Conceitos e Métodos para Formação de Profissionais em Laboratórios de Saúde

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Conceitos e Mtodos para a Formao de Tcni-

cos em Laboratrios de Sade
2 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade
FUNDAO OSWALDO CRUZ

Presidente
Paulo Ernani Gadelha Vieira
ESCOLA POLITCNICA DE SADE JOAQUIM VENNCIO

Diretora
Isabel Brasil Pereira
Vice-diretor de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnolgico

Maurcio Monken
Vice-diretora de Ensino e Informao

Mrcia Valria Morosini
Vice-diretor de Gesto e Desenvolvimento Institucional

Sergio Munck
INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Diretora
Tnia Cremonini Arajo Jorge
Vice-diretora de Pesquisa, Desenvolvimento Tecnolgico e Inovao

Mariza Gonalves Morgado
Vice-diretora de Ensino, Informao e Comunicao

Helene dos Santos Barbosa
Vice-diretora de Servios de Referncia e Colees Cientficas

Elizabeth Ferreira Rangel
Vice-diretor de Desenvolvimento Institucional e Gesto

Christian Maurice Gabriel Niel
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Conceitos e Mtodos para a Formao de Tcnicos

em Laboratrios de Sade
Volume 4
ORGANIZADORAS
Etelcia Moraes Molinaro
Luzia Ftima Gonalves Caputo
Maria Regina Reis Amendoeira
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Sumrio
Prefcio 9
Apresentao da coleo 13
Apresentao pelas organizadoras 15
Captulo 1. Imunologia 19
Captulo 2. Virologia 125
Captulo 3. Bacteriologia 221
Captulo 4. Micologia 399
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Captulo 1
Imunologia
Antnio Teva
Jos Carlos Couto Fernandez
Valmir Laurentino Silva
1. Introduo Imunologia
A imunologia uma cincia recente. Sua origem atribuda, por alguns
autores, a Edward Jenner, que, em 1796, verificou proteo induzida pelo
cowpox (vrus da varola bovina) contra a varola humana, nomeando tal pro-
cesso da vacinao. No entanto, sabido que, na antiguidade, os chineses j
inalavam o p das crostas secas das pstulas de varola ou as inseriam em
pequenos cortes na pele, em busca de proteo.
O sistema imune o conjunto de clulas, tecidos, rgos e molculas
que os humanos e outros seres vivos usam para a eliminao de agentes ou
molculas estranhas, inclusive o cncer, com a finalidade de se manter a
homeostasia do organismo. Os mecanismos fisiolgicos do sistema imune con-
sistem numa resposta coordenada dessas clulas e molculas diante dos orga-
nismos infecciosos e dos demais ativadores, o que leva ao aparecimento de
respostas especficas e seletivas, inclusive com memria imunitria, que tambm
pode ser criada artificialmente, atravs das vacinas. Na ausncia de um sistema

imune funcional, infeces leves podem sobrepujar o hospedeiro e lev-lo
morte. Porm, mesmo com um sistema imune funcional, o homem, por exem-
plo, pode adquirir uma doena infecciosa ou um cncer, pois a resposta imune
especfica, diante de um agente agressor, leva tempo para se desenvolver e,
alm disso, tanto organismos estranhos, como clulas neoplsicas, desenvol-
vem mecanismos de evaso para fugir da resposta imune.
Neste captulo, sero abordados conceitos bsicos dos principais com-
ponentes do sistema imune, os mecanismos de resposta especfica ante os
diversos agentes infectoparasitrios, como tambm a investigao dos vestgios
da passagem desses agentes, por meio de mtodos laboratoriais para pesquisa
de antgenos e anticorpos especficos, principal propsito desse texto, uma
vez que se destina a alunos de escolas tcnicas de nvel mdio.
2. rgos, tecidos e clulas

envolvidos na resposta imunitria
2.1. Clulas que participam do sistema imunitrio

As respostas imunes so mediadas por uma variedade de clulas e por
molculas que estas clulas expressam (Figura 1). Os leuccitos so as clulas
que desempenham as principais aes, mas outras clulas, que se encontram
nos tecidos, tambm participam da resposta imunitria, enviando sinais e rece-
bendo estmulos dos leuccitos. As clulas que participam do sistema imunitrio
se originam na medula ssea, onde muitas evoluem para a fase adulta. A partir
da medula, e por meio de vasos sanguneos, elas migram junto com todos os
elementos celulares do sangue. Inclusive as hemcias, que transportam o oxig-
nio, e as plaquetas que participam da coagulao, uma vez que estes elemen-
tos se originam das clulas-tronco progenitoras da medula. As clulas que
derivam do progenitor mieloide e do progenitor linfoide so as que mais
Imunologia | 21
interessam para o entendimento das aes do sistema imunitrio, de modo

que, neste texto, no sero considerados os megacaricitos e os eritrcitos.
O progenitor mieloide o precursor dos granulcitos, fagcitos
mononucleares (macrfagos), clulas dendrticas e mastcitos do sistema imu-
ne. Os macrfagos so as clulas fagocitrias mais relevantes. Estas clulas so
a forma diferenciada dos moncitos sanguneos, que se encontram estrategica-
mente distribudos em vrios tecidos para dar origem ao sistema fagocitrio
mononuclear. Os microglicitos so os macrfagos do crebro, as clulas de
Kupffer so os macrfagos do fgado, os macrfagos alveolares fazem parte do
tecido pulmonar, entre outros macrfagos residentes em diferentes tecidos. As
funes dos macrfagos se caracterizam pela neutralizao, ingesto e destrui-
o de partculas, incluindo os biopatgenos, alm de processar e apresentar
antgenos para os linfcitos T. Neste contexto, so as clulas dendrticas as
mais especializadas na captura e na apresentao de antgenos para os linfcitos
T. As clulas dendrticas imaturas migram do sangue para residirem nos tecidos
e realizam tanto a fagocitose quanto a micropinocitose. Aps o encontro com
um patgeno, maturam rapidamente e migram para os ndulos linfticos, onde
encontram o ambiente adequado para a apresentao de antgenos.
Os granulcitos recebem essa denominao por possurem grnulos em
seu citoplasma que se coram densamente por corantes hematolgicos tradicio-
nais. So tambm chamados de leuccitos polimorfonucleares, devido s formas
de seus ncleos. Existem trs tipos de granulcitos, sendo eles os neutrfilos, os
eosinfilos e os basfilos; todos com um tempo de vida relativamente curto e
produzidos em grande nmero durante as respostas inflamatrias.
Os neutrfilos, assim como os macrfagos e as clulas dendrticas, so
representantes do grupo de clulas fagocitrias do sistema imunitrio, mas,
diferentemente destas clulas, no apresentam antgenos para os linfcitos T.
Os neutrfilos so os elementos celulares mais numerosos e importantes da
resposta inata.
Os eosinfilos parecem ser importantes, principalmente na resposta

diante de infeces parasitrias ou processos alrgicos, j que seu nmero
aumenta no curso destas reaes.
A funo dos basfilos provavelmente similar e complementar dos
eosinfilos e mastcitos.
Os mastcitos, cujo precursor parece ser comum aos basfilos,
devido a semelhanas funcionais, tambm se diferenciam ao chegar aos
tecidos onde residem. Eles se localizam principalmente margem dos
vasos sanguneos e liberam mediadores que agem nas paredes vasculares
quando ativados.
Figura 1. Clulas que participam do sistema inunitrio

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O progenitor linfoide comum d origem aos linfcitos. Os linfcitos so

as clulas que reconhecem, especificamente, os antgenos. Sua morfologia tpica
consiste em uma pequena clula redonda com ncleo esfrico. Apesar da aparn-
cia uniforme microscopia tica, vrios tipos de linfcitos podem ser distinguidos
com base nas suas propriedades funcionais e protenas especficas que expressam.
A distino mais fundamental consiste na classificao destas clulas em duas
linhagens principais, conhecidas como linfcitos B e linfcitos T.
Os linfcitos B, tambm chamados de clulas B (de bursa ou bolsa de
Fabricius, nas aves, e derivadas da medula ssea, nos mamferos), quando
ativados, proliferam e se diferenciam em clulas plasmticas ou plasmcitos,
que so as clulas efetoras da linhagem B, cuja funo principal a secreo de
anticorpos. Os linfcitos T, ou clulas T (derivados do timo), se apresentam
em duas classes principais. Uma se diferencia, quando ativada, em clulas T
CD8+ ou citotxicas, que matam as clulas infectadas, ao passo que a outra
classe de clulas T, chamadas de clulas T CD4+ ou auxiliares, atuam na
ativao de outras clulas, como os linfcitos B e os macrfagos, alm de
coordenar a resposta imunitria.
O receptor de antgeno da clula B (BCR) (Figura 2) uma forma de
anticorpo ligada membrana que a clula B passa a produzir, aps sua ativao
e diferenciao em clula plasmtica. Os anticorpos so molculas agrupadas
em uma classe de substncias denominadas imunoglobulinas, e o receptor de
antgeno do linfcito B tambm conhecido como imunoglobulina de mem-
brana. A imunidade humoral a principal funo das clulas B e dos
plasmcitos, e consiste em secretar anticorpos no sangue e em outros lquidos
orgnicos, resultando efeitos protetores, mediados por lquidos teciduais.
O receptor de antgeno da clula T (TCR) (Figura 2) constitui uma
classe heterognea de protenas de membrana que, embora estejam relaciona-
das evolutivamente com as imunoglobulinas, so diferentes delas, j que esto
adaptadas para detectar antgenos derivados de protenas estranhas ou

patgenos que entram nas clulas hospedeiras. Todavia, em contraste com as
imunoglobulinas, os TCRs nunca so secretados, de modo que a clula T
precisa migrar at as reas de leso para exercer seus efeitos protetores, por
meio de contato direto com a clula alvo ou para influenciar as atividades de
outras clulas do sistema imunitrio. Juntamente com os macrfagos, as
clulas T desenvolvem uma categoria de resposta imune denominada imuni-
dade mediada por clulas.
Figura 2. Estruturas bsicas do receptor de superfcie da clula B e do receptor T.
A maioria dos linfcitos virgens possui uma sobrevida muito curta,

sendo programada para morrer em poucos dias aps ter sado da medula
ssea ou do timo. No entanto, se uma dessas clulas receber sinais indican-
do a presena de um imungeno (antgeno que estimula uma resposta imune
especfica), ela poder responder por meio de um fenmeno conhecido
como ativao, durante o qual pode sofrer vrios ciclos de diviso celular.
Imunologia | 25
Algumas das clulas-filhas retomam ao estado de repouso, tornando-se clu-

las de memria, que podem sobreviver por vrios anos. Estes linfcitos de
memria representam uma grande proporo das clulas do sistema imunitrio.
A outra prognie do linfcito virgem ativado diferencia-se em clulas efetoras,
que sobrevivem apenas alguns dias, mas que, durante este perodo, executam
atividade que resultam em defesa.
Outra classe de clulas linfoides, chamada de clulas matadoras natu-
rais ou clulas natural killer (NK), desprovida de receptores antgeno-
especficos, sendo parte do sistema imune inato. Essas clulas circulam no
sangue como grandes linfcitos, com diferentes grnulos citotxicos, e so
capazes de reconhecer e matar algumas clulas anormais, tais como clulas
tumorais e clulas infectadas por vrus. E parecem ser importantes na defesa
contra biopatgenos intracelulares na imunidade inata.
2.2. Os rgos linfoides e a rede linftica

Os rgos linfoides (Figura 3) so tecidos organizados que contm
grandes quantidades de linfcitos em um ambiente de clulas no linfoides.
Nesses rgos, as interaes que os linfcitos tm com as clulas no linfoides
so importantes, tanto para o desenvolvimento dos linfcitos e o incio da
resposta imune adaptativa, como para a manuteno dos mesmos. Tais r-
gos podem ser divididos em rgos linfoides centrais ou primrios, produ-
tores de linfcitos, e rgos linfoides perifricos ou secundrios, que de-
sempenham a funo de maximizar o encontro entre os linfcitos e os
produtos processados pelas clulas apresentadoras de antgenos, dando in-
cio resposta imune. Os rgos linfoides centrais so a medula ssea
vermelha e o timo, um grande rgo localizado na poro superior do trax.
Tanto os linfcitos B como as clulas T surgem na medula ssea, mas apenas
os linfcitos B ali se diferenciam. Os linfcitos T migram para o timo para
sofrer seu processo de diferenciao. Uma vez completada sua maturao
celular, os dois tipos de linfcitos entram na corrente sangunea, migrando

para os rgos linfoides perifricos. Durante a vida intrauterina, o fgado
fetal desempenha o papel que a medula ssea vermelha passa a desenvol-
ver plenamente aps o nascimento.
Os rgos linfoides perifricos so especializados na captura do
antgeno para possibilitar o incio das respostas imunes adaptativas. Os
microrganismos patognicos podem penetrar no hospedeiro por muitas
portas de entrada, instalando o processo infeccioso em qualquer stio, mas
o encontro do antgeno com os linfcitos acontecer nos rgos linfoides
perifricos: os ndulos linfticos, o bao e vrios tecidos linfoides associa-
dos s superfcies das mucosas. Os linfcitos esto em contnua recirculao
entre esses tecidos, para os quais o antgeno tambm carreado, vindo de
todos os locais de infeco, primariamente dentro de macrfagos e clulas
dendrticas. Dentro dos rgos linfoides, clulas especializadas, como as
clulas dendrticas maduras, apresentam o antgeno para os linfcitos.
A rede linftica consiste em um extenso sistema de vasos que
coletam o lquido intersticial, fazendo-o retornar para o sangue. Esse
lquido intersticial produzido continuamente pela passagem de gua e
solutos de baixo peso molecular atravs das paredes vasculares que pe-
netram no espao intersticial, pela secreo celular e outros fatores de
excreo. Ao ser parcialmente drenado para os vasos linfticos, passa a
ser chamado de linfa. A linfa flui lentamente pelos vasos linfticos prim-
rios, desgua em vasos linfticos de calibre progressivamente maior, que
convergem para o ducto torcico, e desemboca na veia cava superior,
que, por sua vez, devolve todo o volume para a corrente sangunea, num
fenmeno denominado recirculao.
Localizados em pontos de convergncia da rede vascular, os ndu-
los linfticos constituem uma srie de rgos encapsulados em forma de
caroo de feijo, que se distribuem ao longo dos vasos linfticos. Os
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vasos linfticos aferentes drenam o fluido dos tecidos e carregam antgenos

e clulas infectadas aos seios dos ndulos linfticos, onde os antgenos so
capturados. Os seios so revestidos por orifcios minsculos, que permi-
tem a linfa e seu contedo atravessarem o ndulo linftico e entrarem em
contato com os linfcitos. Nos ndulos linfticos, os linfcitos B se locali-
zam em folculos nas reas corticais, tambm denominadas reas timo-
independentes; as clulas T so mais difusamente distribudas em torno das
reas paracorticais, tambm conhecidas como zonas de clulas T ou reas
timo-dependentes. Alguns dos folculos de clulas B contm reas cen-
trais, denominadas centros germinativos, onde ocorre intensa proliferao
dos linfcitos B, aps seu encontro com o antgeno especfico e clulas T
auxiliares. Por fim, a linfa sai por um vaso linftico eferente no lado oposto
do ndulo linftico, numa regio conhecida como hilo.
O bao encontra-se situado atrs do estmago e filtra o sangue da
mesma forma como os ndulos linfticos filtram a linfa e coletam antgenos.
Tambm captura e se desfaz de clulas vermelhas senescentes. A massa
principal deste rgo composta pela polpa vermelha e os linfcitos cir-
cundam as arterolas que o penetram, formando reas da polpa branca, cuja
regio mais interna dividida em uma camada linfoide periarteriolar, con-
tendo principalmente clulas T e revestidas por uma coroa de clulas B.
Figura 3. rgos, tecidos e clulas envolvidos na resposta imunitria.
2.3.Tecido linfoide associado mucosa

A expresso tecido linfoide associado mucosa (MALT = mucosal-
associated lymphoid tissue) uma descrio geral para os tecidos linfoides no
encapsulados, que existem nas regies subjacentes s mucosas. Os MALTs se
distribuem anatomicamente e seus componentes individuais incluem:
Anel de Waldeyer - Anel de estruturas linfoides que circunda a
faringe. formado pelas tonsilas e adenoides.
Tecido linfoide associado aos brnquios (BALT = bronchial-associated
lymphoid tissue) - Agregados linfocitrios semelhantes, mas organizados
difusamente, que protegem o epitlio respiratrio.
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Tecidos linfoides associados ao intestino (GALT = gut-associated

lymphoid tissues) - Incluem folculos linfoides isolados e o apndice
cecal, alm de estruturas especializadas do intestino delgado, as placas
de Peyer.
Tecido linftico urogenital
Entre outros MALTs (Figura 3).
Coletivamente, estima-se que o sistema imune de mucosa contenha
tantos linfcitos quanto o resto do corpo. Esses linfcitos formam um grupo
especial de clulas que seguem leis um tanto diferentes. Embora notavelmente
diferentes em sua aparncia, os ndulos linfticos, o bao e os tecidos linfoides
associados mucosa demonstram a mesma arquitetura bsica. Cada um deles
opera segundo o mesmo princpio, capturando o antgeno nos locais de infec-
o e apresentando-o a pequenos linfcitos migratrios para, assim, induzirem
as respostas imunes adaptativas. Os tecidos linfoides perifricos tambm proveem
sinais de sobrevivncia aos linfcitos que no encontram seu antgeno especfi-
co. Isto importante para manter o nmero correto de linfcitos T e B
circulantes, e assegura que somente os linfcitos com o potencial de responder
ao antgeno estranho sejam mantidos.
2.4. Recirculao de linfcitos

Os pequenos linfcitos T e B que se diferenciaram na medula ssea e
no timo, mas que ainda no se encontraram com o antgeno, so referidos
como linfcitos virgens ou em repouso. Estes elementos circulam continua-
mente do sangue para os tecidos linfoides perifricos, nos quais penetram por
meio de interaes adesivas especiais com os capilares e retornam para o
sangue atravs dos vasos linfticos ou, no caso do bao, diretamente ao
sangue. Na presena de uma infeco, os linfcitos que reconhecem o agente
infeccioso so retidos no tecido linfoide, onde proliferam e se diferenciam em
clulas efetoras, capazes de controlar a infeco.
Quando ocorre uma infeco tecidual, os antgenos so capturados por

clulas dendrticas, que se deslocam do stio da infeco pelos vasos linfticos
aferentes para os ndulos linfticos. Nos ndulos linfticos, essas clulas pro-
cessam e apresentam o antgeno aos linfcitos T que esto recirculando, os
quais elas ajudam a ativar. As clulas B que encontram o antgeno, medida
que migram atravs do ndulo linftico, tambm so detidas e ativadas com o
auxlio de algumas clulas T ativadas. Uma vez que esses linfcitos especficos
tenham passado por um perodo de proliferao e diferenciao, eles deixam
os ndulos linfticos como clulas efetoras atravs dos vasos linfticos eferentes.
T:: desenvolvimento, diversidade e ativao

