G.P. Microbiologia 2017-I

UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA

PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
IV CICLO
GUIA DE PRCTICA
DE
MICROBIOLOGIA MDICA
2017-I
UNIVERSIADA PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA
ASIGNATURA DE MICROBIOLOGIA MDICA
INDICE
Pgina
Recomendaciones generales 3
Microscopia: estudio y manejo del microscopio 4
Mtodos de coloraciones: coloraciones simples., diferenciales y especiales 7
Coloracin diferencial de Gram 9
Coloracin diferencial de Ziehl-Neelsen 11
Coloracin especial: coloracin de Leishman y Vago 12
Medios de cultivo: simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales 14
Siembra bacteriana. Medios de aislamiento 17
Metabolismo bacteriano 19
Pruebas de sensibilidad a los antibiticos (antibiograma) 27
Reaccin antgeno anticuerpo: Aglutinacin 29
Fagocitosis 31
Reaccin de Precipitacin 32
Pruebas Inmunoenzimaticas: ELISA 33
Preparacin de Antgenos bacterianos 35
Aislamiento e Identificacin de cocos Gram positivos: Genero Staphylococcus 38
Aislamiento e Identificacin de cocos Gram positivos: Gnero Streptococcus 40
Aislamiento e Identificacin de cocos Gram negativos: Genero Neisseria 42
Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram positivos: Genero Bacillus 44
Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram positivos: genero Listeria 46
Estudio microbiolgico de la flora normal de la Secrecin Bucofarngea 48
Aislamiento e Identificacin de bacilos acido- alcohol- resistentes: Genero Mycobacterium. 50
Aislamiento e identificacin de bacilos Gram positivos: genero Corynebacterium 52
Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram negativos: Genero Pseudomona 54
Aislamiento e Identificacin de bacilos Gram negativos: Genero Brucella. Hemocultivo y 56
Serologa
Aislamiento e Identificacin de Enterobacterias: Coprocultivo 59
Estudio e Identificacin de Vibrio cholerae 62
Estudio e Identificacin del Genero Leptospira 64
Estudio e Identificacin de Bartonella 66
Estudio e Identificacin de Treponema Prueba de VDRL RPR 67
Cultivo de muestras de infecciones urinarias: Urocultivo 68
Aislamiento de virus en huevos embrionados y en ratones lactantes. 71
Estudio e Identificacin de Hongos Ambientales 74
Estudio e Identificacin de Hongos Dermatofitos 78
Estudio de Hongos Levaduriformes: Observacin de cortes histopatolgicos 81
Estudio de Hongos Dimrficos: Observacin de cortes histopatolgicos 83
ANEXOS: SEMINARIOS:
Gentica Microbiana e Ingeniera Gentica 86
Vacunas Antimicrobianas. Programa de Vacunacin 87
Antibiticos y quimioterpicos 88
Enfermedades de transmisin sexual. SIDA 89
Arbovirus. Dengue y Fiebre amarilla 90
ASIGNATURA DE MICROBIOLOGA MDICA
RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO

DURANTE EL CURSO DE MICROBIOLOGA MDICA
1. El estudiante deber asistir a las clases prcticas llevando consigo la Gua de Prcticas,
mandil, plumn indeleble para escribir sobre vidrio y lpices de colores.
2. No se podr ingresar sin mandil, guantes y mascarilla a la sala de prcticas, para evitar
contaminaciones
3. Durante las prcticas no se debe comer, beber ni fumar, para evitar o prevenir posibles
contaminaciones.
4. Sobre la mesa de trabajo slo debern colocar su gua de prctica y su libreta de apuntes.
5. Eliminar el material de desecho, como papeles, trozos de algodn, etc. al tacho de basura
6. Las coloraciones deben efectuarse en el lavadero de cada mesa de prctica para evitar que
se tian la mesa de trabajo, ropa o manos.
7. Colocar las lminas preparadas sobre hojas de papel blanco.
8. Dejar los cultivos ya usados, en la canastilla de tubos. Tener cuidado que permanezcan
debidamente cerrados y en posicin vertical para evitar que se derramen.
9. Las lminas coloreadas a desecharse debern ser colocadas en frascos de boca ancha con
desinfectante.
10. Todos los cultivos que se preparen debern incubarse, teniendo en cuenta las siguientes
anotaciones:
Nombre o iniciales de los estudiantes
Nombre del germen, nmero de mesa, turno y fecha de la siembra
Las placas debern ser invertidas, a menos que el profesor de instrucciones
contrarias Los tubos debern estar bien tapados y colocados en gradillas
Los alumnos se responsabilizan de colocar estos cultivos en estufa a 37C
11. Al finalizar el trabajo:

Limpiar con algodn los objetivos del microscopio
Tener cuidado de dejar el objetivo de menor aumento frente al condensador y que no
queden lminas sobre la platina
Limpiar la mesa de trabajo
Comprobar que la llave de gas este cerrada
Lavarse prolijamente las manos con jabn.
12. El Protocolo de cada prctica ser controlado por el profesor al final de la prctica.
El Profesor Responsable del Curso

SIGNATURA DE MICROBIOLOGA MDICA
PRCTICA N 1
MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO
I. OBJETIVO
1. Conocer e identificar correctamente las partes pticas y mecnicas del microscopio

compuesto.
2. Familiarizar al alumno con el uso correcto, cuidado y conservacin del microscopio.
II. MATERIALES
Microscopios Pipeta Pasteur

Lminas portaobjetos Plumn indeleble
Laminillas cubreobjetos Papel lente
Lminas coloreadas Tela de felpa(25 cm)
Suero fisiolgico Fibra de pelo y lana
III. PARTES DEL MICROSCOPIO

Reconocer cada una de las siguientes partes del microscopio:
PARTE MECANICA
Tubo portalentes y cremallera Condensador

Tornillos macro y micromtrico Brazo y Pie
Revolver Charnela
Platina
PARTE OPTICA
Ocular Lentes de condensador

Objetivos Diafragma
Espejo
IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO
1. Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina.

2. Sistema de Iluminacin: comprende el foco, condensador y diafragma.
3. Sistema de Ajuste: comprende el macromtrico, micromtrico y cremallera
4. Sistema de Aumento: comprende el ocular generalmente de 10 x , 15 x, y los objetivos
de 4x, 10, 20x, 40, y 100x.
5
ESCUELA PROFESIONAL DE MEDICINA
ASIGNATURA: MICROBIOLOGIA MDICA
PRACTICA N 2
METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES. DIFERENCIALES

Y ESPECIALES.
INTRODUCCION
La mayor parte de los colorantes usados en Microbiologa son de tres tipos:

A) Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromforo) es el anin llamados colorantes
cidos Ej. Eosinato de sodio Eosina.
B) Aquellos cuyo cromforo es el catin llamados colorantes bsicos Ej. Cloruro azul de
metileno.
C) Los colorantes neutros, compuestos por bsicos y cidos Ej. Hematoxilina (bsico) Eosina
(cido).
En los trabajos bacteriolgicos generalmente se usan colorantes bsicos como el azul de
metileno, cristal de violeta, fucsina bsica, safranina, todos ellos pertenecen al grupo de los
colorantes derivados de la anilina.
Las coloraciones pueden ser segn el nmero de colorantes que utilizan:

A) Simples: cuando se utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul
de lactofenol
B) Diferenciales: cuando utilizan ms de un colorante como la coloracin de Gram, y Ziehl -
Neelsen.
C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten reconocer ciertas estructuras celulares
como la coloracin de Leishman, Vago, Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora) etc.
A. COLORACIONES SIMPLES
Son aquellas coloraciones que utilizan un solo colorante para visualizar la morfologa de los
microorganismos.
MATERIAL
Muestra con mezcla bacteriana

Lminas portaobjetos
Laminillas cubreobjeto
Asa bacteriolgica de Kolle en aro
Colorante Azul de metileno
Colorante Tinta China
7
Colorante Azul de lactofenol
Mechero de Bunsen
Varillas para coloracin
Aceite de cedro
Xylol
Papel lente
Microscopio de luz con objetivo de inmersin
COLORACIN AZUL DE METILENO:
1. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor

2. Cubrir el frotis con una gota del colorante y dejar actuar por 3 5 minutos
3. Lavar con agua y dejar secar
4. Observar al microscopio con objetivo de inmersin y aceite de cedro
RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso
COLORACIN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:
1. Colocar una gota de tinta china sobre la lmina portaobjetos

2. Agregar una gota de la mezcla bacteriana
3. Cubrir la preparacin con una laminilla cubreobjeto
4. Observar con lente de menor y mayor aumento.
RESULTADO: Observar la capsula en los microorganismos sin teir resaltan sobre un fondo
oscuro. Como la capsula de la levadura Cryptococcus
COLORACIN AZUL DE LACTOFENOL:
1 Colocar una gota del colorante sobre la lamina portaobjetos

2 Colocar una muestra de un cultivo de hongo sobre el colorante
3 Cubrir con una laminilla cubreobjeto
4 Observar con lente de menor y mayor aumento
RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul celeste
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje la morfologa de los microorganismos observados
8
B. COLORACIONES DIFERENCIALES
Son aquellas coloraciones que utilizan ms de un colorante y, generalmente el segundo colorante

es llamado colorante de contraste. Entre los ms usados tenemos la coloracin de Gram y la de
Ziehl Neelsen o tambin llamado cido- alcohol resistente
COLORACION DE GRAM
Es una coloracin diferencial que permite diferenciar a las bacterias en Gram positivas y Gram
negativas, segn la estructura y composicin de la pared celular. En las Gram negativas, el
peptidoglucano tiene una sola capa y las cadenas no estn entrelazadas; en las Gram positivas la
mayora presenta muchas capas de peptidoglucano.
Existen varias modificaciones del Gram, una de ellas es la de Kopeloff
MATERIAL

Muestra con mezcla de bacterias

Solucin fisiolgica al 0.85%

Lminas portaobjetos

Asa bacteriolgica de Kolle en aro

Set de colorante de Gram, modificado por Kopeloff:
Violeta de genciana o Cristal violeta (colorante primario)
Bicarbonato de sodio
Lugol (mordiente)
Alcohol- acetona (decolorante)
Fucsina bsica (colorante de contraste)

Mechero de Bunsen


Microscopio de luz con objetivo de inmersin

Aceite de cedro

Xylol

Papel lente
9
PROCEDIMIENTO
1. Dividir la lmina en 3 partes: 1/3 para rotular el N de muestra y 2/3 para la preparacin del
frotis.
2. Con el asa bacteriolgica previamente esterilizada, tomar la muestra y realizar un frotis en el
centro de la lmina portaobjeto, extendindola en espiral del centro a la periferia, para obtener
una preparacin en capa fina.
3. Fijar la muestra, mediante el secado del frotis a temperatura ambiente, o con la ayuda de la
llama dbil del mechero de Bunsen.
4. Colocar la lmina portaobjetos con la preparacin sobre la varilla de coloracin.
5. Cubrir el frotis con el colorante Violeta de Genciana, luego agregar 1- 2 gotas de la solucin
de bicarbonato de sodio, dejar actuar por 2 minutos.
6. Lavar con agua corriente (evitar la cada del chorro de agua directamente sobre el frotis)
7. Cubrir con Lugol durante 1- 2 minutos, lavar luego con agua.
8. Decolorar el frotis con una solucin de alcohol- acetona (inclinar la lmina y decolorar hasta
que no arrastre colorante) mximo por 10 segundos. Luego lavar con agua.
9. Cubrir con el colorante de contraste fucsina bsica durante 30 segundos. Luego lavar con agua.
10. Secar a temperatura ambiente o con ayuda de la llama dbil del mechero de Bunsen
11. Observar al microscopio con el objetivo de inmersin.
RESULTADOS
Las bacterias Gram positivas se colorean de violeta y las bacterias Gram negativas de color rosado.
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo realizado en prcticas.
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PRACTICA N 3
COLORACION DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN
INTRODUCCION
Coloracin diferencial que permite la tincin de microorganismos que poseen elevado contenido
de lpidos, como el gnero Mycobacterium (bacilo tuberculoso), llamados tambin cido-alcohol-
resistente. Al teirse los microorganismos con el colorante primario (fucsina bsica fenicada) que
es soluble en sustancias lipoides y aplicando el calor, el colorante es forzado a penetrar en la clula
y en esta forma resistir a la decoloracin.
MATERIAL

Lminas con frotices de bacilo tuberculoso

Set de coloracin Ziehl-Neelsen:
Fucsina fenicada al 5% (colorante primario)
Alcohol cido (alcohol etlico con 3% de HCl)
Azul de metileno (colorante de contraste)

Mechero de alcohol
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir con fucsina fenicada el frotis realizado en la lmina y calentar la preparacin con el
mechero de alcohol hasta apreciar el desprendimiento de vapores, repetir este procedimiento
por tres veces, evitando que hierva el colorante.
2. Lavar con agua corriente.
3. Decolorar con alcohol cido hasta que se aprecie una coloracin rosada.
4. Lavar con agua corriente
5. Cubrir con colorante de contraste: Azul de metileno por un minuto.
7. Secar y observar con lente de inmersin.
RESULTADO
Las bacterias cido alcohol resistentes se tien de color rojo y las no cido alcohol resistentes se
tien de color azul.
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la prctica.
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PRACTICA N 4
COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN Y VAGO
INTRODUCCION
Son coloraciones especiales que permiten colorear algunas bacterias que no tienen afinidad con
los colorantes de anilina como: las espiroquetas. As como tambin la coloracin de
microorganismos presentes en la sangre.
COLORACION DE LEISHMAN
Es una coloracin especial policromtica utilizada para demostrar la presencia y morfologa de

microorganismos en sangre y tejidos como: Bartonella, Hongos, Rickettsias.
MATERIALES

Frotis de sangre con Bartonella

Solucin de colorante Leishman

Agua destilada tamponada

Microscopio con lentes de 100X

Aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO
1. Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos.

2. Agregar agua destilada tamponada mezclando bien y esperar 15 minutos
3. Lavar con agua de cao y dejar secar
4. Observar con objetivo de inmersin
5. Anotar los resultados en el protocolo.
COLORACIN DE VAGO
Es utilizado para la coloracin de grmenes espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el

mtodo de Gram, ni por el Ziehl-Neelsen y que se colorean muy dbilmente con el Leishman.
12
MATERIALES

Lmina portaobjetos

Palito mondadientes

Set de coloracin de Vago:

Mercuro cromo al 2%
Violeta de genciana

Asa de siembra en aro

Microscopio con lentes de 100X

Aceite de inmersin
PROCEDIMIENTO
1. En una lamina colocar una gota de suero fisiolgico al o.85%
2. Con el palito mondadientes obtener una muestra de sarro dentario y realizar un frotis en capa
fina extendiendo en sentido espiral de adentro hacia fuera.
3. Fijar el frotis al calor suave
4. Cubrir con Mercuro cromo durante 3 minutos
6. Cubrir el frotis con Violeta de genciana por 3 minutos
8. Secar y observar al microscopio con objetivo de inmersin.
RESULTADOS
Coloracin Leishman: Los microorganismos se tien de color rosado oscuro
Coloracin de Vago: Observar Treponema phagadeni, espiroqueta que se encuentra formando
parte de la flora normal de la boca, en forma de espiral y de color violeta- rosado.
PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la prctica.
13
PRACTICA N 5
MEDIOS DE CULTIVO: SIMPLES, ENRIQUECIDOS, SELECTIVOS Y

DIFERENCIALES,
INTRODUCCION
Para el aislamiento de bacterias de un material patolgico, es necesario su cultivo en medios
especiales con una determinada concentracin de iones de hidrgeno, sales, compuestos
nitrogenados, hidratos de carbono, humedad y temperatura. Segn su utilizacin pueden ser:
simples, enriquecidos, selectivos y diferenciales.
MATERIALES
Goteros de vidrio

Probetas de 100 ml. Trpodes con malla de Asbesto
Balones de 250 ml. Tubos de 16x150 mm
Tiras de Papel indicador de Ph Tubos de 13x100 mm

Frasco con solucin NaOH (N/10) Placas Petri
Frasco con solucin HCl (N/10) Frascos estriles
Pinzas rectas Agua destilada
Bagetas de vidrio Tubo con sangre citratada
Caldo nutritivo Agar simple o Agar nutritivo

Extracto de carne 0.3 g Extracto de carne 0.3 g
Peptona 1.0 g Peptona 1.0 g
Dextrosa 0.5 g Dextrosa 0.5 g
Cloruro de sodio 0.5 g Cloruro de sodio 0.5 g
Agua destilada 100 Ml Agua destilada 100 ml
pH 7.0 - 7.4 Agar 1.5 g
pH 7.0 - 7.4
Caldo peptonado
Peptona 2.0 g
Cloruro de sodio 1.0 g

5.0 gr. de Agar Mac Conkey deshidratado.

6.0 gr. de Agar SS deshidratado.

6.5 gr. de Agar TSI.

2.2 gr. de Agar Citrato de Simmons

2.1 gr. de Agar Urea.

