ha pasado a travs de la muestra, y otro de referencia que solo ha atravesado el
disolvente (si la muestra se halla disuelta). De este modo, el espectrofotmetro puede
medir diferente la fraccin de luz absorbida (o trasmitida) solo por la muestra y a
cualquier longitud de onda. Un registrador representa grficamente de forma continua
la cantidad de luz trasmitida o absorbida para cada frecuencia; la grfica resultan se te
denomina espectro infrarrojo de compuestos (Weininger et al., 1988)

Una forma usual de obtener el espectro IR de un slido o un lquido consiste en

disolverlo en un disolvente no polar como CHCl3 o CCl4. Los disolventes tienen pocas
absorciones propias y no modifican demasiado las del soluto. Los lquidos que no son
solubles en los disolventes normales para IR, pueden extenderse en formas de una
lmina delgada entre dos placas de NaCl, registrando luego su espectro. Esta tcnica
de lquido puro se emplea tambin con muestras solubles, cuando se desea
observar aquellas partes del espectro que quedan enmarcadas por la absorcin de los
disolventes.

Los slidos insolubles en IR, pueden dispersarse en un disco delgado de KBr. Se

tritura juntos la muestra y el KBr, y luego la mezcla se comprime en una prensa de
alta presin, hasta convertirla en un disco delgado y translucido. El KBr no absorbe la
radiacin infrarroja, de modo que al colocarlo en el espectrmetro solo se registra el
espectro de la muestra. El KBr presenta la desventaja de que, al ser una sal y por ello
muy polar, puede alterar la posicin e intensidad de las seales de la muestra. Sin
embargo, resulta posible comparar espectros en KBr y en disolucin, puesto que se
conoce los efectos de los distintos medios sobre la absorcin de numerosos grupos
funcionales (Weininger et al., 1988)
39
En los espectrmetros multiplex o de transformada de Fourier (FTIR) actuales el haz
de radiacin infrarroja es generado en la fuente (A9 y despus del su colimacin se
dirige hacia el interfermetro (C) por medio del espejo (B). El rayo del lser de Helio-
Neon sigue a la radiacin infrarroja a travs del interfermetro con objetito de
determinar el desplazamiento del espejo mvil y para conocer la longitud de onda a la
que se produce la absorcin de radiacin. Posteriormente, se encuentra un espejo
ajustable (D) que conduce el rayo procedente del interfermetro a la muestra. Desde
el compartimiento de la muestra el rayo llega a un detector (E) trmicamente estable.
Como se observa en la figura 13 (Sierra et al., 2010).

Figura 13. Esquema de un espectrmetro de FTIR.

El interfermetro, el cual sustituye al tradicional monocromador, es la parte

fundamental de este instrumento gracias al cual se obtiene un interderograma. Un
interferograma es bsicamente la representacin de la intensidad frente al tiempo
(espectro en el dominio del tiempo). Sin embargo, un qumico est ms interesado en
un espectro en el que se represente la intensidad frente a la frecuencia (espectro en
dominio de las frecuencias). Una operacin matemtica, denominada trasformacin de
Fourier, puede separar la frecuencia de absorcin individual del interferograma
produciendo un espectro virtual idntico al que se observara mediante un instrumento
dispersivo (Sierra et al., 2010).
38
Los instrumentos FTIR acoplados a ordenadores operan en modo de haz simple. Para
obtener el espectro de un compuesto, primero se obtienen el interferograma del fondo
(o background) debido a los gases atmosfricos activos al IR (CO 2 y H2O) o el
disolvente de la muestra. En interferograma es sometido a trasformacin de Fourier
para obtener el espectro del background. Despus se coloca la muestra en la celda y
se obtiene el espectro de la misma. Este espectro contiene la banda de absorcin de
la muestra y el background. El software del instrumento resta automticamente el
espectro del background del espectro anterior y el resultado es idntico al que se
obtiene con un instrumento dispersivo de doble haz (Sierra et al., 2010).