3. Clulas T
Os linfcitos so as nicas clulas do organismo que expressam recepto-
res altamente diversificados para o antgeno, o que permite o reconhecimento
de uma grande variedade de substncias estranhas. Essa diversidade gerada
durante o processo de desenvolvimento dos linfcitos T e B, a partir de clulas
precursoras. O desenvolvimento dos linfcitos T alfa beta (ab) e gama delta
(gd) segue estgios sequenciais, consistindo na recombinao somtica e ex-
presso dos genes do TCR, proliferao celular, seleo induzida pelo antgeno
e aquisio de fentipos de capacidade funcional. Essas clulas se originam de
precursores do fgado fetal ou da medula ssea de adultos e completam o seu
desenvolvimento no timo. As clulas T em desenvolvimento no timo so
chamadas de timcitos. A maioria dos timcitos imaturos no expressa o TCR
ou os correceptores CD4 e CD8 e migram atravs do crtex, onde os eventos
de maturao ocorrem quando expressam pela primeira vez o TCR e iniciam a
maturao em clulas CD4 ou CD8.
Os nveis de proliferao e apoptose so extremamente altos nos timcitos
corticais, onde cerca de 95% morrem antes de chegar regio medular do
timo. O resultado desse processo seletivo a restrio ao MHC prprio e a
tolerncia a muitos autoantgenos. A diferenciao funcional e fenotpica em
Imunologia | 31
clulas T CD4 ou CD8 ocorre na medula tmica, e as clulas T maduras so

liberadas para a circulao.
3.1. Receptores de antgenos e molculas

acessrias dos linfcitos T
Os linfcitos T respondem aos antgenos peptdicos, que so expos-
tos pelas clulas apresentadoras de antgenos (APCs). O incio desta res-
posta requer o reconhecimento especfico do antgeno pelas clulas T, a
adeso estvel das clulas T s APCs e a transduo dos sinais ativadores.
Cada um desses eventos mediado por molculas distintas, expressas pelas
clulas T. As molculas de MHC e os peptdeos formam um complexo na
membrana plasmtica das APCs. O receptor que reconhece esse complexo
peptdeo-MHC o TCR (Figura 2), que distribudo clonalmente, ou
seja, os clones de linfcitos que apresentam diferentes especificidades ex-
pressam distintos TCRs. Os sinais bioqumicos, que so acionados na clula
T pelo reconhecimento do antgeno, no so transduzidos pelo TCR, mas
por protenas no variveis chamadas CD3 e dzeta (z), que esto ligadas de
forma no covalente ao receptor do antgeno para formar o complexo TCR.
Portanto, nas clulas T, o reconhecimento do antgeno basicamente realiza-
do por dois grupos de molculas: um receptor para o antgeno altamente
varivel, o TCR, e protenas sinalizadoras no variveis (CD3 e cadeia z).
Outras molculas acessrias funcionam como molculas de adeso para esta-
bilizar a ligao das clulas T s APCs, permitindo que o TCR mantenha
ntimo contato com o antgeno durante o tempo suficiente para a transduo
dos sinais necessrios ativao dessas clulas.
As clulas T que expressam o TCR d pertencem a uma linhagem
distinta das clulas T restritas ao MHC. A percentagem das clulas T d
muito varivel nos diferentes tecidos das diferentes espcies, normalmente no
excedendo mais do que 5%. Elas no reconhecem os antgenos peptdeos
associados s molculas MHC e no so restritas ao MHC. Alguns clones

dessas clulas reconhecem uma pequena molcula que pode ser apresentada
por molculas similares s da classe I do MHC, ou seja, uma apresentao no
clssica de molculas normalmente encontradas nas microbactrias e em outros
microrganismos. A diversidade limitada das clulas d sugere que os ligantes
desses receptores so bem conservados. Elas podem iniciar a resposta imune
contra um pequeno nmero de microrganismos antes mesmo do recrutamento
das clulas T antgeno-especficas ab.
Alm dos componentes do complexo TCR, as clulas T apresentam
vrias protenas de membrana, as quais exercem papel crucial na resposta
destas clulas no reconhecimento do antgeno. Essas molculas presentes
na membrana de linfcitos ligam-se especificamente a outras molculas da
membrana de outras clulas, como as APCs, clulas do endotlio de
vasos e da matriz extracelular. Essas molculas no apresentam regies
variveis, no so polimrficas, so idnticas em todas as clulas T de
todos os indivduos de uma mesma espcie, e so responsveis pela
transduo de sinais bioqumicos para o interior das clulas T. Essa propri-
edade assegura que as clulas T e as APCs permaneam ligadas o tempo
suficiente para permitir aos TCRs a oportunidade de localizar, reconhecer
e responder ao complexo peptdeo-MHC na APC.
3.2. Correceptores CD4 e CD8: Receptores envolvidos na

ativao
As molculas CD4 e CD8 so protenas das clulas T que se ligam s
regies no polimrficas das molculas de MHC e transduzem os sinais que,
juntamente com os sinais liberados pelo complexo TCR, iniciam a ativao das
clulas T. Normalmente, as clulas T ab maduras expressam CD4 ou CD8,
embora existam referncias da expresso de ambos os marcadores. Esses
correceptores interagem com as molculas de MHC, quando o TCR reconhe-
Imunologia | 33
ce de forma especfica o complexo peptdeo-MHC na APC. Cerca de 65%

das clulas T ab maduras do sangue e dos tecidos expressam o correceptor
CD4 e 35% do CD8.
4. Natureza dos antgenos

O antgeno (do grego anti,contra e gen, gerar) qualquer substn-
cia solvel, celular ou particulada que pode ser especificamente ligada por
um anticorpo ou por um receptor de antgeno de clula T. Os antgenos
possuem duas propriedades: a da imunogenicidade, que a capacidade
de induzir uma resposta imune especfica, e a da antigenicidade, que a
capacidade de interagir com os linfcitos T ou linfcitos B j sensibilizados.
Assim, todas as substncias imunognicas so tambm antignicas. As mo-
lculas que desencadeiam a resposta imune so chamadas de imungenos.
Pequenas substncias qumicas no so capazes de estimular uma resposta
e, portanto, recebem o nome de hapteno. Para ter capacidade de induzir
uma resposta imune, o hapteno ligado a uma macromolcula, que
chamada de carreadora. O complexo hapteno-carreador, ao contrrio do
hapteno livre, pode atuar como um imungeno.
4.1. Determinante antignico

Os stios de ligao dos anticorpos e dos TCRs interagem com uma
rea muito pequena das macromolculas antignicas, que chamada de
determinante antignico ou epitopo. Portanto, a menor poro da mo-
lcula responsvel pela ligao ao linfcito ou anticorpo. A presena de
vrios determinantes iguais chamada de polivalncia ou multivalncia e
cada um pode ser ligado por uma molcula com regio varivel. As super-
fcies celulares, incluindo os microrganismos, geralmente possuem uma grande
quantidade de determinantes antignicos.
4.2. Relao filogentica dos antgenos

A estimulao de linfcitos de galinhas com protena de pato resulta em
uma resposta imune muito baixa. Por outro lado, se inoculadas em galinhas,
protenas de coelho, a resposta imune bastante elevada. Isto acontece porque
quanto mais prxima for a relao filogentica, menor ser o estmulo e vice-
versa. Existe pouca diferena entre as protenas de galinhas e patos e muita
diferena entre as protenas de aves e mamferos. Embora este conceito da
relao filogentica reflita boa parte das aplicaes imunolgicas, no pode ser
tomado como regra. A induo de uma resposta imune muito especfica funo
direta da semelhana biolgica entre a fonte do antgeno e o animal receptor,
ainda que seja menos intensa. Lebres e coelhos pertencem mesma famlia e so
bastante semelhantes, tanto morfolgica quanto fisiologicamente. Portanto, ao se
injetar protenas de coelho em lebre, poder se obter anticorpos muito especfi-
cos, ou seja, anticorpos que s reagem contra protena de coelho.
4.3. Peso molecular e complexidade molecular

Na maioria dos antgenos, quanto maior for a molcula, maior ser o
nmero de epitopo; e quanto maior a complexidade, maior ser a
imunogenicidade. Um antgeno complexo contm vrios determinantes
antignicos, onde alguns dos quais so mais eficientes na induo da resposta
imune e so chamados imunodominantes.
4.4. Configurao espacial e acessibilidade

A imunogenicidade e a antigenicidade de uma protena no depende
apenas de sua estrutura primria (isto , da sequncia de aminocido), mas
tambm das estruturas secundrias, tercirias e at quaternrias. Assim, se tratar-
mos uma protena pelo calor, ou agentes qumicos desnaturantes, e inocularmos
esta em um animal, poderemos obter a formao de anticorpos com especificidade
diferente do que se inoculssemos a protena intacta. A configurao espacial de
Imunologia | 35
diversos epitopos em uma nica molcula de protena pode influenciar a ligao

do anticorpo de vrias formas (Figura 4). A rea importante para a imunogenicidade
deve ficar acessvel, na superfcie da molcula.
Figura 4. Distribuio dos determinantes antignicos sequenciais e no

sequenciais em uma macromolcula proteica
4.5. Forma de administrao e adjuvantes

A dose do antgeno, a via e o esquema de imunizao, assim como o
uso de adjuvantes, so fatores atuantes na induo da resposta imune. As
vias de inoculao subcutnea, intradrmica e intramuscular levam geralmente
os imungenos para os ndulos linfticos regionais, e, mais frequentemente,
induzem a imunidade celular. Os antgenos inoculados por via endovenosa e
intraperitonial acumulam-se predominantemente no bao, e mais frequente-
mente induzem a uma imunidade humoral. O adjuvante melhora a
imunogenicidade de compostos com ele misturado, sem interferir na
especificidade da resposta. Em medicina preventiva, so muitas vezes adicio-
nados s vacinas para reduzir a dose e a frequncia de injees dos antgenos
utilizados para a imunoprofilaxia de doenas infecciosas. Normalmente, o
antgeno aprisionado por ele, formando depsitos, o qual liberado aos
poucos por perodo de tempo mais extenso. Com isso, h o aumento do
tempo de exposio do antgeno no organismo pelo retardamento de sua
destruio, estimulando, assim, a migrao de clulas para o local de inoculao

e aumentando a interao destas clulas com o mesmo. O tipo de adjuvante
mais comumente usado em estudos experimentais o adjuvante de Freund,
que pode ser classificado em dois tipos: AIF (Adjuvante Incompleto de
Freund), que constitudo por leo mineral neutro e lanolina ou Arlacel; e o
ACF (Adjuvante Completo de Freund), que alm do leo mineral neutro
mais lanolina, adicionado um componente bacteriano, normalmente o
Mycobacterium, morto pelo calor. Alm desses, outros adjuvantes so utiliza-
dos, como o sulfato de alumnio, o hidrxido de alumnio, a IL-12, entre
outros. Dependendo da composio, adjuvantes podem ou no ser usados em
seres humanos.
Bases qumicas da especificidade antignica

Anticorpos formados contra determinadas substncias tm uma reao
forte contra elas, principalmente se os anticorpos interagem com os antgenos
especficos que induziram a sua formao (antgenos homlogos), mas podem
reagir com a mesma ou menor intensidade com outros antgenos, que so
chamados de antgenos heterlogos, porm com estrutura semelhante. Essas
reaes com antgenos heterlogos so denominadas reaes cruzadas. As
reaes cruzadas podem ocorrer basicamente em funo da similaridade entre
dois diferentes determinantes antignicos, ou ainda pelo fato de dois antgenos
diferentes apresentarem o mesmo determinante antignico.
5. Diversidade das imunogobulinas

Os anticorpos so conceituados como glicoprotenas globulares com
funo imunitria e pertencem superfamlia das imunoglobulinas. So sinte-
tizados por linfcitos B e, principalmente, por plasmcitos, em resposta ao
estmulo imunognico. Interagem, especificamente, com os imungenos, que
estimulam sua biossntese; desencadeiam vrios mecanismos na fase efetora
Imunologia | 37
da resposta imune que, frequentemente, resultam em anular a ao de

biopatgenos, por meio da ativao do sistema complemento, opsonizao
dos antgenos para fagocitose, citotoxicidade celular dependente de anticorpo
(ADCC), em que os anticorpos marcam os microrganismos para serem destrudos
pelas clulas do sistema imune inato e reaes de hipersensibilidades, entre
outras ocorrem.
Estas funes so estruturalmente separadas na molcula e a regio de
ligao ao antgeno varia amplamente, sendo conhecida como regio varivel ou
regio V. A regio molecular que participa da funo efetora conhecida como
regio constante ou C, e no varia do mesmo modo, embora apresente cinco
formas principais que se especializaram na ativao de diferentes mecanismos.
A notvel diversidade das molculas dos anticorpos consequncia de
um mecanismo altamente especializado, pelos quais os genes expressos so
reunidos por rearranjos de DNA, que juntam dois ou trs diferentes segui-
mentos para formar um gene de regio varivel durante o desenvolvimento das
clulas B. Subsequentes rearranjos nucleicos podem reunir o gene composto
da regio varivel e qualquer gene da regio constante, produzindo assim
anticorpos de cada um dos 5 isotipos.
Estruturalmente (Figura 5), a imunoglobulina formada por duas cadeias
leves (L-light-leve), idnticas, constitudas de polipeptdeos de cerca de 25
mil Daltons e de duas cadeias pesadas (H- heavy- pesado), tambm idnticas,
com peso molecular de 50 mil Daltons ou mais. Cada cadeia leve est ligada a
uma cadeia pesada por pontes dissulfdricas. O nmero exato e as posies
destas pontes entre as cadeias diferem entre as classes e subclasses de
Imunoglobulinas. Alm disso, ambas as cadeias, leves e pesadas, possuem
uma regio varivel e outra constante. Portanto, a imunoglobulina possui na
cadeia leve uma regio constante (CL) e uma varivel (VL). O mesmo na
cadeia pesada, uma regio constante (CH) e uma varivel (VH). Existem dois
tipos de cadeias leves, a kappa (k) e a lambda (l). Em humanos, 60% das
cadeias leves so do tipo kappa, e 40% so do tipo lambda. Os primeiros

110, ou mais, aminocidos da regio aminoterminal das cadeias leves ou
pesadas variam muito entre os anticorpos de especificidade diferentes e por
isto so chamadas de regio varivel.
A molcula de imunoglobulina pode ser digerida por enzimas
proteolticas. A digesto pela papana quebra a molcula em trs fragmentos
(Figura 5): dois fragmentos chamados Fab (fragment antingen binding), que
se liga ao antgeno especfico, e um fragmento denominado Fc (fragment
crystallizable, fragmento cristalizvel), por formar cristais quando armazenado
em locais frios. Os fragmentos Fab so os que contm as cadeias leves (L)
completas, emparelhadas com os domnios V (varivel) e C (constante) da
cadeia pesada, enquanto o Fc, contm apenas o domnio C (constante). A
papana cliva a molcula na poro aminoterminal das pontes de enxofre,
permitindo que as metades carboxiterminais da Fc permaneam unidas, dei-
xando o fragmento Fc livre. J a pepsina, cliva na mesma regio, mas na
poro carboxiterminal das pontes dissulfrdicas, produzindo o (Fab)2, onde
os dois braos dos Ac permanecem unidos.
Figura 5. Estrutrua bsica de uma imunoglobina e a formao dos fragmentos

pela digesto enzimtica.
Imunologia | 39
5.1. Gerao da diversidade na resposta imune

humoral e maturao da afinidade
Mesmo a resposta a um Ag simples diversa, com muitas molculas de
Igs, cada uma com afinidade nica e especificidade acurada. Durante a organi-
zao dos diferentes segmentos genticos necessrios para produzir uma mol-
cula de Ig, combinaes ao acaso dos diferentes componentes gnicos produ-
zem uma enorme diversidade potencial.
Durante as fases iniciais do desenvolvimento do linfcito B, a IgM de
membrana produzida como receptor. A mudana de isotipo em clulas B
ocorre ao serem estimuladas pelo antgeno. Isto assegura a manuteno da
mesma regio varivel, garantindo a especificidade ao Ag correspondente,
expressa nos diferentes isotipos, aos quais orientam diferentes funes efetoras.
Uma diferena bsica entre o Ac produzido na resposta primria e na res-
posta secundria a sua afinidade. O Ac da classe IgM, produzido para um
Ag na resposta primria, tende a ser de afinidade relativamente baixa e pode
contar com uma avidez adicional, causada por sua estrutura pentamrica, para
ligar-se eficientemente ao Ag. Entretanto, a IgG e outras classes produzidas
na resposta secundria tendem a ter uma afinidade maior. Vale ressaltar que o
aumento gradual da afinidade do Ac pelo Ag indutor, que observado no
curso de uma resposta, acontece no ndulo linftico. Este fenmeno
(maturao da afinidade) a consequncia da hipermutao somtica dos
genes de Ig acoplada com a seleo das clulas B com Ig de superfcie de
alta afinidade. A maturao da afinidade, no curso de uma resposta imune,
pode ser encarada como um processo darwiniano, requerendo primeiro a
gerao de variabilidade nos receptores de clulas B e ento a seleo
daqueles com maior afinidade pelo Ag. Aps esse processo, as clulas B,
que se ligam ao Ag de modo bem-sucedido e sobrevivem seleo, saem
do centro germinativo do ndulo linftico para tornarem-se clulas B de
memria ou clulas plasmticas secretoras de Ac.
5.2. Distribuio e propriedades dos isotipos

Os agentes infectoparasitrios devem achar seus caminhos para a maior
parte dos locais do organismo hospedeiro, e os anticorpos tambm devem ser
amplamente distribudos para cont-los. Os anticorpos so distribudos por
difuso atravs de mecanismos especiais, para lev-los, por exemplo, para os
pulmes e o intestino. Anticorpos de diferentes isotipos (Figura 6) operam
em locais diferentes. Os primeiros anticorpos a serem produzidos numa res-
posta imune humoral so sempre as IgMs. Estes so produzidos antes que a
clula B tenha sofrido hipermutao somtica; portanto, tendem a ser de baixa
afinidade, como visto anteriormente. Estas molculas formam pentmeros, cujos
10 stios de ligao com o Ag podem se unir simultaneamente a antgenos
multivalentes, tais como os polissacardeos de parede celular bacteriana. Esta
estrutura pentamrica tambm torna a IgM capaz de ativar o complemento de
maneira mais eficaz, o que contribui para o controle mais eficiente de uma
infeco. Quanto IgD, no se conhece muito bem a sua funo, mas parece
exercer um papel na diferenciao dos linfcitos B induzida pelo Ag. O
principal isotipo de imunoglobulina no sangue e nos fluidos extracelulares a
IgG, considerando todas as subclasses (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4). A IgG
tem propriedades diversas, dentre as quais, confere proteo ao feto, pois a
nica classe de imunoglobulina humana que pode ser transportada atravs da
placenta diretamente para a corrente circulatria do feto. A IgG tambm atua
na neutralizao de toxinas, imobilizao de bactrias, sensibilizao para NK,
ativao do complemento e opsonizao.
A IgA a principal imunoglobulina presente em secrees externas,
como saliva, muco, suor, suco gstrico e lgrimas. Alm disso, a principal
imunoglobulina contida no colostro e no leite, e deve ser no neonato a
principal fonte de proteo contra patgenos no intestino. A IgA se divide
em duas subclasses, IgA1 e IgA2. A IgA presente no plasma encontrada na
forma monomrica e em pequenas concentraes, enquanto a forma dimrica
Imunologia | 41
encontrada em grandes concentraes nas regies mucosas do organismo.

Estas previnem a invaso de bactrias ou a penetrao de toxinas nas clulas
epiteliais. A IgE est difundida de maneira moderada nos espaos extravasculares
e tem como principal propriedade a sensibilizao de mastcitos e basfilos,
promovendo reao inflamatria, atravs da liberao de mediadores qumicos
como a histamina, que, por sua vez, promove vasodilatao, permitindo a
passagem de Acs do vaso para a rea lesada, e fatores quimioatraentes que
recrutam fagcitos para o local de infeco. Alm disso, podem estar envolvi-
das em processos alrgicos e na ajuda para eliminao de helmintos, quando
sensibilizam eosinfilos.
Figura 6. Estrutura dos cinco principais isotipos de imunoglobulinas humanas
5.3. Polimorfismo das imunoglobulinas

Quando uma Ig usada como Ag, ela tratada como qualquer outra
protena estranha e faz desencadear uma resposta de Ac. Pode ser produzido
Ac anti-Ig que reconhea aminocidos caractersticos do isotipo do Ac injeta-
do. Tambm possvel gerar Acs que reconhecem diferenas no Ac de
membros da mesma espcie e tal fenmeno se deve variao gentica ou
polimorfismo. Tais variantes allicas so chamadas de alotipos e representam
pequenas diferenas polimrficas nos loci, que codificam as regies constantes

das cadeias leves e pesadas. Contrastando com os Acs anti-isotipos, os Acs
anti alotipos reconhecero Ig de um dado isotipo em alguns representantes de
uma dada espcie. Finalmente, as variaes na sequncia dos epitopos de uma
Ig so conhecidas como idiotipos (Figura 7).
Para a produo de Acs altamente especficos, a clivagem pela papana
(Figura 5) essencial, pois esta enzima, como j foi dito anteriormente, corta
a molcula antes das pontes de sulfeto, o que mantm a poro Fc inteira, e a
produo dos Ac sero altamente especficas contra a regio Fc daquele isotipo.
Quando se deseja uma molcula de Ac que no reaja com o sistema comple-
mento e no se fixe em receptores para Fc de superfcie celular, cliva-se a Ig
com a pepsina, que corta depois das pontes de sulfeto, o que mantm a
frao (Fab)2 ntegra, permitindo a ligao especfica com o alvo desejado e
impossibilitando as aes efetoras caractersticas do isotipo.
Figura 7. Localizao das variaes isotpicas, alotpicas na molcula de

imunoglobina.
Imunologia | 43
5.4. Anticorpos monoclonais

Em 1975, Georges Khler e Cesar Milstein planejaram um mtodo para a
preparao do anticorpo monoclonal (Ac mo), atravs da fuso da clula B ativada
normal produtora de anticorpo com uma clula do mieloma (uma clula plasmtica
cancerosa). Neste evento, produziram uma clula hbrida (hibridoma), que possua
as propriedades de crescimento imortal da clula do mieloma e secretava o Ac
produzido pela clula B.
Os clones resultantes das clulas do hibridoma que secretam grandes quanti-
dades de Ac mo podem ser indefinidamente cultivadas. Os hibridomas de clulas B
so produzidos utilizando polietilenoglicol (PEG) para fusionar as clulas do mieloma
com as clulas B de animais que foram imunizados com o Ag, atravs do qual se
deseja produzir os anticorpos. As clulas do mieloma contribuem para o crescimen-
to imortal das clulas fusionadas, e as clulas B contribuem com a informao
gentica para a sntese do Ac especfico de interesse. As condies do procedi-
mento devem permitir seletivamente a sobrevivncia e o crescimento somente dos
hibridomas. Para tal, utilizado o meio HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina).
Neste meio, a aminopterina bloqueia a sntese de DNA pela via de novo. Na
presena de aminopterina, as clulas devem usar a via de salvamento, onde as
enzimas catalisadoras so a fosforribosiltransferase hipoxantina-guanina (HGPRT) ou
a timidina quinase (TK), para produzir o DNA. Uma mutao em qualquer uma
destas duas enzimas bloqueia a habilidade da clula em usar a via de salvamento.
Portanto, clulas do mieloma sozinhas morrero, pois so deficientes para as enzimas
HGPRT ou TK, essenciais para a via de salvamento. Somente as hbridas iro
sobreviver, pois a clula B contribui com a enzima que falta para a via de salvamento.
Embora as clulas B no fusionadas sejam capazes de sobreviver no meio HAT,
estas no vivem por perodos extensos in vitro e morrem.
Aps a obteno dos hibridomas, estes devem ser diludos e distribudos em
placas de cultura apropriada numa concentrao de 0,5 clula por poo. Tal
procedimento nos dar a certeza de que o Ac produzido seja oriundo de
um nico clone, pois como no existe meia clula, teoricamente, teremos um

poo vazio e outro com apenas uma clula. Feito isso, cada hibridoma, aps
multiplicao e produo de Ac, ser examinado por teste sorolgico, tendo em
vista a identificao dos hibridomas desejados, ou seja, aqueles que sintetizam o
anticorpo monoclonal que reaja com o Ag correspontente. Uma vez identifica-
dos, os hibridomas so induzidos proliferao, tornando-se assim uma fonte
inesgotvel de anticorpos altamente especficos.
Os Ac mo so muito teis como reagentes para diagnstico, exames de
imagem e procedimentos teraputicos na clnica mdica. Para diagnstico, podem
ser utilizados na deteco de gravidez, diagnstico de numerosos microrganismos
patognicos, medidas de nveis sanguneos de vrias drogas, tipagem sangunea,
tipagem de antgenos de histocompatibilidade, caracterizao fenotpica de diversos
tipos celulares e deteco de antgenos produzidos por determinados tumores. Por
exemplo, para esse propsito, Ac mo radiomarcados podem ser utilizados in vivo
na deteco ou localizao de antgenos tumorais, permitindo diagnsticos precoces
de alguns tumores primrios ou metastticos nos pacientes. Na imunoterapia, o Ac
mo especfico para um determinado Ag tumoral de superfcie, acoplado com um
quimio ou radioterpico, pode ser potente agente teraputico.
6. Sistema completo
O nome complemento foi originado a partir da atividade complementar de
protenas na ao bactericida de alguns Acs. O sistema complemento um comple-
xo proteico existente no plasma, sob a forma inativa, constitudo por substncias
termolbeis e/ou termoestveis; e que tem como funo a eliminao de um agente
estranho pela ativao de mecanismos inespecficos, que se constitui de:
Fagocitose - quando algumas protenas ativadas do complemento unem-se
a bactrias, opsonizando-as para ingesto pelos fagcitos portadores de
receptores do complemento;
Imunologia | 45
Reao inflamatria - quando os pequenos fragmentos de protenas

promovem eventos vasculares e recrutam fagcitos ao local da ativida-
de inflamatria.
Lise - quando uma vez desencadeada a cascata, os componentes terminais
do complemento lesam certas bactrias, vrus e clulas com a formao de
poros na membrana celular.
Alm dessas trs funes, o sistema complemento tambm responsvel
pela depurao imune, que consiste na remoo de complexos imunes da circulao
no bao e no fgado. Este sistema, com cerca de 30 protenas ou mais, interage por
ativao enzimtica. O complemento pode agir sozinho ou com Ac e so conheci-
das 3 vias, a clssica, a alternativa e a via das lectinas. A via clssica ativada por
complexos imunes, enquanto as vias alternativa e das lectinas so ativadas por
microrganismos. Todas as vias de ativao convergem para uma etapa final de reao
em cadeia denominada sequncia comum (Figura 8).
Figura 8. Vias de ativao do sistema complemento