1.7 gr. de Caldo MR VP

3.3 gr. de Agar Lisina Hierro.
14
PREPARACION
I. MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES
1. Caldo nutritivo; primero disolver los ingredientes en los 100 ml de agua destilada y someter
al calor hasta su completa dilucin. Luego tomar el pH con el papel indicador. Si el medio es
cido agregar gota a gota la solucin de NaOH; si el medio es alcalino agregar gota a gota
solucin de HCl hasta lograr el pH indicado. Envasar y esterilizar al autoclave a 121C por 15
Minutos. Controlar la esterilidad incubando a 37C por 24 horas. Luego dejar en refrigeracin
hasta su utilizacin.
2. Agar nutritivo o simple; disolver primero el Agar en los 100 ml de agua destilada tibia, luego
agregar los dems ingredientes. Controlar el pH con ayuda de las soluciones de NaOH HCl.
Luego envasar y esterilizar a 121C por 15 Minutos y controlar la esterilidad por incubacin a
37C por 24 horas. Dejar luego en refrigeracin hasta su utilizacin.
II. MEDIOS ENRIQUECIDOS
1. Para el Agar Sangre; primero preparar Agar simple y esterilizar en autoclave, luego dejar
enfriar hasta una temperatura de 45C y adicionar 5ml de sangre citratada o desfibrinada.
Mezclar con movimientos rotatorios hasta obtener un buen homogenizado y distribuir en
Placas Petri estriles; dejar luego solidificar y realizar el control de esterilidad. Mantenerlo en
refrigeracin hasta su utilizacin. El color normal del medio debe ser rojo cereza.
2. Para el Agar chocolate; preparar primero Agar sangre y someterlo a una temperatura de 80C
hasta que se torne color chocolate, luego repartir en placas Petri estriles y realizar control de
esterilidad y dejarlo despus en refrigeracin.
III. MEDIOS SELECTIVOS
3. Para el Agar Mac Conkey; disolver el medio en los 100 ml de Agua destilada, calentar hasta
su completa disolucin. Autoclavar a 121 C por 15 Minutos y repartir en placas estriles.
4. Para el Agar SS; disolver el medio deshidratado en 100 ml. de Agua destilada, someter al calor
hasta su completa disolucin. Repartir luego en placas estriles. No necesita autoclavar.
IV. MEDIOS DIFERENCIALES
1. Para el Agar TSI (Hierro tres azcares); disolver el medio en 100 ml de Agua destilada, hervir
hasta su completa disolucin. Distribuir en tubos de 13x100mm y esterilizar en autoclave a
121 C por 15 Minutos. Luego de autoclavar colocar los tubos en plano inclinado. El medio al
final tendr un color rojo naranja.
2. Para el Agar Citrato Simmons, seguir los pasos para el Agar TSI, el medio tendr un color
verde.
3. Para el Agar Urea; disolver el medio en agua destilada, hervir hasta su completa disolucin y
autoclavar. Despus adicionar 5 ml de Solucin de Urea al 40% esterilizada por filtracin;
15
mezclar homogneamente y repartir en tubos de 13x100mm en plano inclinado. El medio
tendr un color amarillo.
4. Para el Caldo Peptonado; disolver los medios en agua destilada tibia, repartir en tubos de
13x100mm y autoclavar a 121 C por 15 Min.
5. Agar Lisina Hierro; disolver el medio en agua destilada por calor hasta su completa
disolucin y repartir en tubos de 13x100mm; luego autoclavar a 121 C por 15 min., y dejar
enfriar los tubos en plano inclinado.
PROTOCOLO
Realizar un cuadro indicando:
A. Los medios de cultivo preparados en cada mesa.
B. El color que presentan cada medio de cultivo preparado.
C. Materiales que usaron para la preparacin.
16
PRACTICA N 6
SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO.
INTRODUCCION
Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un

incremento marcado del nmero de clulas. Algunas especies alcanzan una poblacin mxima a
las 24 horas y otras necesitan un perodo ms prolongado para alcanzar su mximo desarrollo.
Los microorganismos que desarrollan en medios de cultivo en el laboratorio, se denominan
cultivos y el resultado de la multiplicacin bacteriana colonia, as como el procedimiento por el
cual se pone en contacto un microorganismo con un medio de cultivo, se llama siembra. Existen
varias tcnicas de siembra, siendo las ms usadas : La siembra por estra, por dispersin-
agotamiento, por inoculacin y por puntura.
Las principales caractersticas morfolgicas que presentan las colonias son:
FORMA : Circular, elptica, puntiforme y filamentosa.

ELEVACIN : Plana, convexa, acuminada, umbilicada.
BORDE : Entera, ondulada, dentada y filamentoso.
SUPERFICIE : Lisa, rugosa, granulada.
TAMAO : Dimetro en milmetros.
CONSISTENCIA : Cremosa, membranosa y mucoide.
CROMOGENESIS : Pigmentacin verde, amarilla, roja, etc.
MATERIALES

Tubos con suero fisiolgico estril Tubos con Agar Sabouraud

Tubos de 16x150 con Caldo nutritivo
Tubos de16x150 con medio hipertnico de
Tubos de 16x150 con Agar nutritivo Chapman

Placas con Agar nutritivo Torundas estriles

Placas con Agar Mac Conkey Asas de siembra en aro y punta

Placas con Agar hipertnico de Chapman
PROCEDIMIENTO
A) TIPOS DE SIEMBRA
Siembra por estra: Diseminar en forma de zigzag, una pequea cantidad de muestra bacteriana
sobre la superficie del medio de cultivo slido con la ayuda de un Asa de siembra en aro.
17
Siembra por dispersin-agotamiento: Sembrar la muestra bacteriana en zigzag, hasta la mitad de la
superficie del medio de cultivo slido que se encuentra en una placa Petri, girar sta unos 45 y
continuar sembrando en zigzag, hasta que se agote toda la muestra del Asa de siembra en aro.
Siembra por puntura: Sembrar la muestra bacteriana en un tubo con Agar semi-slido, con ayuda
del Asa de siembra en punta, introducindola en forma vertical hasta la mitad de Agar.
Siembra por inoculacin: Con ayuda de un Asa en aro, tomar una muestra bacteriana e
introducirlo hasta el fondo del tubo con medio lquido, procurando no tocar las paredes del tubo.
B) LECTURA:
Con la ayuda del profesor:

1. El alumno proceder a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en los medios de
cultivos sembrados.
2. Realizar un protocolo con los resultados obtenidos.
PROTOCOLO
METODOS DE SIEMBRA DESCRIPCION DE LA MEDIO DE CULTIVO

SIEMBRA USADO
ESTRIA
DISPERSION
AGOTAMIENTO
PUNTURA
INOCULACIN
CARACTERISTICA OBSERVACION DE MEDIO DE CULTIVO

DE LA COLONIA COLONIAS USADO
FORMA
ELEVACIN
BORDES
SUPERFICIE
TAMAO
CONSISTENCIA
CROMOGENESIS
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PRACTICA N 7
METABOLISMO BACTERIANO
INTRODUCCION
La identificacin bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinacin de las

caractersticas de las colonias y morfologa con tincin de Gram u otras coloraciones. Sin embargo,
la caracterizacin final de un aislamiento bacteriano desconocido, para identificarlo a nivel de
gnero y especie se lleva a cabo estudiando ciertos sistemas enzimticos que son nicos para cada
especie y sirvan como marcadores de identificacin.
En el laboratorio, estos sistemas enzimticos se detectan inoculando una pequea porcin de la

colonia bacteriana aislada en una serie de medios de cultivo que contienen substratos especficos
e indicadores qumicos que permiten detectar cambios del pH o la presencia de subproductos
especficos.
I. ACCION SOBRE LOS CARBOHIDRATOS
Por definicin, la fermentacin es un proceso metablico de oxido- reduccin que ocurre en un

medio ambiente anaerobio, y en lugar de oxgeno, un substrato orgnico sirve como el aceptor
final de hidrgeno (electrones). Este trmino de fermentacin se refiere a la utilizacin de hidratos
de carbono como la glucosa los cuales les servirn como fuente de energa y carbono.
Las bacterias se diferencian por los hidratos de carbono que utilizan, los tipos y cantidades de
cidos mixtos producidos, dando como resultado la acidificacin del medio, el cual es visible por
el cambio de color en el medio de cultivo de fermentacin (pH- indicador); la presencia de gas
(CO2 e H+) se manifiesta por la presencia de burbujas o rotura del medio slido.
A) REACCIONES DE OXIDACIN- FERMENTACIN DE AZUCARES:
EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)
EL medio TSI fue diseado para la diferenciacin de Bacilos Gram negativos, basndose en la
capacidad potencial de estas bacterias para fermentar carbohidratos y producir sulfuro de hidrgeno
(H2S).
El medio contiene tres azcares: glucosa, lactosa y sacarosa en proporciones de 1:10:10
respectivamente. Para detectar los productos cidos generados se emplea un indicador de pH que
es el rojo de fenol cuyo rango de viraje est entre pH 8.4 (rojo) y pH 6.8 (amarillo).
Los patrones de comportamiento de los bacilos Gram negativos ante los carbohidratos presentes
en este medio pueden ser fundamentalmente tres:
1. Fermentacin de glucosa nicamente.
2. Fermentacin de glucosa + lactosa, glucosa + sacarosa o glucosa + ambos carbohidratos.
3. No fermentacin de carbohidratos.
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Como producto de la fermentacin de los diferentes carbohidratos se puede formar gas, que se
detecta como pequeas burbujas o grietas en el medio o por desplazamiento del mismo hacia arriba
del tubo.
El medio tiene incorporado tiosulfato de sodio como fuente de azufre para generar H2S, y sales de
hierro que al reaccionar con el gas forman un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso (FeS).
MATERIAL
Tubo con medio TSI en plano inclinado.

Cepas control: E. coli, S. aureus, Ps. Aeruginosa
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra inocule una porcin pequea de la colonia en el centro del tubo y estre
la superficie del pico de flauta.
2. Rotular e incubar a 37C por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubacin indicada.

1. Producto de H2S: ennegrecimiento en el fondo del tubo.
2. Fermentacin de la glucosa nicamente: (rojo/amarillo), esto se debe a que la glucosa (que
se encuentra en baja concentracin con respecto a los otros azcares), ha sido utilizada y la
cantidad de cido producido no es suficiente para neutralizar los productos alcalinos generados
por la utilizacin de la peptona; adems los cidos pueden ser utilizados.
Estos procesos, que son oxidativos, ocurren en la superficie del medio, mientras que en el fondo,
por no estar en contacto con el oxgeno, slo hay fermentacin y el medio permanece cido.
3. Fermentacin doble o triple de carbohidratos:(Amarillo/amarillo).La fermentacin de la
glucosa y alguno (o ambos) de los otros dos azcares produce gran cantidad de cidos, por lo
que el tubo permanece amarillo.
4. No fermentacin de carbohidratos:(rojo/anaranjado). Se presenta nicamente utilizacin
oxidativa de peptonas, por lo que slo la superficie del tubo se alcaliniza.
5. Produccin de gas: Formacin de burbujas (CO2 e H+), grietas o desplazamiento del medio.
B) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL- METIL- CARBINOL (Acetoina)
1. PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM )

2.
La prueba de Rojo de metilo es una prueba cuantitativa que proporciona una caracterstica
valiosa para identificar especies bacterianas que producen cidos fuertes (lctico, actico,
frmico) a partir de glucosa.
Estas bacterias que primariamente siguen la va de fermentacin de cidos mixtos
frecuentemente producen suficiente cido despus de una incubacin prolongada, como para
mantener un pH por debajo de 4.4 (el punto cido lmite del indicador rojo de metilo),
superando el sistema amortiguador del pH del medio.
20
3. PRUEBA DE VOGES PROSKAUER ( VP )
El cido pirvico, un compuesto fundamental formado en la degradacin fermentativa de la

glucosa, es metabolizado por algunos microorgansmos produciendo el acetil- metil-
carbinol(Acetoina)un subproducto neutro de la va 2,3- butilenglicol.
La prueba se basa en la conversin del acetil- metil- carbinol en diacetil a travs de la accin
del KOH y Oxgeno atmosfrico. El diacetilo es convertido en un complejo rojo bajo la accin
cataltica del Alfa naftol y Creatinina.
MATERIALES
Cepa bacteriana MR positivo y negativo

Cepa bacteriana VP positivo y negativo

Reactivo Rojo de metilo

Reactivo de Voges- Proskauer(Alfa naftol al 5% y KOH al 40%)

Cepas bacterianas E. coli y Klebsiella
PROCEDIMIENTO
1. Por la tcnica de inoculacin, sembrar independientemente la cepa control MR positivo y

negativo, en el medio MR- VP. Rotular los tubos e incubar durante 48- 72 horas a 37C.
2. Proceder del mismo modo con las cepas VP controles, incubar por 18- 24 horas.
INTERPRETACION
1. Para la prueba Rojo de Metilo, aadir al cultivo unas gotas del reactivo del mismo nombre,
cuyo rango de viraje est entre pH 4.4(rojo) y 6.0 (amarillo). La prueba positiva se
manifiesta de color rojo estable y la negativa de color amarillo- naranja.
2. Para la prueba de Voges- Proskauer, agregar al cultivo 0.6 ml(12 gotas) de Alfa naftol y
0.2 ml (4 gotas) de KOH. Agitar el tubo por 1 minuto y dejarlo en reposo durante 15
minutos. Es importante aadir los reactivos en el orden especfico.
Una prueba positiva, color rojo localizado en la mitad superior o en todo el tubo es observada
dentro de los primeros 15 minutos. Si la lectura se realiza despus de una hora los cultivos
pueden presentar un color cobrizo, siendo esta una interpretacin falsa positiva.
En la prueba negativa no cambia el color inicial del medio de cultivo.
II. ACCION SOBRE LAS PROTEINAS
PRODUCCION DEL INDOL
Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa son capaces de actuar sobre el aminocido
triptofano, produciendo indol, un benzil pirrol, cido pirvico y amoniaco(NH3). El indol
puede detectarse en un medio rico en triptofano, observando la aparicin de un color
rojo(en forma de anillo o impregnado en la tira de papel), luego de agregar una solucin
que contiene p- dimetilaminobenzaldehido.
21
MATERIALES

Cepa indol positivo y negativo.

Medio lquido peptonado y/o Medio SIM

Reactivo de Kovac(alcohol amilico + HCL concentrado + p- dimetilamino benzaldehido).

Cepas bacterianas E. coli, Salmonella.
PROCEDIMIENTO
La aparicin de un color rojo fucsia brillante en la interfase del reactivo y el caldo, pocos
segundos despus de haber agregado el reactivo es indicativo de la presencia de indol y
constituye una prueba positiva. Las bacterias que ha pesar de desarrollar en el medio, pero
que no producen indol, al agregar el reactivo, este aparecer sin cambio alguno, siendo esta
una prueba negativa.
III. UTILIZACION DEL CITRATO COMO UNICA FUENTE DE CARBONO
Esta prueba se utiliza principalmente para identificar varias especies de la familia

Enterobacteriaceae, las cuales pueden obtener energa por va distinta de la fermentacin
de los carbohidratos, utilizando el citrato de sodio como nica fuente de carbono para su
metabolismo y desarrollo, por lo tanto,cualquier medio que se emplee para determinar esta
caracterstica no debe contener protenas ni carbohidratos.
El citrato de sodio es una sal del cido ctrico, compuesto orgnico simple que constituye
uno de los metabolitos del ciclo de Krebs.
PRINCIPIO
La utilizacin del citrato por una bacteria se detecta por su crecimiento en un medio con
citrato con formacin de subproductos alcalinos. El medio (Citrato de Simmons)incluye
citrato de sodio, un anin como nica fuente de carbono y fosfato de amonio como nica
fuente de nitrgeno.
Las bacterias que pueden utilizar citrato tambin pueden extraer nitrgeno de la sal de amonio,
con produccin de amonio(NH3), alcalinizando el medio por conversin del NH3 en hidrxido
de amonio(NH4OH), detectndolo con el indicador de pH incorporado el azul de bromotimol
cuyo rango de viraje esta entre pH 6.9(verde) y pH 7.8(azul).
MATERIALES

Cepa control citrato positivo y negativo.

Medio de Citrato de Simmons en plano inclinado
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa de siembra bien esterilizada, sembrar por la tcnivca de estra en cada tubo
la cepa citarto positiva y negativa.
2. Rotular los tubos e incubar a 37C por 18- 24 horas.
22
INTERPRETACION
Prueba positiva:Color azul en 24 a 48 horas y crecimiento en la superficie del medio

inclinado.
Prueba negativa: No hay cambio de color ni crecimiento.
IV. HIDRLISIS DE LA UREA (PRUEBA DE LA UREASA)
Prueba importante para la identificacin de especies bacterianas que poseen la enzima

ureasa que hidroliza la urea, segn el siguiente esquema:
O

NH2- C- NH2 + 2HOH ------------------- CO2 + H2O + 2 NH (NH4)2 CO3
Ureasa
El amoniaco reacciona en la solucin para dar carbonato de amonio, producindose una

alcalinizacin y un aumento del pH del medio que lleva como indicador el rojo neutro.
MATERIALES

Cepa patrn ureasa positiva y negativa ( E. coli, Proteus )