Existen diferencias muy claras entre los espectrofotmetros FTIR y los

espectrofotmetros dispersivos. As, los primeros son equipos mucho ms modernos,
compactos y funcionales en menos de un segundo, es posible recolectar decenas de
interferongramas de una misma sustancia y acumularlos en la memoria del ordenador.
Cuando se realiza la trasformacin de Fourier sobre la suma de todos los
interferogramas acumulados, el espectro obtenido tendr una mejor relacin sea-
ruido. Tambin la identificacin de la longitud de onda que incide sobre la muestra es
mucho ms exacta, ya que en este tipo de equipos se utiliza un lser para el calibrado
de la misma. Adems, el equipo presenta menos elementos a travs de los cuales
pasa la radiacin electromagntica y la perdida de intensidad de la radiacin en su
recorrido hacia la muestra es mucho menor. De esta manera se pueden detectar
absorciones de energa ms dbiles.

Adems de los dos equipos anteriormente mencionados, hay disponibles

comercialmente fotmetros no dispersivos sencillos y robustos que se utilizan para el
anlisis cuantitativo de compuesto como hidrocarburos, monxido de carbono, cianuro
de hidrogeno, etc. Estos instrumentos pueden no utilizar ningn elemento para la
seleccin de la longitud de onda o bien podra incluir un filtro para tal propsito (Sierra
et al., 2010).

39
 III. JUSTIFICACIN

Los biocombustibles representan en la actualidad una fuente potencial de energa

renovable, adems de que podran generar nuevos y grandes mercados para los
productores agrcolas. No obstante, slo algunos de los actuales programas de
biocombustibles son viables, y la mayora implica altos costos sociales e irnicamente
ambientales. Ante las implicaciones sociales y econmicas que conlleva el empleo de
productos alimenticios (caa de azcar, maz, etc.) en la obtencin de biocombustibles
y las limitaciones agroecolgicas para la produccin masiva de los cultivos
energticos en nuestro pas; una propuesta es el maguey, que representa una
excelente alternativa para impulsar el desarrollo sustentable del pas, dada su alta
productividad aun en condiciones restrictivas de humedad, temperatura y suelo, y a
que en su produccin no se requiere de abrir nuevas tierras al cultivo y que pueden
reconvertir suelos marginales o degradados. Actualmente la cantidad y el tipo de
azcares que contiene el agave son muy importantes debido a que adems de
producir bebidas espirituosas (bacanora, mezcal y tequila), pueden ser fuente directa
para la produccin de biocombustibles como el bioetanol, biodiesel y biogs. Siendo el
agave un material viable para ser usado como substrato en procesos fermentativos,
por lo que existen grandes oportunidades de investigacin para desarrollar procesos
de bioconversin; ya que es tcnicamente factible, eficiente y econmicamente
atractivo. En el caso de Zacatecas se cuenta con 5,300 hectreas de Agave tequilana
Weber variedad azul y 59,000 hectreas de poblaciones naturales de Agave salmiana
(maguey verde) mientras que el Agave americana es solo empleado como ornato en
las casas y parques de Zacatecas; por lo que el objetivo fue identificar los
carbohidratos presentes para su posible uso en la generacin de frmacos y como
sustrato para la produccin de cepas microbianas Aspergillus niger capaces de
fermentar los azcares del agave produciendo tambin biocombustibles (Huitrn et al.,
2008), entre otros usos.

40
 IV. HIPTESIS
El Agave americana presenta diferentes tipos y concentraciones de carbohidratos
simples con respecto al Agave salmiana y tequilana Weber var. azul. empleados para
la elaboracin del mezcal.

V. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Identificar y cuantificar los carbohidratos de Agave americana, salmiana y tequilana

Weber var. azul.

OBJETIVOS ESPECFICOS

1. Obtener carbohidratos de diferentes partes de la planta en Agave americana,

salmiana y tequilana Weber var. azul.

2. Identificar cualitativamente por cromatografa en capa fina los carbohidratos de

los diferentes agaves.

3. Identificar la presencia de grupos funcionales caractersticos de los

carbohidratos presentes en los agaves por medio de FTIR.

4. Cuantificar los carbohidratos simples por medio de cromatografa de lquidos de

alta resolucin (HPLC).

41
 VI. MATERIALES Y MTODOS

El presente trabajo se realiz en el Laboratorio de Biotecnologa de la Unidad

Acadmica de Biologa y en el Laboratorio de Plantas de la Unidad Acadmica de
Ciencias Qumicas de la Universidad Autnoma de Zacatecas.