No processo de ativao, que envolve uma srie de etapas proteolticas,

uma protena precursora inativa clivada para fornecer um grande fragmento
ativo; esta se une superfcie celular e contribui para a prxima clivagem, e
um pequeno fragmento peptdico que liberado serve como mediador de
resposta inflamatria. Cada uma das trs vias de ativao gera uma convertase
de C3 por um caminho diferente, determinando que as principais molculas
efetoras e os eventos tardios sejam os mesmos para as trs vias. importante
lembrar que a ativao inadequada e a persistncia dos efeitos inflamatrios
so potencialmente prejudiciais ao organismo, de modo que a sua regulao
precisa ser bem rigorosa. E uma das maneiras de controle se resume ao
pouqussimo tempo que os componentes-chaves permanecem ativos (milsi-
mos de segundos), a menos que se liguem a uma superfcie celular. Alm da
curta vida-mdia dos fragmentos do complemento, existem vrios pontos na
via de ativao, nos quais podem atuar protenas reguladoras, o que previne
a ativao inadvertida do complemento sobre clulas do hospedeiro e evita a
leso de clulas do organismo.
Quanto nomenclatura, todos os componentes da via clssica so
designados pela letra C, seguida por uma designao numrica simples: C1,
C2. Os componentes foram numerados pela ordem de descoberta e no
segundo a sequncia de reaes (C1, 4, 2, 3, 5, 6, 7, 8 e 9). Quanto
aos produtos de clivagem, so designados por letras minsculas, onde o
maior fragmento recebe a letra b (exceto o fragmento C2, que recebe a letra
a) e o menor, a letra a. Os componentes iniciais da via alternativa, em vez de
serem numerados, so indicados pelas letras maisculas B e D, e seus produ-
tos de clivagem tambm so designados pelas letras b e a, onde o maior
fragmento Bb e o menor, Ba. Quanto aos componentes ativados, recebem
uma linha horizontal superior, por exemplo, Bb.
Imunologia | 47
6.1. Ativao da via clssica

O componente C1 um complexo formado por trs protenas C1q,
C1r e C1s. Uma vez formado o complexo Ag-Ac, o componente C1q se
liga na regio Fc do Ac, dando incio a uma reao em cascata, onde C1q
ativa duas molculas de C1r capazes de se ligar a outras duas de C1s,
resultando no complexo C1q-C1s-C1r-C1r-C1s, que uma serina
protease. Desta forma, C1s atua em C4 e C2, dissociando-as em C4a e
C4b, C2a e C2b. Nesta etapa, a unio de C4b a C2b (em alguns livros,
C2a) forma a C3 convertase. Aps a formao da C3 convertase, esta
cliva C3 em C3a e C3b. O C3 a frao mais abundante no plasma e o
mais importante entre os componentes do complemento, pois inmeras
molculas de C3b podem se ligar superfcie de um patgeno. Alguns
fragmentos C3b se ligam a receptores da membrana e atuam como opsoninas,
facilitando a fagocitose, outros fragmentos de C3b se ligam a C3 convertase,
originando a C5 convertase (C4bC2bC3b) da via clssica (Figura 9),
que vai atuar em C5 dissociando-o em C5a e C5b. Com a dissociao de
C5, inicia-se uma etapa comum a todas as vias de ativao do complemen-
to, onde a frao C5b interage com C6, que abre um stio de ligao para
C7. Por sua vez, o complexo C5bC6C7 deposita-se na superfcie da
membrana e abre o stio de ligao para C8, que penetra na membrana da
clula. O C8, ento, abre um stio para C9, que, aps a ligao de vrios
C9, forma um canal transmembrnico ou poro hidroflico, chamado de
complexo de ataque membrana (MAC), ocasionando lise celular e
desequilbrio osmtico. importante ressaltar que no curso da cascata do
sistema complemento, os fragmentos menores C4a, C2a, C3a e C5a
liberados no interstcio, so potentes mediadores inflamatrios.
Figura 9. Ativao da cascata do complemento pela via clssica.
6.2. Via das Lectinas

A via das lectinas (Figura 10) semelhante via clssica. As lectinas so
protenas, ou glicoprotenas, que se ligam a carboidratos e podem ativar a via
clssica do complemento na ausncia do complexo antgeno-anticorpo. A
principal lectina a protena ligadora de manose (MBL), que faz o papel de
C1q ao se ligar resduos de carboidratos da superfcie de uma bactria
ativadora ou outras substncias. A MBL est associada com duas pr-enzimas
MASP-1 e MASP-2 (Serina Protease Associada a MBL). Quando a MBL
se liga aos grupamentos manose terminais nos carboidratos bacterianos, MASP-
1 e MASP-2 so ativadas e continuam a ativar a via clssica.
Imunologia | 49
Figura 10. Ativao da cascata do complemento pela via das lectinas
6.3. Via Alternativa

Com exceo da etapa inicial, os eventos da via alternativa (Figura 11)
so homlogos aos da via clssica e das lectinas. A via alternativa constante-
mente ativada, em taxa muito reduzida, a qual aumenta drasticamente na pre-
sena de superfcies ativadoras adequadas, como as membranas celulares de
microrganismos. Esta via pode ser ativada pela ligao do C3b ou de uma
forma hidrolizada espontaneamente, conhecida como iC3b, superfcie do
patgeno. Este se liga ao fator B, formando C3bB, componente suscestvel
ao fator D, uma protease do plasma. O fator D cliva o componente B em Ba
e Bb, onde Bb permanece ligado ao C3b, formando a molcula C3bBb que
a C3 convertase da via alternada. A C3 convertase da via alternativa produ-
zir mais C3b, tornando o sistema mais ativo, pois muitos fagcitos possuem
receptores para este componente. A C3 convertase da via alternativa extre-
mamente instvel e, por isso, costuma sofrer rpida dissociao. No entanto,
uma protena plasmtica denominada properdina se liga a esta convertase e a
estabiliza, diminuindo sua degradao e permitindo a continuao da cascata.
Nesta via, alguns C3b se ligam ao C3bBb e formam a C5 convertase da via

alternada C3b2Bb ou C3bBbC3b. Este complexo cliva C5 em C5a e C5b,
dando incio a sequncia comum, onde C5b inicia o complexo de ataque
membrana, ligando-se a C6, C7, C8 e C9 (Figura 12).
Figura 11. Ativao da cascata do complemento pela via alternativa.
Figura 12. Sequncia final da cascata do complemento comum a todas as vias

de ativao, onde C5b inicia o complexo de ataque membrana, ligando-se a
C6, C7, C8 e C9.
Imunologia | 51
7. Complexo principal de histocompatibilidade

Todo organismo multicelular possui algum sistema de defesa que distin-
gue agentes infectoparasitrios e elimina-os do hospedeiro. Mais ainda, os
grandes vertebrados tm um sistema imune mais evoludo que pode discriminar
o que estranho e fazer uma resposta seletiva para o mesmo. A vantagem de
tal imunidade especfica a rpida adaptao do sistema imune aos agentes
patognicos que so mais frequentemente encontrados no meio ambiente lo-
cal. Esta capacidade conseguida atravs do complexo principal de
histocompatibilidade, cujos produtos desempenham um papel no reconheci-
mento intercelular e na discriminao entre o prprio e no prprio. A identi-
ficao das molculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC)
aconteceu pela investigao da sua funo na resposta imunolgica aos tumo-
res, na rejeio de transplantes de pele e no controle da resposta imune.
7.1. Estrutura das molculas do MHC

Os genes que codificam as molculas do MHC esto localizados no
cromossomo 6 humano e no 17 em camundongos, denominados antgenos
leucocitrios humanos (HLA) e de histocompatibilidade (H-2), respectiva-
mente. O MHC pode ser dividido em quatro subconjuntos de genes ou
classes: classes I, II, III e IV, sendo os de classe I e II ligados ao processamento
e apresentao de antgenos, enquanto os genes que compem as classes III e
IV codificam para outras protenas, estando algumas relacionadas com a res-
posta imune, tais como componentes do sistema complemento, algumas citocinas,
etc. Em humanos, existem trs loci que codificam as molculas de classe I, os
quais so denominados HLA-A, HLA-B e HLA-C, e trs loci gnicos do
MHC de classe II, que so denominados HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DR.
Normalmente, um indivduo herda duas cpias de cada locus gnico (um de
cada progenitor). Assim, em humanos, temos seis loci de classe I e seis loci de
classe II. Todos esses loci apresentam alto grau de polimorfismo, ou seja,
apresentam mltiplos alelos na populao. As molculas do MHC de classe I,

que esto presentes na maioria das clulas nucleadas, so reconhecidas princi-
palmente pelo TCR de linfcitos T CD8, ao passo que as molculas de classe
II, presentes principalmente na superfcie das clulas apresentadoras de antgenos
profissionais, so reconhecidas pelo TCR dos linfcitos T CD4.
7.2. MHC de classe I

As molculas do MHC de classe I so expressas na membrana celular
da maioria das clulas nucleadas dos vertebrados. Sua estrutura constituda
por uma cadeia a (alfa) de aproximadamente 45kDa, que atravessa a membra-
na plasmtica. A outra a b2- microglobulina de 12kDa que se encontra
fracamente ligada membrana. Os genes que codificam a cadeia a (varivel)
esto localizados dentro da regio genmica do MHC, enquanto os genes
que codificam a b2-microglobulina (invarivel) esto localizados fora da regio
do MHC no cromossomo 15 humano. A cadeia a formada por trs
segmentos a1, a2 e a3. A regio em que o peptdeo se liga corresponde
regio amino-terminal e composta pelos segmentos a1 e a2, que formam
uma fenda ou bolsa onde ele se encaixa. O tamanho dessa fenda permite ligar
peptdeos de 8 a 11 aminocidos e corresponde regio do MHC de classe
I que interage com o TCR do linfcito T. Por essa razo, os antgenos proteicos
precisam ser processados para gerar peptdeos, pequenos o suficiente para se
ligarem molcula do MHC. A regio invarivel, que corresponde ao seg-
mento a3, se liga ao correceptor CD8 do linfcito T. Essa ligao confere a
especificidade da molcula de classe I com a clula T CD8. O domnio a,
tambm se liga de forma no covalente molcula b2-microglobulina, sendo
esse complexo estabilizado pelo peptdeo processado que se liga nos dom-
nios a1 e a2 (Figura 13). Somente nessa forma estvel a molcula do
MHC de classe I expressa na superfcie das clulas.
Imunologia | 53
7.3. MHC de classe II

As molculas do MHC de classe II tambm so expressas na membrana
celular. Mas estas so expressas na superfcie de clulas apresentadoras de antgenos
profissionais. Essas clulas incluem as clulas dendrticas, os macrfagos e os linfcitos
B. A molcula de classe II formada por uma cadeia a e uma b. A cadeia a tem
32-34kDa, enquanto a cadeia b tem 29-32kDa (Figura 13). As duas cadeias do
MHC de classe II so codificadas dentro da regio genmica do MHC e ambas
so polimrficas, ou seja, so variveis. As cadeias a e b, na poro extracelular,
possuem domnios a1 e a2 e b1 e b2, onde a poro varivel das duas cadeias
so os segmentos a1 e b1, conforme pode ser visto na Figura 13. Os domnios
a1 e b1 interagem para formar a fenda de ligao ao peptdeo, que estruturalmen-
te bastante similar molcula do MHC de classe I. Esta fenda, ou bolsa onde
se encaixa o peptdeo a ser apresentado clula T. Assim, como de se esperar,
esta tambm a regio da molcula do MHC de classe II que apresenta maior
variabilidade. Na molcula de classe II, as extremidades da fenda de ligao do
peptdeo so abertas, o que permite a ligao de peptdeos de 10-30 aminocidos,
mas pode ocorrer ligao de peptdeos maiores, o que no acontece com a
molcula de classe I que tem as extremidades fechadas.
Figura 13. As trs classes de genes no MHC humano e a expresso dos

produtos de classe I e II.
7.4. Processamento e apresentao de antgenos s clulas T CD8

Antgenos apresentados pelas molculas de MHC de classe I so, na
maioria das vezes, gerados dentro da mesma clula que produziu a molcula
de classe I. Os peptdeos gerados so derivados de protenas que se encon-
tram no citosol da clula, que podem ser da prpria clula, de origem viral ou
de outros microrganismos intracelulares e antgenos tumorais. Os antgenos, em
geral protenas presentes no citoplasma, so degradados em peptdeos por um
complexo multiproteoltico denominado proteassoma. Esses peptdeos so trans-
portados do citoplasma para o retculo endoplasmtico rugoso por intermdio
de uma protena transportadora de antgeno (TAP). Os peptdeos transporta-
dos pela TAP para dentro do retculo endoplasmtico se ligam molcula
nascente do MHC classe I, tornando-a estvel. Assim, o complexo resultante,
MHC classe I e peptdeo, deixam o retculo endoplasmtico e movem-se para
o complexo de Golgi, do qual transportado para a superfcie da clula onde
reconhecido pela clula T CD8.
7.5. Processamento e apresentao de antgenos s clulas T CD4

As molculas do MHC de classe II tambm se ligam a peptdeos
originados da degradao proteica, mas, geralmente, os peptdeos resultam da
protelise de molculas endocitadas ou partculas fagocitadas pelas APC. As
partculas so internalizadas em vesculas intracelulares, denominadas endossomas,
que se fundem com lisossomas, contendo enzimas proteolticas. A vescula
resultante dessa fuso chamada fagolisossoma. O processo de degradao
do antgeno ocorre em condies cidas, que o pH timo para a ao das
enzimas proteolticas, e os peptdeos originados da degradao se ligam na
fenda da molcula do MHC de classe II. Quando recm-sintetizada no retculo
endoplasmtico, a molcula do MHC de classe II tem a fenda protegida por
uma protena denominada cadeia invariante (Ii). Desse modo, a fenda do
MHC classe II no pode acomodar peptdeos presentes no retculo
Imunologia | 55
endoplasmtico. Essa molcula de classe II , ento, direcionada para os

fagolisossomas, onde se encontram os peptdeos exgenos resultantes da
protelise dos antgenos. Nos fagolisossomas, as enzimas proteolticas digerem
a cadeia II; porm, no totalmente, restando o fragmento chamado peptdeo
de classe II, associado cadeia invariante (CLIP = class II associated invariant
chain peptide). Com a remoo do CLIP, por meio da molcula HLA-DM,
o peptdeo processado pode se ligar fenda da molcula de classe II e ser
reconhecido especificamente pelos linfcitos T CD4.
8. Resposta celular e resposta humoral

Se a resposta inata for suficiente para anular a ao de um agente
infectoparasitrio, no ocorrer ativao da resposta imune adaptativa e, por-
tanto, no formar memria imunitria. Por outro lado, caso ocorra persistncia
da infeco, devido aos mecanismos de escape desse agente, haver a neces-
sidade da ativao da resposta imune adaptativa. Em funo da natureza do
agente infectoparasitrio e da forma com que seus antgenos so processados,
a resposta imune adaptativa pode seguir dois caminhos distintos, que levam
proliferao de clulas CD8+ (resposta celular predominantemente Th1) e
secreo de anticorpos por clulas B e plasmcitos (resposta humoral predomi-
nantemente Th2) (Figura 14). Th1 e Th2 no so sinnimos de resposta
celular e humoral. Existe predomnio, mas clulas Th2 so funcionais, e existem
anticorpos IgG ligados ao Th1.
A imunidade mediada por clulas se desenvolve por uma rede de
interaes que resulta em defesa contra microrganismos que sobrevivem dentro
de fagcitos ou de outras clulas. Os antgenos de patgenos processados no
citosol, fora de vesculas cidas, so conduzidos at a superfcie celular pela
molcula de classe I e apresentados para as clulas T CD8+ que eliminam
diretamente a clula infectada, enquanto os antgenos de patgenos processa-
dos em vesculas cidas so apresentados pelas molculas de classe II s clulas
T CD4+, que podem se diferenciar em dois tipos: CD4+Th1, que ativam

clulas mononucleares (macrfagos e linfcitos) e CD4+Th2, que induzem a
proliferao e diferenciao das clulas B em plasmcitos produtores de
anticorpos.
Figura 14. Esquema geral da resposta celular e humoral
8.1. Resposta celular e o mecanismo de ao das clulas T CD8+

Os linfcitos T CD8+ ativados se diferenciam em clulas T citolticas
(CTL), que destroem somente as clulas portadoras do antgeno associado a
produtos de classe I do MHC, no danificando a clula vizinha durante o
evento. O mecanismo de ao pode ocorrer pela lise direta atravs das enzimas
perforinas e granzimas, como tambm pela induo de apoptose. No primei-
ro processo, aps a ligao do TCR/CD3 com o antgeno via MHC I, os
microtbulos da clula CD8+ se movem para a rea de contato com a clula
alvo, e os grnulos contendo as enzimas citolticas tambm se aglomeram nesta
regio. Neste contato, as protenas formadoras de poros (perforinas) entram
em contato com concentraes de Ca++ e sofrem polimerizao. Esta
Imunologia | 57
polimerizao forma um canal permevel a ons na membrana plasmtica da

clula alvo, levando a um desequilbrio osmtico e lise (Figura 15). Alm de
lise direta, as clulas CD8+ CTL produzem IFN-g, que estimula a atividade
fagocitria de macrfagos, inibe diretamente a replicao de vrus e induz a
expresso de molculas de classe I. O segundo mecanismo de destruio de
clula-alvo envolve a interao da molcula ligante de Fas, denominada Fas-L e
presente no CTL, com a molcula Fas (CD95), presente na clula alvo. Essa
interao leva a clula-alvo apoptose, que tambm pode ser induzida pela
ao das granzimas. Neste evento, as clulas acometidas condensam o citoplasma
e a cromatina, formando os corpos apoptticos, que sero fagocitados rapida-
mente por clulas vizinhas sem a formao de reao inflamatria adjacente
(Figura 15). Um efeito adicional da apoptose a ativao de enzimas celulares
que degradam genomas virais em at 200 pares de bases e seus mltiplos.
Figura 15. Necrose e apoptose induzidas por clulas T citotxicas