Medio Agar urea segn Christensen
PROCEDIMIENTO
1. Por medio de la siembra por estra, sembrar la cepa positiva y negativa. No inocular en
el fondo.
2. Incubar durante 18- 24 horas a 37C
INTERPRETACION
Prueba positiva: se observa de color rosado en la superficie o en todo el

medio. Prueba negativa: El medio permanece del color original
V. PRUEBA DE LA CATALASA
La catalasa es una enzima que poseen la mayora de las bacterias aerobias y facultativas
anaerobias.
El perxido de hidrgeno (H2O2) es uno de los productos finales del metabolismo
oxidativo de los carbohidratos y s se acumula es letal para el microorganismo.
La catalasa convierte el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno de acuerdo a la siguiente
reaccin:
2 H2O2 --------> 2 H2O + O2
La prueba es de vital importancia en la diferenciacin de los estreptococos (catalasa

negativa) de los estafilococos (catalasa positiva).
23
MATERIALES

Cepas Control: S. aureus, Streptococcus Enterococcus

Solucin de Perxido de hidrgeno (H2O2) al 3%

Medio de cultivo: cualquier medio slido, no inhibitorio, y sin sangre ya que los eritrocitos
poseen actividad de catalasa, por lo que su presencia puede dar resultados falsos positivos.
PRUEBA EN LMINA
a) Con el asa bacteriolgica en punta o un aplicador estril, picar el centro de una colonia
bien aislada y transferir l inoculo a un portaobjetos limpio.
b) Aadir 1 a 2 gotas de H2O2 al 3%
c) Observar si se forman burbujas o no inmediatamente despus que se aade el reactivo.
d) Descartar la lmina en un recipiente con desinfectante.
PRECAUCIONES
1. El orden de la prueba en lmina no debe invertirse cuando se use asa de platino, ya que
puede resultar falso positivo. El alambre de nichrone no interfiere en el resultado de la
prueba.
2. La prueba debe realizarse en cultivos de 18- 24 horas; cultivos ms viejos pueden
perder su actividad de catalasa dando una reaccin falsa negativa.
3. El H2O2 es extremadamente acstico, por lo que se debe evitar que toque la piel, en
caso que ocurra inundar el rea afectada con alcohol de 70% para neutralizar la accin.
NO DEBE USARSE AGUA.
INTERPRETACION
Prueba cualitativa: La aparicin rpida y prolongada de burbujas, de gas o efervescencia

son indicativas de catalasa positiva. Algunas bacterias poseen enzimas diferentes a la
catalasa que descomponen el H2O2, dando pocas burbujas diminutas durante 20- 30, stas
no son catalasa positivas.
VI. PRUEBA DE LA CITOCROMO OXIDASA
Los citocromos son hemoprotenas que contienen hierro y actan como el ltimo eslabn
de la cadena respiratoria aerobia, transfiriendo electrones (H) al oxgeno con formacin de
agua. El sistema citocromo se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios
facultativos, permitiendo identificar a organismos que carecen de la enzima o son
anaerobios estrictos.
En el laboratorio se hace reaccionar la bacteria con un sustrato oxidable como el dimetil
o tetrametil- p- fenilendiamina ( el cual se presenta en solucin, discos o tiras llamados
comnmente oxidasa).
MATERIAL
Cepa control: sembrada en Agar nutritivo
Reactivo de oxidasa
24
PROCEDIMIENTO
1. Directo: Se aaden a las placas sobre la bacteria dos o tres gotas del reactivo.
2. Indirecto: Se toma con el asa un poco de la colonia bacteriana y se extiende sobre los
discos o tiras de papel que tienen ya el reactivo de oxidasa
INTERPRETACIN
Las colonias bacterianas con actividad Citocromo oxidasa desarrollan inmediatamente un
intenso color azul oscuro.
AGAR LIA (Agar Lisina Hierro)
Principio: Determina la capacidad de un microorganismo para utilizar el aminocido Lisina

descarboxilndolo o desaminndolo, la fermentacin de la glucosa, la produccin o no de
gases (CO2), junto con la produccin o no de cido sulfhdrico (H2S).
Lectura: Se efecta despus de 18 a 24 horas de incubacin. Se lee la reaccin producida en la

superficie (parte aerobia) y en la profundidad (parte anaerobia) del medio. El indicador de pH
del medio es purpura de bromocresol, el cual en acidez vira al color amarillo y en alcalinidad
al color purpura. Por contener una pequea cantidad de glucosa (1g/L) al ser fermentada el
fondo del tubo es amarillo y la superficie alcalina
Interpretacin: en este medio se leen las siguientes reacciones bioqumicas:

a) Fermentacin de la glucosa: la bacteria no utiliza el aminocido slo fermenta la
glucosa: superficie purpura/fondo amarillo.
b) Descarboxilacin de la lisina: Positivo (purpura todo el medio), Negativo (superficie
violeta/fondo amarillo).
c) Desaminacin de la lisina: superficie roja/fondo amarillo.
d) Produccin de gas: ruptura del medio.
e) Produccin de H2S: ennegrecimiento del medio.
VII. PRUEBA DE LA HEMOLISINA
Algunos microorganismos son capaces de producir una serie de enzimas y sustancias

txicas que pueden ser detectadas al sembrar el microorganismo en una placa de Agar
sangre, produciendo la lisis de los eritrocitos, segn el tipo de lisis que producen pueden
clasificarse en tipo Alfa, Beta y Gamma.
MATERIALES
Cepa bacteriana
Placas con Agar sangre de carnero
PROCEDIMIENTO
1. Con el asa en aro sembrar la cepa bacteriana en la placa de Agar sangre
2. Incubar por 18 24 horas a 37 C
25
INTERPRETACIN
Hemlisis tipo Alfa: Es un tipo de hemlisis incompleta, hay un enverdecimiento del
medio debido a la salida de un derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a
compuestos del tipo de la biliverdina
Hemlisis tipo Beta: Hay una lisis completa de los eritrocitos observndose una zona clara
alrededor de la colonia
VIII. PROTOCOLO
PRUEBAS MEDIO DE REACTIVO Y /O LECTURA

BIOQUMICAS CULTIVO INDICADOR
TSI
(Fermentacin-
H2S)
VP
VOGES-
PROSKAUER
MR
ROJO DE
METILO
INDOL 0
CITRATO
CATALASA
UREASA
CITOCROMO
OXIDASA
LIA
(Agar Lisina
Hierro)
HEMOLISINA
26
PRACTICA N 8
PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A LOS ANTIBIOTICOS (ANTIBIOGRAMA)
INTRODUCCION
Es una prueba de laboratorio clnico que se utiliza para medir la actividad antibacteriana de los
antibiticos y quimioterapeticos empleados en el tratamiento de las enfermedades infecciosas.
La medida de la actividad antibacteriana puede realizarse por los siguientes mtodos:

Mtodo de dilucin

Mtodo de Difusin en Agar
OBJETIVOS
1. Realizar la tcnica de difusin en Agar simple para determinar la susceptibilidad a los
antibiticos.
2. Interpretar los resultados del mtodo utilizado.
3. Precisar las indicaciones y limitaciones de la tcnica empleada.
DILUCION EN TUBO
Permite estimar cuantitativamente la susceptibilidad de un antibitico, midiendo la concentracin

inhibitoria mnima (CIM), es decir, la concentracin ms baja que inhibe el crecimiento in vitro
bacteriano.
Consiste en la preparacin de una serie de diluciones del antibitico estudiado en caldo o en medio
agar al cual se inocula luego una suspensin del germen. Luego de una incubacin por 24 horas,
se puede observar la CIM como la dilucin ms alta en la que no existe crecimiento macroscpico
bacteriano. Esta tcnica es costosa por la cantidad de material que se utiliza.
DIFUSION EN AGAR (Segn Kirby- Bauer y col.)
Es un mtodo simple de rutina en Microbiologa mdica, para seleccionar el antibitico o

quimioterpicos ms adecuado en la terapia de las enfermedades infecciosas. Consiste en sembrar
la muestra en estudio sobre toda la superficie de una placa de Agar y colocar luego discos de papel
filtro que contienen los antibiticos y que despus de una incubacin de 24 horas, se observan las
zonas de inhibicin alrededor de cada disco de antibitico. La cantidad de antibitico presente en
el disco difiere para los distintos frmacos.
MATERIALES

Placas de Agar Mller Hilton o Tripticase soya

Tubos con caldo nutritivo

Tubos con Agar semislido

Tubos con cultivo bacteriano

Asas de siembra
27

Torundas estriles

Discos impregnados con diferentes antibiticos o quimioterpicos (sensi- disck).

Pinzas

Mecheros
PROCEDIMIENTO
1. Sumergir la torunda en el caldo bacteriano, escurrir en las paredes del tubo y sembrar
uniformemente sobre la superficie de la placa de Agar.
2. Dejar reposar por 5 minutos a temperatura ambiente.
3. Con la pinza en condiciones estriles, colocar los discos impregnados con los diferentes
antimicrobianos sobre la superficie del Agar. La distancia entre los discos debe ser de 20mm.
4. Incubar a 37C durante 24 horas.
LECTURA
a) Medir en milmetros el dimetro de las zonas de inhibicin del desarrollo bacteriano alrededor
de los discos, incluyendo el dimetro del disco.
b) Comparar con la tabla el dimetro de las zonas de inhibicin obtenidas y determinar si el
microorganismo es Resistente (R), intermedio (I), o sensible (S) a los diferentes
antimicrobianos utilizados.
Un resultado intermedio (I) indica que el aislado es menos susceptible de lo normal, pero puede
responder a dosis altas del antibitico.
La cantidad de antibitico presente en el disco depende de la concentracin y de su capacidad
de difusin en el Agar.
c) Anotar e interpretar los resultados.
Antimicrobiano Cdigo Resistente Sensible Antimicrobiano Cdigo Resistente Sensible

Gram negativo Gram positivo
Amikacina AK-MK 14 17 Ac.nalidixico NA 21 16
Amoxicilina +
clavulanico AM 13 18 Cefepima FEP 14 18
Ampicilina AMP 13 17 Ciprofloxacin CIP 15 21
Cefalotina CFM 14 18 Clindamicina CM-DA 14 17
Cefotaxima CTX 14 23 Cloranfeicol C 12 18
Ceftazidima CAZ 14 20 Eritromicina E 13 18
Ceftriaxona CRO 13 17 Gentamicina GM-GE 12 15
Cefuroxina RBA 14 18 Nitrofurantoina FD 14 17
Ciprofloxacin CIP 15 21 Norfloxacin NOR 12 17
Cloranfenicol C 12 18 Oxacilina AO 10 13
Gentamicina GM-GE 12 15 Penicilina P 19 20
Sulfazotrim SUT 12 18 Rifampicina RIF 16 20
Tetraciclina T 14 19 Sulfazotrim SUT 12 18
Tobramicina NN 12 15 Tetraciclina T 14 19
Vancomicina V 9 12
PROTOCOLO
Desarrollar y esquematizar un cuadro indicando los resultados que se han obtenido en la prctica
desarrollada.
28
PRACTICA N 9
REACCION ANTIGENO ANTICUERPO: AGLUTINACIN
La aglutinacin es un fenmeno inmunolgico producto de una reaccin antgeno-anticuerpo en

el que uno de los reactantes es de naturaleza particulada, de tamao grande. Estas partculas pueden
ser bacterias, eritrocitos, partculas de ltex, bentonita, etc., y se encuentran recubiertas en forma
natural o artificial por antgenos o anticuerpos. Al ser suspendidas en un medio salino y mezclarse
con antisueros o antgenos especficos, formaran los respectivos complejos Ag-Ac observables a
simple vista o con lentes de poco aumento.
AGLUTINACION BACTERIANA
Existen muchos mtodos comnmente empleados para demostrar la aglutinacin bacteriana, uno
de los ms simples es la aglutinacin en lmina o prueba de Widal, que consiste en la mezcla del
antgeno con el suero del paciente en una lmina. Esta tcnica ofrece un mtodo de muestreo rpido
para anlisis de rutina.
MATERIALES

Lmina para aglutinacin ( lminas excavadas)

Antgeno bacteriano

Suero de paciente

Pipetas serolgicas de 0.2 ml

Palitos mondadientes
PROCEDIMIENTO
1. Con la pipeta colocar una gota del suero problema, en cada uno de los pocitos de una lmina
de vidrio excavada.
2. Agregar una gota de cada uno de los antgenos a cada gota de suero de un mismo paciente.
3. Mezclar uniformemente con ayuda de un mondadientes distinto para cada gota.
4. Hacer rotar suavemente la lmina por espacio de 2 a 3 minutos.
RESULTADO
La aglutinacin se observa por la aparicin de grumos de tamao variable que tienden a

agruparse en la periferia de la gota. Anotar los resultados en su protocolo.
PROTOCOLO:
Realizar una aglutinacin cualitativa y una cuantitativa
29
Aglutinacin cuantitativa
TUBOS
REACTIVOS
1 2 3 4 5
ANTISUERO 0.08 0.04 0.02 0.01 0.005
ANTIGENO AGREGAR UNA GOTA A CADA TUBO
TITULO 1/20 1/40 1/80 1/160 1/320
RESULTADO:
Ttulo del suero: .
Esquematizar o dibujar las reacciones realizadas en prctica
30
PRACTICA N 10
FAGOCITOSIS
La lnea celular de defensa est ntimamente asociada con la lnea humoral. La fagocitosis o el
englobamiento de partculas extraas por ciertas clulas es un fenmeno no especfico, pero se
incrementa cuando intervienen anticuerpos especficos o complementos. Entre las clulas
fagocticas se encuentran los polimorfonucleares y los macrfagos (monocitos libres). A estas
sustancias que demuestran habilidad para hacer a los antgenos ms susceptibles a la fagocitosis
se les llama OPSONINAS.
FAGOCITOSIS IN VITRO
Las pruebas OPSONOCITOFAGICAS son difciles de realizar, en comparacin con otras
pruebas serolgicas, pero en ciertos sistemas es la nica a ser utilizada. El antgeno y la sangre
total (conteniendo los anticuerpos, complemento y leucocitos) se incuban juntos y luego, muestras
de estas mezclan se colorean.
El ndice fagoctico es el nmero promedio de partculas ingeridas por cada 100 Neutrfilos de la
sangre.
MATERIAL

Cultivo en caldo de Staphylococcus y/o Colorante Wright

Klebsiella Agua tamponada

Bao Mara a 37C
de 13x100 con 0.5 ml de EDTA sdica al
Tubos
Centrfuga

1%

Una jeringa de 5 ml con aguja N 20 Gradilla

Pipetas Pasteur con perilla de jebe Microscopio con objetivo de inmersin

Lminas portaobjetos Aceite de cedro
PROCEDIMIENTO
1. Con la jeringa hipodrmica recolectar 5 ml de sangre venosa.

2. Colocar en cada tubo con EDTA, 5 ml de sangre y mezclar suavemente.
3. Agregar 0.5 ml de cultivo bacteriano a cada tubo respectivamente.
4. Llevar los tubos a Bao Mara por 30 minutos, mezclando suavemente cada 10 minutos.
5. Centrifugar a 3000 r.p.m. por 5 minutos, cada tubo.
6. Recolectar con una pipeta Pasteur los elementos formes de la capa de glbulos blancos de cada
tubo.
7. Realizar los frotices y colorear con Wright:
Cubrir el frotis con colorante Wright por espacio de 3 minutos.

Aadir agua tamponada y soplar suavemente realizando una buena mezcla.

Despus de 15 minutos, lavar con agua de cao.

Secar y observar con objetivo de inmersin.
RESULTADO
Se observar la presencia de grmenes intracelulares que han sido fagocitados.
31
PRACTICA N 11
REACCION DE PRECIPITACION
INTRODUCCION
Es una reaccin antgeno- anticuerpo, en el que el antgeno es de naturaleza soluble. Cuando se
mezcla un antgeno soluble con su anticuerpo correspondiente se forma un precipitado en la zona
de equivalencia y visibles por lo general macroscpicamente. Las reacciones de precipitacin
pueden realizarse en un gel como el Agar.
INMUNODIFUSION SIMPLE
Llamada tcnica de Mancini, se utiliza para determinar la concentracin de Inmunoglobulinas en
el suero humano. En el que, un anticuerpo conocido se incorpora a un medio de Agar noble y se
deja gelificar; luego se realizan perforaciones en el Agar donde se coloca el antgeno,
procedindose luego a incubar, luego de lo cual, se realiza la lectura observndose la formacin
de un halo circular de precipitacin cuyo dimetro es proporcional a la concentracin antignica.
INMUNODIFUSION DOBLE
Llamada tambin mtodo de Ouchterloni, es til para comparar antgenos, detectar anticuerpos
precipitantes, anticuerpos antinucleares y antgenos en enfermedades. En esta prueba se emplea
Agar semi-slido en portaobjetos, en el cual se efectan perforaciones, los cuales se llenan con los
elementos reaccionantes (antgeno- anticuerpo) y luego de 12 a 24 horas de incubacin a
temperatura ambiente, observamos la aparicin de bandas de precipitacin.
MATERIALES
Suero positive Placas Petri

Antgeno Pipetas capilares
Lminas de vidrio con Agar noble al 1% Lminas preparadas y coloreadas

PROCEDIMIENTO
1. Con una pipeta capilar, colocar el suero (contiene los anticuerpos) en el orificio central.
2. Depositar en los orificios perifricos los antgenos a estudiar.
3. Colocar las lminas en una cmara hmeda.
RESULTADO
Observar las bandas de precipitacin que se forman:

Identidad total : Las bandas de precipitacin se unen.
Identidad parcial : Se observa un espoln.
No identidad : Las bandas se cruzan.
32
INMUNOELECTROFORESIS
Es til para la separacin de las protenas en un campo elctrico, permitiendo medir e identificar
componentes sricos: IgA, IgM, IgG, IgD e IgE, cadenas livianas y componentes monoclonales.
Resulta de la combinacin de la electroforesis con la inmunodifusin. En una primera fase los
antgenos son colocados en las perforaciones realizadas en el Agar y separados de acuerdo a su
movilidad en un campo elctrico, luego de una corrida electrofortica, se coloca el antisuero en una
especie de surco longitudinal que se abre en el Agar frente a las protenas que han migrado. Luego de
incubar, se forman bandas de precipitacin frente a las Inmunoglobulinas reaccionantes.
PRACTICA N 12: PRUEBAS INMUNOENZIMATICAS: ELISA
INTRODUCCION
En los ltimos aos se han desarrollado numerosos mtodos para la deteccin de antgenos virales
como de anticuerpos especficos (Ig. M, Ig. G o Ig. Totales).
Se trata de procedimientos de alta sensibilidad, mucho mayor que la prueba de Hemaglutinacin
o la prueba de Fijacin de Complemento y similar a la prueba de Radioinmunoensayo (RIA).
Esta prueba se usa para medir la cantidad de anticuerpo presente en una muestra determinada
utilizando colorantes fluorescentes o enzimas con sustratos cromognicos, las que producen una
reaccin de color. Estas pruebas se conocen como Anlisis de Inmunoabsorbencia Ligada a
Enzimas (enzime- linked immunosorbent assay) ELISA.
La ventaja de ELISA con respecto a la prueba de Inmunofluorescencia consiste en que no es

necesario un observador experimentado y en que es posible procesar un gran nmero de muestras
simultneamente en forma rpida y automatizada.
PROCEDIMIENTO
Determinacin de Anticuerpo en fase slida
anticuerpo especfico antiviral o anticuerpo de captura.

Sensibilizar una placa de poliestireno, tubo perla, esto consiste en absorber la superficie de la placa con el

Luego se aade la muestra clnica, si esta contiene antgeno viral se unir al anticuerpo de captura
peroxidasa, fosfatasa alcalina biotina- aviclina.

Esta unin se detectar mediante otro anticuerpo marcado con una enzima. Las enzimas ms usadas son la

Luego, lavar cuidadosamente para eliminar el anticuerpo marcado no combinado con el antgeno.

Aadir el sustrato de la enzima.

Observar la presencia de color.
LECTURA

El desarrollo de color puede observarse visualmente o de preferencia con un colormetro o un espectrofotmetro.