6.1. Obtencin de la muestra

Se recolectaron muestras de tres diferentes agaves: A. salmiana, A. tequilana Weber,

A. americana ubicados en el rea de cultivo de la Unidad Acadmica de Ciencias
Biolgicas en Guadalupe, Zac., los cuales fueron cortadas siguiendo el proceso que
se lleva a cabo en las compaas mezcaleras, cortando cada una de las pencas
hasta obtener una pia lo ms completa posible para despus sacarla de raz,
posteriormente en un lugar limpio se desenraiz y se quit el exceso de penca para
obtener una pia limpia. De este proceso colectamos las pias o cabeza (cortada en
pedazos), el cogollo y pencas de cada agave.

Ya en el laboratorio cada parte del agave, fue triturado y filtrado en gasa, el jugo
obtenido de cada molienda o triturado se alcuot en tubos cnicos marca Corni.
Para obtener el jugo cocido del agave, se coloc en autoclave durante un tiempo
aproximado de 6 horas a una temperatura de 120 C. Trascurrido el tiempo de
cocimiento se dej enfriar para despus exprimir algunos pedazos y obtener el jugo.

6.1.1. Determinacin de pH

Desde una aproximacin simplificada, el pH puede definirse como una medida que
expresa el grado de acidez o basicidad de una solucin en una escala que vara
entre 0 y 14. La acidez aumenta cuando el pH disminuye. Una solucin con un pH
menor a 7 se dice es cida, mientras que si es mayor a 7 se clasifica como bsica.
Una solucin con pH 7 ser neutra.

42
El valor de pH representa el menos logaritmo en base diez de la concentracin
(actividad) de iones hidrogeno [H+]. Como la escala es logartmica, la cada en una
unidad de pH es equivalente a un aumento de 10 veces en la concentracin de H+.
Entonces, una muestra de agua con un pH de 5 tiene 19 veces ms H+ que una de
pH 6 y 100 veces ms que una de pH 7.

La determinacin de pH se puede clasificar en dos clases, colorimtricas y

electromtrico mtodos. Los mtodos colorimtricos emplean indicadores que
desarrollan una gama de colores a diferentes pH. Su precisin es restringida y slo
son satisfactorias para su uso en una prueba de campo.

La determinacin se realiz con tirillas indicadoras (Figura 14). Estas simplemente se

sumergieron por un instante en el jugo, lo que provoco un cambio de color.
Posteriormente se compar con el patrn de coloracin impreso en la caja para
asignar un pH.

Figura 14. Determinacin del pH por tirilla indicadora.

43
 6.1.2. Determinacin de los grados brix.

Los grados Brix (Bx), son un representante de la unidad de azcar contenido en una
solucin acuosa. Un grado Brix, corresponde a 1 gramo de sacarosa en 100 gramos
de solucin y por tanto representa la fuerza de la solucin como un porcentaje en
peso en sentido estricto, en masa (% w/w). Si la solucin contiene slidos disueltos
excepto la sacarosa pura, como otros azcares, minerales, entonces el grado Brix
slo aproxima el contenido de slidos disueltos. La determinacin del grado Brix,
tradicionalmente se ha empleado en vinos, azcar, jugos de fruta, miel y otras
industrias (Badui, 1996).

Los grados Brix se determinan por refractmetra (Figura 15), los refractmetros de
mano son utilizados para medir la concentracin de slidos disueltos en una solucin
y pueden ser usados para una amplia gama de soluciones, como la concentracin de
azcar en zumos y bebidas, la concentracin de salsas, champ, leche, aceites
industriales, sal marina, anticongelante, etc. (Badui, 1996).

Figura 15. Refractmetro.

Su manejo es rpido y sencillo, simplemente se coloca una gota de la muestra sobre

el prisma y se lee el resultado en la escala; por lo que en segundos se obtiene el
resultado.

44
 6.2. Cromatografa en capa fina

La cromatografa en capa fina (TLC CCF) se ha convertido en una potente

herramienta analtica para la separacin de compuestos con propiedades qumicas y
fsicas muy similares, tales como hidratos de carbono.se puede utilizar tanto para
determinaciones cualitativas y cuantitativas. El material principal de apoyo
encontrado, ms til para la separacin de los hidratos de carbono es de gel de
slice, una sustancia estable e inerte.