8.2. Mecanismo de ao das clulas CD4+ Th1 e CD4+ Th2

Alguns microrganismos como Mycobacterium spp so patgenos
intracelulares que crescem em vesculas, onde so parcialmente protegidos da
ao dos anticorpos e das clulas CD8 CTL. Estes normalmente inibem a
fuso destas vesculas com o lisossomo, prevenindo sua destruio. Diante
disso, esses microrganismos so eliminados normalmente quando estas clulas
so ativadas atravs de citocinas inflamatrias, como o IFN-g, produzido pelas
clulas CD4+Th1.
O processo de ativao, atravs do contato dos macrfagos com as
clulas CD4+Th1, gera uma srie de aes bioqumicas que convertem o
macrfago numa potente clula anti bacteriana. Estas reaes so: fuso do
fagossomo com o lisossomo, expondo as bactrias s enzimas lisossomais;
aumento da expresso de MHC de classe I e classe II; expresso de receptor
de TNF-a e secreo de TNF-a, que junto com o IFN- g, sinergiza para o
aumento da ao bactericida, resultando na produo de xido ntrico (NO)
e oxignio reativo (O2); secreo de IL-12, que orienta a diferenciao de
clulas Th0 para Th1; e secreo de IL-10, que inibe a produo de IFN- g e
serve para amortecer os efeitos lesivos da ativao exacerbada de macrfagos
nos tecidos. Quando um patgeno resiste aos efeitos iniciais da resposta imune
celular, pode-se evoluir para uma inflamao crnica, consistindo intenso infiltrado
mononuclear e proliferao de tecido conjuntivo caracterstico de inflamao
inespecfica ou por um padro de inflamao crnica que se distingue pela
formao de granuloma que se caracteriza por agregados de macrfagos ativados,
os quais assumem uma aparncia epitelioide circundados por linfcitos T. Fre-
quentemente, mas no invariavelmente, clulas gigantes multinucleadas, que
derivam da fuso de vrios macrfagos, so encontradas em granulomas mais
antigos. As clulas CD4 Th1 e Th2 participam regulando tais granulomas com
produo de citocinas inflamatrias e anti-inflamatrias, prevenindo a dissemi-
nao dos patgenos e leses tissulares.
Imunologia | 59
8.3. Resposta humoral

Muitas bactrias importantes nas doenas infecciosas humanas se mul-
tiplicam nos espaos extracelulares do organismo, e a maior parte dos
patgenos intracelulares se dissemina de uma clula para outra atravs dos
fludos extracelulares. A resposta imune humoral conduz destruio dos
microrganismos extracelulares e seus produtos, como, por exemplo, as
toxinas; alm de tambm prevenir ou diminuir a disseminao das infeces
intracelulares, atravs da neutralizao desses agentes. Os anticorpos tam-
bm facilitam o reconhecimento de microrganismos por clulas fagocitrias,
permitindo que assim sejam ingeridos e digeridos, como ativam o sistema
complemento, potencializando a opsonizao, recrutando clulas inflama-
trias para o local da infeco e lisando certos microrganismos pela forma-
o dos poros em suas membranas (Figura 16).
Figura 16. Alguns mecanismos efetores da resposta mediada por anticorpos

Nesta resposta, a ativao das clulas B e sua diferenciao em clulas

plasmticas secretoras de imunoglobulinas deflagrada pelo antgeno especfico e
requer a participao de clulas CD4 Th2 (Figura 14), que tambm controlam a
mudana de isotipo e desempenham papel importante na hipermutao somtica, o
que necessrio para a maturao da afinidade dos anticorpos, que ocorre no curso
da resposta humoral. A imunoglobulina de superfcie funciona como receptor de
antgenos, ou BCR, e realiza dois papis na ativao: a transduo de sinal direto
para o interior da clula, quando se une ao antgeno e a conduo desses antgenos
aos stios intracelulares, para ser degradado e levado superfcie do linfcito B,
onde, por sua vez, so reconhecidos por CD4 Th2 antgenos especficos. Esta
resposta dependente da clula T chamada de timo-dependente (TD). Porm,
alguns antgenos, como os lipopolissacardeos (LPS) bacterianos, podem ativar
diretamente linfcitos B, e tal resposta chamada de timo-independente (TI).
Anticorpos de alta afinidade neutralizam toxinas, vrus e bactrias. Mas,
podem no resolver o problema, pois muitos agentes no so neutralizados pelos
anticorpos e devem ser removidos por outros meios. Assim, o papel dos anticorpos
nestas situaes ativar outras clulas (clulas efetoras acessrias), que tenham
receptores para Fc de Imunoglobulina. Dentre essas, podemos citar macrfagos e
neutrfilos, que ingerem bactrias recobertas por IgG; assim como as NK, que
lisam diretamente parasitos recobertos por IgG; e ainda clulas infectadas com vrus,
recobertas tambm com IgG. Tal fenmeno acontece por um mecanismo denomi-
nado citotoxidade celular, dependente de anticorpo (ADCC). Alm da ADCC,
via IgG, exercida pela NK, o mesmo fenmeno pode ser observado por meio da
IgE, onde as clulas citotxicas so os eosinfilos, e a importncia da ADCC via
IgE se deve ao fato de que alguns parasitos no so mortos diretamente por
fagocitose, somente atravs dos mediadores liberados por estas clulas. A IgE
tambm participa na sensibilizao e ativao de mastcitos promovendo liberao
de substncias que dilatam vasos sanguneos e recrutam clulas inflamatrias.
Imunologia | 61
9. Resposta imune aos agentes infectoparasitrios

O ambiente em que vivemos povoado por muitas espcies de
microrganismos onde uma pequena parcela tem a capacidade de causar
doenas. O sistema imune evoluiu no sentido de promover aes que
resultem na defesa contra estes microrganismos, contribuindo para a recu-
perao e manuteno da homeostase. Os agentes infectoparasitrios dife-
rem em sua patogenicidade e virulncia. A patogenicidade refere-se
capacidade de um organismo causar doena, e a virulncia o grau de
patogenicidade. Portanto, a patogenicidade depende das caractersticas do
agente, do estado imunitrio do hospedeiro e dos determinantes
socioambientais. Em indivduos com sistema imunitrio normal, os agentes
infectoparasitrios devem ser suficientemente virulentos para se estabelecer
e causar infeco. Por outro lado, indivduos com sistema imunitrio debili-
tado, agentes pouco virulentos, tais como os comensais, podem causar
leses graves. Neste tpico sero abordados os principais mecanismos de
resposta s aes dos vrus, bactrias, protozorios e helmintos que parasitam
o organismo humano.
Os vrus so microrganismos intracelulares obrigatrios, que se repli-
cam no interior das clulas e podem causar leso tecidual e doena, por
vrios mecanismos (Figura 17). A replicao viral interfere com a sntese e
com as funes normais das protenas celulares, levando leso da clula
infectada e morte. Este o efeito citoptico, e se diz que a infeco
ltica. Vrus no citopticos podem causar infeces latentes, durante as
quais residem nas clulas do hospedeiro e produzem protenas estranhas ao
mesmo tempo em que estimulam a imunidade especfica. Em decorrncia,
as clulas infectadas so reconhecidas e mortas pelas clulas CTL. As
protenas virais tambm podem estimular as reaes de hipersensibilidade
tardia (DTH), e a leso celular uma consequncia direta das respostas
imunes fisiolgicas contra os vrus.
Figura 17. Mecanismos pelos quais os vrus lesionam as clulas
Os principais mecanismos de imunidade inata aos vrus envolvem a

estimulao direta de IFN a/b pelas clulas infectadas, que funcionam inibindo
a replicao viral e lise das clulas infectadas pelas clulas NK. Alm desses
mecanismos, a ativao do sistema complemento e a fagocitose servem para
eliminar vrus de locais extracelulares. Na imunidade especfica, combina-se a
resposta celular com a resposta humoral. Os anticorpos especficos se ligam s
protenas do envelope ou do capsdeo, impedindo a fixao do vrus na clula
hospedeira e, consequentemente, impedindo sua penetrao (Figura 16).
Alm disso, os anticorpos IgG opsonizantes tambm podem potencializar a
remoo pela fagocitose (Figura 16) ou destruio das clulas infectadas atra-
vs da ADCC via clulas NK. Embora os anticorpos sejam importantes na
imunidade contra vrus, eles no so suficientes para eliminar infeces virais.
Imunologia | 63
Contudo, o principal mecanismo contra uma infeco viral estabelecida atra-

vs de uma resposta celular via CD8+ citolticos especficos, que destroem as
clulas infectadas, estimulam a ao de enzimas intracelulares que degradam
genomas virais e secretam citocinas com ao de interferon.
As bactrias extracelulares causam doena de duas maneiras: induzindo
reao inflamatria que resulta na destruio tecidual no local da infeco e
produzindo toxinas, que possuem diversos efeitos patolgicos. Estas podem
ser endotoxinas (componentes da parede celular bacteriana) ou exotoxinas
(ativamente secretadas pelas bactrias). Portanto, as respostas imunes contra
bactrias extracelulares visam eliminar a bactria e o efeito de suas toxinas.
O principal mecanismo de imunidade inata a fagocitose por neutrfilos,
moncitos e macrfagos, mas a resistncia destas bactrias fagocitose e a sua
digesto um determinante na virulncia. A ativao do sistema complemento
na ausncia do anticorpo importante, pois a produo de C3b opsoniza a
bactria e favorece a fagocitose. O MAC lisa diretamente a bactria e os
subprodutos do complemento (fragmentos menores), que participam da res-
posta inflamatria recrutando e ativando leuccitos. A imunidade humoral es-
pecfica a principal resposta protetora contra essas bactrias e consiste do
reconhecimento de antgenos proteicos por clulas CD4+ Th2, apresentados
via MHC de classe II. Os anticorpos especficos, alm de neutralizarem bact-
rias e suas toxinas, impedindo sua ligao s clulas alvo, ativam o sistema
complemento potencializando suas aes.
Quanto s bactrias que sobrevivem no interior de clulas hospedeiras,
as mais patognicas so aquelas que sobrevivem no interior dos macrfagos,
como as microbactrias. Por serem praticamente inacessveis aos anticorpos, sua
eliminao requer mecanismos diferentes daqueles observados para bactrias
extracelulares. O principal mecanismo de imunidade inata contra essas bactrias
atravs da fagocitose, mas estas podem ativar diretamente ou indiretamente
clulas NK, que promovem uma defesa precoce contra bactrias intracelulares
antes da resposta especfica. A principal resposta especfica contra essas bact-

rias a resposta celular, com atuao de clulas Th1 (CD4+ e/ou CD8+)
que estimulam os macrfagos a produzirem diversas substncias bactericidas.
Desta maneira, as clulas CD4+ Th1 e CD8+ Th1 atuam em conjunto na
resposta celular contra bactrias intracelulares e o mecanismo exercido por uma
pode complementar o da outra. importante salientar que a ativao de
macrfagos tambm pode causar leso tecidual, manifestada pela reao de
hipersensibilidade tardia (DTH ou HT), assim como as observadas nas infec-
es virais e em outros agentes infectoparasitrios.
Em termos muito genricos, os anticorpos so mais eficazes contra os
parasitos extracelulares e os CTLs, contra os intracelulares. Em outras pala-
vras, as citocinas produzidas pelas clulas T CD4+ podem ser importantes
na determinao do resultado da infeco, uma vez que as clulas Th1 e
Th2 possuem um perfil de citocinas contrastante e de contrarregulao,
mostrando que o papel das clulas Th1 e Th2 na determinao do resultado
da infeco sugere que as respostas das clulas Th1 levem morte dos
patgenos intracelulares e que as respostas das clulas Th2 eliminem os
patgenos extracelulares. Todavia, isto muito mais uma simplificao did-
tica do que o quadro real.
O tipo de resposta que conferir maior proteo depende da natureza
e da fase evolutiva do parasito. Por exemplo, o anticorpo por si s, ou
combinado com o complemento, pode danificar alguns parasitos extracelulares,
mas ser sempre melhor quando atuando com uma clula efetora. Diferentes
mecanismos efetores atuaro em uma nica infeco contra os diferentes estgi-
os do ciclo de vida do parasito. Assim, na malria, os anticorpos contra as
formas livres bloqueiam sua capacidade para invadir novas clulas, mas as
respostas mediadas por clulas impedem o desenvolvimento da fase heptica
nos hepatcitos. A imunidade protetora na malria no se correlaciona simples-
mente com os nveis de anticorpos e pode at ser induzida na ausncia deles.
Imunologia | 65
O parasito precisa superar os mecanismos de defesa preexistentes no

hospedeiro, para que possa se estabelecer com sucesso antes da iniciao da
resposta imune especfica do hospedeiro. O complemento exerce um papel
nesta fase, uma vez que vrios tipos de parasitos, incluindo os vermes adultos
e as larvas infectantes, possuem molculas em sua superfcie de revestimento
que ativam a via alternativa. Macrfagos, neutrfilos, eosinfilos e plaquetas
constituem a primeira linha de defesa. Anticorpos e citocinas, produzidos
especificamente em resposta aos antgenos parasitrios, potencializam as ativi-
dades antiparasitrias de todas estas clulas efetoras. Entretanto, os macrfagos
teciduais, moncitos e granulcitos possuem alguma atividade intrnseca antes
mesmo da potencializao.
Os tripanossomos e os parasitos da malria (plasmdios) que penetram
no sangue so removidos da circulao por clulas fagocticas no fgado e no
bao. Antes de agirem como clulas apresentadoras de antgenos na iniciao
de uma resposta imune, os macrfagos atuam como clulas efetoras que inibem
a multiplicao dos parasitos ou at mesmo os destroem. Estas clulas tambm
secretam molculas que regulam a resposta inflamatria e potencializam a imuni-
dade atravs da ativao de outras clulas. A fagocitose pelos macrfagos
fornece uma defesa importante contra os parasitos menores; entretanto, estas
clulas tambm secretam muitos fatores txicos que permitem a destruio dos
parasitos sem a internalizao. Quando ativados pelas citocinas, os macrfagos
podem destruir parasitos extracelulares relativamente pequenos, como os est-
gios eritrocitrios do plasmdio, e tambm os parasitos maiores, como os
estgios larvais do esquistossomo. Os macrfagos tambm atuam como clulas
exterminadoras atravs da ADCC.
A ativao dos neutrfilos e macrfagos uma caracterstica geral dos
estgios iniciais da infeco. Todas as funes efetoras dos macrfagos so
potencializadas logo aps a infeco. Embora sua ativao especfica seja induzida
por citocinas secretadas pelas clulas T, como IFNg, GM-CSF, IL-3 e IL-4,
mecanismos T-independentes tambm podem ativ-los. Neste caso, clulas

NK secretam IFNg quando estimuladas pela IL-12 produzida pelos macrfagos.
As propriedades efetoras exibidas pelos macrfagos tambm podem ser
apresentadas pelos neutrfilos. Os neutrfilos so clulas fagocticas que po-
dem destruir os agressores, seja por mecanismos dependentes de oxignio,
seja por independentes, como o xido ntrico. Os neutrfilos produzem uma
exploso oxidativa mais intensa do que os macrfagos e seus grnulos secretores
contm protenas altamente citotxicas. A destruio extracelular pelos neutrfilos
mediada por H202, enquanto os componentes granulares esto envolvidos
na destruio intracelular dos organismos internalizados. Os neutrfilos esto
presentes nas leses inflamatrias causadas por parasitos e provavelmente atuando
na eliminao desses parasitos das clulas rompidas. Como os macrfagos, os
neutrfilos possuem receptores para Fc e receptores para complemento e
podem participar das reaes citotxicas dependentes de anticorpo, a fim de
destruir as larvas de Schistosoma mansoni, por exemplo. Dessa forma, os
neutrfilos so mais destrutivos do que os eosinfilos para vrias espcies de
nematdeos, embora a eficcia relativa dos dois tipos celulares possa depender
do istipo e da especificidade do anticorpo.
Os eosinfilos esto associados a infeces helmnticas e se encontram
envolvidos especificamente na defesa contra os estgios teciduais de helmintos,
que so grandes demais para serem fagocitados. A reao do mastcito de-
pendente de IgE consta primariamente em localizar os eosinfilos prximos ao
parasito e, ento, potencializar suas funes antiparasitrias.
Os eosinfilos so clulas de menor potencial fagoctico perante os
neutrfilos, no entanto, sofrem um processo de desgranulao em resposta a
distrbios em sua membrana celular, liberando o contedo granular sobre a
superfcie dos parasitos. O dano aos helmintos pode ser causado pela protena
bsica principal (MBP). A MBP no especfica para um determinado alvo,
mas o dano s clulas do hospedeiro muito pequeno, uma vez que a
Imunologia | 67
protena fica confinada a um espao diminuto entre o eosinfilo e o verme.

Os eosinfilos e os mastcitos podem agir em conjunto na destruio das
larvas de helmintos, onde os produtos dos mastcitos potencializam a ao
dos eosinfilos. Desta forma, os antgenos liberados provocam desgranulao
local dos mastcitos dependentes de IgE e a liberao de mediadores, que
atraem seletivamente os eosinfilos para o local, potencializando ainda mais
suas atividades (Figura 18).
Figura 18. Expulso de helmintos parasitos do lume intestinal
A resposta imune contra Trypanosoma cruzi depende no apenas das

clulas T CD4+ e CD8+, mas tambm das NK e da produo de anticorpos.
O mesmo verdadeiro para a resposta imune contra o Toxoplasma gondii. As
clulas NK, estimuladas pela IL-12 secretadas pelos macrfagos, constituem
outra fonte de IFNg. As infeces crnicas normalmente esto associadas com
produo reduzida de IFNg e provavelmente explicam a alta incidncia de
tuberculose e toxoplasmose em pacientes com AIDS, os quais possuem nme-

ros reduzidos de clulas T CD4+.
Em algumas infeces parasitrias, o sistema imunitrio no consegue
eliminar o parasito, mas reage isolando o organismo com clulas inflamatrias.
O hospedeiro reage ao antgeno localmente, o que estimula a liberao de
citocinas, que por sua vez recrutam as clulas de defesa para o local afetado.
Na esquistossomose, a formao do granuloma outro exemplo da reao do
hospedeiro contra o parasito. Essa reao uma resposta crnica mediada por
clulas aos antgenos solveis liberados pelos ovos do parasito no fgado. Os
macrfagos se acumulam no local e liberam fatores fibrognicos que estimulam
a formao do tecido granulomatoso. Embora essa reao possa ser benfica
para o hospedeiro, no sentido que isola as clulas hepticas das toxinas secretadas
pelos ovos dos helmintos, tambm constitui a maior fonte de dano, provocan-
do alteraes irreversveis no fgado e perda da funo heptica.
Em muitas infeces a distino entre uma resposta mediada por clulas
ou por anticorpo pode ser difcil, dado que ambas atuam em conjunto contra o
parasito. A expulso de alguns nematdeos intestinais ocorre espontaneamen-
te poucas semanas aps a infeco primria. Parece haver dois estgios na
expulso, alcanados por uma combinao de mecanismos T-dependentes e T-
independentes. Clulas T (predominantemente Th2) respondem aos antgenos
do parasito e induzem a produo de anticorpo pelas clulas que sofreram
proliferao. Ocorre proliferao dos mastcitos da mucosa e hiperplasia das
clulas caliciformes secretoras de muco no epitlio intestinal. Os vermes so
danificados por anticorpo e produtos dos mastcitos sensibilizados por IgE,
que desgranulam aps o contato com o antgeno e liberam a histamina que,
por sua vez, aumenta a permeabilidade do epitlio intestinal onde o verme se
encontra. Esses processos no so suficientes para eliminar os vermes; portan-
to, molculas inflamatrias inespecficas, secretadas pelos macrfagos, incluin-
do TNF e IL-1, contribuem para a proliferao das clulas caliciformes e
Imunologia | 69
provocam aumento na secreo de muco. O muco reveste os vermes e leva

sua expulso.
Existem inmeros exemplos de estratgias fsicas simples e protetoras nos
parasitos. Os nematdeos possuem uma cutcula extracelular espessa que os
protege da agresso txica. O tegumento dos esquistossomos sofre um
espessamento durante a maturao, oferecendo uma proteo semelhante. A
superfcie frouxa de revestimento de muitos nematdeos pode se desintegrar
sob o ataque imune.
A maioria dos parasitos interfere na resposta imune e a imunossupresso
uma caracterstica universal da infeco parasitria, comprometendo tanto as
respostas mediadas por anticorpo como as mediadas por clulas.
Os antgenos solveis dos parasitos, quando liberados em enormes
quantidades, podem prejudicar a resposta do hospedeiro por um processo
denominado distrao imune. Assim, os antgenos solveis de vrios agentes
infectoparasitrios parecem inativar os anticorpos circulantes, fornecendo uma
cortina de fumaa e desviando o anticorpo do parasito. Muitos destes
antgenos de superfcie liberados so formas solveis de molculas inseridas na
membrana do biopatgeno.
Alm dos efeitos destrutivos diretos de alguns parasitos e de seus produtos
aos tecidos do hospedeiro, muitas respostas imunes, por si s, possuem efeitos
patolgicos. Na malria, na tripanossomose e na leishmaniose visceral, o nmero e a
atividade aumentados dos macrfagos e linfcitos, no fgado e no bao, levam ao
aumento de tamanho destes rgos. Na esquistossomose, grande parte da patolo-
gia resulta dos granulomas dependentes de linfcitos que se formam ao redor dos
ovos no fgado. As alteraes significantes que ocorrem nos indivduos com elefantase
so provavelmente resultado de respostas imunopatolgicas s larvas adultas nos
linfticos. A formao de complexos imunes comum, eles podem ser depositados
nos rins, como na sndrome nefrtica da malria, e podem dar origem a vrias outras
alteraes patolgicas.
A IgE das infeces helmnticas pode promover desde efeitos bran-

dos reaes severas no hospedeiro, por meio da liberao de mediado-
res pelos mastcitos, caracterizados por pruridos, eritemas, dificuldades
respiratrias ou mesmo choque anafiltico.
10. Aplicao e importncia do diagnstico

imunosorolgico das doenas infecto parasitrias
O diagnstico sorolgico das doenas transmissveis consiste na in-
vestigao da infeco no indivduo ou na populao, mediante a deteco,
quantificao e caracterizao de variveis (imunoglobulinas, antgenos,
citocinas) presentes no plasma/soro sanguneo ou em outros materiais bio-
lgicos, tais como amostra fecal, urina, saliva, escarro ou tecidos.
O desenvolvimento de novas informaes cientficas est relacionado
com os progressos na metodologia pelo desenvolvimento de novos proce-
dimentos, novas tcnicas ou instrumentos. Os primeiros mtodos de iden-
tificao e medida de imunoglobulinas foram desenvolvidos por Von Behring
& Kitasato, influenciados pelos experimentos de Pasteur sobre a Teoria dos
Germes, ao encontrarem no soro de animais imunizados contra difteria e
ttano, substncias neutralizantes e especficas que denominaram anticorpos.
As pesquisas desenvolvidas por vrios cientistas se voltaram imediatamente
para a caracterizao bioqumica dessas substncias neutralizantes e o de-
senvolvimento de tcnicas capazes de induzir a formao de elevadas con-
centraes de anticorpos em animais de laboratrio. Este foi o perodo
fundador do diagnstico sorolgico.
Neste tpico, as tcnicas sorolgicas sero abordadas, principal-
mente, sob o ponto de vista dos profissionais que realizam o diagnstico
sorolgico das doenas infectoparasitrias.
Imunologia | 71
10.1. Aplicaes dos testes sorolgicos