A mayor cantidad de antgeno presente en la muestra, ms intenso ser el color observado.
33
ESQUEMA DE LA PRUEBA DE ELISA
(Ensayo Inmunoenzimtico para la deteccin de Anticuerpos contra los virus de Inmunodeficiencia
humana HIV-1 grupo O y HIV-2)
SUSTRATO A
20 ul.
Cromognico
(Ag-Ac color
PLACAS CON SUEROS CONJUGADO celeste) SOLUCION
GLICO-PROTEINA + OBTENIDOS + (Peroxidasa con Ig + SUSTRATO B + DE

G Antihumana) 5ul
DEL VHI DE PACIENTE C/ pozo Buffer Perxido PARADA
Hidrogeno 100
ul
CONTROL + INCUBAR INCUBAR

30 min a 30 min
37 a 37
CONTROL +
Absorber
CONTROL -
LAVAR LAVAR
twin twin
salino salino
CONTROL - 1/10 1/10
(5 veces)
CONTROL -
PACIENTE
PACIENTE
SECAR SECAR
PACIENTE la placa la placa
(tomado de Wiener lab.)
34
MICROBIOLOGIA MDICA
PRACTICA N 13
PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS
INTRODUCCION
Antgeno es toda sustancia que introducida parenteralmente en el hombre o en los animales, induce
la formacin de anticuerpos o la aparicin de fenmenos de hipersensibilidad. "In vitro" y en
presencia de factores accesorios, pueden reaccionar con el anticuerpo especfico, dando lugar a
fenmenos perceptibles.
Los Antgenos ms comunes en Medicina son: las bacterias, virus, toxinas, esporas de hongos,
hemates, suero, etc.
Se aplican en las inmunizaciones y consisten en inocular un antgeno en dosis adecuadas y
generalmente progresivas con las siguientes finalidades.
1. Inducir en el hombre o en los animales, la formacin de anticuerpos que los protejan contra
determinados procesos infecciosos. Este mtodo conocido como vacunacin confiere
inmunidad adquirida activa.
2. Obtener antisueros, o sea sueros que contengan anticuerpos, los cuales sern empleados en:
a) Seroterapia, para el tratamiento de diferentes enfermedades, como la difteria, ttanos, etc.,
en las cuales se administran anticuerpos pre- formados confiriendo al paciente una
inmunidad adquirida pasiva.
B) La tipificacin de especies bacterianas, lo que ha dado lugar a verdaderos esquemas de
clasificacin, como el de Kauffmann-White para las Salmonellas, el de Ewing para las
Shigellas y el de Kauffmann-Knipschildt- Vahlne para Escherichia coli.
I. PREPARACION DE ANTIGENOS BACTERIANOS SOMATICOS Y

FLAGELARES A PARTIR DE CULTIVOS EN MEDIO SOLIDO.
A. MATERIAL

Cultivo bacteriano en medio slido y en desarrollo confluente

Cultivo bacteriano en medio lquido (caldo nutritivo)

Pipetas graduadas estriles de 5 cc.

Suero fisiolgico estril, repartido en frascos de 100 cc.

Embudos y gasa, estriles para filtrar

Acido fnico concentrado en tubos de 13x100 ml.

Formol concentrado, en tubos de 13x100 ml.

Pipetas de Pasteur, estriles

Escala de MacFarland (tubo N 3)

Pipetas graduadas de 1 ml.

Tubos vacos estriles de 16x150 ml.
35

Algodn y Alcohol yodado

Agar nutritivo en placas y tubos
B. PROCEDIMIENTO
1. Con una pipeta graduada, agregar 2 cc. de suero fisiolgico estril a los cultivos
bacterianos presentados en medio slido
2. Recoger por lavado todo el desarrollo bacteriano, tratando de no arrastrar Agar
3. Filtrar a travs de gasa estril
4. Separar la suspensin en cantidades iguales en dos tubos de 13x100
5. Para preparar el Antgeno somtico "O", medir la cantidad de suspensin bacteriana
de uno de los tubos y agregar fenol en volumen necesario para alcanzar una
concentracin de 0.5%.
Se puede as mismo inactivar las fracciones flagelares, sometiendo el antgeno a la
ebullicin durante dos horas, o tratndolo con alcohol absoluto.
6. Para preparar el Antgeno flagelar "H", inactivar las fracciones somticas en el otro
tubo de suspensin bacteriana, agregando formol puro hasta alcanzar una
concentracin del 0.5%
7. Ambas suspensiones para poder ser inoculadas, se llevaran a una densidad de 9x108
grmenes por cc. para lo cual se agregan con pipeta Pasteur a un tubo con 10 cc. de
suero fisiolgico, gotas de cada uno de los antgenos concentrados hasta alcanzar una
turbidez similar al tubo N3 de la Escala de MacFarland.
Este es un Mtodo turbidimtrico de clculo bacteriano, que consiste en diluir el antgeno

y apreciar la turbidez obtenida comparndola con la de los tubos patrones de un nefelmetro
o determinndola con exactitud mediante un Espectrofotmetro.
El Nefelmetro ms conocido es el de MacFarland, que se obtiene de la siguiente manera:

Preparar una solucin de Cloruro de Bario al 1%
Otra de cido sulfrico al 1%.
Colocar una serie de 10 tubos vacos y estriles
Agregar las soluciones, de acuerdo al siguiente cuadro:
TUBO N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Cl2Ba 1% 0.1 cc. 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0
H2SO4 1% 9.9 cc. 9.8 9.7 9.6 9.5 9.4 9.3 9.2 9.1 9.0
Bacterias 3.0 x 6.0 x 9.0 x 1.2 x 1.5 x 1.8 x 2.7 3.0

108 108 108 109 2.1 x 2.4 x x
10 9 10 9 x
por cc. 10 9 10 9
109 109
36
La unin de ambos reactivos qumicos forma un precipitado blanco de Sulfato de bario que al
homogenizarse da una turbidez que es ms intensa cuanto mayor es la cantidad de Cloruro de bario
empleado. A cada tubo corresponde una concentracin de grmenes determinada, de acuerdo a lo
sealado en el cuadro.
C. CONTROL DE ESTERILIDAD
Sembrar cada uno de los antgenos preparados, en caldo nutritivo y/o Agar sangre, con
la finalidad de controlar su esterilidad
Realizar la observacin a las 18 24 horas, no debe haber crecimiento bacteriano.
Resultado: Realizar un protocolo del trabajo realizado en la prctica.
D. INOCULACION
1. Inocular en la vena marginal de la oreja del conejo dosis de 0.25 cc., 0.5cc., 0.75cc., 1.0cc.,
1.5cc., 2.0cc., 2.5cc., hasta 3.0cc., del antgeno, con intervalo de 4 a 5 das.
2. Realizar la sangra despus de 4 das de la ltima inyeccin.
E. DESARROLLAR UN PROTOCOLO DE INOCULACIN (DEMOSTRACION)
37
PRACTICA N 14
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM

POSITIVOS: GENERO STAPHYLOCOCCUS
INTRODUCCION
Los Estafilococos pertenecen a la Familia Micrococcaceae y son organismos redondos u ovales,

agrupados generalmente en forma de racimos, inmviles, no esporulados, y Grampositivos en los
cultivos jvenes. Son habitantes naturales de la flora nasal, boca, piel e intestinos, pero como
patgeno es causante de diversos procesos infecciosos que van desde fornculos, abscesos,
intoxicaciones alimentarias hasta septicemias mortales. De las tres especies conocidas S. aureus,
S. epidermidis y S. saprophyticus, slo dos tienen importancia mdica. Slo la especie patgena
S. aureus produce una enzima llamada coagulasa.
MATERIALES

Placas Petri con Agar hipertnico de Chapman (MH) o Manitol salado

Placas Petri con Agar sangre (AS)

Tubos con Caldo plasma

Lminas portaobjetos

Set de colorantes para Gram

Asa de platino en aro

Reactivo Catalasa
PROCEDIMIENTO:
1. Estudiar la bacteria sembrada en las placas con Agar hipertnico de Chapman y Agar sangre,
por el mtodo de dispersin-agotamiento y con 24- 48 horas de incubacin a 37C
2. Realizar un frotis de las placas sembradas y colorearlas con Gram.
3. Observar placas sembradas con las diferentes especies de Staphylocococcus, estudiando las
caractersticas de las colonias en medios de Agar sangre y Agar Hipertnico de Chapman
(tamao, forma, pigmento, hemolisis, etc.)
4. De la placa con Agar sangre y Agar Hipertnico de Chapman, tomar una asada de una colonia
de color amarillo e inocularlo el tubo con caldo plasma e incubar a 37C (Prueba de la
coagulasa)
5. Realizar la prueba de la Catalasa.
6. Agar hipertonico de Chapman o manitol salado contiene: Manita, Cloruro de sodio al 6.5% y
como indicador de pH el rojo de fenol
7. Sembrar las especies en una placa Petri con disco de novoviacina
38
RESULTADOS:
1. Caractersticas macroscpicas de la muestra:

2. Resultado de la coloracin realizada
3. Resultado de la reaccin de la Coagulasa, en caldo plasma observar que slo S. aureus coagula
el plasma.
4. Resultado de la reaccin de Catalasa, agregando agua oxigenada y observando la aparicin de
burbujas en las tres especies.
5. Resultado en Agar hipertnico de Chapman observar las colonias amarilla (manita positivas) de
S. aureus y S. saprofiticus; y color rosado (manita negativa) en S .epidermidis.
6. Observar la presencia de hemlisis en las placas con Agar sangre
7. La novoviacina permite diferenciar S. epidermidis de S. saprofiticus. S. epidermidis es
sensible y S. saprofiticus resistente.
PROTOCOLO:
Realizar un protocolo de trabajo indicando: la especie bacteriana que se trabajo, tamao de la

colonia, forma que presenta, pigmento, hemlisis, y otras caractersticas que crea conveniente.
Complete el cuadro con lo realizado durante la prctica.
CEPAS MH AS COAGULASA CATALASA GRAM Caracterstica

BACTERIANAS o (Agar morfolgica
TRABAJADAS Manitol sangre)
salado
39
PRACTICA N 15
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM POSITIVOS:
GENERO STREPTOCOCCUS
INTRODUCCION
El gnero Streptococcus comprende muchas especies agrupadas segn la clasificacin de

Lancefield en los grupos A (S. pyogenes); B (S. agalactiae); C (Ej. S. equi); D (Ej. Enterococos);
G (S. canis); H (S. sanguis); K (S. salivarius) y Streptococcus pneumoniae (no pertenece a
ningn grupo). Con la coloracin de Gram se comportan como positivos adoptando formas de
cadenas. Algunos son patgenos para el hombre y los animales, otros forman parte de la flora
normal o transitoria del cuerpo humano y otros son saprofitos.
Los Streptococcus desarrollan en medios enriquecidos como el Agar sangre, que permite
diferenciar algunas especies en base a la hemlisis producida. La hemolisis tipo es incompleta,
los glbulos rojos que rodean a la colonia son parcialmente daados pero no lisados como sucede
en la hemolisis tipo . Existe un enverdecimiento del medio debido a la salida del eritrocito de un
derivado del tipo de la metahemoglobina, que es oxidado a compuestos como la biliverdina. El
grupo de estreptococos alfa hemolticos se denominan S. viridans. La mayora de Streptococcus
pueden desarrollar en presencia o ausencia de oxgeno. Diversas pruebas bioqumicas permiten la
diferenciacin de las especies de Streptococcus.
MATERIAL

Solucin de Desoxicolato al 2%
Cultivo de Streptococcus en medio de caldo BHI
Tubo con ClNa al 6.5%

Placas con Agar sangre de carnero Lminas portaobjetos

Torunda estril y bajalengua Set de colorantes de Gram- Kopeloff

Tubos con Thioglicolato Asas de Kolle, pinzas

Tubos con caldo Inulina Microscopio, aceite de inmersin.

Discos de Bacitracina

Discos de Optochin
PROCEDIMIENTO
1. Observar el desarrollo de Streptococcus en el medio de caldo BHI, si el crecimiento produce

turbidez o sedimento.
2. Observar el desarrollo de la bacteria en Agar sangre, sembrado por el mtodo de dispersin y
agotamiento e incubado a 37C por 18- 24 horas. Realizar un frotis en la lmina portaobjetos
y colorear por Gram.
40
3. Estudiar el comportamiento de las especies de Streptococcus, frente a la Bacitracina y el disco
de Optochin,
4. Sembrar las cepas bacterianas en el medio de Thioglicolato.
5. Sembrar la cepa en el caldo de Inulina.
6. Sembrar la cepa en el tubo con ClNa al 6.5%
7. Realizar la prueba de la catalasa
8. Realizar la prueba de Desoxicolato de sodio, permite observar la capacidad de ciertas bacterias
de lisarse en presencia de sales biliares
LECTURA
1. En Agar sangre, S. pyogenes y S. agalactiae son beta- hemolticos; S. viridans y S. pneumoniae

son alfa- hemolticos. Realizar el frotis de las colonias y colorear por Gram.
2. Respecto a la sensibilidad a la Bacitracina y Optochina: S. pyogenes es sensible a la Bacitracina
y S pneumoniae es sensible a la Optochina
3. Agregar una gota del Desoxicolato de sodio al 2% sobre una o varias colonias en la placa de
Agar sangre e incubar a 35C durante 30 minutos. En una reaccin positiva se observa que las
colonias son lisadas (desaparecen)
4. Observar que solo S. pneumoniae metaboliza la Inulina.
5. Observar el desarrollo en el medio de Thioglicolato. Este medio es usado para determinar el
efecto del O2 sobre las bacterias (Aerobio, Anaerobio, Facultativo), contiene Agar 0.075% y
cido tioglicolato que acta como agente reductor disminuyendo aun ms el potencial de
oxido-reduccin del medio.
6. En la solucin de ClNa al 6.5% , observar que slo desarrolla Enterococo (Grupo D)
7. Todas las especies del gnero Estreptococo son catalasa negativa
PROTOCOLO
Realizar un protocolo de trabajo de la prctica realizada
IDENTIFICACION PRESUNTIVA DE STREPTOCOCOS
Metabo Desarro Lisis por Bilis

SENSIBILIDAD CAMP Hidrlisis lismo llo en
ORGANISMO De de la NaCl
Bacitra Opto Hipu Escu Inulina 6.5% Desoxi
cina chin rato lina colato Sodio
- hemolticos
GRUPO A S R N N N N N N
S. pyogenes
GRUPO B R* R P P N N P* N
S. agalactiae
GRUPO C, F, G R R N N N N N N
- hemolticos
GRUPO Viridans R* R N N N* N N N
S. pneumoniae R S N N N P N P*
S= Sensible; R= Resistente; N= Negativo; P= Positivo; *= Reaccin variable
41
PRACTICA N 16
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE COCOS GRAM NEGATIVOS: GENERO

NEISSERIA
INTRODUCCION
Las Neisserias son cocos Gram negativos, que se presentan caractersticamente en pares, con los
lados adyacentes aplanados, simulando granos de caf. Comprende varias especies, entre stas
N. gonorrhoeae, y N. meningitidis, causan frecuentemente enfermedad significativa en el hombre.
En muestras clnicas del tracto urogenital u otras, se tien adicionalmente con el colorante azul de
metileno, observndose las Neisseria intra y extracelularmente.
Estos microorganismos son exigentes y requieren medios enriquecidos como el Agar chocolate,
que le proporciona una rica fuente de hierro y el Agar Thayer Martin.
La mayora de las especies requieren para el crecimiento una humedad relativamente alta y una
tensin de CO2 entre 5 a 10%. Desarrollan a temperaturas exactas entre 35 a 37C y un pH de 7.2
a 7.6.
Todas las especies producen catalasa y Citocromo- oxidasa, que permiten diferenciarlos de otros
microorganismos morfolgicamente similares.
La diferenciacin bioqumica se realiza por pruebas de utilizacin de hidratos de carbono:
Glucosa, maltosa, sacarosa y lactosa.
El diagnstico de gonorrea requiere una estrecha cooperacin entre el mdico y el

laboratorio. Se debe considerar los siguientes aspectos:
a) Recoleccin correcta de la muestra.
b) Seleccin del recipiente apropiado para el transporte y rpido envo al laboratorio.
c) Seleccin del medio de cultivo apropiado
d) Aislamiento e identificacin de la bacteria en el laboratorio.
MATERIALES

Placa con Agar Thayer Martin sembrada con Neisseria

Placa con Agar chocolate sembrada con Neisseria

Lmina control con frotis de Neisseria coloreada con Gram

Reactivo de Citocromo- oxidasa

Reactivo de catalasa


Lminas portaobjetos

Set de coloracin de Gram
42

Colorante de Azul de metileno

Microscopio

Asas de siembra en aro y punta

Solucin de alcohol yodado

Algodn y Xilol.
METODOLOGIA
1. Observar en el medio de Thayer Martin y Agar chocolate, las colonias pequeas, circulares de
bordes continuos, blanco- grisceos, convexas, brillantes o ligeramente opacas si corresponden
a N. gonorrhoeae y si es N. meningitidis colonias pequeas de borde entero, circulares,
translcidas o ligeramente opacas.
2. Dejar caer una gota del reactivo de oxidasa sobre una colonia y observar entre los 2- 3 minutos el
cambio de color del rosado al marrn o negro, que corresponde a una prueba de oxidasa positiva.
3. Realizar un frotis de la colonia oxidasa positiva y colorearla por el Gram. Comparar con la
lmina control.
4. Realizar un frotis de la muestra clnica de secrecin endocervical y colorearla con el azul de
metileno.
PROTOCOLO
MEDIO DE CULTIVOCOLONIASTAMAOGRAM AZUL DE

MUESTRA METILENO
AGAR THAYER MARTIN
AGAR CHOCOLATE
SECRECION
ENDOCERVICAL
OXIDASA CATALASA
PRUEBAS
BIOQUIMICAS
43
PRACTICA N 17
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM

POSITIVOS: GENERO BACILLUS
INTRODUCCION
El gnero Bacillus agrupa microorganismos aerobios Grampositivos, formadores de esporas y que

pueden sobrevivir en el ambiente por muchos aos. Algunas especies causan enfermedades en el
hombre y los animales como el B. anthracis causante de la enfermedad conocida como
"carbunco", otros como el B. cereus, B. subtilis, B. megaterium y B. mycoides son saprofitas y
se encuentran en el suelo, agua y aire.
La especie patgena B. anthracis, causante del carbunco en los procesos patolgicos se presenta
como un bacilo rectilneo, Gram positivo, grueso, inmvil y capsulado. En los cultivos, las colonias
son grandes, mates, rugosas con bordes festoneados (aspecto de cabeza de medusa), se agrupan en
largas cadenas, sin cpsula y conforme el cultivo envejece forman esporas.
MATERIALES