El proceso de cromatografa en capa fina comenz con el lavado de la placa, por lo

tanto, la placa de silica gel se activ lavndola en metanol y se sec en la estufa a
90-100 C por 30 min.

Se tom una alcuota de 1.5 mL de cada una de las muestras, estas fueron
concentradas en rotaevaporador marca eppendorf VacufugeTM a una temperatura de
35 C por 24 horas, ya que contenan demasiada agua, con el motivo de tener mayor
visibilidad del contenido en las siguientes pruebas a realizar. Despus del proceso
anterior, las muestras tuvieron una consistencia chiclosa o polvosa por lo que se
disolvieron en 100L de agua destilada, para poder cargarlas en la placa de silica gel.

Los mono y disacridos se disuelven fcilmente en agua pero son casi

completamente insolubles en la mayora de disolventes orgnicos. Los polisacridos
son insolubles o muy poco solubles en agua. Para que la elucin en agua no afectara
al corrimiento de las muestras se dej que se evaporara el agua de las muestras ya
cargadas en la placa a temperatura ambiente.

Se utiliz como fase mvil 2-propanol-acetona-cido lctico (0.1 M) en una

proporcin de 4:4:1 y como revelador de la placa difenil amina 4%, cido clorhdrico
10 % en acetona. Con esta, se dej impregnar o saturar la cmara durante 15
minutos. Posteriormente se introdujo la placa para su corrimiento. Antes de que la
fase mvil alcance el final de la placa, esta es sacada de la cmara y se deja secar o
evaporar a temperatura ambiente. La placa se observa a luz ultravioleta a una
longitud de onda de 254 y 365 nm.

45
 6.3. La estructura qumica de los extractos mediante la
tcnica de FTIR

Es una tcnica de alta resolucin que proporciona un espectro de reflexin de las

bandas de los grupos funcionales presentes en sustancias inorgnicas y orgnicas,
por lo cual es posible realizar una identificacin de la sustancia de inters (Skoog et
al., 2001). Los anlisis de espectroscopa infrarroja con transformada de Fourier
(FTIR) se efectuaron utilizando un equipo marca Thermo scientific marca Nicolet iS50
con celda dispersiva (Figura 16), los grficos se realizaron en el software estadstico
OriginPro 8. Los espectros se midieron en el rango de 600 a 4000 nm. Cada una de
las muestras se concentraron en un rotaevaporador marca eppendorf Vacufuge TM a
temperatura de 30C por 12 horas.

Figura 16. Equipo Thermo scientific utilizado para el anlisis de FTIR.

6.4. HPLC

Para identificar cada uno de los carbohidratos se hizo un anlisis previo de corrimiento
de stos, utilizando un cromatgrafo de lquidos marca Agilent Techologies serie
1200, con una columna Agilent Zorbax empacada con 3-aminopropilsilano (4.6 mm ID
x 150) mm para el anlisis de carbohidratos con una fase mvil Acetonitrilo-H2O
(75:25) utilizando concentraciones conocidas.

46
 VII. RESULTADOS Y DISCUSIN.

El polisacrido predominante en la planta de agave es la inulina, que est compuesta

principalmente de monosacridos de fructosa (85 a 92%); est fructosa es obtenida
de la hidrolisis, en la mayora de los casos por medio trmico; la composicin general
en porcentaje de la planta es:

Tabla 6. Composicin general en la planta de agave.

COMPOSICIN PORCENTAJE
(%)
Humedad 60
Carbohidratos 25
Fibras 10
Sales minerales 2.5
Otros (protenas, saponinas, etc.) 2.5

Tratamiento de las muestras

Se prepararon 13 muestras las cuales consistieron en la extraccin del jugo crudo del
cogollo o escapo floral, penca o hoja y pia o tallo de tres agaves distintos, solo los
jugos provenientes del tallo fueron hidrolizados (jugo cocido). En la Tabla 7 se
observan los parmetros de pH y grados Brix de cada una de los jugos en su estado
inicial de cada agave, donde notamos que el pH en todas las muestras; se encuentran
en valor entre 4 a 5 por lo tanto es levemente cido. Vera et al. (2009) reportan que el
pH en los agaves mezcaleros de la regin de Oaxaca vara entre especies y por las
condiciones de cocimiento; reportan en A. angustifolia el pH fue de 4.5 mientras que
en el mismo agave pero cocido presenta un pH 5.5, siendo un pH muy similar al
determinado en estas muestras.