Os testes sorolgicos vm sendo constantemente empregados para
auxiliar na confirmao diagnstica das suspeitas clnicas de infeces, permi-
tindo a obteno de resultados em curto espao de tempo, em funo de
algumas caractersticas que incluem a simplicidade de execuo, baixo custo
operacional e a possibilidade de automao. Suas contribuies, entretanto,
so inestimveis, principalmente quando o patgeno, ou seus produtos,
dificilmente podem ser demonstrados nos fluidos biolgicos ou na estrutura
hstica do hospedeiro.
Estes mtodos so utilizados na qualificao e quantificao de diversos
componentes, incluindo antgenos, anticorpos, imunocomplexos, enzimas e
hormnios, entre outras molculas relacionadas ao processo inflamatrio. O
conhecimento dos fundamentos gerais para adequada aplicao e criteriosa
interpretao dos resultados exige que estas tcnicas sejam realizadas por pro-
fissionais bem treinados, a fim de se prevenir a ocorrncia dos falsos resulta-
dos, que conduzem para o diagnstico e tratamento incorretos dos pacientes.
O mtodo sorolgico pode ser qualitativo ou quantitativo. O mtodo
qualitativo indica uma resposta do tipo ou tudo ou nada, por exemplo:
aglutinou ou no aglutinou, infectado ou no infectado. O ensaio quantitativo
mede a concentrao de antgeno ou anticorpos, podendo ser expressa sob a
forma de cruzes, titulaes, densidades ticas em reaes fotocolorimtricas ou
outras unidades de medida que se aplicam. A expresso do resultado sob a
forma de cruzes, ou por titulaes, que correspondem a maior diluio em que
ainda se observa a reao antgeno-anticorpo, bastante subjetiva, por retratar
a intensidade de uma reao determinada visualmente por critrios pessoais. A
utilizao de aparelhos que realizam a leitura automtica das reaes sorolgicas
traduz em nmeros os resultados obtidos de maneira visual, reduzindo, por um
lado, a probabilidade dos erros, mas por outro, elevando (em alguns casos) o
custo do exame laboratorial.
10.2. A importncia do diagnstico individual

O indivduo sintomtico ou assintomtico com nveis de anticorpos
especficos detectveis denominado soropositivo. Aquele que no pos-
sui anticorpos detectveis o soronegativo. No caso do indivduo diag-
nosticado soronegativo (em uma primeira anlise), que ao reavaliar a pri-
meira amostra junto com uma segunda, de coleta mais recente (processo
conhecido como sorologia pareada), e no caso de resultado da primeira
amostra se repetir e a segunda resultar positiva, diz-se que ocorreu
soroconverso. O diagnstico individual normalmente se realiza com a
finalidade de elucidar processos patolgicos com sinais e sintomas comuns
a vrias doenas, procedimento este denominado diagnstico diferencial.
Como exemplos, podem-se distinguir sorologicamente doenas como a
leishmaniose tegumentar difusa e a hansenase lepromatosa, a leishmaniose
visceral e a hepatite viral, a hepatite B e a hepatite C, a toxoplasmose e a
rubola, entre outras.
Em algumas situaes torna-se importante determinar a fase clnica
da doena, principalmente aquelas em que os patgenos possuem habili-
dade para atravessar a barreira placentria e gerar embriopatias ou fetopatias.
A presena de anticorpos especficos uma evidncia da exposio atual
ou anterior aos agentes infecciosos, caracterizada pela diversidade funcio-
nal das vrias classes de imunoglobulinas e a ordem em que se apresentam
nos fluidos biolgicos. Determinada por fatores genticos, a IgM, regra
geral, a primeira a apresentar nveis que possibilitam a deteco aps
estmulo imunognico e caracterizar fase inicial na maioria das infeces. O
seu decrscimo compensado pelo surgimento da IgG, normalmente en-
contrada ao final de um processo agudo, permanecendo durante a fase
crnica, e podendo ser detectada durante longo perodo no plasma do
hospedeiro, mesmo aps a cura, como imunoglobulina de memria. Nor-
Imunologia | 73
malmente, nas solicitaes de exame laboratorial, pedem-se a pesquisa de

IgM e IgG especficas. Porm, em infeces recentes por Toxoplasma
gondii ou por citomegalovrus, a IgM e IgG podem eventualmente resultar
negativas, mas a IgA positiva pode corrigir falhas no diagnstico. Por estas
razes, imunoglobulinas como a IgE e a IgA especficas tm sido pesquisadas
e utilizadas com maior preciso na determinao de fase inicial das infec-
es, uma vez que possuem vida mdia menor e permanecem na circulao
aps o incio do processo infeccioso, por um perodo ainda mais curto que
o da IgM.
Os testes sorolgicos so tambm utilizados para verificao do po-
tencial de virulncia e de invasividade dos enteroparasitos. A Entamoeba
histolytica, por exemplo, enquanto parasita o lume intestinal, parece no
induzir, ou pouco induz, a formao de anticorpos especficos. Por outro
lado, a ulcerao, a penetrao tecidual e a consequente multiplicao e
disseminao deste parasito no hospedeiro, pode proporcionar elevados
ttulos de IgG anti ameba no plasma sanguneo, facilmente detectveis.
Alm das imunoglobulinas, as Protenas de Fase Aguda (PFA),
presentes normalmente em baixas concentraes no plasma sanguneo, alte-
ram-se em resposta aos estmulos inflamatrios aps leso tecidual ou infec-
o. Em linhas gerais, as PFA constituem um vasto nmero de protenas
plasmticas de origem heptica, cuja sntese aumenta em 25% ou mais e
podem ser classificadas em funo do incremento de sua produo aps
estmulo inflamatrio (Quadro 1). Tradicionalmente, a quantificao da
Protena C Reativa (PCR) na prtica clnica tem vrios objetivos, entre
eles, a avaliao da extenso e a atividade da inflamao, o que permite o
acompanhamento do processo patolgico, diferenciao entre doena in-
flamatria e no inflamatria e estimativa de seu respectivo prognstico.
Quadro 1. Caractersticas cinticas das protenas de fase aguda

Protenas de fase aguda Tempo de resposta entre estmulo Peso molecular (kDa)
e elevao dos nveis plasmticos
Grupo 1: aumenta menos de uma vez
Ceruloplasmina 48-72 horas 132
C3 48-72 horas 180
C4 48-72 horas 206
Grupo II: aumenta de duas a quatro vezes

a-1- glicoprotena cida 24 horas 41
a-1 - antitripsina 10 horas 54
a-1 - antiquimotripsina 10 horas 68
Haptoglobina 24 horas 86
Fibrinognio 24 horas 340
Grupo III: aumenta acima de cinco mil vezes

Protena C reativa 6-10 horas 110
Encefalites virticas, citomegalia, 2-10 horas 180
herpes sistmica e tuberculose
Amiloide srico A
Os testes sorolgicos tambm so utilizados para selecionar doado-

res e receptores de sangue e de rgos, no s no contexto de quem
desempenha a determinao de grupos sanguneos ou antgenos de
histocompatibilidade, como tambm para quem se compromete na deteco
e preveno de doenas infecciosas transmissveis por meio da transfuso
sangunea e hemoderivados, como tecidos e rgos transplantados. No
Brasil, o Ministrio da Sade estabeleceu estratgias de controle apoiadas
na triagem clnica, epidemiolgica e sorolgica para preveno das doenas
transfusionais, que incluem a doena de Chagas, a sfilis, as hepatites B e
C, a sndrome de imunodeficincia adquirida (SIDA/AIDS), o vrus da
leucemia T do adulto (HTLV-I e II), em todo o territrio nacional, e a
malria, em regies endmicas. As condies que constituem contraindicao
absoluta para doao de rgos, relacionadas s doenas infecciosas, alm
das empregadas na preveno de doenas transmissveis por meio da transfu-
Imunologia | 75
so sangunea e hemoderivados, incluem avaliao laboratorial de septice-

mia bacteriana ou fngica, ativa.
As molculas liberadas pelo parasito e os anticorpos correspondentes
encontrados no hospedeiro so chamados de marcadores sorolgicos. Estes
marcadores podem ser utilizados para avaliar o prognstico de doenas e alguns
marcadores indicam evoluo para cura, enquanto outro agravamento. Baseando-
se nestes princpios, pode-se avaliar a eficcia teraputica.
Os anticorpos protetores, induzidos por parasitos em processos
infecciosos ou por vacinas, podem ser pesquisados e utilizados como
marcadores para avaliar a imunidade especfica, naturalmente adquirida
ou artificialmente induzida por vacinas. Os testes sorolgicos realizados
em paciente pr-natal so de fundamental importncia na pesquisa de
doenas congnitas, como a toxoplasmose, a sfilis, a citomegalia, entre
outras; e na avaliao da imunidade especfica, principalmente para do-
enas imunoprevinveis com a aplicao de vacinas (hepatite B, rubola,
difteria, ttano).
10.3. A importncia do diagnstico coletivo

A aplicao dos testes sorolgicos em inquritos epidemiolgicos
denomina-se soroepidemiologia e serve para estimar a soroprevalncia,
que corresponde ao nmero de indivduos positivos em um perodo de
tempo determinado, sem distinguir os casos novos dos antigos. Como a
soroprevalncia est intimamente relacionada com a taxa de infeco e a
permanncia dos anticorpos circulantes, este indicador auxilia nos seguintes
propsitos em relao s doenas infectoparasitrias: estabelecer prevalncia
sorolgica, identificar os principais problemas sanitrios, estabelecer priori-
dades de vacinao, demarcar a distribuio e verificar a erradicao de
doenas, verificar a reintroduo de doenas em reas consolidadas, deter-
minar a periodicidade das epidemias, avaliar as campanhas de vacinao,
investigar enfermidades descobertas recentemente (doenas emergentes) e

estimar as perdas econmicas atribudas enfermidade.
Testes sorolgicos tambm so aplicados na anlise do contedo
intestinal de insetos hematfagos, para identificao das fontes alimentares
dos vetores envolvidos na transmisso de doenas. Estabelecer o padro
alimentar dos insetos hematfagos de grande importncia para o entendi-
mento de sua biologia, alm de possuir valor fundamental para a Sade
Pblica, no delineamento de estratgias de controle de vrios agravos
gerados por esses vetores.
11. Fundamentos gerais do imunodiagnstico

A pesquisa laboratorial da resposta imune pode ser empregada para
a verificao da resposta humoral e da resposta celular. A pesquisa da
resposta humoral pode ser realizada de duas maneiras. Uma dessas manei-
ras refere-se ao emprego de anticorpos especficos para identificar um
antgeno parasitrio ou outras substncias que desempenham o papel de
antgenos na reao, tais como drogas, hormnios, cidos nuclicos,
citocinas, receptores de clulas, etc. Uma outra maneira a deteco de
anticorpos especficos na amostra a ser testada, passvel de determinar se
um indivduo foi exposto a um organismo especfico. A medida das interaes
entre antgeno-anticorpo com o propsito de diagnstico conhecida
como imunosorologia.
As tcnicas imunossorolgicas fundamentam-se na natureza da
interao antgeno-anticorpo, nas quais podem expressar-se de duas formas
distintas, em decorrncia da utilizao de imunorreagentes livres de marca-
o ou de reagentes marcados. As tcnicas em que no se empregam
marcadores demonstram-se por fenmenos visveis. Portanto, ao se combi-
nar anticorpos com antgenos solveis, os complexos resultantes podem
Imunologia | 77
formar precipitados insolveis. Se os antgenos so particulados (bactrias,

protozorios, hemcias), os anticorpos os aglutinam. Se o anticorpo pode
ativar a via clssica do sistema complemento e o antgeno se encontra em
uma superfcie celular, o resultado pode ser a citlise. As tcnicas que
empregam imunorreagentes marcados caracterizam-se pela simples combina-
o do antgeno com o anticorpo, necessitando que um deles esteja marca-
do convenientemente. O imunorreagente pode ser marcado com corantes
fluorescentes ou quimioluminescentes, radioistopos, enzimas, ouro ou
prata coloidais, entre outros marcadores.
11.1 Reaes de precipitao

As reaes de precipitao ocorrem entre antgenos solveis e seus
anticorpos correspondentes, com formao de agregados insolveis que se
precipitam. Os determinantes mais importantes das reaes de precipitao
consistem nas concentraes relativas de antgeno e anticorpo. Esta relao
ilustrada esquematicamente na Figura 19. Ocorre precipitao mxima
quando a quantidade se antgenos e de anticorpos so equivalentes (zona
de equivalncia), com quantidades decrescentes nas zonas de excesso de
antgeno ou excesso de anticorpo. O fenmeno de prozona refere-se
precipitao subtima, invisvel aos nossos olhos, que ocorre na regio de
excesso de anticorpo. Portanto, necessrio que diluies de antissoros
reajam com quantidades fixas de antgeno a fim de obter o mximo de linha
de precipitao. O fenmeno de prozona pode ser responsvel pelo apa-
recimento de resultados falso-negativos em outros testes sorolgicos, alm
dos testes de precipitao, como nas reaes de aglutinao. Existem
vrios sistemas disponveis para a prtica da reao de precipitao, dentre
estes, destacam-se a precipitao em meios lquidos, meios semisslidos,
como gar ou agarose, e outros suportes, tais como o acetato de celulose.
Figura 19. Curva de formao de imunocomplexos visveis
11.2. Reao de precipitao em meio lquido

Conhecida tambm como tcnica da precipitina ou tcnica do anel,
a reao de precipitao em meio lquido (Figura 20) consiste em se
colocar em tubos de ensaio ou em tubos capilares uma soluo de anticorpos
conhecidos (soro hiperimune) e sobre ela se adicionar, cuidadosamente, a
soluo antignica que se deseja pesquisar, de modo a constituir-se uma
interface entre ambas. As molculas da soluo antignica iro difundir-se
atravs da outra soluo, formando um gradiente de concentrao. Ao
nvel em que a equivalncia antgeno/anticorpo for a ideal, se formar uma
faixa de precipitado visvel (um anel de turvao branco leitoso na interface).
Imunologia | 79
Figura 20. Imunodifuso em meio lquido (Teste de Precipitina)
11.3. Reao de imunodifuso simples em meio semisslido

Neste sistema, tambm chamado imunodifuso unidirecional ou tcnica
de Oudin, a soluo antignica sobreposta a uma coluna de gar, em um
tubo de 35 a 45 mm de altura contendo o soro hiperimune. As molculas de
antgeno penetram no gel e se difundem com velocidade caracterstica para
cada espcie molecular (coeficiente de difuso) influenciada pela concentrao
do gel. Ao final de certo tempo de difuso, que em geral de uma semana,
cada antgeno ter formado, com o seu anticorpo correspondente, um disco
ou zona de precipitao.
11.4. Reao de imunodifuso dupla

(imunodifuso de OUCHTERLONY)
Em uma delgada camada de gel sobre uma lmina de vidro escavam-se
pequenos orifcios. Em um deles, coloca-se soro ou plasma e, em outro
orifcio, coloca-se o antgeno. Um difunde em direo ao outro, formando
precipitados brancos em forma de linhas ou arcos, tambm chamados de
bandas de precipitao (Figura 21). Quando a concentrao de antgenos e

anticorpos muito pequena, as bandas no so visveis, necessitando, nesse
caso, que se use soluo corante para protenas. Quando necessrio, corar o
gel para visualizar as bandas deve-se retirar do gel os imunorreagentes que no
formaram imunocomplexos (imunorreagentes solveis) por processos de lava-
gem com soluo fisiolgica. O imunocomplexo (agregado insolvel), em
funo do seu tamanho efetivo, fica retido nas malhas do gel, onde, em
seguida, submetido ao corante adequado, o que possibilita a visualizao
das bandas quando formadas. A velocidade de difuso de cada imunorreagente
regida pelas leis da difuso e depende da concentrao e do tamanho dos
poros do gel, da temperatura, da concentrao do gar e de sua pureza.
Figura 21. Representao esquemtica da reao de imunodifuso dupla

Ouchterlony.
Imunologia | 81
11.5. Reao de imunodifuso radial simples

(imunodifuso de MANCINI)
Nesta tcnica, o anticorpo especfico para determinado antgeno in-
corporado ao gel e distribudo sobre uma lmina de vidro ou placa de Petri.
Em posies adequadas, so feitos orifcios onde se colocam solues antignicas
a serem testadas, bem como solues padro, com pelo menos trs concentra-
es conhecidas do antgeno. A partir desse momento, ocorre difuso radial
do antgeno, resultando na opacificao em forma circular (halo ou anel) em
torno do orifcio. O dimetro deste anel de precipitao proporcional
concentrao do antgeno e, deste modo, a quantidade deste pode ser deter-
minada por comparao com os dimetros obtidos por padres conhecidos
por meio de uma curva de referncia.
11.6. Reao de imunoeletroforese (mtodo de

GRABAR e WILLIAMS)
A imunoeletroforese uma tcnica de imunoprecipitao em meio gela-
tinoso que combina a eletroforese com a imunodifuso radial. A tcnica
realizada em duas etapas: na primeira, os antgenos so fracionados por
eletroforese, enquanto na segunda etapa, ocorre a difuso dos antgenos
contra o antissoro especfico, presente nas canaletas abertas no gel. A reao
antgeno-anticorpo nesse sistema evidenciada pela formao de linhas ou
bandas de precipitao no gel, correspondendo cada banda a um complexo
imune especfico.
11.7. Reao de imunoeletroforese unidimensional simples

Tambm conhecida como eletroforese de foguete ou tcnica de
Laurell, a imunoeletroforese unidimensional utiliza antissoro especfico para
o antgeno, ou o anticorpo que se quer quantificar, incorporado ao gel de
agarose, que colocado em lminas de vidro. Assim como na tcnica de
Grabar e Williams, o pH do gel determinado de modo que a molcula a

ser analisada fique com carga negativa, migre para o polo positivo e a
substncia incorporada no migre ao gel. As amostras a serem quantificadas,
bem como os controles, so distribudos em pequenos orifcios do gel e
submetidos eletroforese. A partir dos orifcios de aplicao, formam-se
cones de precipitao, cujas extenses variam de acordo com as concentra-
es das substncias pesquisadas. O padro de precipitao se assemelha
a um foguete, por se formar nas margens laterais do curso da migrao
eletrofortica, at que se esgote a substncia em anlise, resultando na
convergncia das margens laterais em forma de ponta.
11.8. Reao de contraimunoeletroforese

Tambm chamada de eletroimunodifuso dupla unidimensional. Nesta
tcnica, antgenos e anticorpos migram por eletroforese, simultaneamen-
te, em direes opostas, a partir de orifcios separados do gel, no mes-
mo eixo, resultando na precipitao no ponto de encontro dos
imunorreagentes entre os orifcios. Para a realizao deste mtodo,
antgenos e anticorpos devem apresentar diferentes mobilidades
eletroforticas. Os anticorpos possuem propriedades de migrar para o
polo negativo (ctodo) em um campo eltrico, enquanto os antgenos
devem ser previamente tratados com soluo tampo de pH adequado
para otimizar os efeitos eletroendosmticos que orientem sua migrao
para o polo positivo (nodo). Este fenmeno pode ser induzido com o
uso de tampes alcalinos (Figura 22). Este mtodo permite a realizao
de vrias anlises em uma nica lmina, fornece resultados mais rpidos e
mais sensveis que a imunodifuso convencional e pode ser realizado em
outros suportes, como o acetato de celulose.
Imunologia | 83
Figura 22. Representao esquemtica da reao de contraimunoeletroforese
11.9. Reaes de aglutinao

A aglutinao a formao de redes de clulas ou partculas inertes
(ltex ou gelatina), interligadas por pontes moleculares de anticorpos, que se
combinam simultaneamente com dois determinantes antignicos nas superfcies
de clulas ou partculas adjacentes.
11.10. Reao de aglutinao direta

