SDS-PAGE

SDS-PAGE é a abreviatura de dodecil sulfato de sódio (SDS) de

poliacrilamida(PAGE), que consiste em uma técnica usada em bioquímica,
genética e biologia molecular utilizada para separar moléculas com base no
tamanho, forma ou ponto isoelétrico. O SDS-PAGE, juntamente com o
Western blotting (immunoblotting) é normalmente usado para determinar a
presença e / ou a abundância relativa de uma dada proteína.
Também pode ser utilizada para separar moléculas de DNA e RNA.

A técnica consiste na exposição das proteínas ao

detergente iônico SDS, antes e durante a eletroforese
em gel. O SDS desnatura as proteínas, fazendo com que
elas dissociam-se em suas subunidades, desta forma,
todas as cadeias polipeptídicas são ‘forçadas’ a terem
sua conformação estendida e com carga similar, carga
negativa (carga adquirida com o tratamento com SDS),
para a corrida na eletroforese. Portanto, o tratamento
com SDS elimina os efeitos das diferenças na forma de
modo que o comprimento da cadeia, o que reflete no
peso molecular, é o único determinante da taxa de migração das proteínas
em eletroforese SDS-poliacrilamida.

Uma das vantagens da utilização do SDS que posso citar como exemplo
seria que as cadeias que possuem peso molecular semelhantes, com
diferenças pequenas de aproximadamente 10 por cento, podem ser
separadas por esta técnica.

O procedimento é simples, primeiro as proteínas são misturadas com o

detergente aniônico SDS, que se liga a proteínas e desnatura a sua
estrutura secundária e não-associados dissulfeto terciário, em temperatura
elvada, cerca de 100°C por 5 minutos. SDS também se aplica uma carga
negativa uniforme elétrica para cada proteína na proporção de sua massa.

A solução de proteínas a ser analisado é primeiro misturado com SDS, um

detergente aniônico que desnatura secundário e não-associados dissulfeto
estruturas terciárias, e aplica uma carga negativa para cada proteína na
proporção de sua massa. Sem SDS, as proteínas com diferentes pesos
moleculares semelhantes migrariam de forma diferente devido a diferenças
na relação carga massa, cada proteína tem um ponto isoelétrico e peso
molecular especial, a sua estrutura primária. Isto é conhecido como PAGE
nativo. Adicionando SDS resolve este problema, uma vez que se liga e se
desdobra a proteína, dando uma carga negativa uniforme perto ao longo do
comprimento do polipeptídeo.
SDS-poliacrilamida poros Eletroforese em Gel

Eletroforese envolve a aplicação de uma corrente elétrica para o gel,

permitindo que as proteínas migram através da matriz.

A separação eletroforética de proteínas é mais comumente realizada em gel

de poliacrilamida. Este gel é um polímero reticulado da matriz utilizada para
apoiar e separar as moléculas. A densidade do gel pode ser controlada pela
variação da concentração de monômero. Géis podem ser de densidade
constante ou podem ser variáveis (géis de gradiente). Depois da formação
de ligações cruzadas, as amostras são carregadas em pequenos poços no
gel e a eletroforese é realizada.

Quando uma mistura de proteínas é aplicada a um gel e uma corrente

elétrica aplicada, proteínas menores migram mais rapidamente do que as
proteínas maiores através do gel. A taxa de movimento é influenciado pelo
tamanho dos poros do gel e da força do campo elétrico. Os poros de um gel
de poliacrilamida altamente reticulada são muito pequenas. Esse gel pode
correr pequenas proteínas e peptídeos, porém proteínas grandes, não
seriam capazes de se mover através dele.

SDS-PAGE (eletroforese em gel) e Westen Blot Processo

Western Blot

• Bloqueio
A primeira etapa do protocolo de western blot é o bloqueio da membrana
(figura 2), a fim de reduzir as interações com proteínas não-específicas
entre a membrana e os anticorpos. Isto é conseguido através da colocação
da membrana em uma solução de albumina bovina (BSA) ou non-fat leite
em pó (NFDM).

• Anticorpo primário
O primeiro anticorpo a ser aplicado (específico para a proteína de interesse)
é incubado com a membrana. O anticorpo é diluído em uma solução tampão
(PBS) contendo uma proteína transportadora (BSA ou NFDM), juntamente
com um pouco de detergente. O anticorpo primário específico para a
proteína de interesse, e, em concentrações adequadas, não deve vincular
qualquer uma das outras proteínas da membrana (Figura 3 - anticorpo
vermelho).