47
 Tabla 7. Determinacin de pH y Bx

Agave pH Bx
cogollo 5 7.4
penca 5 5.4
Americana
jugo 5 5.2
jugo cocido 5 7
cogollo 5 9.8
penca 5 8
Salmiana
jugo 5 6
jugo cocido 5 6
cogollo 5 8
Tequilana penca 4 8.8
Weber jugo 5 9
jugo cocido 4 9

En la Figura 17, se presenta la cromatografa en capa fina (CCF) de una

alcuota de los estndares de azcares, las placas fueron reveladas con el reactivo
difenilamina que es especfico para azcares reductores y la reaccin se consider
positiva por la formacin de un complejo color caf. En el caso de los estndares la
mancha aparece cercano al frente del solvente (con Rf= 0.74) y presentan
tonalidades azul-verde. Se determin el valor de Rf de cada estndar, el cual se
muestra en la Tabla 8. Tambin a los jugos de los agaves que tericamente
contienen azcares fueron sometidos al anlisis por CCF.

48
 .

Figura 17. Placa control de CCF de los estndares de azcares (C1-C7). Las placas se
corrieron con iso-propanol-Acetona-cido lctico 0.01M (4:4:1) y se revelaron con
Difenilamina. La mancha con Rf de 0.74 (flecha) correspondera a los azcares
reductores.

Tabla 8. Valor de azcares en cromatografa en capa fina

Azcar Valor de Rf
Lactosa 0.22
Manosa 0.28
Galactosa 0.36
Glucosa 0.41
Fructosa 0.46
Xilosa 0.52

En la Figura 18, se presenta la CCF del jugo de agave salmiana y agave tequilana
Weber (Figura 19), las placas fueron reveladas con el reactivo difenilamina que es
especfico para azcares reductores y la reaccin se consider positiva por la formacin
de un complejo color caf. La presencia de manchas intensas (Rf=0.46) indicara
contaminacin de algn otro compuesto distinto a los azcares. De lo anterior se
concluye que la se determin la presencia cualitativa de azcares.
49
 Figura 18. Cromatografa en capa fina de Agave salmiana.
a) imagen escaneada b) fotografa

La primera (a) placa corresponde a la imagen de la placa revelada de los jugos del
Agave salmiana, la segunda (b) es una fotografa de la misma placa unos momentos
despus del revelado. La carga de las muestras en las placas de slice gel se marc
de la siguiente forma: 1.-jugo cocido. (Rf= 0.75). 2.- jugo crudo (Rf=0.725). 3.-
cogollo. y 4.- penca (Rf=0.75).

La placa CCF mostrada en la Figura 19 tratada con isopropano-acetona-ac. lactico

0.1 M (4:4:1) y fue revelada con difenilaamina, mostrndonos la coloracin caf de

Figura 19. Cromatografa en capa fina de Agave tequilana Weber.

a) imagen escaneada b) fotografa

50
las diferentes muestras del agave: penca (1,Rf=0.756), cogollo (2, Rf=0), juego pia
(3,Rf=0.731), jugo cocido (4,Rf=0.731). Se muestra la placa en dos resoluciones de
imagen, escaneada (a) y en fotografa (b), adems las flecha superior muestra el nivel
que ms alto que alcanzo la fase mvil en la placa tomndola en cuenta para los
clculos del Rf de cada muestra.

La figura 20 muestra la placa CCF de Agave americana de manera escaneada (a) y

en fotografa (b) donde el complejo caf del revelador se encuentra en todas las
posiciones con un Rf muy parecido entre s (1:0.756, 2:0.731, 3:0.731, 4:0.682). Las
flechas indican el centro del complejo mencionado y el lmite que alcanz la fase mvil
en la placa.