A aglutinao direta a formao de agregados suficientemente grandes
que ocorre entre partculas insolveis, em sua forma ntegra ou fragmentada,
contendo antgenos naturais de superfcie. Hemcias, bactrias, fungos e
protozorios podem ser aglutinados diretamente por anticorpos, os quais,
sendo bivalentes, formam pontes, ligando determinantes antignicos nas super-
fcies de partculas vizinhas. Para se detectar anticorpos especficos, diluies
seriadas das amostras so postas para reagir junto a uma quantidade constan-
te de antgeno. Aps um perodo de incubao, a reao se concretiza
(Figura 23) e o resultado geralmente expresso como ttulo da amostra, ou

seja, a mxima diluio em que ocorre aglutinao.
Figura 23. Representao esquemtica da reao de aglutinao direta
11.11. Reao de inibio da aglutinao

direta de hemcias por antgenos virais
Diversos antgenos virais encontram receptores na superfcie de
hemcias, principalmente hemcias avirias, e induzem sua aglutinao. Esta
propriedade particular de muitos vrus aproveitada para a titulao de
anticorpos produzidos contra esses antgenos virais, na vigncia dos pro-
cessos infecciosos ou na convalescena, para fins diagnsticos e de seg-
mento evolutivo.
Todas as reaes de inibio baseiam-se na competio, seja de dois
determinantes antignicos semelhantes por um mesmo stio de combinao
ou de dois anticorpos diferentes por um mesmo determinante antignico.
A reao se efetua entre os imunorreagentes que formam o composto mais
estvel. Neste caso, o soro do paciente, contendo anticorpos especficos,
em diluio seriada, misturado a quantidades fixas de antgeno viral pa-
dronizado, sendo incubado a 37 0C e, em seguida, as hemcias so adici-
onadas (Figura 24). Verifica-se at qual diluio houve neutralizao, ou
seja, inibio da propriedade aglutinante para hemcia.
Imunologia | 85
Figura 24. Representao da inibio da aglutinao viral das hemcias
11.12. Reao de aglutinao passiva de

hemcias e suportes inertes
A reao se baseia na aglutinao de hemcias ou de partculas inertes
(ltex, gelatina) que funcionam como suporte, recobertas por um antgeno
especfico solvel, em presena de amostra de soro ou plasma contendo os
anticorpos correspondentes. A formao de pontes de anticorpos entre as
partculas adjacentes indica a ocorrncia da reao (Figura 25).
Figura 25. Esquema da reao de aglutinao passiva de hemcias e suportes inertes
11.13. Reao de inibio passiva de partculas inertes (ltex)

Partculas de ltex tendo antgenos ancorados sua superfcie podem
ser aglutinadas pela formao de ponte anticrpica, do mesmo modo que a
aglutinao direta de hemcias, como j foi exposto. No entanto, ao se
misturar antgenos solveis aos soros contendo anticorpos, haver bloqueio

dos stios de combinao das molculas de anticorpo e inibio da
aglutinao.
11.14. Reao de fixao do complemento

A fixao do complemento ocorre aps a interao antgeno-
anticorpo. O consumo de complemento in vitro pode ser utilizado como
um teste para detectar e medir concentraes de anticorpos e antgenos. A
reao se manifesta em trs momentos: no primeiro, o antgeno se combina
com o anticorpo. No segundo, se os imunocomplexos estiverem presen-
tes, os componentes do sistema complemento ligam-se, sendo assim con-
sumidos. Finalmente, adiciona-se o sistema revelador que consiste de hemcias
de carneiro sensibilizadas com hemolisina (anticorpo antieritrocitrio). Aps
um perodo de incubao, observa-se se ocorreu ou no lise das hemcias
sensibilizadas e a atividade hemoltica pode ento ser medida, a fim de se
determinar a quantidade do imunorreagente pesquisado (Figura 26).
Ao se pesquisar a presena de anticorpos em fludos biolgicos, a
ausncia de lise do sistema hemoltico indica a sua presena na amostra,
pois como os principais componentes do sistema complemento foram
consumidos na lise do imunocomplexo inicial, no estaro disponveis
para a lise do sistema hemoltico e a reao ser positiva.
Tanto os anticorpos como os antgenos devem ser destitudos de
atividade anti-complementar para no ativar o complemento, indepen-
dentemente do imunocomplexo. O complemento obtido de soro de
cobaia, colhido e estocado de maneira apropriada para preservar a ativi-
dade hemoltica.
Imunologia | 87
Figura 26. Representao da reao de fixao de complemento
11.15. Reaes de imunofluorescncia

A tcnica de imunofluorescncia foi descrita pela primeira vez por
Albert H. Coons e seus colaboradores, em 1941. Estes pesquisadores
objetivavam empregar corantes em tcnicas sorolgicas e utilizaram para
isso, alm dos corantes comuns, radicais fluorescentes.
Neste perodo, j era conhecida a capacidade dos anticorpos de se
ligarem a radicais qumicos sem perder sua caracterstica de reconhecimento
e ligao aos antgenos. J haviam sido descritos trabalhos utilizando con-
jugados de anticorpos e corantes em tcnicas de aglutinao. O produto
resultante desta conjugao no s mantinha suas propriedades aglutinantes
originais como ainda coloria os grumos aglutinados. Porm, esta colorao
foi considerada de fraca intensidade, o que levou Coons a optar pelos
corantes fluorescentes.
Uma das grandes vantagens da tcnica a intensa luminosidade emi-
tida por quantidades muito pequenas de corantes fluorescentes, permitin-
do identificar estruturas fluorescentes entre vrias outras estruturas presen-

tes em cortes de tecidos ou esfregaos.
A tcnica de imunofluorescncia representou um grande avano no
imunodiagnstico, principalmente no que diz respeito sorologia. At a elabo-
rao deste mtodo, as reaes ocorridas entre antgeno e anticorpo s podiam
ser evidenciadas atravs de reaes secundrias, como a precipitao ou a
aglutinao, que geram fenmenos decorrentes da formao de imunocomplexos
em grande quantidade ou utilizando partculas relativamente grandes. Uma das
vantagens da imunofluorescncia foi o fato de ter maior sensibilidade que os
mtodos existentes na ocasio, permitindo distinguir uma nica clula bacteriana
corada por fluorescena entre 107 bactrias no coradas.
S foi possvel o desenvolvimento da tcnica de imunofluorescncia
devido a caractersticas especiais que algumas substncias possuem de armaze-
nar energia luminosa e liber-la mais tarde. A este fenmeno foi dado o nome
de luminescncia. Se a substncia capaz de armazenar e emitir luminescncia
por perodos mais longos, chama-se ento fosforescncia; se o perodo de
emisso da luminosidade mais curto, chama-se a isso fluorescncia. Entre os
corantes fluorescentes mais utilizados destacam-se a rodamina (isotiocianato de
tetrametil rodamina TRICT) e a fluorescena (isotiocianato de fluorescena
FITC), esta ltima supera a primeira por possuir maior eficincia quntica, ou
seja, maior capacidade de absoro e de emisso de luminosidade. Porm,
com a modernizao dos equipamentos, no s de microscpios como tam-
bm de citmetros, foram feitas modificaes para aumentar a eficincia quntica
dos demais corantes para utiliz-los em testes que buscam mais de um marcador
em superfcies celulares.
A intensidade da luz emitida por este corante sofre grande interferncia
do meio em que ele se encontra. O pH um dos fatores que mais interfere,
pois h um mnimo de fluorescncia em pH cido e mxima fluorescncia em
Imunologia | 89
pH alcalino, por isso o material deve ser montado em glicerina tamponada

alcalina antes da observao em microscpio de fluorescncia.
Para se obter bons resultados com as tcnicas imunofluorescentes,
fundamental a utilizao de um bom microscpio tico equipado com acess-
rios e filtros que permitam a boa visualizao e captao da fluorescncia.
Atualmente, existem vrios modelos de variadas procedncias. Para a escolha
do equipamento que mais se adapte s necessidades do laboratrio, deve-se
ter em mente qual o objetivo do teste, que tipo de material ser utilizado
como antgeno ou como amostra (para que seja feita a escolha das objetivas e
oculares), qual o corante ou corantes que sero utilizados (para que sejam
definidos os filtros do equipamento), quantos exames sero realizados em
mdia e quantas vezes por semana, uma vez que tal escolha ir interferir na vida
til e escolha da lmpada a ser utilizada, entre outros fatores.
A ligao qumica de anticorpos a corantes d origem a um composto
chamado conjugado, que associa a capacidade de reconhecimento e ligao
do primeiro s propriedades corantes do segundo, sem que ocorra nenhum
tipo de prejuzo para ambos. Apesar de processo de conjugao ser relativa-
mente simples, h uma srie de cuidados que precisam ser seguidos devido s
variaes que podem ocorrer em cada um dos reagentes a cada associao.
Um dos cuidados principais a imunizao dos animais com os antgenos mais
purificados possveis para evitar a reatividade cruzada com outros antgenos.
Atualmente existem no mercado compostos conjugados de extrema pureza e
alta especificidade, direcionados contra os mais variados antgenos e que aten-
dem perfeitamente s necessidades da grande maioria dos laboratrios.
A partir do mtodo descrito por Coons e seus colaboradores, sugiram
numerosas variaes, das quais, a imunofluorescncia direta foi a mais simples
e a primeira a ser descrita. Nesta tcnica, o conjugado reage diretamente com
antgenos presentes na superfcie de clulas (Figura 27). Como esta tcnica se
presta pesquisa de substncias que atuam como antgenos para o conjugado,
torna-se necessria, a cada procura de um antgeno diferente, a produo de

um conjugado diferente. Alm disso, de todas as variaes da imunofluorescncia,
esta a menos especfica, j que principalmente em tecidos ou esfregaos,
devido grande quantidade de material na amostra, pode ocorrer a presena
de antgenos homlogos ao que se est pesquisando. Quando se trata de
clulas ntegras, h certa facilidade no reconhecimento, porm em fragmentos
celulares ou estruturas muito pequenas necessrio grande conhecimento e
intenso treinamento para diminuir a inespecificidade.
Esta variao do mtodo ainda bastante aplicada no diagnstico de
infeces por Chlamydia trachomatis em esfregaos cervicais e uretrais. Este
mtodo tambm foi largamente utilizado na identificao de antgenos do
MHC e na tipagem de linfcitos B e linfcitos T.
Figura 27. Esquema da reao de imunofluorescncia direita
Outra variedade do mtodo a imunofluorescncia indireta. Nesta

modalidade, pode-se realizar a pesquisa de anticorpos contra os mais variados
antgenos. O conjugado uma imunoglobulina que reconhece a outra
Imunologia | 91
imunoglobulina como antgeno, ou seja, uma anti-imunoglobulina ou anticorpo

secundrio (Figura.28). A vantagem deste mtodo que o anticorpo pode
estar ancorado superfcie de qualquer antgeno e ainda assim ser reconheci-
do pelo conjugado. Assim, um nico conjugado pode ser utilizado na pesqui-
sa de anticorpos contra vrias infeces diferentes, tornando o mtodo mais
barato. Uma vez que o reconhecimento de uma imunoglobulina por outra se
d pela regio estvel do fragmento cristalizvel (poro Fc), a ligao
espcie especfica, conferindo ao mtodo grande especificidade. Ele tambm
mais sensvel do que o mtodo direto, porque existem normalmente mais
epitopos na imunoglobulina para o conjugado se ligar. Quanto maior a quanti-
dade de conjugado maior ser a emisso de fluorescncia.
Figura 28. Esquema da reao de imunofluorescncia
Esta modalidade do mtodo auxilia o diagnstico de vrias doenas e

permite a pesquisa de diferentes isotipos de imunoglobulinas, sendo que,
neste caso, h a necessidade de utilizar um conjugado para cada um dos
isotipos. Desta forma, o mtodo utilizado no acompanhamento da doena e,
em alguns casos, pode ser tambm utilizado como critrio de cura.
De uma maneira geral, a tcnica de imunofluorescncia apresenta nveis

de sensibilidade que variam de 70% a 90%, e especificidade que varia de
85% a 99%. Por ser um mtodo com perfil mais especfico, este mais
utilizado em confirmaes sorolgicas. Deve-se utilizar o mtodo de
imunofluorescncia sempre aliado a outro mtodo mais sensvel para a realiza-
o da triagem e fornecer os dois resultados em combinao. A sua utilizao
pesquisando IgM e IgG sricas pode aumentar a sensibilidade, uma vez que a
primeira aparece mais precocemente.
11.16. Ensaios imunoenzimticos - Enzyme-linked

immunosorbent assay - ELISA
Os estudos preliminares que tornaram passveis de execuo os mto-
dos imunoenzimticos foram realizados, simultaneamente, em 1966, por Nakane
e Pierce, nos Estados Unidos, e por Avrameas e Uriel, na Frana, com a
utilizao da peroxidase (horseradish peroxidase - HRP) para a confeco de
conjugados proteicos, tendo como precursor o processo de marcao de
protenas com corantes fluorescentes, criado por Coons, em 1941.
Em 1971, dois grupos de pesquisadores, um holands, formado por
Van Weemen e Schurs, e um sueco, formado por Engvall e Perlmann, idealiza-
ram e introduziram, pioneiramente, o mtodo imunoenzimtico para deteco
e quantificao de antgenos ou anticorpos especficos. Estes grupos observa-
ram que protenas poderiam ser imobilizadas em uma superfcie slida de
poliestireno e a reao imune, ser revelada pela formao de produtos colori-
dos da reao enzima-substrato, na presena de um componente doador de
eltrons, denominado cromgeno.
O mtodo ELISA, quando efetuado em timas condies (enzimas
altamente ativas, antgenos puros, substratos de alta qualidade, anticorpo e
conjugado), apresenta sensibilidade semelhante ao radioimunoensaio, com a
vantagem de no ser necessrio utilizar material radioativo. Entretanto, esse
Imunologia | 93
mtodo apresenta algumas desvantagens, pois alguns substratos usados nessas

reaes so teratognicos e a presena de enzimas endgenas interferem nos
resultados quando se usa clulas inteiras como antgenos.
A reao desenvolvida frequentemente em placas plsticas de
microdiluio (suporte), contendo sries de orifcios, onde so depositados os
imunorreagentes, antgenos ou anticorpos, dependendo do objetivo do mto-
do. O processo de revestimento da placa com o imunorreagente adequado
denomina-se sensibilizao. Para sensibilizar a placa deve-se tratar o
imunorreagente com soluo alcalina, deixando-o com carga efetiva negativa, e
assim promover, passivamente, a adsoro placa por interaes eletrostticas
(foras coulmbicas), as quais ocorrem em virtude das cargas positivas do
poliestireno ou polivinil (polyvinyl chloride - PVC) utilizado para confeccion-
las. Alm das placas de microdiluio de 96 cavidades, tambm so utilizados
outros suportes, entre os quais, esferas de sefarose, esferas de poliestireno ou
de PVC, ou tubos de poliestireno ou PVC, que possibilitam a adsoro
adequada da maioria dos imunorreagentes.
As etapas de lavagem das placas de microdiluio interpem-se s demais
etapas de execuo do mtodo e servem para retirar excessos de imunorreagentes
no ligados. Podem ser usados procedimentos manuais ou automticos, que vo
desde o uso de jorradeiras contendo a soluo de lavagem, ou de pente multicanal
adaptado a um sistema de vcuo (lavadora semiautomtica), at a utilizao de
lavadoras de placas automticas, que reduzem o tempo de realizao do teste e
proporcionam maior uniformidade ao processo.
O revestimento da superfcie interna da placa de ELISA, pelo menos
no plano terico, no absoluto e, portanto, algumas regies permanecem
livres de ligao. Estes espaos devem ser ocupados com qualquer molcula
alheia ao sistema reacional, no sentido de reduzir, ou mesmo evitar, a ligao
inespecfica, no imune, de componentes da amostra, geradores de reaes
indesejveis que possibilitam falsas interpretaes. A cobertura destes espaos
vazios chamada de bloqueio. Entre as protenas mais empregadas nesta etapa

destacam-se a soro albumina bovina (BSA), a ovalbumina e a casena, alm de
um complexo proteico, como o soro de cobaia.
Dependendo do material a ser pesquisado, pode-se conjugar antgenos
com enzimas (Ag-E) e anticorpos ou anti anticorpos com enzimas (Ac-E).
Enzimas so macromolculas de natureza proteica, com funo biolgica
de alto poder cataltico de reaes qumicas e elevada especificidade ao
substrato correspondente. As mais usadas nestes testes so a fosfatase
alcalina e a peroxidase.
Para revelar a presena da enzima no complexo formado, utiliza-se uma
soluo reveladora, que consiste em um tampo adequado, onde se adicionam
o substrato correspondente enzima conjugada e um componente doador de
eltrons (cromgeno). A enzima conjugada quebra o substrato e seus produ-
tos atuam no cromgeno, alterando a colorao do sistema (Figura 29).
Figura 29. Esquema do ensaio imunoenzimtico ELISA indireto,para pesquisa

de anticorpos especficos
A leitura da reao em condies de trabalho de campo pode ser feita

de forma visual, simplesmente pela observao da alterao da colorao. Em
condio laboratorial utiliza-se espectrofotmetro apropriado para leitura dos
Imunologia | 95
orifcios das placas, que transforma a intensidade de cor em nmeros. Quanto

maior a leitura, maior ser a concentrao de enzima conjugada e,
consequentemente, maior ser a concentrao da substncia pesquisada em
tcnicas no competitivas.
O mtodo ELISA pode ser classificado de acordo com sua atividade
de amplificao, ou seja, por mtodos diretos no competitivos, ou baseados
em sua atividade moduladora, que so mtodos competitivos.
O ELISA direto mais usado em imuno-histoqumica. Seu fundamento
consiste na utilizao de anticorpos primrios marcados com enzima, que se
combinam especificamente aos antgenos presentes em cortes histolgicos. A
aplicao da soluo reveladora destaca o material pesquisado.
O ELISA indireto empregado para a pesquisa de anticorpos, onde
amostras de soro ou plasma so colocadas para reagir com antgenos imobiliza-
dos em uma fase slida (placas de ELISA). Posteriormente, so revelados com
auxlio de conjugado enzimtico especfico levando a formao de um produto
corado ao agir sobre substratos cromognicos. Para pesquisa de antgenos
presentes em material biolgico, a amostra posta para reagir com anticorpos
especficos imobilizados na fase slida.
O ELISA competitivo consiste na pesquisa de antgeno, onde o
anticorpo mobilizado na fase slida e o antgeno correspondente compete
com uma quantidade padronizada e marcado para stios de combinao dispo-
nvel. Nesse caso, a reduo da reao indica maior quantidade de antgeno
na soluo. Para pesquisar anticorpos, o antgeno imobilizado e poder se
ligar ao anticorpo da amostra ou ao j conhecido e marcado (conjugado
enzimtico), para, assim, decrescer a intensidade de colorao da reao. Em
ambos os mtodos competitivos (Figura 30), dois procedimentos podem ser
seguidos: a competio simultnea, cujo antgeno ou anticorpo marcado
adicionado junto com a amostra; ou a saturao sequencial, onde o antgeno
ou anticorpo adicionado primeiro, seguido de uma incubao com o

imunorreagente marcado.
Figura 30. Modelo de mtodo competitivo, onde antgenos marcados e antgenos

no marcados de uma amostra competem pelos stios de ligao dos anticorpos
imobilizados em um suporte
11.17. Western blotting - WB

A tcnica de Western Blotting, tambm chamada de immunoblotting
ou imunoeletrotransferncia, uma ferramenta de grande utilidade para a
caracterizao de antgenos, ou para pesquisa de anticorpos especficos para
um determinado componente antignico.
A tcnica de WB baseia-se numa combinao de trs mtodos muito
aplicados em biologia molecular: a separao de macromolculas atravs de
eletroforese em gel de poliacrilamida, na presena de duodecil-sulfato de
Imunologia | 97
sdio (SDS-PAGE); sua transferncia eletroltica para membranas (geralmente

de nitrocelulose); e o ensaio de revelao, utilizando anticorpos ou protena
A, marcados por enzimas, radionucldeos, fluorocrmos, metais coloidais ou
complexo biotinina-avidina-peroxidase.
Assim, as protenas de um dado antgeno so separadas, transferidas
eletroliticamente para membranas de nitrocelulose e postas a reagir com anticorpos
marcados. No final, a reao antgeno-anticorpo revelada por meio de
imunocomplexos formados com protenas definidas, e facilmente identificadas
pelos seus pesos moleculares caractersticos.
A origem do nome Western Blotting partiu de uma brincadeira acadmi-
ca baseada no nome Southern, do autor de um mtodo de eletrotransferncia
de fragmentos de cidos nucleicos (DNA), que recebeu o nome de Southern
Blot. Pouco tempo mais tarde, Alwine e cols conseguiram fazer uma adequa-
o na tcnica de Southern Blotting, que se consistiu na eletrotransferncia de
cido ribonucleico (RNA), o qual, por sua vez, foi analisado atravs de
sondas de DNA. Assim, seguindo o princpio da brincadeira inicial, resolveu-
se chamar a nova tcnica de Northern Blotting. Pouco mais tarde, em 1979,
Towbin, Staehelin e Gordon desenvolveram o mtodo de eletrotransferncia
de protenas. Para seguir a j ento tradicional forma de referir-se ao mtodo
resolveu-se batizar a nova tcnica de Western Blotting.
A razo para transferirem-se protenas, a partir de um gel de poliacrilamida
para uma membrana sinttica, est na possibilidade de manuseio contnuo do
material para anlise, alm de se poder trabalhar com vrios reveladores ao
mesmo tempo, ou com sondas de elevado peso molecular, uma vez que a
poliacrilamida no um material muito adequado para que molculas de gran-
de tamanho sejam difundidas.
As membranas mais utilizadas para o blotting so derivadas da
nitrocelulose. Apesar disso, elas so frgeis e apresentam uma baixa capacida-
de de ligao s macromolculas eletrotransferidas. As membranas de nylon
so muito mais resistentes e ligam-se muito fortemente s protenas. Sua

capacidade de ligao seis vezes maior que a das membranas de nitrocelulose.
Sua limitao est relacionada a no impregnao por corantes, comumente
empregados na revelao de protenas (azul de Comanssie e negro de
amido), e grande quantidade de reaes inespecficas, requerendo, assim,
um bloqueio muito bem feito antes de se desenvolver o ensaio
imunoenzimtico para a revelao do Western Blotting. Outro aspecto muito
importante a porosidade da membrana. Recomenda-se a utilizao de
membranas com 0,45mm para o uso genrico e com dimetros bastante
menores (0,2mm) para estruturas proteicas, com pesos moleculares inferio-
res a 20 kDa. As melhores membranas, embora sendo bastante caras, so as
de difluoreto de polivinilideno (PVDF). Elas combinam a excelente capaci-
dade ligante e a resistncia mecnica manipulao necessria para a elabo-
rao das fitas, contendo protenas eletrotransferidas.
11.18. Teste imunocromatogrfico