Placas Petri con Agar nutritivo

Placas Petri con Agar sangre

Tubos con Caldo nutritivo

Tubos con Agar semislido

Tubos con gelatina

Lminas para frotices


Set de coloracin de Hiss para cpsula

Set de coloracin de Wirtz Conklin para esporas

Asa de Kolle
PROCEDIMIENTO
1. Sembrar la muestra en placas de Agar sangre, Agar nutritivo, caldo nutritivo y gelatina.
2. Preparar frotices para colorear con Gram, Hiss, y Wirtz Conklin.
COLORACION HISS (PARA CAPSULA)
1) Preparar un frotis
2) Cubrir con Fucsina bsica y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 30 segundos
3) Lavar con solucin acuosa de Sulfato de cobre al 20%.
4) Lavar con agua corriente y secar
5) Observar al microscopio con lente de inmersin
44
COLORACION DE WIRTZ CONKLIN ( PARA ESPORAS)
1) Preparar un frotis
2) Cubrir con verde de malaquita y calentar hasta el desprendimiento de vapores por 5 minutos
(adicionar colorante cada vez que falte)
3) Lavar con agua corriente
4) Colorear con safranina al 0.5% por 1 minuto
5) Lavar y secar
6) Observar al microscopio con lente de inmersin
LECTURA:
EN LOS CULTIVOS
En Agar sangre: Las colonias se observan blanco grisceo, no hemoltica en las especies
patgenas y - hemolticas en las especies saprofitas.
En Agar nutritivo: Se observan bacilos endoesporulados
En caldo nutritivo: Se observa un sedimento en el fondo del tubo.
En Agar semislido: Se observa un crecimiento en forma de pino
invertido En Gelatina: slo las especies saprofitas producen hidrlisis.
EN LAS LAMINAS COLOREADAS
Gram : Bacilos Grampositivos dispuestos en cadenas, las esporas generalmente se ubican en el

centro del bacilo.
Hiss : El cuerpo bacteriano se observa de color prpura y la cpsula de color claro o incoloro.
Wirtz Conklin: El cuerpo bacteriano se observa de color rosado y la espora de color verde.
RESULTADOS
A) DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
GENERO BACILLUS
ESPECIE PATGENA ESPECIE SAPROFITA
Caldo nutritivo
Agar nutritivo
Agar sangre
Agar semislido
Hemolisis
Hidrlisis de la gelatina
Prueba de la Catalasa
Fermentacin salicina
Movilidad
45
PRACTICA N 18
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO

LISTERIA
INTRODUCCION
El gnero Listeria comprende bacilos Grampositivos, microaerfilos, no esporulados, mviles y

presentan flagelos peritricos. Se presentan aislados o en grupos de dos en cadena o en forma de V de
Y. Esta ampliamente distribuido en la naturaleza, en los vegetales en descomposicin, en el suelo, en
las heces de los portadores sanos animales y hombres. La especie patgena es Listeria monocytogenes
y la enfermedad que causa se le conoce como Listeriosis, la cual compromete los ganglios linfticos,
produce sntomas neurolgicos, encefalitis aguda y monocitosis en sangre.
El microorganismo se puede aislar de la sangre, lquido cefalorraqudeo y de las heces, desarrolla
bien en medios de cultivo comunes.
MATERIAL

Tubos con Caldo nutritivo

Tubos con medios semislidos (Motilidad)

Placas Petri con Agar sangre

Placas Petri con Agar nutritivo

Tubos de 13x100 con:

Agar urea de Christensen

Citrato de Simmons

Caldo rojo de fenol con glucosa

Caldo rojo de fenol con sacarosa

Caldo rojo de fenol con lactosa

Caldo rojo de fenol con manita

Caldo rojo de fenol con salicina

Caldo esculina

Caldo:

MR-

VP
PROCEDIMIENTO
1. Hacer frotices a partir de una colonia sembrada en Agar nutritivo y colorearla con Gram.
2. Preparar una lmina en fresco a partir del tubo con caldo nutritivo sembrado, entre lmina y
laminilla.
46
3. Sembrar en el Tubo con medio semislido, placas de Agar sangre, Agar nutritivo, y en los
diferentes medios diferenciales
4. Dejar en incubacin por 24 a 48 horas a 37C.
LECTURA

FROTICES CON GRAM : Se observaran como bacilos Grampositivos.

LAMINAS EN FRESCO : Se observar la movilidad peritrica, utilizando los objetivos de 40 aumentos.

EN CALDO NUTRITIVO: Se observar una turbidez tenue y homognea.
EN AGAR SANGRE : Se observar colonias pequeas con hemlisis tipo Beta.

EN MEDIOS DIFERENCIALES : Observar
MOVILIDAD + GLUCOSA + MR +
HEMOLISINA + SACAROSA - VP +
CATALASA + LACTOSA -
OXIDASA - MANITA -
UREA - SALICINA +
CITRATO - ESCULINA +
47
PRACTICA N 19
"ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE LA FLORA NORMAL DE LA SECRECION

BUCOFARINGEA
INTRODUCCION
La flora normal se adquiere con rapidez durante y poco despus del nacimiento, y cambia de forma
continua a lo largo de la vida. Los organismos presentes en un determinado momento dependen
de la edad, nutricin y medio ambiente del individuo, por lo que es difcil determinar la flora
normal de cada individuo ya que depende en gran parte de los factores antes enunciados; ejemplo,
los lactantes alimentados con leche materna tienen Estreptococos y Lactobacilos en su tracto
gastrointestinal, en los pacientes que estn recibiendo grandes dosis de antibiticos presentan un
gran desarrollo de levaduras.
La nariz y la boca pueden ser intensamente colonizados por bacterias como Estreptococos,
Estafilococos, difteroides, y cocos Gram negativos.
La superficie de los dientes y los surcos gingivales contienen un gran nmero de bacterias
anaerobias.
La rinofaringe esta habitada generalmente por estreptococos no hemolticos y diplococos Gram
negativos, en ella puede poblarse un gran numero de especies patgenas como Streptococcus
pneumoniae, Neisseria meningitidis, S. pyogenes, Klebsiella pneumoniae y Haemophilus
influenzae.
MATERIALES
Caldo nutritivo en tubos (13 x 100)

Agar nutritivo en placas
Agar sangre en placas
Agar chocolate en placas
Medio hipertnico de Chapman en placas
Agar Mac Conkey en placas
Agar Sabouraud en tubos
Torundas estriles (2 x tubo)
Baja lengua
Asa de Kolle en aro
Laminas portaobjetos
Set de colorante Gram
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PROCEDIMIENTO
A. PRIMER DIA
1. Con ayuda de torundas estriles y el baja lengua, tomar una muestra de la orofaringe.
2. Sembrar las muestras, en los diferentes medios de cultivo.
3. Incubar las placas y tubos sembrados por 24 a 48 horas a 37C
B. SEGUNDO DIA
LECTURA
Con la ayuda del Profesor, el alumno proceder a hacer el estudio de lo que ha desarrollado en
los medios de cultivos.
IDENTIFICACION
Sembrar en los diferentes medios de cultivo para el estudio bioqumico correspondiente y

pruebas de patogenicidad si se requiere.
Caldo plasma en tubo

- Disco de Bacitracina
- Disco de Optochin
- Reactivo de Citocromo- oxidasa
- Reactivo de catalasa
PROTOCOLO
El alumno realizar un cuadro estadstico con los resultados obtenidos.
49
PRACTICA N 20
AISLAMIENTO E IDENTIFICACCION DE BACILOS ACIDO- ALCOHOL-

RESISTENTES
GENERO MYCOBACTERIUM.
INTRODUCCION
Este gnero esta conformado por microorganismos que se caracterizan por tener morfologa bacilar,
poseen un alto contenido de lpidos complejos en su estructura qumica y se desarrollan lentamente en
los medios de cultivo frente a los cuales son exigentes con los componentes nutritivos.
Existen especies patgenas para el hombre y los animales, as como especies saprofitas en el aire,
en el agua y en la tierra.
Las especies patgenas para el ser humano son: Mycobacterium tuberculosis variedad hominis,
que puede infectar cualquier lugar del organismo, siendo la localizacin pulmonar, renal y
digestiva los mas frecuentes y el esputo es el espcimen clnico ms comn para establecer el
diagnstico especfico a travs de la baciloscopia.
Mycobacterium leprae produce la lepra enfermedad de Hansen; Mycobacterium bovis,
Mycobacterium avium, Mycobacterium kansasi y Mycobacterium simiae, con menor frecuencia,
tambin, son patgenos.
MATERIALES

Un frasco de boca ancha con muestra de esputo positivo

Lminas portaobjetos nuevas y desengrasadas

Lminas con extensiones de M. tuberculosis var. Hominis

Lminas con extensin de otros tipos de Micobacterias

Set de colorante de Gram

Set de colorante de Ziehl- Neelsen (col. A. A. R.)

Cepas patrones sembradas en medio Lownstein Jensen + verde de malaquita
PROCEDIMIENTO
1. Observar los caracteres macroscpicos del esputo: sangre, mucoide, mucopurulento.

2. Tomar una partcula mucopurulenta del esputo y hacer una extensin homognea sobre la
lmina portaobjetos nueva.
3. Fijar la preparacin.
4. Realizar una coloracin con Gram y otra con Ziehl- Neelsen
50
El mismo procedimiento se sigue con muestras de orina, heces, lquido cefalorraqudeo, lquido
pleural, etc.
LECTURA
Observar como los grmenes visibles por el Gram, no aparecen en la coloracin de Ziehl- Neelsen
porque no son cidos alcohol resistente.
El bacilo de Koch y los otros Mycobacterium en cambio aparecen como elementos bacilares rojos
en un fondo azul.
EXAMEN MICROSCOPICO CUANTITATIVO
Enfocar con el objetivo de 100x la lmina referencial, cuantificar la cantidad de bacilos en toda la
longitud de los 2/3 del extendido que corresponde aproximadamente a 100 campos y anotar los
resultados, segn el siguiente cuadro:
Negativo : No se observan bacilos en 100 campos.

Positivo (+) : Menor de 1 bacilo por campo, en 100 campos.
Positivo (++) : De 1 a 10 bacilos por campo, en 50 campos.
Positivo (+++) : Ms de 10 bacilos por campo, en 25 campos.
La lectura cuantitativa permite controlar la evolucin del paciente que esta en tratamiento y
permite detectar aquellos que sean resistentes al tratamiento.
TIPIFICACIN DE MICOBACTERIAS
Se investiga la velocidad de desarrollo y la produccin de pigmento, permitiendo clasificarlos en
grupos.
I. Cepas que desarrollan en 8 ms das. Llamadas de desarrollo lento.
GRUPO I: Pigmentan por estmulo de la luz. Son fotocromgenas.

Ejemplo: M. kansasi , M. simiae
GRUPO II: Pigmentan sin necesidad de estmulo luminoso. Son escotocromgenas. Ejemplo:
M. scrofulaceum
GRUPO III: No pigmentan espontneamente, ni por estmulo luminoso. Son

no cromgenas. Ejemplo: M. tuberculosis var. Humano y
M. tuberculosis var. Bovina
II. Cepas que desarrollan en 7 das o menos.
GRUPO IV: Pueden pigmentar o no pigmentar. Ejemplo: M. fortuita
PROTOCOLO DE TRABAJO:
Realizar esquemas de lo realizado y observado en la prctica correspondiente.
51
PRACTICA N 21
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM POSITIVOS: GENERO

CORYNEBACTERIUM
INTRODUCCION
El gnero Corynebacterium comprende un grupo heterogneo de bacterias en el cual se
incluyen especies comensales y patgenos a animales, plantas y bacterias de suelo.
Las caractersticas comunes del gnero son:
1) Bacilos pleomrficos Grampositivos, No forman esporas
2) Las clulas se dividen abruptamente (efecto de resorte), de donde resulta su disposicin en
letras chinas,
3) Aerobios o anaerobios facultativos,
4) Catalasa positivos,
5) Citocromo oxidasa negativo.
La especie tipo es Corynebacterium diphtheriae que causa la difteria, infeccin aguda, contagiosa
y febril, caracterizada por inflamacin local y formacin de una seudomembrana en la orofaringe,
adems del dao al corazn y nervios perifricos por accin de una exotoxina (toxina difterica).
Es propagada por portadores sanos y convalecientes, su puerta de entrada es las vas respiratorias
superiores.
El gnero se divide en tres grupos:
Grupo I : Corinebacterias parsitas y patgenas para el hombre y animales;
Grupo II : Corinebacterias fitopatgenas, y;
Grupo III : Corinebacterias no patgenas.
Algunas de las especies ms frecuentemente halladas en el laboratorio clnico son: C.diphtheriae,

C.pyogenes, C.ulcerus, C.haemolyticus, C.xerosis, C.renale, C.equi, C.ovis, C.bovis, C.ovis y
C.hoffmannii (pseudodiphthericum).
La muestra debe ser tomada con un hisopo, se debe frotar enrgicamente sobre cualquier lesin
inflamatoria, adems del hisopado de garganta, se requieren muestras de nasofaringe, y enviar
inmediatamente al laboratorio o inocular directamente en el medio suero de Loeffer o Agar telurito.
MATERIAL

Cepa
de Corynebacterium diphtheriae en caldo Tubos Agar Urea Christensen en plano
con
enriquecido inclinado

Placa con Agar sangre Caldo Rojo de fenol + Glucosa

Caldo Rojo de fenol + Maltosa
Placa con Agar chocolate telurito de potasio
Asas de siembra

Lminas portaobjetos

Tubo de 13x100 con medio Pai en plano inclinado

Set de colorante de Gram Aceite de inmersin

Set de colorante de Albert Microscopio
52
PROCEDIMIENTO
1. Tomar el inculo de la cepa de C.diphtheriae y realizar la siembra por el mtodo de
dispersin agotamiento en las placas de Agar sangre y Agar chocolate, y en el medio Pai
por estras. Incubar por 48 horas a 37C.
2. Realizar el frotis del cultivo en caldo enriquecido y colorear por Gram.
3. Realizar el frotis del cultivo y colorear por el mtodo de Albert.
4. Bioqumica: Sembrar en los medios diferenciales de Agar Urea de Christensen, en el caldo
Rojo de fenol + Glucosa, caldo Rojo de fenol + Maltosa.
COLORACION DE ALBERT
Los grnulos metacromticos conocidos tambin como de volutina, son material de reserva de
polifosfato, se distribuyen en el citoplasma, preferentemente en los extremos del bacilo, se tien
de color azul intenso y el soma bacteriano se observa muy dbilmente.
PROCEDIMIENTO
1. Realizar el frotis a partir del cultivo y fijar al calor suave.
2. Cubrir con la Solucin A de Albert (Azul de toluidina, verde de metilo, cido actico,
alcohol etlico, agua destilada) por 3 a 5 minutos.
3. Lavar con agua corriente, evitar el lavado directo del frotis.
4. Cubrir con la Solucin B de Albert (yodo metlico, yoduro de potasio, agua destilada) por
1 minuto.
5. Lavar con agua corriente, secar y observar al microscopio, objetivo de 100X
LECTURA
En la coloracin Gram- Kopeloff observar los bacilos rectos o ligeramente curvados

ensanchados
en sus extremos como mazos, pleomrficos (en forma de pera, huso) o dispuestos
paralelamente, o en forma de letras chinas.

En la coloracin Albert observar la bacteria color verde y los grnulos de color azul oscuro
En de potasio (medio selectivo inhibidor de Gram negativos) observar

el cultivo en Agar chocolate telurito
los tres tipos de bacilos diftricos:
a) Tipo gravis: colonias grandes grisceas.
b) Tipo mitis: colonias medianas, circulares, lisas totalmente negras.
c) Tipo intermedius: colonias pequeas, lisas o rugosas con centro negro.
En el cultivo en Agar sangre observar el crecimiento de colonias pequeas, convexas, con

color crema o blanco grisceas, slo las colonias Tipo mitis producen beta
bordes enteros,
hemolisis.
BIOQUIMICA DE Corynebacterium diphtheriae
Hemolisis: Beta (slo el Tipo mitis) Gelatina : Negativo

Catalasa : Positivo Sacarosa : Negativo
Movilidad: Negativa Glucosa : Negativo
Urea* : Negativa Maltosa : Positivo
Nitrato : Positivo Lactosa : Negativo
53
PRACTICA N 22
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS:

GENERO PSEUDOMONAS
INTRODUCCION
La especie Pseudomona aeruginosa es un bacilo Gram negativo, casi todas son mviles con
flagelos polares monotricos y multitricos, poseen cpsula, no forman esporas, no son exigentes
para su desarrollo In Vitro.
Pseudomona aeruginosa es la especie ms frecuentemente asociada con enfermedad humana,

principalmente quemaduras severas, pero tambin se aslan de orina, sangre, lavados
bronquiales, esputo y tracto genital femenino. En pacientes comprometidos pueden causar
infecciones con riesgo de vida fatales.
La deteccin del pigmento piocianina en el medio de cultivo es virtualmente diagnstica de P.

aeruginosa, la mayora de los aislamientos producen tambin el pigmento fluoresceina y
desarrollan bien a 42C.
MATERIAL

Cepa de Pseudomona aeruginosa en caldo nutritivo.

Caldo Tripticase en tubo de 16 x 150

Agar nutritivo en Placa Petri

Agar Mac Conkey en tubo 16 x 150

Agar semi-slido en tubo de 13 x 100

Medio TSI

Reactivo de Oxidasa

Frasco con cloroformo

Set de colorantes Gram

Lminas portaobjetos
PROCEDIMIENTO
1. Hacer un frotis a partir de la cepa Pseudomona aeruginosa y colorear por el mtodo de

Gram.
2. Sembrar la cepa de P. aeruginosa en los diferentes medios de cultivo, por las tcnicas
conocidas.
3. Incubar a 37C por 24- 48 horas.
54
RESULTADOS
COLORACION DE GRAM: Bacilos pequeos, Gram negativos.

CALDO NUTRITIVO: Observar el crecimiento abundante en el medio, el pigmento
de color verdoso y un olor caracterstico.
AGAR MAC CONKEY: Observar colonias grises claro, no fermentadoras de lactosa.
MEDIO TSI: No hay cambios, ya que P. aeruginosa y otras especies de este gnero no
fermentan los carbohidratos [utilizan los carbohidratos slo por va oxidativa en el
medio de oxidacin- fermentacin (OF)].
AGAR NUTRITIVO: Describir la colonia, observar la difusin del pigmento en el
Agar, y realizar la prueba de la oxidasa, que es positiva para P. aeruginosa.
CALDO TRIPTICASE: Agregar 1 ml de cloroformo para extraer el pigmento de la
piocianina.
PROTOCOLO
CARACTERSTICAS MICROORGANISMOS
Pseudomona aeruginosa
Crecimiento en Mac Conkey
Reacciones en TSI
Difusin de Pigmento en Agar nutritivo
Prueba de Citocromo- oxidasa
Solubilidad Cloroformo- piocianina
Crecimiento Agar nutritivo
Agar semislido
55
PRACTICA N 23
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS: GENERO

BRUCELLA
HEMOCULTIVO Y SEROLOGIA
INTRODUCCION
Son microorganismos pequeos, usualmente cocobacilares, inmviles no formadores de esporas.