Figura 20. Cromatografa en capa fina de Agave americana.

Si se compara la coloracin de los estndares con las muestras se observa que el

color es similar al de la fructosa, glucosa y sacarosa; as mismo que sus Rf.
Indicando la presencia de estos azcares en las diferentes partes de los agaves. La
coloracin es ms intensa en el jugo crudo de cada agave probable mayor
concentracin de azcares.

Los resultados de esta tcnica es similar a la reportada por Mellado y Lpez (2013),
los cuales determinaron por CCF e identificados mediante estndares los
carbohidratos presentes en un jarabe de agave azul (tequilana Weber). Utilizaron la
51
misma metodologa, mostrando que los jarabes de agave azul contienen fructosa en
abundancia y algunos contienen trazas de FOS DP4 (kestosa y nistosa), formados
en la hidrlisis de los fructanos de A. tequilana Weber.

Continuando con los resultados cualitativos, la espectroscopa de infrarrojo con

transformada de Fourier (FTIR) permiti identificar grupos funcionales presentes en
los compuestos orgnicos y que gracias a la diferencia observada en el momento
dipolar de los enlaces, es posible su deteccin mediante las frecuencias de vibracin
que se registran en la regin de infrarrojo del espectro electromagntico. Por tanto,
las frecuencias registradas entre 4000 a 500 cm-1 del IR, permite identificar y efectuar
un anlisis comparativo de los grupos funcionales presentes en las diferentes
muestras de los agaves, adems de los estndares empleados de carbohidratos.

En la Figura 21, se observan los espectros obtenidos de los estndares, resultando

que las mayores vibraciones se encuentran en los rangos de 500 a 1500 cm-1 y 2900
a 3500 cm-1 correspondientes a las vibraciones del enlace O-H, indicando la
existencia de molculas derivadas de alcoholes; el enlace C-H de los grupos
alifticos localizados en la regin de 3000 cm-1, tambin son observados (figura 21).

En la Figura 22, las flechas nos indica una longitud de onda que oscila entre los 1040
cm-1 a los 1070 cm-1, la flecha roja indica el pico con una longitud de onda 1390-1395
cm-1, la flecha negras con una longitud de 1575-1580 cm-1. El mayor nmero de
frecuencias encontradas en el espectro de IR coinciden a lo esperado por las
vibraciones del enlace C-H a 1365-1420 cm-1 correspondientes a compuestos
alifticos saturados, principalmente.

52
Figura 21. Espectro FT-IR de estndares de azcares.

Figura 22. Espectro FT-IR del Agave salmiana.

53
Para los espectros de Agave tequilana Weber y americana (Figuras 23 y 24), las
vibraciones del enlace C=C no conjugado, es una de la frecuencias observadas con
mayor definicin y se encuentra localizada a 1587 cm -1, frecuencia que coincide con
la vibracin reportadas por Vats, (2013). Por lo que, el mayor nmero de frecuencias
encontradas en el espectro de IR coinciden a lo esperado por las vibraciones del
enlace C-H a 1365-1420 cm-1 correspondientes a compuestos alifticos saturados,
principalmente.

Figura 23. Espectro FT-IR del Agave tequilana Weber.

54
 Figura 24. Espectro FT-IR del Agave americana.

Se observ un patrn esencialmente idntico donde las bandas caractersticas

aparecieron a 3300 cm-1 y en 1700 cm-1, el primer pico fue identificado tambin en
los trabajo de Wu y Lee (2000) que corresponde a un grupo O-H y el segundo como
C=O. Se observa que alrededor de la frecuencia 330 y 1600 cm -1 en los espectros
de los Agaves salmiana, tequilana Weber y americana, teniendo un pico particular,
la frecuencia que abarca de 3300 a 3500 cm-1 es caracterstica de enlaces N-H que
pertenece al grupo funcional de las aminas o bien de H que pertenecen a un puente
de Hidrogeno u O-H libre (McMurry, 2001).