O dispositivo de imunocromatografia composto de uma membrana
porosa de celulose modificada e membranas absorventes acessrias de fibra de
vidro, contendo os elementos de reao, ajustadas em um invlucro plstico
apropriado com uma janela para se acrescentar a amostra de teste e outra para
leitura do resultado da reao. O princpio de funcionamento do teste
imunocromatogrfico baseia-se na reao especfica antgeno-anticorpo e se
constitui por uma fase slida (membrana porosa), onde esto imobilizados
elementos de captura, e por uma fase mvel, onde esto suspensos o conjuga-
do (que pode ser a protena A, ligada ao ouro coloidal ou outros conjugados
disponveis) e a molcula alvo da amostra.
A fase mvel migra sobre a fase slida por efeito de capilaridade,
conduzindo o complexo formado entre a molcula alvo e o conjugado, que,
por sua vez, ser retido na linha de captura da fase slida, formando um
Imunologia | 99
complexo macromolecular colorido visvel ao olho humano. Caso a amostra

no contenha a molcula alvo, esta linha de reao no se formar. Uma
segunda linha de reao, denominada linha de controle, se forma pela captura
do conjugado livre, que permite a confirmao da migrao da fase mvel
(Figura 31).
Figura 31. Princpio doTeste Imunocromatogrfico
11.19. Imuno-histoqumica
A imuno-histoqumica (IHQ) rene a interao antgeno anticorpo in
vitro, tcnicas histolgicas e reaes qumicas, em um mtodo que permite
detectar diferentes estruturas de tecidos, revelados por diversos tipos de pro-
cessos de visualizao. utilizada no diagnstico anatomopatolgico de vrias
doenas degenerativas ou parasitrias, bem como na identificao de estruturas
normais em estudos de histologia bsica. As tcnicas de IHQ permitem a
localizao de protenas nas clulas de uma seo de tecido, fixados em formol
ou includo em blocos de parafina. Existe, atualmente, a disponibilidade de um
nmero crescente de anticorpos para uso em IHQ, o que vem possibilitado
uma maior preciso diagnstica.
Existem dois tipos de tcnicas de imuno-histoqumica:
Tcnica direta Os anticorpos primrios so ligados a um marcador

apropriado, e o corte de tecido, que contm antgenos especficos,
incubado com o anticorpo durante algum tempo. Aps a interao
entre os anticorpos e as protenas, os anticorpos que no se ligaram
so removidos por lavagem. Dependendo do marcador utilizado, a
leitura da reao ser realizada pela microscopia adequada; para
marcadores fluorescentes, por exemplo, o corte observado por
microscopia de imunofluorescncia, enquanto para outros marcadores,
utiliza-se a microscopia tica convencional.
Tcnica indireta Nesta tcnica, se utiliza o anticorpo primrio

especfico para uma determinada protena e para o anticorpo se-
cundrio, uma anti-imunoglobulina marcada que reconhece o
anticorpo primrio. O corte de tecido incubado com o anticorpo
especfico para determinada protena. Depois de lavado, incuba-
do com o imunoconjugado, que se vai ligar ao anticorpo primrio.
Em seguida, h a observao por microscopia adequada, depen-
dendo do marcador utilizado.
A tcnica de IHQ pode tambm estar associada a um processo
enzimtico de colorao, como ao complexo avidina-biotina-enzima-
cromgeno (Figura 32). O complexo formado pela ligao de uma
molcula de estreptavidina com vrias de biotina associadas a uma enzima
(peroxidase ou fosfatase alcalina), que tem como funo a converso de
um cromgeno incolor em um produto final colorido. O cromgeno mais
utilizado o DAB (diaminobenzidina), que confere cor marrom-ferruginosa
ao precipitado permanente.
Imunologia | 101
Figura 32. Amplificao de sinal devido ao maior nmero de molculas de

enzimas biotinaladas ligadas avidina
O anticorpo marcado com a peroxidase pode se ligar a stios teciduais

inespecficos, prejudicando a resultado do exame. A utilizao de protenas
inertes alheias ao sistema reacional, tais como soro fetal bovino, soro albumina
bovina ou casena, ao competirem com os stios de ligao inespecficos,
reduzem a reao inespecfica. A peroxidase endgena, encontrada em dife-
rentes tecidos, tambm pode mascarar uma reao e deve ser inibida pela
incubao prvia do corte com perxido de hidrognio. A fosfatase alcalina
est amplamente distribuda nos tecidos humanos e encontrada em altas
concentraes na mucosa intestinal e nos tbulos proximais dos rins, entre
outros tecidos. A biotina endgena, assim como as outras protenas utilizadas
na IHQ, tambm encontrada em tecidos, particularmente no fgado, pul-
mo, bao, tecido adiposo, glndula mamria, rim e crebro. A atividade da
biotina pode ser suprimida pelo uso de tampes alcalinos, pela pr-incubao
com avidina ou com leite desnatado.
A avidina uma glicoprotena bsica com PM de aproximadamente

68 mil, obtida a partir da clara do ovo de vrias espcies de aves. A molcula
de avidina quadrivalente e simtrica, onde cada lado da molcula contm um
par de receptores para a biotina. A estreptavidina, obtida a partir do Streptomyces
avidinii, possui ponto isoeltrico prximo ao neutro e mantm as propriedades
de ligao da avidina sem apresentar prejuzos ao resultado final. O sistema
avidina-biotina permite a amplificao de sinal, pois muitas molculas de biotina
podem se ligar a um anticorpo. E a adio da avidina marcada com corantes
fluorescentes, ou com enzimas, resultam em uma amplificao da reao, facili-
tando a visualizao do corte corado.
11.20. Citometria de fluxo

A citometria de fluxo uma tcnica utilizada para contar, examinar e
classificar partculas microscpicas suspensas, em fluxo, em um meio lquido.
Permite a anlise de vrios parmetros simultaneamente, sendo conhecida tam-
bm por citometria de fluxo multiparamtrica. A verso mais aplicada da
citometria de fluxo denominada FACS (fluorescence-activated cell sorter,
separador de clula ativado por fluorescncia), que foi projetada para automatizar
a anlise e a separao das clulas coradas com anticorpo fluorescente. O
FACS utiliza um feixe de laser e um detector de luz para contar as clulas
intactas nicas em suspeno. Atravs de um aparelho de deteco tico-
eletrnico so possveis anlises de caractersticas fsicas e/ou qumicas de uma
simples clula.
Em sistemas celulares, as principais propriedades analisadas so o tama-
nho relativo, a granulosidade relativa, a complexidade interna das partculas e a
intensidade relativa da fluorescncia. Essas caractersticas so determinadas por
meio de um sistema de acoplamento ptico-eletrnico que registra a forma
como a clula, ou partcula, dispersa a luz do laser incidente, emitindo
fluorescncia (Figura 33).
Imunologia | 103
Figura 33. Deteco de linfticos B fluorescente, por citometria de fluxo
O fundamendo da citometria de fluxo consiste na emisso de um feixe

de luz (normalmente laser), de nico comprimento de onda (cor), direccionado
a um meio lquido em fluxo. Um nmero de dectores apontado ao local
onde o fluxo passa atravs do feixe de luz. Um na linha do feixe (Forward
Scatter ou FSC) e vrios perpendiculares a este ( Side Scatter ou SSC), alm
de um ou mais detectores fluorescentes. Cada partcula suspensa passando
atravs do feixe dispersa a luz de uma forma, e os corantes qumicos fluores-
centes encontrados na partcula, ou juntos partcula, podem ser excitados,
emitindo luz de menor frequncia do que o da fonte de luz.
Esta combinao de luz dispersa e fluorescente melhorada pelos
dectetores e, analisando as flutuaes de brilho de cada detector (uma para
cada pico de emisso fluorescente), possvel explorar vrios tipos de infor-
mao sobre a estrutura fsica e qumica de cada partcula, individualmente.
FSC correlaciona-se com o volume celular e SSC depende da complexidade
interna da partcula (Ex: forma do ncleo, quantidade e tipo dos grnulos
citoplasmticos e rugosidade da membrana). Atualmente, alguns citmetros de
fluxo tm eliminado a necessidade da fluorescncia e usado somente disperso

de luz para sua medio. Outros citmetros de fluxo formam imagens de cada
fluorescncia da clula, disperso de luz e transmisso de luz.
O citmetro de fluxo dividido fundamentalmente em cinco sistemas:
Sistema fluido Local onde ocorrer a introduo e o alinhamento

das clulas por diferena de presso, e que sero interceptadas pela
luz do laser.
Sistema ptico Contm a fonte de luz do laser. Normalmente

so usadas lmpadas de mercrio ou xenon, lasers de alto poder
(argnio, kripton), lasers de poder baixo (argnio-488nm, red-
HeNe-633nm, green-HeNe e HeCd-UV) e lasers diodo (azul,
verde, vermelho e violeta).
Sistema eletrnico Responsvel por converter os sinais ticos

detectados em sinais eletrnicos proporcionais, atravs de um sistema
analgico para digital (ADC), gerando FSC e SSC, assim como
sinais fluorescentes.
Sistema de amplificao Codifica e processa as informaes

recebidas em escala linear ou escala logartimica.
Sistema computacional Responsvel pela anlise, processamento

dos sinais e emisso do resultado, utilizando softwares especficos.
Existe ainda um filtro e um sistema detector que capta a luz proveni-
ente das clulas. A emisso de luz frontal mede o tamanho da clula
e a luz lateral avalia a sua granulosidade e complexidade interna.
Modernos citmetros de fluxo so capazes de analisar vrias partcu-
las em cada segundo, em tempo real, e podem separar e isolar partculas
com propriedades especficas. Os parmetros possveis de medir so: vo-
lume e complexidade morfolgica das clulas, pigmentos celulares (como a
Imunologia | 105
clorofila), DNA, RNA, anlise e classificao de cromossomas, prote-

nas, antgenos superfcie celular (marcadores CD) e antgenos
intracelulares, entre outras molculas.
A hematologia foi uma das primeiras modalidades biomdicas a se
beneficiar das aplicaes clnicas da citometria de fluxo. Algumas destas
aplicaes so utilizadas regularmente para o diagnstico ou o acompanha-
mento teraputico de diferentes afeces. Em cancerologia, a deteco da
clula tumoral a aplicao mais desenvolvida. Esta deteco repousa
essencialmente sobre a medio de contedo anormal de DNA no ncleo
da clula tumoral e da expresso proteica dos antgenos tumorais.
Atualmente, a imunologia, a biologia molecular e as anlises clnicas
so as reas da cincia que mais utilizam a citometria de fluxo para a deteco
ou identificao de subtipos de clulas implicadas na imunidade. A contagem
de linfcitos T consiste em classificar e quantificar as subpopulaes desses
linfcitos, pela pesquisa imunofenotpica dos CDs, por meio de conjugados
fluorescentes especficos. Dependendo dos fluorocromos que estaro liga-
dos aos anticorpos monoclonais, as fluorescncias emitidas por eles, quando
excitados pelo laser , tero comprimentos de ondas diferentes e,
consequentemente, cores diferentes. H diversos tipos de fluorocromos,
como o isotiocianato de fluorescena (FITC), a ficoeritrina (PE), a protena
Clorofil peridinina (PerCP) e o Texas Red.
Os sinais eletrnicos so usados para analisar as clulas de acordo
com seus marcadores de superfcie, e esta anlise interpretada atravs de
um grfico de separao dividido em janelas (gates) (Figura 34). O citmetro
fornece o nmero absoluto de linfcitos, por exemplo, linfcitos T CD3+/
CD4+ e de linfcitos T CD3+/CD8+, porque em cada tubo de amos-
tra existe um nmero conhecido de partculas de referncia conjugadas com
fluorocromos (valor padro).
Figura 34. Anlise do linftico feita pelo Citmetro de Fluxo mostrando os

Gates e as populaes marcadascom FITC, PE e PerCP
11.21. Testes de hipersensibilidade celular cutnea tardia

Embora existam mtodos in vitro para o exame da imunidade celular,
como, por exemplo, a linfoproliferao e a citometria de fluxo, a resposta
celular tambm pode ser verificada in vivo por meio de testes de
hipersensibilidade celular cutnea tardia. Estes testes so muito simples e
podem ser empregados na avaliao geral da imunidade celular em estudos
de deficincia imunolgica e na verificao da exposio a determinados
agentes infectoparasitrios individuais ou em inquritos epidemiolgicos.
importante ressaltar que um teste positivo para um agente infeccioso no
significa necessariamente diagnstico de doena ativa ou infeco por este
agente, mas apenas a presena de clulas Th1 de memria, cuja origem foi
induzida por uma infeco primria assintomtica ou de uma doena curada.
O teste negativo indica que o indivduo no deve ter tido contato com o
agente que se investiga.
Imunologia | 107
Estes testes, alm de representarem o principal exame complementar

para o diagnstico e acompanhamento do curso de vrias enfermidades
infectoparasitrias, so indicados tambm para a avaliao da diminuio da
imunidade celular Th1, ou anergia, que se configura pela ausncia de resposta
a uma bateria de antgenos comuns, determinada por fatores genticos ou
ambientais. Como ocorre, por exemplo, em indivduos com infeces recor-
rentes, com infeces causadas por microrganismos que normalmente no so
patognicos, indivduos em uso de imunossupressores, indivduos com
imunodeficincias primrias ou com doenas que levam imunodeficincia
secundria, como a AIDS, neoplasias, doenas autoimunes, etc. Na suspeita
de anergia, feita a aplicao na pele, de certos produtos qumicos que
reagem com protenas que induzem sensibilizao sistmica a vrios metablitos
do agente sensibilizante. O dinitroclorobenzeno (DNCB) um agente que
tem sido utilizado desta maneira, com a finalidade de testar a imunidade celular
em pacientes com suspeita de anergia. Este no deve ser um procedimento de
rotina, e deve ser reservado a pacientes que apresentaram ausncia de resposta
celular aos antgenos comumente testados.
Dentre os antgenos mais utilizados, para a avaliao da resposta celular
de hipersensibilidade tardia, figuram os seguintes: a tuberculina, tambm cha-
mada de PPD (derivado proteico purificado), empregada no teste de Mantoux,
que utilizado para a avaliao da exposio ao Mycobacterium tuberculosis;
a lepromina, ou antgeno de Mitsuda ou mitsudina, que utilizada diante da
suspeita de hansenase; o extrato de Leishmania contido no teste de
Montenegro, utilizado no diagnstico complementar e em inquritos
epidemiolgicos de leishmaniose tegumentar; os antgenos de Candida albicans,
candidina ou oidiomicina, empregados diante da suspeita de candidase; a
tricofitina, para as dermatofitoses causadas por fungos; a paracoccidioidina,
utilizada sob a forma de filtrado de cultura na avaliao da resposta celular ao
Paracoccidioides brasiliensis, e outros.
O teste se procede pelo inculo, aps antissepsia da pele com lcool,

de 0,1 mL de antgeno especfico, por via intradmica na face anterior do
antebrao, usando seringas de 1 mL com agulhas n 8x0,25mm, estreis e
descartveis. Como controle, deve-se injetar o mesmo volume de soluo
salina em outro ponto do antebrao. A formao de uma ppula pequena e
uniforme indica injeo correta. A injeo subcutnea leva diluio do antgeno
e pode gerar resultados falso-negativos. A leitura realizada por medio dos
maiores dimetros do eritema e da endurao aps 48-72 horas na maioria
dos procedimentos. Endurao maior que 5 mm de dimetro geralmente indica
resposta positiva.
12. Alguns parmetros utilizados no controle

de qualidade do diagnstico sorolgico
O controle de qualidade para o diagnstico sorolgico das doenas
infectoparasitrias, da mesma maneira que para todos os outros procedimentos
laboratoriais, deve ser criteriosa em todas as etapas do processo. Comeando
pela fase pr-analtica, que inclui a indicao e solicitao corretas do teste
adequado, coleta da amostra do paciente convenientemente preparado, alm
do transporte e manuseio da amostra em condies apropriadas at o laborat-
rio de anlise. A fase analtica compreende a escolha do mtodo adequado,
a realizao do teste de acordo com as recomendaes do fabricante e o
registro do resultado obtido. A fase ps-analtica inclui os eventuais clculos e
a apresentao do resultado em forma de laudo final. A partir desta fase, deve
ser feita a interpretao do resultado, em conjunto com os dados clnicos e
demais exames laboratoriais, para que seja definida a melhor conduta.
12.1. Construo de banco de soros

O banco de soros uma coleo catalogada de amostras representativas
de uma populao que se mantm para preservar suas caractersticas imunolgicas.
Imunologia | 109
Para a adequada constituio, necessrio a incluso de amostras proveni-

entes de pessoas infectadas e de pessoas no infectadas. As amostras de
pessoas infectadas, chamadas controles positivos, devem ser pertencentes
s reas endmicas (se a doena possuir tal caracterstica) e vir com diag-
nstico conclusivo que demonstre o parasito ou por provas que deem tais
indicaes, como, por exemplo, os testes intradrmicos de hipersensibilidade
celular, reao de hibridizao ou a reao polimersica em cadeia ( Polymerase
Chain Reaction - PCR). As amostras de indivduos no infectados, consi-
derados normais e chamados de controles negativos, so selecionadas
mediante a apresentao de resultados negativos obtidos com as mesmas
provas utilizadas para seleo das amostras positivas e, se possvel for,
provenientes de reas no endmicas da modalidade estudada. Se houver
a incluso de soros provenientes de indivduos com outras doenas, para a
verificao de respostas cruzadas, as mesmas provas diagnsticas de certeza
devem ser realizadas. Todo banco de amostras necessita da aprovao de
comisso de tica em pesquisa envolvendo seres humanos, bem como da
aprovao de comisso de tica para uso de animais (CEUA), quando
envolve amostras no humanas.
12.2. Avaliao dos mtodos sorolgicos

Ao analisar o comportamento sorolgico de duas populaes, onde
uma delas seja constituda por amostras provenientes de pessoas infectadas
e a outra de pessoas no infectadas, ao se comparar os resultados sorolgicos
obtidos em ambas, com frequncia relativa em porcentagem, encontram-se
duas curvas gaussianas bem definidas (Figura 35).
Figura 35. Distribuio de frequncias dos ttulos sorolgicos de duas popula-

es hipotticas, uma normal A e outra infectada B, encontradas com um teste
sorolgico hipoteticamente ideal
Entretanto, estes dados hipotticos ideais no refletem o que se

observa em uma rotina de diagnstico sorolgico. Os resultados dos testes
sorolgicos se agrupam em quatro categorias, de acordo com a existncia
ou no da doena e a positividade ou no do teste. Para qualquer infeco
que se analise, observa-se sobreposio entre as curvas de distribuio da
populao normal (A) e a de infectados (B), como se mostra na Figura
36, onde os soros, com resultados positivos ao teste e provenientes de
pacientes nos quais o diagnstico de certeza era positivo, denominam-se
verdadeiros-positivos. Soros com resultados negativos obtidos de contro-
les normais so chamados verdadeiros-negativos. Soros com resultados
negativos provenientes de pacientes infectados so denominados falsos-
negativos e aqueles com resultado positivo ao teste sorolgico, porm
obtidos de controles normais, so os falsos-positivos.
Imunologia | 111
Figura 36. Distribuio de frequncias dos ttulos sorolgicos, semelhantes ao

que se encontra habitualmente: uma normal A e outra infectada B, obtidas
com um teste sorolgico hipoteticamente ideal
Neste exemplo hipottico, a sobreposio das curvas simtrica e a

linha de corte (cut off) encontra-se marcada ao centro, fornecendo assim, igual
quantidade de resultados falsos-negativos (C) e falsos-positivos (D). Os da-
dos com que se obtm as curvas podem ser extrados de um quadro de dupla
entrada, como apresentado no Quadro 2.
Quadro 2 Demonstrao de populaes de indivduos infectados e no

infectados, onde: a = Verdadeiros-positivos, b = Falsos-positivos, c =
Falsos-negativos, d = Verdadeiros-negativos e P = Prevalncia.
INDIVDUOS
INFECO
TESTE
PRESENTE AUSENTE TOTAL
POSITIVO a b a+b
NEGATIVO c d c+d
TOTAL a + c (P) b+d n
Apesar de testes sorolgicos produzirem muitos resultados verdadei-

ros, alguns resultados falsos, como j mencionado, podem ser gerados,
sejam eles positivos ou negativos; e, por conseguinte, comum dizer que
os testes sorolgicos so presuntivos, ou seja, de valor probabilstico.
Estes testes, obrigatoriamente, devem ser avaliados para definir parmetros
importantes quanto s suas qualidades fixas (sensibilidade, especificidade e
acurcia), uma vez que estes valores independem da prevalncia da infec-
o estudada na populao.
Um teste de triagem sorolgica ideal deve ser capaz de identificar
todos os indivduos com a condio estudada e de excluir todos os indiv-
duos que no apresentem esta condio. A probabilidade do teste em
identificar corretamente, em uma populao, os indivduos que apresentem
a infeco, denomina-se sensibilidade (S) e pode, tambm, ser conceitu-
ada como a capacidade de um teste sorolgico proporcionar resultados
positivos nos indivduos infectados ou, ainda, como a capacidade do m-
todo sorolgico em detectar quantidades mnimas do material desejado.
Calcula-se a sensibilidade com a seguinte relao:
Sensibilidade = a : (a + c)
De acordo com os dados do quadro 3
Sensibilidade = 300 : 400 = 0,75 ou 75%
Os resultados podem ser apresentados em uma escala de 0 a 1, mas
normalmente so expressos em porcentagem.
A capacidade do teste para excluir aqueles que no so afetados
chamada especificidade (E), que tambm pode ser conceituada como a
qualidade que um teste apresenta em distinguir molculas diferentes, porm,
com elevado grau de homologia. Aproveitando os dados do Quadro 3, a
especificidade calcula-se por:
Imunologia | 113
Especificidade = d : (b + d ) onde Especificidade = 540 : 600 = 0,9 ou 90%
Quadro 3 Resultados sorolgicos hipotticos encontrados em duas popula-

es de indivduos infectados e no infectados
INDIVIDUOS
INFECO
TESTE
PRESENTE AUSENTE TOTAL
POSITIVO 300 a 60 b 360 a + b