Son Gram negativos y necesitan una tincin prolongada con la fucsina bsica de por lo menos 2
minutos en lugar de los 30- 60 segundos de tincin convencional de Gram.
La enfermedad conocida como Brucelosis o Fiebre Malta es causada por las siguientes especies
Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella abortus.
Su multiplicacin y desarrollo in vitro es muy lento, necesitan de medios especiales como el Agar
Brucella o Caldo tripticasa soya.
Para la identificacin de especies se utiliza una serie bioqumica para observar la produccin de
H2S, hidrlisis de la urea, desarrollo en medios especiales con fucsina 0.002 %, Thionina 0.002 %
y requerimiento de CO2.
DIAGNOSTICO DE LABORATORIO
Este microorganismo puede ser aislado de la sangre, lquido cefalorraqudeo, mdula sea o
biopsias de ganglios linfticos e hgado.
I: HEMOCULTIVO
Para el Hemocultivo se utiliza el medio de doble fase (slido + lquido) de Ruiz- Castaeda. La
incubacin debe hacerse en una atmsfera de 5- 10% de CO2 a 35- 37C. Las colonias aparecen
entre el 4 al 5 da, pero los cultivos deben ser incubados hasta los 30 das antes de ser descartado
como negativo.
II: SEROLOGIA
Para el diagnstico serolgico se utilizan las tcnicas de:
1. Aglutinacin rpida en placa
2. Aglutinacin lenta en tubo (Wright)
3. Prueba de aglutinacin del 2- mercaptoethanol (2- ME)
4. Prueba modificada de Coombs (antiglobulina)
5. ELISA
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MATERIAL

Tubo con cepa de Brucella

Frascos con medio de Ruiz- Castaeda

Muestra de sangre total de paciente

Agar fucsina en placa

Agar Thionina en placa

Suero positivo y suero control negativo

Antgeno estandarizado de Brucella

Lminas excavadas

Pipetas de 0.2 ml

Palito mondadientes

Lminas portaobjetos

PROCEDIMIENTO
I: HEMOCULTIVO
Agregar 5 ml. de sangre de paciente sospechoso a Brucelosis en el medio de Ruiz- Castaeda, e

incubar por 4 a 5 das a 37C. Se debe esperar hasta 30 das para descartar el cultivo.
COLORACION
Realizar un frotis de la cepa desarrollada en Caldo trypticase y colorearla por el mtodo de
Gram, siguiendo las recomendaciones sealadas anteriormente.
II: SEROLOGIA
1. Con la pipeta de 0.01 colocar una gota de suero negativo en el primer crculo de la 2da. Lnea
de la lmina excavada.
2. Con la pipeta de 0.01 ml colocar en la lmina excavada, las siguientes cantidades de suero
positivo: 0.08, 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml respectivamente.
3. A cada alcuota de suero aadir una gota de antgeno, equivalente a 0.03 ml.
4. Mezclar cuidadosamente por rotacin, con ayuda de un palito mondadientes empezando por el
suero negativo y la dilucin ms alta 1:400
5. Dejar en reposo por espacio de 3 minutos, luego rotar la lmina durante un minuto y dejar en
reposo por 4 minutos ms.
6. A los 8 minutos no ms, observar la presencia de grumos (aglutinacin) que indica una reaccin
positiva antgeno- anticuerpo y el titulo de anticuerpo alcanzado.
57
INTERPRETACION
SUERO ANTIGENO DILUCION / TITULO
0.08 + 0.03 25 +
0.04 + 0.03 50 ++
0.02 + 0.03 100 +++
0.01 + 0.03 200 ++++
0.005 + 0.03 400 +++++
DIFERENCIACION BIOQUIMICA
ESPECIES
DE PRUEBAS DE DIFERENCIACION
BRUCELLA
Crecimiento en
Husped Necesidad Produccin Hidrlisis
Preferido CO2 (5%) de H2S de Urea
Fucsina Thionina
0.002 % 0.002 %
B.abortus Bovino + ++ Dbil + -
B.melitensis Cabra, oveja - - Dbil + +
B.suis Cerdos - + Fuerte - +
B.canis Perros - - Fuerte - +
58
PRACTICA N 24
AISLAMIENTO E IDENTIFICACION DE ENTEROBACTERIAS: COPROCULTIVO
INTRODUCCION
En el intestino del hombre existe una flora bacteriana constituida por Enterobacterias (Escherichia
coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella) y otros microorganismos anaerobios y aerobios, algunos
de los cuales son patgenos para el
Hombre y causantes de enfermedades.
El diagnstico y aislamiento del microorganismo causante de la enfermedad se realiza mediante
el COPROCULTIVO, es decir el cultivo de las heces en la fase evolutiva de la enfermedad, para
el aislamiento del agente patgeno bacteriano.
La mayora de las Enterobacterias tienen una accin invasiva penetrando en la mucosa intestinal
produciendo ulceraciones o abscesos, y el modo de transmisin es generalmente por ingesta de
alimentos contaminados con heces humanas.
Escherichia coli, bacilo Gram negativo no esporulados, es miembro de la flora intestinal y en

determinadas condiciones patgena para el hombre, poseen factores de virulencia que les permite
causar infecciones en el tracto gastrointestinal as como en el sistema urinario. La E. coli
enterotoxignico (ECET) es la causa comn de la "Diarrea del viajero" y produce en el
organismo enterotoxinas potentes y poseen factores de colonizacin; la E.coli enteroinvasiva
(ECEI) y la E.coli enterohemorragica (ECEH) son causantes de diarrea sanguinolenta.
Klebsiella pneumoniae, bacilos Gram negativos a veces con cpsula producen infecciones
oportunistas en el husped comprometido (generalmente hospitalizado), el tracto respiratorio y
urinario son los lugares de infeccin ms comunes, es difcil distinguir entre colonizacin e
infeccin y son productoras de endotoxinas.
Salmonella typhi, bacilo Gram negativo mvil con flagelos peritricos son exclusivas del hombre
y causan la fiebre tifoidea; otras, causan infecciones intestinales y a veces septicemias como la
Salmonella paratyhi A, B C.
El gnero Shigella, comprende especies que son bacilos Gramnegativos inmviles, causan la
Disentera bacteriana, enfermedad que produce diarrea, moco, sangre, calambres abdominales y
fiebre. La especie S. dysenteriae es la mas virulenta.
El gnero Proteus, presenta especies que son bacilos Gram negativos rectos, mviles con flagelos
peritricos, anaerobio facultativo. Son habitantes de la flora intestinal y otras causantes de
infecciones urinarias, heridas crnicas adquiridas generalmente en el hospital.
59
MATERIALES

Muestra de heces.

Placas Petri con Agar Mac Conkey

Placas Petri con Agar SS

Placas con Agar Manitol

Tubos con Agar Sabouraud

Tubos con medio TSI, LIA

Tubos con caldo peptonado

Tubos con Citrato de Simmons

Tubos con caldo MR-VP

Frasco con Lugol

Reactivo para Citocromo-oxidasa

Reactivo de Kovacks (prueba de indol)

Reactivo para Rojo de metilo

Lminas portaobjeto y cubreobjeto

Reactivo para VP (Alfa- naftol al 5% e Hidrxido de Potasio al 40%)

Juego de colorantes para Gram

Material bsico para laboratorio
PROCEDIMIENTO
1. Realizar un estudio macroscpico de la muestra de heces (consistencia, color, presencia de

sangre, moco, etc.)
2. Realizar un estudio microscpico de la muestra con Lugol y suero fisiolgico y Gram.
3. Realizar la siembra de la muestra de heces en medios de cultivos:
a) Suspender aproximadamente un gramo de heces (dos asadas) en un tubo con 3 ml. de
solucin salina.
b) Tomar una asada de la suspensin de heces y sembrar en las placas de Agar Mac Conkey,
Agar SS, Agar Manitol, y tubos con Agar Sabouraud e incubar a 37C por 24 horas.
c) Sembrar las cepas bacterianas aisladas en medios de diferenciacin bioqumica: TSI, LIA,
Caldo peptonado, Citrato de Simonns y Caldo MR-VP. Incubar a 37C por 24 horas.
LECTURA
EN AGAR MAC CONKEY, observarlas colonias rojas (Lactosa +) que han metabolizado la
Lactosa y las colonias Lactosa negativas que no han metabolizado la Lactosa.
EN AGAR SS, observar el desarrollo de colonias Lactosa negativas y presencia de color negro en
las colonias que son SH2.
EN AGAR MANITOL Y AGAR SABOURAUD, observar el desarrollo de colonias y anotar las
caractersticas.
EN TSI (Glucosa, Sacarosa, Lactosa), cuando las bacterias metabolizan los carbohidratos toma el
medio un color amarillo y cuando producen SH2 se torna de color negro.
EN LIA (Agar, Lisina, Hierro ), observar si hay descarboxilacin y desaminacin de la Lisina y
produccin de SH2 por las bacterias. Si hay Descarboxilacin de la lisina se eleva el pH del medio
debido a la produccin de aminas, pH= 5.2 ( color amarillo), pH 6.8 (color prpura) [indicador
prpura de bromocresol]
60
EN CALDO PEPTONADO, observar la produccin de Indol por las bacterias, al agregar el
reactivo de Kovac tornndose rojo grosella.
EN CITRATO DE SIMMONS, se tornar de color azul cuando la bacteria utiliza el citrato como
fuente de energa y alcaliniza el medio. (Formacin de Hidrxido de amonio). Positivo (color azul),
negativo (color verde).
EN CALDO MR, observar el color rojo que toma cuando se le aade el Rojo de metilo. Cuando
hay produccin de cidos mixtos con un pH < 4.4 (positivo color rojo); pH > 4.4 (negativo color
amarillo).
EN CALDO VP, observar el color rojo en anillo que se forma despus de 15 minutos cuando se
le aade alfa-naftol y KOH por la produccin de acetil-metil-carbinol. Positivo (color rojo),
negativo (color amarillo). PRUEBA DE CITOCROMO- OXIDASA agregando una gota del
reactivo oxidasa sobre la colonia y observar a los 5 minutos un intenso color azul si son
productoras de la enzima en caso contrario no habr ningn cambio de color
COLORACION DE GRAM observar los bacilos Gram negativos.

CON SUERO FISIOLOGICO Y LUGOL observar la muestra de heces y verificar si hay
movilidad utilizando objetivos de 40 aumentos
DIFERENCIACION BIOQUMICA
TSI
LIA Cp Ct
(glucosa, sacarosa
Especies MR-VP Oxidasa
lactosa,SH2 ) Lisina Indol Citrat
Ac. Ac. Ga SH2 o
Sup Fon s
+ + + - V + - + - -
Escherichia coli
+ + + - - V + - + -
Klebsiella
- + - + + - + + - -
Salmonella typhi
- + - - - V - - - -
Shigella
- + - V - - V + - -
Proteus
61
PRACTICA N 25
ESTUDIO E IDENTIFICACION DE VIBRIO CHOLERAE
INTRODUCCION
Los miembros de la familia Vibrionaceae, se encuentran en el agua dulce y salada. Incluye los
gneros: Vibrio, Aeromonas y Plesiomonas. El gnero Vibrio comprende muchas especies siendo
las de importancia mdica Vibrio cholerae, causante del clera epidmico; V. parahaemolyticus,
causante de gastroenteritis; V. vulnificus, causante de bacteriemia, infecciones en heridas
cutneas, celulitis; y V. alginoliticus, responsable de otitis externa, infeccin de heridas cutneas,
tejidos blandos.
Son bacilos Gramnegativos, curvados, con aspecto de coma de 1-5 m, se presentan solos, en
parejas o en cadenas que semejan espirilos, muy mviles, poseen un flagelo polar, no forman
esporas, sin cpsula, aerobios y oxidasa positivo.
La ltima pandemia fue producida por el biotipo El Tor, serotipo Ogawa.
Desarrollan en medios enriquecidos como el agar sangre, el medio selectivo TCBS (tiosulfato, citrato,
sales biliares, sacarosa, indicador Azul de timol y Azul de bromotimol) y medios alcalinos.
MATERIAL
Placa Petri con medio TCBS sembrada con V. cholerae y V. parahaemolyticus

Tubos con TSI
Tubos con LIA
Tubo con Caldo peptonado
Tubo con MR-VP
Tubo con Citrato de Simmons
Desoxicolato de sodio al 0.5
% Lminas portaobjetos
Microscopios
Aceite de cedro
PROCEDIMIENTO Y LECTURA
1. En Agar TCBS (thiosulfato, citrato, sales biliares, sacarosa): Se observan las colonias de V.
cholerae, de 2-4 mm de dimetro, lisas, con un centro opaco y periferia transparente,
circulares, de color amarillo (resultado de la utilizacin del citrato y formacin de cidos a
partir de la utilizacin de la sacarosa)
En Agar TCBS las colonias de V. parahaemolyticus se observan colonias circulares, de aspecto
62
verde- gris translucido; V. alginolyticus se observa de color amarillo (sacarosa positiva)
2. En medio TSI, observar si hay acidez en la superficie y en el fondo por metabolismo de la
sacarosa, no produce H2 S.
3. En el caldo peptonado, detectar la presencia de indol
4. En el medio LIA observar si hay decarboxilacin de la Lisina.
5. En el medio MR- VP detectar la produccin del acetil-metil-carbinol
6. En el medio Citrato de Simmons, observar la formacin o no de hidrxido de amonio
7. Realizar un frotis de ambas especies y colorear con Gram
8. Realizar la prueba de la cuerda positiva, colocando una gota de la solucin de
Desoxicolato sobre una lamina portaobjetos, luego con el asa de siembra en aro transferir una
colonia de V. cholerae, mezclar y observar que se produce una suspensin viscosa al retirar el
asa como una cuerda larga que se torna mas pegajosa despus de 60 segundos mas.
9. Realizar las lecturas en los medios diferenciales bioqumicos sembrados.
PROTOCOLO
MEDIOS Vibrio cholerae Vibrio parahaemolyticus
TSI Acidez en superficie y profundidad Acidez superficie y

profundidad
LIA Positiva por descarboxilacin de la Positiva

Lisina
VP 10- 50% cepas es positivo Negativo
MR Negativo Negativo
Indol Positivo Positivo
Citrato Negativo Negativo
Urea Negativo Negativo
Oxidasa Positiva Positivo
Catalasa Positiva Positiva
Prueba de la cuerda Positiva Negativo
RESULTADOS
1. Realizar esquemas de lo observado en la prctica

2. Realizar las pruebas bioqumicas correspondientes.
63
PRACTICA N 26
ESTUDIO E IDENTIFICACION DEL GENERO LEPTOSPIRA
INTRODUCCION
Las Leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, con las espiras estrechamente unidas,
muy mviles, con una longitud de 6 a 20 m y 0.1 m de dimetro, sus extremos semejan a
ganchos semicirculares (ocasionalmente se presentan rectos).
El gnero Leptospira (Noguchi, 1917) pertenece a la Familia Leptospiraceae, Orden Spirochetales;

comprende 6 especies patgenas Leptospira interrogans con 18 variantes serolgicas, L. noguchi,
L. santarosai, L. borgpetersenii, L. weilii, L. kirhneri y L. inadai, y mas de 200 serovares
saprofitos comprendidos dentro de Leptospira biflexa. Se diferencian por su virulencia, sus
propiedades antignicas, reactividad frente a anticuerpos monoclonales, la prueba de la
endonucleasa de restriccin o la composicin de su DNA.
La Leptospirosis es una zoonosis de distribucin mundial. Los reservorios naturales son los
roedores y una gran variedad de animales silvestres y domsticos, los cuales eliminan con la orina
el agente etiolgico, contaminando el agua, suelo, alimento, etc. El mecanismo de transmisin
puede ser directo (orina, rganos de animales infectados) o indirecto (a travs del agua o material
contaminado. La puerta de ingreso al organismo humano es a travs de lesiones de la piel y
mucosas incluyendo la conjuntiva ocular.
Se colorean por mtodos especiales como Fontana Tribondeau (contiene nitrato de plata) y
coloracin de Kiktenko, ya que toman dbilmente los colorantes de anilina. Son visibles al
microscopio de campo oscuro en preparaciones frescas.
Desarrolla en medios especiales lquidos, semislidos y slidos enriquecidos con suero de conejo
o carnero al 8-10%, a una temperatura ptima de 28 30C, en un periodo de incubacin de 5- 10
das, en condiciones de aerobiosis.
Para el diagnstico definitivo de Leptospirosis se requiere de:
1. Aislamiento de la Leptospira a partir de muestras clnicas (sangre, lquido cefalorraqudeo,

orina) en medios de cultivo o inoculacin en hmster o cobayo.
2. Evidencia sexolgica en sueros pareados con incremento cudruple del ttulo de
diagnstico inicial de 1:100
64
MATERIAL
Cultivo de Leptospira en medio semislido de Fletcher- modificado

Lamina control coloreada por el mtodo de Kiktenko, Vago, Fontana Tribondeau, o Rojo de
Congo.
Microscopio.
LECTURA
En el medio semislido de Fletcher- modificado observar el desarrollo de las Leptospiras en

todo el tubo y la formacin de un anillo a unos milmetros de la superficie del medio
En la coloracin de Kiktenko las Leptospiras se tien de un color rosado- violeta en fondo
incoloro, presentndose sueltas o entrelazadas, semejando la letra C S, generalmente con los
extremos en forma de semigancho y con las espiras bien unidas.
En la observacin al microscopio de campo oscuro, las leptospiras se observan como un
collar de perlas son muy mviles, realizan movimientos de translacin, rotacin y al rededor
de su eje.
RESULTADOS
1. Caractersticas del cultivo observado.