Las frecuencias de 1600 a 1680 cm-1 corresponden a C=C es decir a los alquenos,
por lo que podemos ubicar estos grupos funcionales en los espectros de los jugo de
los tres agaves. Las frecuencias de 1000-1500 cm-1 corresponde a un enlace C-O
que puede pertenecer a un ter (C-O-C), observado en todos los jugos. Se ha
reportado tambin, la presencia de azcares en los jugos de A. salmiana, A.
tequilana y A. americana como la sacarosa, la cual presenta vibraciones

55
caractersticas a 1045 y 1120 cm-1, las frecuencias localizadas sugieren la presencia
de fructosa y glucosa (Mellado y Lpez, 2015). Con los espectros de IR, obtenidos
para los jugos de los tres agaves se puede distinguir que existe una gran posibilidad
de que los carbohidratos presentes sean en su mayora fructosa y glucosa, ya que
se sabe que estn presentes en el agave.

Por ltimo, se realiz cuantificacin de carbohidratos en los jugos de agaves por la

tcnica de HPLC. Las muestras empleada se observan en la Tabla 9 donde se
especifica el origen de cada jugo y las concentraciones iniciales de solidos de cada
uno de ellos.

Tabla 9. Muestras de jugos de los agaves y su concentracin empleados en HPLC.

Muestra Concentracin (mg/ml)

Jugo de Agave americana del cogollo 120
Jugo de Agave americana de la hoja 70
Jugo de Agave americana crudo 100
Jugo de Agave americana cocido 70
Jugo de Agave tequilana Weber del cogollo 150
Jugo de Agave tequilana Weber de la hoja 100
Jugo de Agave tequilana Weber crudo 140
Jugo de Agave tequilana Weber cocido 200
Jugo de Agave salmiana cogollo 90
Jugo de Agave salmiana de la hoja 130
Jugo de Agave salmiana crudo 140
Jugo de Agave salmiana cocido 100

56
En la Tabla 10, se observan los carbohidratos empleados como estndares para la
determinacin y cuantificacin de los jugos, adems de los tiempos de retencin de
cada uno expresados en los espectros obtenidos por HPLC.

Tabla 10. Estndares y tiempos de retencin

Tiempo de retencin
Carbohidratos
(minutos)
Ramnosa 3.07
Xilosa 3.35
Arabinosa 3.566
Fructosa 5.7
Dextrosa 6.3
Galactosa 6.66
Sacarosa 8.07
Trehalosa 9.651

En la Tabla 11 se observan los azcares determinados en cada jugo de agave.

Todos los jugos presentan Fructosa y Dextrosa, casos especiales son: el Jugo de
Agave tequilana Weber crudo que adems presenta Ramnosa; en el jugo de Agave
americana del cogollo Xilosa y Arabinosa, en el Jugo Agave tequilana Weber del
cogollo Galactosa; en el jugo de Agave americana crudo se encontr Sacarosa y
Trehalosa.

57
 Tabla 11. Carbohidratos y concentraciones (mg/ml) determinadas en los jugos de los
Agaves tequilana Weber, americana y salmiana.

Arabinosa

Galactosa

Trehalosa
Ramnosa

Sacarosa
Dextrosa
Fructosa
(mg/ml)

(mg/ml)

(mg/ml)

(mg/ml)

(mg/ml)

(mg/ml)

(mg/ml)

(mg/ml)
Xilosa
Jugo de Agave

americana del
0.2541 0.3077 1.7647 1.3663
cogollo
americana de la
1.5533 6.4871 9.7721
hoja
americana crudo 85.2477 87.2582 3.6567 6.7268

salmiana de la hoja 3.4612 2.6982

salmiana crudo 4.9954 4.1692

salmiana cocido 2.9335 2.9998

tequilana Weber
0.7496 1.0104 2.981
del cogollo
tequilana Weber
4.9065 4.558
de la hoja
tequilana Weber
0.2304 3.4459 3.8661
crudo
tequilana Weber
8.0819 3.4565
cocido

En la Figura 25, se muestra el espectro de los jugo de Agave tequilana Weber

obtenido por HPLC, se observa para el jugo tequilana Weber en penca y el jugo
cocido solo la presencia de fructosa y dextrosa; el jugo tequilana Weber del cogollo
presenta fructosa, dextrosa y galactosa; mientras que el jugo tequilana Weber crudo
presenta Ramnosa, fructosa y dextrosa.