NEGATIVO 100 c 540 d 640 c + d
TOTAL 400 a + c (P) 600 b+d 1000 n
A acurcia (A), tambm chamada de confiabilidade ou eficincia do

teste, refere-se ao somatrio dos resultados verdadeiros positivos e negativos
em relao populao estudada.
Acurcia = (a + d) : n onde Acurcia = (300 + 540) : 1000 = 0,84 ou 84%
O coeficiente de prevalncia (P) pode ser conceituado como a por-

centagem de indivduos infectados, parasitologicamente comprovados em uma
populao. Esse conceito difere da soroprevalncia, (SP) que considera a
porcentagem de indivduos soropositivos na populao estudada.
Prevalncia = (a + c) : n onde Prevalncia = 400 : 1.000 = 40%
Soroprevalncia = (a + b) : n onde Soroprevalncia = 360 : 1.000 = 36%
A determinao das qualidades fixas de um teste sorolgico, por si s,

no satisfaz suficientemente s necessidades do controle sob os resultados
sorolgicos, uma vez que a ocorrncia de resultados falsos pode alterar, em
funo da prevalncia de infeco. Como as tcnicas sorolgicas so utilizadas
em diversos lugares do mundo em reas com diferentes coeficientes de
prevalncia, importante conhecer a probabilidade de que os resultados

positivos segundo a tcnica empregada sejam realmente positivos, bem
como os resultados negativos sejam realmente negativos. Estas probabilida-
des so os valores de predio (VP) da tcnica. O parmetro mais fre-
quentemente utilizado o valor de predio de positividade (VPP), que
permite identificar os doentes em um grupo de indivduos considerados
soropositivos. O valor de predio de negatividade (VPN) conceituado
como a probabilidade de que a doena estudada no exista em um grupo
de indivduos considerados como soronegativos. Disto deduz-se que o
valor de predio pode ser dado pelo teorema de Bayes:
VPP = (P x S) : (P x S) + (1 - P) x (1 - E)
VPN = E x (1 - P) : E x (1 - P) + (1 - S) x P
Por outro lado, os clculos podem expressar-se de uma forma mais

simples, mediante os valores do Quadro 3 apresentado anteriormente:
VPP = a : (a + b) onde VPP = 300 : 360 = 0,83 (83%)
VPN = d : (c + d) onde VPN = 540 : 640 = 0,84 (84%)
feita a aplicao do mesmo teste sorolgico, com sensibilidade e

especificidade invariveis, em duas reas endmicas para uma determinada
doena, onde a nica diferena entre estas populaes seja a prevalncia
de infeco encontrada, representada por uma populao (A) de baixa
prevalncia e uma (B) de alta prevalncia. A alterao no comportamento
do teste se verifica pela modificao dos valores de predio de positividade
e de negatividade. A partir dos valores apresentados no quadro 4, pode-
se verificar tais modificaes.
Imunologia | 115
Quadro 4 - Quadro explicativo para os clculos do valor de predio de

positividade em duas populaes hipotticas: populao A = baixa prevalncia
e populao B = alta prevalncia, para uma determinada infeco.
Resultado (A) Prevalncia de infeco = 1% (B) Prevalncia de infeco = 10%

do teste Infectados No infectados total Infectados No infectados total
Positivo 980 990 1970 9800 900 10700

Negativo 20 98010 98030 200 89100 89300
Total 1000 99000 100000 10000 90000 100000
P = 1% S = 98% SP = 99% P = 10% S = 98% SP = 99%

VPP = 980 / 1970 X 100 = 49,7% VPP = 9800 / 10700 X 100 = 91,6%
Conforme demonstrado, embora o teste sorolgico tenha sensibilidade

e especificidade elevadas, 98% e 99% respectivamente, sua aplicao em
rea de baixa prevalncia gerou valor de predio de positividade inferior a
50%. Contrariamente, em rea de alta prevalncia o valor de predio de
positividade elevou-se acima de 90%.
O Quadro 5 ilustra, com maiores detalhes, como o valor de predio
de positividade dos testes sorolgicos, com diferentes nveis de sensibilidade e
de especificidade, sofrem alteraes em funo dos valores crescentes do
coeficiente de prevalncia. Via de regra, o teste sorolgico no deve ser
empregado em reas de baixa prevalncia em consequncia da gerao de
numerosos resultados falsos-positivos.
Em tcnicas parasitolgicas dificilmente ocorrem resultados falso-positi-
vos, como, por exemplo, a identificao de hemoparasitos em exames micros-
cpicos pela extenso sangunea em lmina, ou enteroparasitos em fezes,
definitivo para comprovar uma infeco. Por outro lado, no podem ser utiliza-
dos para estimar a prevalncia real de infeco, por apresentarem resultados

falso-negativos.
Quadro 5 - VPP de testes com diferentes ndices de sensibilidade e

especificidade para diversas taxas de prevalncia
VARIAO DO VALOR DE PREDIO DE POSITIVIDADE

especificidade = 99% sensibilidade = 99%
Prevalncia % sensibilidade % especificidade 99%

70 80 90 95 99 70 80 90 95 99
0,5 2 2 5 9 33 26 29 31 22 33
1,0 3 5 9 17 50 41 45 48 49 50
5,0 15 21 34 51 84 79 81 83 83 84
10,0 27 35 52 69 92 89 90 91 91 92
20,0 45 55 71 83 96 95 95 96 96 96
Valores de predio de positividade
Os resultados dos testes sorolgicos tambm podem ser confrontados

para a verificao da copositividade, da conegatividade e da concordncia
bruta. Estes parmetros podem ser obtidos em funo da distribuio dos
resultados dos testes sorolgicos, como representados no Quadro 6 de ma-
neira semelhante sensibilidade, especificidade e confiabilidade. A concor-
dncia ajustada Kappa (K) um parmetro que se baseia na comparao do
ndice de concordncia esperada com o ndice de concordncia observada.
Imunologia | 117
Quadro 6 - Quadro explicativo para os clculos da Copositividade, e da

Conegatividade, Concordncia bruta e Concordncia ajustada Kappa (K.)
TESTE 1 (Teste de referncia)

TESTE 2 PRESENTE AUSENTE TOTAL
POSITIVO a b a + b (p1)
NEGATIVO c d c + d (q1)
TOTAL a + c (p2) b + d (q2) a+b+c+d
Copositividade = a : (a + c)
Conegatividade = d : (b + d)
Concordncia bruta= (a + d) : ( a + b + c +d)
Kappa = [2 (ad + bc) : (p1q2 + p2q1)]
Pode-se utilizar o seguinte critrio para conceituar os resultados

do controle de qualidade: valores 40,0% so considerados pobres, de
40,1 at 79,9% regulares, valores 80,0 a 89,9% so considerados bons
e 90% so considerados excelentes.
Resumo do captulo
O sistema imunitrio, assim como os demais sistemas do organismo,
possui suas prprias clulas, tecidos, rgos e molculas. A principal clula
desse sistema o linfcito. Os linfcitos so as nicas clulas do organismo
que expressam receptores altamente diversificados para o antgeno, o que
permite o reconhecimento de uma grande variedade de substncias estranhas.
A ativao do sistema imune adaptativo depende da apresentao de
antgenos. Um antgeno qualquer substncia que pode ser reconhecida por
um anticorpo ou por um receptor de clula T. Os antgenos possuem duas
propriedades: a imunogenicidade e a antigenicidade. Os que no so capazes
de induzir uma resposta imune so chamados de haptenos e precisam ser
acoplados s molculas carreadoras para adquirirem tal capacidade. O
determinante antignico, ou epitopo, a menor poro da molcula e
responsvel pela propriedade de estimular uma resposta imune. As superfcies
celulares, incluindo os microrganismos, geralmente possuem uma grande quan-
tidade de determinantes antignicos.
Os anticorpos atuam na resposta imune ligando-se especificamente ao
agente patognico ou seu subproduto, ativando o sistema complemento,
opsonizando para aumentar a fagocitose e a citotoxicidade dependente de
anticorpo, e permitindo, assim, que microrganismos e parasitos sejam destrudos
pelas clulas do sistema imune.
Os anticorpos se encontram distribudos por todo o organismo, pois
os agentes infecciosos podem vencer as diversas barreiras naturais e estabele-
cer uma infeco em qualquer parte do corpo. Os primeiros anticorpos a
serem produzidos numa resposta imune so as IgM e tendem a ser de baixa
afinidade, mas so muito potentes na ativao do sistema complemento. A
IgG o principal isotipo no sangue e fluidos extracelulares, e transportada
atravs da placenta diretamente para a corrente circulatria do feto durante a
vida intrauterina. A IgA tem papel importante na proteo das superfcies
Imunologia | 119
mucosas contra patgenos ou seus subprodutos. A IgE tem como principal

funo o recrutamento de clulas inflamatrias atravs da ativao de mastcitos
e basfilos, como tambm pode estar envolvida na eliminao de parasitos e
processos alrgicos.
Existem vrios sistemas proteicos de reao em cadeia no plasma sangu-
neo, dentre estes, o sistema complemento, que um complexo sistema
constitudo por molculas termolbeis e termoestveis, e que tem como funo
a eliminao de um agente estranho, facilitando a fagocitose, quando algumas
protenas ativadas do complemento opsonizam a superfcie do patgeno; por
reao Inflamatria, quando os pequenos fragmentos de protenas recrutam
fagcitos ao local da atividade inflamatria; ou por lise direta, quando, uma
vez desencadeada a cascata, os componentes terminais do complemento lesam
a membrana dos microrganismos.
Todo organismo multicelular possui algum sistema de defesa que distin-
gue os patgenos e elimina-os do hospedeiro. A vantagem de tal imunidade
especfica que o sistema imune pode rapidamente adaptar-se queles patgenos
que so mais frequentemente encontrados no meio ambiente local. Esta capa-
cidade conseguida atravs do complexo principal de histocompatibilidade,
cujos produtos desempenham um papel no reconhecimento intercelular e na
discriminao entre o prprio e o no prprio.
Didaticamente, a imunidade adaptativa se organiza em imunidade humoral
e imunidade celular. A imunidade mediada por clulas se desenvolve por uma
rede de interaes que resulta em defesa contra microrganismos, os quais
sobrevivem dentro de fagcitos ou de outras clulas. A resposta iniciada
pelo reconhecimento do antgeno de microrganismos intracelulares por clulas
T atravs do complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Na respos-
ta via CD8, somente a clula alvo que porte o antgeno associado classe I
pode ser lisada ou induzida a entrar em apoptose. Em outro mecanismo da
resposta celular, as clulas T CD4+ Th1 ativam, por exemplo, macrfagos
infectados atravs de citocinas como o IFN-g. Quando um patgeno resiste

aos efeitos dos macrfagos ativados, pode-se desenvolver uma infeco crni-
ca. J a resposta imune humoral conduz destruio dos microrganismos
extracelulares e previne ou diminui a disseminao das infeces intracelulares,
por meio da neutralizao, opsonizao e ativao do sistema complemento.
A ativao das clulas B e sua diferenciao em clulas secretoras de
imunoglobulinas so deflagradas pelo antgeno especfico e requer a participa-
o de clulas CD4+ Th2, que tambm controlam a mudana de isotipo e
desempenham papel importante na hipermutao somtica, o que necessrio
para a maturao da afinidade dos anticorpos.
Em algumas infeces, o sistema imunitrio no consegue eliminar o
parasito, mas reage isolando o agente com clulas inflamatrias. Na
esquistossomose, a formao do granuloma um exemplo da reao do hos-
pedeiro contra o parasito. A maioria dos parasitos desenvolve mecanismos de
escape do sistema imune para garantir sua sobrevivncia e alguns comprometem
tanto as respostas mediadas por anticorpos como as mediadas por clulas.
A medida das interaes entre antgeno-anticorpo com o propsito de
diagnstico conhecida como imunossorologia. As tcnicas imunossorolgicas
fundamentam-se na natureza da interao antgeno-anticorpo nas quais podem
expressar-se em duas formas distintas, em decorrncia da utilizao de
imunorreagentes livres de marcao ou de reagentes marcados. As tcnicas que
no empregam marcadores demonstram-se por fenmenos visveis. Portanto,
ao se combinar anticorpos com antgenos solveis, os complexos resultantes
podem formar precipitados insolveis. Se os antgenos so particulados (bact-
rias, protozorios, hemcias), os anticorpos os aglutinam. Se o anticorpo pode
ativar a via clssica do sistema complemento e o antgeno se encontra em uma
superfcie celular, o resultado pode ser a citlise. As tcnicas que empregam
imunorreagentes marcados caracterizam-se pela simples combinao do antgeno
com o anticorpo, necessitando que um deles esteja marcado convenientemente.
Imunologia | 121
O imunorreagente pode ser marcado com corantes fluorescentes ou

quimioluminescentes, radioistopos, enzimas, ouro ou prata coloidais, entre
outros marcadores.
Apesar de testes sorolgicos produzirem muitos resultados verdadeiros,
alguns resultados falsos podem ser gerados, sejam eles positivos ou negativos
e, por conseguinte, comum dizer que os testes sorolgicos so presuntivos,
ou seja, de valor probabilstico. Estes testes, obrigatoriamente, devem ser
avaliados para definir parmetros importantes quanto s suas qualidades fixas
(sensibilidade, especificidade e acurcia), uma vez que estes valores independem
da prevalncia da infeco estudada na populao.
Questes
1) Descreva o processo de maturao das clulas T, no timo.
2) Comente sobre a importncia das molculas de adeso na resposta imune.
3) Defina imunogenicidade e especificidade.
4) Defina adjuvante e sua funo na resposta imune.
5) Descreva as principais propriedades das cinco classes de Imunoglobulinas.
6) Como voc prepararia um anticorpo contra IgG humana?
7) Descreva o processo de ativao da via clssica e da via alternativa do

complemento.
8) Descreva os principais mecanismos de atuao do sistema complemento na

eliminao de patgenos.
9) Descreva o processamento e apresentao de um antgeno intracelular

presente no citoplasma da clula.
10) Descreva o processamento e apresentao de um antgeno, oriundo de

uma bactria extracelular, que foi ativamente fagocitada por um macrfago.
11) Descreva os principais mecanismos de atuao da resposta humoral.
12) Descreva os mecanismos de ao exercidos pelas clulas CD8 na resposta
celular.
13) Descreva os principais mecanismos de imunidade inata e adaptativa contra
vrus.
14) Descreva os principais mecanismos de imunidade adaptativa e especfica
contra bactrias extracelulares e bactrias intracelulares.
15) Como os helmintos parasitas do lume intestinal so expulsos do organis-
mo?
16) Sempre que encontramos uma reao imunolgica positiva, ela determina
a presena do agente etiolgico? Justifique.
17) O que converso sorolgica?
18) Explique o fenmeno prozona e como fazemos sua neutralizao.
19) O que causa reao cruzada em provas sorolgicas? O voc sugere para
impedir esse fenmeno?
20) Quais a provas sorolgicas realizadas em banco de sangue para preven-
o de doenas transmissveis?
21) Quais as vantagens e desvantagens do uso de anticorpos monoclonais em
provas sorolgicas?
22) Como se processam as reaes de aglutinao direta? D um exemplo de
teste comumente usado para fins de diagnsticos.
23) Qual o fundamento da reao de imunofluorescncia indireta (RIFI)?
24) Fale sobre a reao Imunoenzimtica (ELISA), quanto ao seu modo de
ao, suas vantagens e desvantagens.
Imunologia | 123
25) Na etapa de sensibilizao das placas plsticas de microdiluio, da

reao imunoenzimtica ELISA, utilizamos tampes com pH elevado (por
volta de 9,6) para preparar os antgenos proteicos. Por qu?
26) Com que propsito utilizamos casena (protena do leite) no desenvolvi-
mento do ELISA?
27) Fale sobre o fundamento do teste de imunoeletrotransferncia ( Western-
blotting).
28) Conceitue:
a) Sensibilidade; b) Especificidade
Bibliografia consultada
ABBAS, A. K. ; LICHTMAN, A. H. ; PILLAI, S. Imunologia celular e molecular. 6.
ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008.
BACAL, N. S, FAULHARER, M. H. W. Aplicao prtica em citometria de fluxo.
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BENJAMINI, E. ; COICO, R. ; SUNSHINE, G. Imunologia. 4. ed. Rio de Janeiro:
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DUARTE, R. Ensaio imunoenzimtico (ELISA) para identificao experimental de fontes
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FERREIRA, W.; VILA, S.L.M. Diagnstico laboratorial das principais doenas infec-
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HALLIWELL, R. E. W. ; GORMAM, N. T. Inmunologia clnica veterinria. Zaragoza:
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Conceitos e Métodos para Formação de Profissionais em Laboratórios de Saúde

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Conceitos e Mtodos para a Formao de Tcni-

FUNDAO OSWALDO CRUZ

ESCOLA POLITCNICA DE SADE JOAQUIM VENNCIO

Vice-diretor de Pesquisa e Desenvolvimento Tecnolgico

Vice-diretora de Ensino e Informao

Vice-diretor de Gesto e Desenvolvimento Institucional

INSTITUTO OSWALDO CRUZ

Vice-diretora de Pesquisa, Desenvolvimento Tecnolgico e Inovao

Vice-diretora de Ensino, Informao e Comunicao

Vice-diretora de Servios de Referncia e Colees Cientficas

Vice-diretor de Desenvolvimento Institucional e Gesto

Conceitos e Mtodos para a Formao de Tcnicos

pode ser criada artificialmente, atravs das vacinas. Na ausncia de um sistema

2. rgos, tecidos e clulas

2.1. Clulas que participam do sistema imunitrio

interessam para o entendimento das aes do sistema imunitrio, de modo

Os eosinfilos parecem ser importantes, principalmente na resposta

Figura 1. Clulas que participam do sistema inunitrio

O progenitor linfoide comum d origem aos linfcitos. Os linfcitos so

adaptadas para detectar antgenos derivados de protenas estranhas ou

Figura 2. Estruturas bsicas do receptor de superfcie da clula B e do receptor T.

A maioria dos linfcitos virgens possui uma sobrevida muito curta,

Algumas das clulas-filhas retomam ao estado de repouso, tornando-se clu-

2.2. Os rgos linfoides e a rede linftica

celular, os dois tipos de linfcitos entram na corrente sangunea, migrando

vasos linfticos aferentes drenam o fluido dos tecidos e carregam antgenos

Figura 3. rgos, tecidos e clulas envolvidos na resposta imunitria.

2.3.Tecido linfoide associado mucosa

Tecidos linfoides associados ao intestino (GALT = gut-associated

2.4. Recirculao de linfcitos

Quando ocorre uma infeco tecidual, os antgenos so capturados por

T:: desenvolvimento, diversidade e ativao

clulas T CD4 ou CD8 ocorre na medula tmica, e as clulas T maduras so

3.1. Receptores de antgenos e molculas

associados s molculas MHC e no so restritas ao MHC. Alguns clones

3.2. Correceptores CD4 e CD8: Receptores envolvidos na

ce de forma especfica o complexo peptdeo-MHC na APC. Cerca de 65%

4. Natureza dos antgenos

4.1. Determinante antignico

4.2. Relao filogentica dos antgenos

4.3. Peso molecular e complexidade molecular

4.4. Configurao espacial e acessibilidade

diversos epitopos em uma nica molcula de protena pode influenciar a ligao

Figura 4. Distribuio dos determinantes antignicos sequenciais e no

4.5. Forma de administrao e adjuvantes

destruio, estimulando, assim, a migrao de clulas para o local de inoculao

Bases qumicas da especificidade antignica

5. Diversidade das imunogobulinas

da resposta imune que, frequentemente, resultam em anular a ao de

cadeias leves so do tipo kappa, e 40% so do tipo lambda. Os primeiros

Figura 5. Estrutrua bsica de uma imunoglobina e a formao dos fragmentos

5.1. Gerao da diversidade na resposta imune

5.2. Distribuio e propriedades dos isotipos

encontrada em grandes concentraes nas regies mucosas do organismo.

Figura 6. Estrutura dos cinco principais isotipos de imunoglobulinas humanas

5.3. Polimorfismo das imunoglobulinas

pequenas diferenas polimrficas nos loci, que codificam as regies constantes

Figura 7. Localizao das variaes isotpicas, alotpicas na molcula de

5.4. Anticorpos monoclonais

um nico clone, pois como no existe meia clula, teoricamente, teremos um

Reao inflamatria - quando os pequenos fragmentos de protenas

Figura 8. Vias de ativao do sistema complemento