2. Realiza esquema de la observacin en las lminas coloreadas
65
UNIVERSIDADPRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
PRACTICA N 27
ESTUDIO E IDENTIFICACCON DE BARTONELLA
INTRODUCCIN
La familia Bartonelaceae comprende cinco (5) especies, siendo B. bacilliformes la causante de la

Bartonelosis humana o Enfermedad de Carrin y se transmite a travs de la picadura de un insecto
alado hematfago conocido como Lutzomya.
Bartonella bacilliformes presenta un marcado polimorfismo (bacilar, cocobacilar, cocoide), su

tamao vara entre 1- 3 m de longitud por 0.25- 0.30 m de dimetro, presenta flagelos unipolares
en nmero de 1 a 10. En los cultivos jvenes predominan las formas bacilares (forma virulenta), y
en cultivo viejo la forma cocoide (no virulenta)
Se colorea escasamente con los colorantes de anilina (Gram negativas), pero si tiene afinidad por
los colorantes derivados de Romanowski (Giemsa, Leishman, Wright).
Desarrolla en aerobiosis y microaerobiosis, a una temperatura ptima de 29C en medios

enriquecidos con peptona, triptosa, y plasma (gel de fases) y medio bifsico con sangre y plasma,
durante un periodo de incubacin de 5- 10 das. Su crecimiento es lento por lo general semanas,
enturbia el medio con sedimento y a veces se observa pelculas o tmpanos en la superficie de la
parte lquida del medio.
Puede ser aislada de la sangre (Hemocultivo) en la fase hemtica de la enfermedad, de las lesiones
eruptivas (fase verrucosa o histioide) y del LCR en los casos de neurobartonelosis.
En el laboratorio se puede aislar la bacteria por Hemocultivo (fase hemtica) usando el agar de
fases, medio de aislamiento primario, por cultivo del verrucoma (fase eruptiva); se pueden realizar
pruebas serolgicas (aglutinaciones, fijacin de complemento, Elisa, etc.), por Infeccin de los
hemates humanos por Bartonella (Danza de los hemates) e Inhibicin del movimiento de los
hemates por accin de anticuerpos especficos antibartonella
MATERIAL
Frotices coloreados por Leishman, Wrigth Giemsa procedentes de

cultivo. Cultivo de la bacteria en Medio Agar Gel de Fases
Cortes histolgicos de verrucoma coloreados con Hematoxilina eosina
PROCEDIMIENTO E INTERPRETACIN
Observar al microscopio las lminas coloreadas y apreciar la morfologa y tincin de

Bartonella. En las lminas coloreadas observar las bacterias en forma de empalizada y en
forma aislada. En los cultivos observar la turbidez del medio, la formacin de sedimento y la
formacin de pelculas o tmpanos
Realizar esquemas de las observaciones realizadas.
66
PRACTICA N 28
ESTUDIO E IDENTIFICACIN DE TREPONEMA PRUEBA DE VDRL RPR
INTRODUCCIN
Las espiroquetas constituyen un grupo grande y heterogneo de microorganismos espirilares
mviles, dentro de las cuales se encuentra la familia Treponemataceae que comprende tres gneros
de microorganismos patgenos para el hombre: Treponema ( T. pallidum, causa la sfilis, T.
pertenue, produce el pin, T. carateneum, produce el pinto), Borrelia ( B. recurrentis produce la
fiebre recurrente, B. burgdorferi causa la enfermedad de Lyme), y Leptospira que origina
infecciones generales con fiebre, ictericia y meningitis.
La especie T. pallidum se caracteriza por ser de forma espiral delgados y miden 0.2 m de ancho y
5 a 15 m de largo, son mviles y giran constantemente, no se tien bien con los colorantes de
anilina y es difcil su cultivo en medios artificiales.
PRUEBAS DE DIAGNOSTICO
1. Las muestras obtenidas de las lesiones superficiales tempranas (lquidos tisulares) pueden
observarse en un microscopio de campo oscuro buscando las espiroquetas mviles
caractersticas.
2. Por inmunofluorescencia usando suero antitreponema marcado con fluoresceina
3. Pruebas serolgicas para sfilis, estas pueden usar antgenos treponmicos o antgenos no
treponmicos (cardiolipina purificada del corazn de buey)
4. Prueba de Floculacin (VDRL), el antgeno VDRL es una solucin alcohlica que contiene
0.03% de cardiolipina, 0.9% de colesterol y lecitina purificada; esta prueba esta basada en que
las partculas del antgeno lipido (cardiolipina) permanecen dispersas en suero normal y en
enfermos se combina con la reagina de la sfilis (la reagina es una mezcla de IgM e IgA
dirigidos contra algunos antgenos).
MATERIALES
Suero problema Laminas excavadas
Antgeno VDRL Pipetasgraduadas
PROCEDIMIENTO
Tomar con una pipeta 0.05 ml de suero calentado (bao Mara a 56C x 30) sobre la lamina
excavada
Aadir una gota del antgeno VDRL sobre el suero y rotar durante cuatro (4) minutos
Observar al microscopio con objetivo de menor aumento la formacin de floculos cuando la
reaccin es positiva.
RESULTADOS
N (No reactivo) ........................ Ausencia de floculos
RD (Reactivo dbil) ........................ Floculos pequeos
R (Reactivo) ....................... Floculos medianos y grandes
67
PRACTICA N 29
CULTIVO DE MUESTRAS DE INFECCIONES URINARIAS: UROCULTIVO
INTRODUCCION
El Urocultivo es el examen de muestras de orina que permiten el aislamiento de agentes

patgenos causantes de una infeccin urinaria.
Para la obtencin de muestras debe considerarse:
La recoleccin debe ser con un mnimo de contaminacin
Establecer el momento ptimo para la recoleccin, con el objeto de tener la mejor
probabilidad de recuperar microorganismos causales.
Obtener una cantidad suficiente de la muestra para efectuar las tcnicas de cultivo necesarias.
Toda vez que sea posible, obtener las muestras antes de la administracin de antibiticos.
Normalmente la orina es estril, pero al tomarse la muestra existe la posibilidad de

contaminacin por lo que se realiza de rutina el Urocultivo cuantitativo:
1. Si existe menos de 10,000 grmenes por ml. se considera como contaminantes, siendo la
muestra negativa.
2. Cuando la orina tiene ms de 100,000 bacterias por ml, se considera que hay infeccin urinaria.
3. Si el nmero de grmenes oscila entre 1,000 a 100,000 se interpreta como dudoso y ser
necesario repetir el cultivo.
La orina debe ser procesada en el laboratorio dentro de las 2 horas siguientes a la recoleccin para
lograr recuentos de colonias exactos, luego se deber identificarlas y realizar el Antibiograma
correspondiente.
MATERIAL
Muestra de orina patolgica

Sedimento de orina
Agar Mac Conkey, Medio hipertnico de Chapman (Agar Manitol), Agar Sabouraud, en
placas Agar nutritivo en tubos con 20 ml licuado +/- 50C
Agar Mac Conkey en tubos con 20 ml licuado +/- 50C
Tubos con medio TSI, LIA, Caldo peptonado, MR-VP, Agar Citrato de Simmons, Agar Urea
de Christensen.
Tubos con 9.9 ml de Suero fisiolgico
0.85% Pipetas de 1 ml. estriles
Placas Petri, vacas estriles
68
Bocal con desinfectante
Microscopio
Serie de colorantes de Ziehl- Neelsen
Serie de colorantes de Gram
Lminas portaobjetos y laminillas
PROCEDIMIENTO
PRIMER DIA:
A. Estudio de las caractersticas macroscpicas

Describir el aspecto de la orina:
Color (amarillo, oscuro, castao o incoloro)
Sealar si la orina es clara o turbia.
B. Estudio de las caractersticas microscpicas
1. Obtener una gota del sedimento urinario y observarlo entre lmina y laminilla al
microscopio con objetivos de 10X y 40X
2. Realizar un frotis y colorear por el mtodo de Gram y Ziehl- Neelsen
C. Siembra de la muestra de orina:
1. Tomar 0.01 ml. de la orina sin centrifugar y sembrar por dispersin agotamiento en las
placas con Agar Mac Conkey, Agar Manitol y Agar Sabouraud
2. Mtodo de dilucin: Preparar una dilucin de la orina de la siguiente manera.
a) Con la pipeta de 1 ml, obtener 0.1 ml de orina sin centrifugar y transferirlo al tubo con
suero fisiolgico 0.85% estril. Mezclar bien.
b) Con la misma pipeta transferir 0.1 ml de la mezcla a cada una de las placas Petri vacas
estriles.
c) A cada una de las placas agregar el Agar Mac Conkey licuado y a la otra el Agar
nutritivo licuado, rotar sobre la mesa del laboratorio para obtener una mezcla
homognea.
d) Una vez solidificado el Agar, incubar a 37C por 18- 24 horas.
LECTURA
1. En el sedimento de la orina los elementos que pueden observarse son: pus, eritrocitos, cristales
anormales, leucocitos, levaduras, parsitos, espermatozoides, clulas epiteliales, cilindros.
2. En los frotices coloreados por Gram, observar la presencia de bacterias Gram positivas y
Gram negativas, y por el mtodo de Ziehl- Neelsen las bacterias cido alcohol resistentes(en
caso de infeccin por Mycobacterium).
SEGUNDO DIA:
1. En la siembra de la orina sin centrifugar, observar en la placa de Agar Mac Conkey el

crecimiento de colonias lactosa positivas; en las placas de Agar Manitol, el desarrollo de
69
colonias resistente a altas concentraciones de sales, y en el Agar Sabouraud, si hay presencia
de levaduras.
2. En la siembra por dilucin, observar el desarrollo bacteriano en las placas, contar el nmero
de colonias en un 1/8 de la placa y multiplicarlo por 8 y luego por 1000.
3. Se deber seleccionar una colonia lactosa positiva y negativa del Agar Mac Conkey, preparar
suspensiones en caldo nutritivo y realizar las pruebas diferenciales en la serie bioqumica
respectivamente: TSI, Caldo peptonado, MR-VP, Citrato de Simmons, LIA y Urea de
Christensen. Incubar a 37C por 18-24 horas.
Nota: El agente causal aislado e identificado deber ser sometido a Pruebas de Susceptibilidad
Antimicrobiana. El Antibiograma se realiza tomando 5 colonias del Agar Mac Conkey, se
prepara una suspensin en un tubo con SF al 0.85%, y se determina la Concentracin Mnima
Inhibitoria (MIC) del antibitico cuya finalidad es orientar en la teraputica y la concentracin
del antibitico alcanzado en el suero o en foco de infeccin.
El mtodo de disco-difusin estandarizado [Kirby - Bauer] es el que se usa de rutina en el
laboratorio, para dicha determinacin (MIC).
REPORTE FINAL
Disear el protocolo correspondiente, sealando:

1. La observacin macroscpica y microscpica de la muestra clnica.
2. Las caractersticas del desarrollo bacteriano, y los principios bioqumicos en cada uno de los
medios selectivos empleados.
3. Los resultados del comportamiento bioqumico.
4. La determinacin del agente patgeno causante de la infeccin urinaria.
5. Determinacin cuantitativo nmero de UFC por ml.
Nota: UFC (Unidad Formadora de Colonia)
70
PRACTICA N 30
AISLAMIENTO DE VIRUS EN HUEVOS EMBRIONADOS Y EN RATONES

LACTANTES.
OBSERVACION DE LMINAS COLOREADAS
INTRODUCCION
Los virus son agentes infecciosos responsables de numerosas enfermedades del hombre, de los
animales, de las plantas y tambin de las bacterias (bacterifagos).
En este captulo analizaremos solamente los virus que producen patologa en el ser humano; debido
a sus caractersticas especiales como son su pequeo tamao y su parasitismo intracelular
obligado, los virus no pudieron ser estudiados hasta principios del siglo XX, si bien algunas de las
enfermedades producidas por ellos ya se conocan desde la antigedad (viruela, rabia, hepatitis,
etc.). Dado que los virus carecen de los constituyentes fundamentales para el crecimiento y
multiplicacin deben necesariamente utilizar los sistemas de las clula que parasitan y por ello se
denominan parsitos intracelulares obligados.
En los ltimos aos, se han desarrollado mtodos de diagnstico rpido para la mayora de las
infecciones virales as como drogas antivirales especficas para muchos virus.
Se emplean mtodos directos para el diagnstico de los virus, y dado que estos solo se replican en
el interior de las clulas vivas, para su cultivo in Vitro es necesario el empleo de mtodos especiales
en el laboratorio de virologa, tales como:
a) Cultivos tisulares de humanos o animales. La mayora de los virus pueden multiplicarse
en cultivo de clulas apropiadas.
b) Embriones de pollo (membrana corioalantoidea, cavidad amnitica, cavidad alantoidea y
saco vitelino).
c) Animales de laboratorio (ratones lactantes, Hmsters, monos)
d) Serologa o demostracin de anticuerpos frente al virus.
e) Demostracin directa del virus o de antgenos vricos a partir de frotis de las lesiones.
OBJETIVO DE LA PRCTICA
El aislamiento de los virus es de gran importancia en la investigacin mdica y epidemiologa y

constituye un mtodo muy extendido para el diagnstico de la infeccin.
Por lo tanto estas prcticas nos orientan a conocer los diversos mtodos de aislamiento directo o
indirecto para demostrar los efectos citopticos de los diferentes virus y sus formas como se deben
evaluar en los diferentes procesos infecciosos que generan en el ser humano.
METODOS DE DIAGNOSTICO VIROLGICO:
71
A. USO DE LOS HUEVOS EMBRIONADOS PARA LA PROPAGACION DE LOS VIRUS.
Muchos de los virus y rickettsias patgenas para el hombre y los animales pueden propagarse en
las clulas vivas de las membranas extraembrionarias o en el propio embrin de huevos
embrionados de gallina. Estas tcnicas fueron introducidas por Footdpasture y col., en 1931, y
desde entonces estn siendo ampliamente usadas.
Las vas de inoculacin y la edad del embrin a usar dependen del agente viral que va a ser
inoculado.
MATERIALES

Huevos embrionados de 7-9 das.

Huevos embrionados de 10-12 das.

Jeringas de tuberculina con aguja N 25 x y 22 x 2.

Colorante Fucsina al 1% con agua destilada

Colorante Azul de metileno al 1% con agua destilada

Frascos con Alcohol yodado

Algodn

Ovoscopio

Cinta adhesiva o parafina para sellar los huevos embrionados

Equipo de diseccin (Pinzas, tijeras curvas, guantes)
INOCULACION DEL COLORANTE POR VIA ALANTOIDEA
a) Marcar y limpiar con alcohol yodado, huevos de 10-12 das.

b) Hacer un pequeo orificio con el punzn en la zona marcada de huevos embrionados.
c) Introducir la aguja de la jeringa cargada con colorante aproximadamente en ngulo de 45
e inocular 0.2 ml. de colorante.
d) Se tapa la abertura con cinta adhesiva o cera calentada y se deja en incubacin a 33-35C por
2-4 das, luego cosechar y observar.
INOCULACION POR VIA AMNIOTICA
a) Marcar la cmara de aire y la posicin del embrin de 10-12 das.

b) Limpiar con alcohol yodado un rea de la cmara de aire que est situada por encima del
embrin y hacer una perforacin rectangular de 0.5 cm, con el punzn.
c) Deja caer una gota de suero fisiolgico o aceite mineral estril, para visualizar una zona no
vascularizada de la membrana corioalantoidea subyacente.
d) Con una pinza curva introducir a travs de esta rea, coger hacia arriba la membrana amnitica,
formando una pequea tienda en la base del cual se inyecta 0.2 ml, de la solucin de Azul
de metileno o del inoculo problema.
e) Se suelta la membrana que se localiza en su sitio de origen.
f) Se sella la abertura del huevo con cinta adhesiva o cera caliente y se deja incubando a 33-35C
por 2-4 das (sujeto a la muestra: Influenza)
INOCULACION DEL SACO VITELINO
a) Limpiar con alcohol yodado, la porcin de la cscara que cubre la cmara de aire del huevo
embrionado de 6-7 das.
b) Perforar la cscara en el centro de la cmara de aire.
c) Con una jeringa de 1 ml y aguja de 22x inocular 0.5 ml de Azul de metileno, introduciendo la
72
aguja verticalmente a travs de la cmara de aire, hasta 35 mm de
profundidad. d) Sellar la abertura
COSECHA DE LOS LIQUIDOS (SEGN LAS CAVIDADES INOCULADAS)
a) Comprobar que el embrin este vivo. Enfriar a 4C los huevos embrionados por algunas horas
(2-3 horas antes) para prevenir sangrado de los embriones.
b) Cortar la cscara que cubre la cmara de aire y separar con pinzas, las membranas subyacentes.
c) Verter el contenido del huevo embrionado en una placa Petri. Observar la localizacin del
Azul de metileno y/o Fucsina en las zonas de inoculacin (Membrana alantoidea, amnitica,
corioalantoidea y saco vitelino).
d) Cosechar las membranas en estudio y extraer el liquido alantoideo, amnitico y realizar las
pruebas de diagnstico correspondientes segn la investigacin solicitada
D. INOCULACIN EN RATONES LACTANTES:

Se utilizaran ratones lactantes y las vas de inoculacin sern:
Intraperitoneal, Intracraneal, Subcutnea y Nasal.
E. OBSERVACIN DE LAMINAS COLOREADAS:
Observar la presencia de cuerpos anormales intracelulares denominados cuerpos de inclusin

(Efecto citopatico). Estas estructuras pueden encontrarse en el ncleo o en el citoplasma y su
localizacin es especfica de la enfermedad viral.
Se considera estos cuerpos de inclusin (efecto citopatico) como conglomerados de virus
asociados a productos de reaccin de la clula infectada.
OBSERVACIN DE LMINAS:
1. Cultivo de clulas normales, coloreadas con Hematoxilina eosina (HE), no se tie de rosado
el citoplasma.
2. Rabia: corte histolgico de cerebro. Coloracin HE. Observar inclusiones eosinofilas

intracitoplasmticas denominadas corpsculos de negri.
3. Enterovirus- Virus Polio: En cultivos de clulas humanas (HEP-2), observar la degeneracin

celular, el redondeamiento celular, la picnosis nuclear y desplazamiento del ncleo hacia el
borde de la clula.
4. Herpes simple en cultivos de clulas: Observar las clulas gigantes polinucleadas, las
inclusiones eosinofilas intracelulares denominadas cuerpos de Lipschutz.
5. Citomegalovirus en sedimento de orina: Observar la inclusin intranuclear basfila en

ojos de lechuza rodeada de un halo claro y el citoplasma ce color azulado (Basfilo).
6. Adenovirus en cultivo de clulas HEP-2: Observar la agrupacin de clulas en racimo y las

inclusiones basfilas intranucleares.
PROTOCOLO
Esquematizar los resultados de las inoculaciones realizadas.
73
74
PRACTICA N 31
ESTUDIO E IDENTIFICACIN DE HONGOS AMBIENTALES
INTRODUCCION
Los hongos ambientales se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza viviendo a

expensas de la materia inerte existente, la mayora se encuentra como saprofito, otros pueden ser
causantes de inducir hipersensibilidad as como tambin ser responsables de infecciones. Entre los
hongos ambientales comunes tenemos: Aspergillus, Penicilluim, Fusarium, Rhizopus,
Cephalosporium, Helmintosporium, Rhodotorula
MATERIALES

Tubos con cultivo de Aspergillus, Penicillium,
Fusarium, Rhizopus, Cephalosporium,
Rhodotorula y Helmintosporium.