58
Figura 25. Espectros obtenidos por HPLC de los jugo de diferentes partes del Agave
tequilana Weber. En color azul se expresa el solvente (Acetonitrilo:Agua 50:50), en
rosa se expresa la Ramnosa, en naranjado la fructosa, en verde la Dextrosa y en
amarillo se expresa la Galactosa.

59
Hernndez et al. (2005) reportan que la presencia de Ramnosa y Galactosa se debe
a la Quillaja, ya que est a pesar de tener una estructura compleja en la que se
observan diversas fracciones, posee una aglicona sustituida con un limitado nmero
de diferentes sacridos (galactosa, fructosa, ramnosa, xilosa, glucosa y apiosa),
adems de cido quillaco y cido glucornico, de igual forma las sapogeninas
esteroidales se encuentran sustituidas por un limitado nmero de monosacridos
unidos entre s por enlaces glicosdicos en cadenas lineales o ramificadas, en ambos
casos la hidrlisis provocada supone un rompimiento total de los enlaces
glicosdicos, de forma tal que todos los azcares que conforman a la saponina
queden expuestos como monosacridos.

En la figura 26, se observa los espectro de los jugos de Agave americana obtenido
por HPLC, destacando el jugo del cogollo que presenta Xilosa (0.2541 mg/mL),
Arabinosa (0.3077 mg/mL), Fructosa (1.7647 mg/mL) y Dextrosa (1.3663 mg/mL); y
el jugo de penca con un contenido de Arabinosa (1.5533 mg/mL), Fructosa (6.4871
mg/mL) y Dextrosa (9.7721 mg/mL). Pero aunque el jugo de Agave americana crudo
solo presenta Fructosa (85.2477 mg/mL), Dextrosa (87.2582 mg/mL), Sacarosa
(3.6567 mg/mL) y Trehalosa (6.7268mg/mL) es el jugo que expresa la mayor
concentracin de estos carbohidratos incluso con respecto a los jugos de Agave
tequilana Weber y salmiana.

60
Figura 26. Espectros obtenidos por HPLC de los jugos de Agave americana. (De
diferentes partes del agave) En color azul se expresa el solvente (Acetonitrilo:Agua
50:50), en naranjado la fructosa, en verde la Dextrosa, la fecha azul indica la presencia
de Sacarosa y la flecha roja de Trehalosa.

En la Figura 27, se observan los espectros de los jugos de Agave salmiana

obtenidos por HPLC, donde la mayor concentracin de Fructosa (4.9954 mg/ml)
y Dextrosa (4.1692 mg/ml) la encontramos en el jugo de Agave salmiana crudo.
Segn lo reportado por Lpez y Mancilla (2002) la mayor concentracin de fructosa

61
en los agaves se registra en los jugos cocidos, ya que, la hidrlisis trmica y acida
aumenta considerablemente la concentracin de este carbohidrato, siendo menor en
jugos de agave crudo. Pero en este caso con los resultados obtenidos podemos
suponer que la baja concentracin de fructosa en los jugos de Agave salmiana
cocido se deba al proceso de extraccin despus del cocimiento ya que estos jugos
fueron diluidos.

Figura 27. Espectros obtenidos por HPLC de los jugos de Agave salmiana. En color
azul se expresa el solvente (Acetonitrilo:Agua 50:50), en naranjado la fructosa, en
verde la Dextrosa.

62
 VIII. CONCLUSIONES

La obtencin y separacin de carbohidratos mediante cromatografa en columna

mostr un rango de Rf de 0.72-0.75 para todos los jugos de los agaves que
correspondera a los azcares reductores.

Determinadas regiones espectrales de FT-IR demostraron ser muy tiles para la

determinacin de estructuras qumicas en los jugos. Una banda en la regin de 1075
cm-1 para los jugos de los agaves confirm las vibraciones caractersticas de fructosa
y dextrosa.

Los resultados obtenidos sugieren la presencia de carbohidratos y metabolitos

importantes en las hojas de los Agaves americana y tequilana Weber, donde el
anlisis por HPLC permiti la identificacin de Xilosa, Arabinosa, Fructosa, Dextrosa,
Sacarosa, Galactosa y Trehalosa, esta ltima slo en Agave americana.

63
 IX. LITERATURA CITADA

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