Lminas con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados.

Microscopios
PROCEDIMIENTO
1. Estudie las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de

micelio areo, aspecto de la colonia, produccin de pigmento y consistencia de la colonia.
2. Observar al microscpico utilizando lentes de menor y mediano aumento, las caractersticas
microscpicas de cada uno de los hongos preparados en las lminas con azul de lactofenol.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS AMBIENTALES
Aspergillus
Colonias al inicio de color blanco, luego vara de acuerdo a la especie en: amarillo, verde azufrado,
marrn o negro.
Microscpicamente presenta hifas tabicadas que forman conidiforos no tabicados que se
ensanchan en su extremo distal dando lugar a la cabeza aspergilar que da origen a los esterigmas
y de donde salen las conidias en cadena.
Penicillium
Colonias de color azul verdosas, pulverulento y desarrollo abundante.
Microscpicamente presenta hifas tabicadas con conidiforos ramificados en cuyo extremo se
hallan los esterigmas en forma de pincel del cual se originan las conidias en cadena.
Fusarium
Colonias de micelio areo algodonoso de color rosado violeta en la superficie.
75
Microscpicamente presenta filamentos tabicados con cortos conidiforos, macroconidias
septadas y alargadas, fusiformes.
Rhizopus
Colonias de micelio areo, de aspecto algodonoso, de un color blanco grisceo.
Microscpicamente presenta hifas sin septos, rizoides a partir de los cuales se forman largos
esporangioforos que terminan en una estructura globosa llamada esporangio en cuyo interior se
encuentran las esporas.
Cephalosporium
Colonias de micelio areo de color blanco- rosado o blanco- amarillento.
Microscpicamente presentan hifas septadas, conidiforos cortos que dan origen a conidias
hialinas agrupadas.
Helmintosporium
Colonias de color gris al inicio, despus se torna de color negro en el centro, con la periferia
elevada de color gris.
Microscpicamente se observan hifas septadas y macroconidios con septos longitudinales sobre
conidiforos cortos y nudosos
Rhodotorula
Desarrolla colonias de aspecto cremoso, de color rojo o rosado debido a que forma pigmentos
carotenoides. Microscpicamente se observa clulas ovoides o redondeadas con o sin yema.
PROTOCOLO
Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la prctica.
76
77
PRACTICA N 32
ESTUDIO E IDENTIFICACIN DE HONGOS DERMATOFITOS
INTRODUCCION
Los dermatofitos son organismos queratinfilos que invaden las estructuras queratinizadas del
cuerpo como la piel, pelo y uas. Las artrosporas se adhieren a los queratinocitos, germinan y los
invaden, son causantes de las micosis superficiales y constituyen una de las infecciones ms
comunes en los humanos.
Los agentes causales mas importantes son los hongos del gnero Trichophyton, Microsporum y
Epidermophyton, as como tambin Malassezia furfur que es causante de la Tia versicolor o
Pitiriasis versicolor y la Piedraia hortai que afecta los pelos y produce ndulos en el tallo piloso
de los cabellos, barba y bigote.
Por su hbitat pueden clasificarse en: Zooflicos (Microsporum canis), Geoflicos (Microsporum
gypseum), y Antropoflicos (Epidermophyton).
MATERIALES

Tubos con cultivo de: T. rubrum, T. mentagrophytes, T. tonsurans, M. canis, M. gypseum y E. floccosum.

Lmina con azul de lactofenol de cada uno de los hongos mencionados.

Lminas preparadas de M. furfur en hidrxido de potasio al 20%.

Lminas preparadas de pelo infectado con Piedraia hortai.

Material bsico de laboratorio(xilol, algodn, alcohol)

Microscopios con lentes de menor y mediano aumento.
PROCEDIMIENTO
1. Estudiar las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de

micelio, aspecto de la colonia , produccin de pigmento y consistencia de la colonia.
2. Observar al microscopio las caractersticas microscpicas de cada uno de los hongos
preparados en lminas.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DERMATOFITOS, MALASESSIA Y PIEDRAIA.
Trichophyton rubrum
Colonias de micelio areo blanco, de aspecto algodonoso, al reverso puede observarse un
pigmento de color prpura.
Al microscopio se observan hifas septadas con microconidias ssiles piriformes, a veces puede
observarse macroconidias, clamidosporas y cuerpos nodulares.
78
Trichophyton mentagrophytes
Colonias blanquecinas pulverulentas, granuladas, yesosas, al reverso puede observarse un
pigmento amarillo- pardusco.
Al microscopio se observan hifas septadas con abundante microconidias esfricas agrupadas,
pueden presentar hifas en espiral y macroconidias.
Trichophyton tonsurans
Colonias membranosas, crateriformes o cerebriformes de consistencia acartonada con
pigmentacin amarillo- castao al reverso.
Al microscopio se observan microconidias piriformes hialinas, clamidosporas, e hifas en raquetas
septadas, pueden observarse macroconidios.
Microsporum gypseum
Colonias poco elevadas pulverulentas con pigmento de color canela.
Al microscopio se observan hifas septadas, macroconidios con tabiques transversales en nmero
de 4-6, rara vez se observan microconidias.
Microsporum canis
Colonias de color blanquecino poco elevado, con pigmento amarillo- naranja en el reverso de la
colonia.
Al microscopio se observan macroconidios fusiformes hasta con 8 tabiques transversales y con
pequeas excrecencias en la superficie, pueden tambin observarse microconidias y clamidosporas.
Epidermophyton floccosum
Colonias de aspecto aterciopelado, pulverulentas de color amarillo- azufre con pliegues en la
colonia.
Al microscopio se observan macroconidios con su extremo distal romo y con 3-4 tabiques
transversales, pueden encontrarse aisladas o en racimo.
Malassezia furfur (Pityrosporum)

Al microscopio se observan hifas cortas de extremos romos al lado de formas redondeadas
agrupadas; este hongo no desarrolla en medios comunes por lo que el diagnstico se da por el
examen directo de la muestra
Piedraia hortai
Los ndulos se observan en el tallo piloso como costras arenosas, duras de color pardo a negro
que envuelven completamente el tallo piloso.
PROTOCOLO
Realizar esquemas o dibujos de lo observado en la prctica
79
80
PRACTICA N 33
ESTUDIO DE HONGOS LEVADURIFORMES.

OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.
INTRODUCCION:
Los hongos levaduriformes son frecuentes al estado saprofito en el suelo, aguas, plantas y en las
cavidades naturales del hombre como el tubo digestivo y en las regiones de los pliegues cutneos.
Muchas especies han sido vinculadas a infecciones humanas como la Candida albicans y otras
especies de Candida que puede producir infecciones agudas o crnicas en la piel o mucosas,
aparato genito- urinario, y respiratorio; otras levaduras como Cryptococcus neoformans pueden
causar infecciones cerebrales y rara vez infecciones cutneas; en el hombre la infeccin primaria
es casi siempre pulmonar.
MATERIALES

Cultivo con Candida albicans y Cryptococcus neoformans.

Lminas de Candida albicans en Agar harina de maz.

Lminas de Cryptococcus neoformans en tinta china.

Cortes histolgicos con C. albicans y Cr. neoformans.

Material bsico de laboratorio (xilol, algodn, alcohol)

Microscopios con lentes de menor y mayor aumento.
PROCEDIMIENTO
1. Estudiar las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el aspecto y
consistencia de la colonia.
2. Observar al microscopio las caractersticas que presentan cada especie de los hongos en el
Agar harina de maz, tinta china y en los cortes histolgicos.
CARACTERISTICA DE LOS HONGOS LEVADURIFORMES
Candida albicans

Las colonias son de aspecto cremoso y consistente, de color blanco perlado.
albicans.
En el Agar- almidn- arroz, se observan clamidospora, pseudomicelio y blastospora que tipifican a Candida
observar la presencia de filamentos cortos y levaduras en las lesiones rodeadas de

En los cortes histopatolgicos
una zona de histiocitos.
Cryptococcus neoformans
Las colonias son de color blanquecino perlado al inicio, luego se tornan de color ocre, de aspecto mucoide
viscosas y brillantes con tendencia a deslizarse hacia el fondo del tubo de cultivo.
En las lminas con tinta china seaprecia la cpsula como un halo brillante entre el borde de la levadura y el fondo
oscuro dado por la tinta china.
vasos en las lesiones, las cuales

En los cortes histopatolgicos, se observan como levaduras a lo largo de los
comprimen los tejidos vecinos y los necrosan, escasa infiltracin celular.
81
82
PRACTICA N 34
ESTUDIO DE HONGOS DIMORFICOS.

OBSERVACION DE CORTES HISTOPATOLOGICOS.
INTRODUCCION
Los hongos dimrficos, son hongos causantes de infecciones mucocutneas y/o sistmicas en el
hombre y algunos animales.
Paracoccidioides brasiliensis
En su fase inicial esporgena, se encuentra en el suelo, fragmentos vegetales, espinas, etc. Y en su
fase de levadura en tejidos infectados.
Es el agente causante de la Paracoccidioidomicosis, infeccin crnica, granulomatosa de la piel,
mucosa, ganglios y vsceras. Es ms frecuente entre los trabajadores rurales.
Histoplasma capsulatum
En el ambiente natural se encuentra en la fase miceliar esporgena, que se desarrolla
principalmente sobre compuestos nitrogenados, tales como excretas de aves (gallina, lechuza),
excremento de murcilagos, etc., y en su fase de levadura se encuentra en tejido infectado.
Es el agente causal de la Histoplasmosis que puede afectar el sistema respiratorio en su forma
benigna pudiendo producir calcificaciones dispersas en los campos pulmonares.
Sporothrix schenckii
Hongo que vive en el suelo, sobre plantas, produce la Esporotricosis en el hombre y algunos animales,
el hongo ingresa generalmente por traumatismo con restos punzantes de vegetales contaminados con
el hongo. La infeccin esta localizada preferentemente en los ganglios linfticos
MATERIALES

Cultivo en Agar Sabouraud y Agar BHI de P. brasiliensis, H. capsulatum, S. schenckii.

Microcultivos coloreados con Azul de lactofenol

Cortes histolgicos infectados por estos hongos.
PROCEDIMIENTO
1. Estudiar las caractersticas macroscpicas de los diferentes cultivos, observando el tipo de
micelio, aspecto de la colonia y consistencia de la colonia.
2. Observar las caractersticas microscpicas de cada uno de los hongos.
CARACTERISTICAS DE LOS HONGOS DIMORFICOS

Paracoccidioides brasiliensis
En los frotices coloreados con Leishman o en cortes histolgicos, se presentan como clulas
esfricas u ovaladas de 10 a 80 micras de dimetro, con doble membrana y multigemantes.
En cultivo en Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias de micelio areo de color blanco
compacto, de crecimiento lento. Microscpicamente se observan filamentos hialinos, tabicados
con microconidias esfricas o piriformes.
83
En Agar Infusin cerebro corazn (BHI), se observan colonias cerebriformes, de color beige
claro. Microscpicamente se observan clulas esfricas.
Histoplasma capsulatum
En frotices o cortes histolgicos se observan intracelularmente como nidos de levadura incluidas

en los histiocitos o polimorfonucleares. Las levaduras son pequeas, redondas u ovaladas de 1-3
micras de dimetro.
En Agar Sabouraud glucosado, desarrolla colonias algodonosas de color blanco. Microscpicamente
se observan hifas tabicadas con escasa produccin de microconidias y gran cantidad de macroconidias
tuberculadas redondas y grandes de pared gruesa Clamidospora tuberculada.
En el medio BHI desarrolla colonias pequeas de aspecto membranoso rugoso, color marrn claro.
Microscpicamente, se observan como clulas ovaladas a veces gemantes.
Sporothrix schenckii
En Agar Sabouraud glucosado desarrolla colonias al inicio pequeas, blanquecinas presentando
posteriormente un aspecto hmedo, rugoso y membranoso, de un color que puede variar de crema
a negro.
Microscpicamente se observan hifas finas tabicadas con cortos conidiforos en cuyo extremo se
encuentran las conidias agrupadas dando el aspecto de una margarita.
En medio BHI, desarrolla colonias levaduriformes. Al microscopio se observan clulas en
gemacin ovales o en forma de cigarrillos Gram positivos.
PROTOCOLO
Esquematice o dibuje lo observado en la prctica.
84
85
SEMINARIO-I
GENETICA MICROBIANA E INGENIERIA GENTICA
(Organizacin de los genes. Transferencia del DNA. Mutacin. Expresin gnica

e Ingeniera gentica)
TEMA 1 : ORGANIZACIN DE LOS GENES (ADN PROCARIOTICO)
TEMA 2 : TRANSFERENCIA E INTERCAMBIO DE LA INFORMACIN

GENETICA BACTERIANA.
TEMA 3 : MUTACIN Y SUS CONSECUENCIAS
TEMA 4 : EXPRESIN GNICA E INGENIERIA GENTICA Y SUS

APLICACIONES EN LA MEDICINA.
OBSERVACIONES A TENER EN CUENTA:
PRESENTACIN EN POWER- POINT Y TRPTICO

EXPOSICIN: CADA TEMA 10-15 MINUTOS
LUGAR: AULA DE CLASES TERICAS
HORA: EN HORAS DE PRCTICAS
PASO AL FINAL DE LA EXPOSICIN
Profesor Responsable del Curso
86
SEMINARIO II
VACUNAS ANTIMICROBIANAS. PROGRAMA DE VACUNACIN
(Tipos de vacunas. Requisitos de una buena vacuna)
TEMA 1: TIPOS DE VACUNAS Y CONSECUENCIAS PATOLGICAS DE

LA VACUNACIN.
TEMA 2: OBJETIVOS DE LA VACUNACIN Y REQUISITOS DE UNA

BUENA VACUNA.
TEMA 3: PRACTICAS DE VACUNACIN ACTUAL Y MEDIDAS DE CONTROL
TEMA 4: CONSECUENCIAS PATOLGICAS DE LA VACUNACIN
TEMA 5: PROGRAMAS DE VACUNACIN
87
SEMINARIO - III
ANTIBITICOS Y QUIMIOTERPICOS
(Mecanismos bsicos de actividad y resistencia a los antibiticos)
TEMA 1: CLASES DE AGENTES ANTIBACTERIANOS
1.1: Inhibidores de la Sntesis de la pared celular

1.2: Inhibidores de la Sntesis de protenas
1.3: Inhibidores de la Sntesis de cidos nucleicos
1.4. Inhibidores de la funcin de la membrana citoplasmtica
TEMA 2: RESISTENCIA A LOS AGENTES ANTIBACTERIANOS
2.1: Gentica de la resistencia

2.2: Mecanismos de resistencia
TEMA 3: CLASES DE AGENTES ANTIBACTERIANOS Y ANTITUBERCULOSTTICOS
3.1. Mecanismos bsicos de actividad

3.2. Mecanismos de resistencia
TEMA 4: CLASES DE AGENTES ANTIVIRALES
4.1: Mecanismos bsicos de actividad

TEMA 5: CLASES DE AGENTES ANTIMICTICOS

5.1: Mecanismos bsicos de actividad
88
SEMINARIO - IV
ENFERMEDADES DE TRANSMISION SEXUAL:

(ETS) Y SIDA
1. SFILIS CONGNITA. FASES DE LA ENFERMEDAD. DIAGNSTICO

SEROLGICO.
2. PAPILOMAVIRUS
3. VIRUS DE LA HEPATITIS B
4. VIRUS DE LA INMUNODEFICIENCIA HUMANA (VIH):
A) ETIOPATOGENIA DEL SIDA Y ESTRUCTURA DEL VIH
B) ASPECTOS GENERALES DEL CURSO DE LA INFECCIN POR VIH
C) EPIDEMIOLOGA. TRATAMIENTO Y PREVENCIN
89
SEMINARIO - V
ARBOVIRUS. DENGUE Y FIEBRE AMARILLA
TEMA 1: FIEBRE AMARILLA

a) ESTRUCTURA DEL VIRUS Y PATOGENIA
b) MANIFESTACIONES CLNICAS Y EPIDEMIOLOGA
TEMA 2: FIEBRE AMARILLA

a) DIAGNSTICO E INMUNOLOGA
b) PREVENCIN Y CONTROL
TEMA 3: DENGUE
a) ESTRUCTURA DEL VIRUS Y PATOGENIA
b) MANIFESTACIONES CLNICAS Y EPIDEMIOLOGA
TEMA 4: DENGUE
a) DIAGNSTICO E INMUNOLOGA
b) PREVENCIN Y CONTROL
90

G.P. Microbiologia 2017-I

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UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD ESCUELA

RECOMENDACIONES GENERALES PARA EL USO DEL LABORATORIO

11. Al finalizar el trabajo:

El Profesor Responsable del Curso

MICROSCOPIA: ESTUDIO Y MANEJO DEL MICROSCOPIO

1. Conocer e identificar correctamente las partes pticas y mecnicas del microscopio

Microscopios Pipeta Pasteur

III. PARTES DEL MICROSCOPIO

Tubo portalentes y cremallera Condensador

Ocular Lentes de condensador

IV. SISTEMAS QUE COMPRENDE EL MICROSCOPIO

1. Sistema de soporte: comprende el brazo, el pie, el tubo ocular, el revolver y la platina.

METODOS DE COLORACIONES: COLORACIONES SIMPLES. DIFERENCIALES

La mayor parte de los colorantes usados en Microbiologa son de tres tipos:

Las coloraciones pueden ser segn el nmero de colorantes que utilizan:

Muestra con mezcla bacteriana

COLORACIN AZUL DE METILENO:

1. Preparar un frotis con la mezcla bacteriana y fijar al calor

RESULTADO: Los microorganismos se observan de color azul intenso

COLORACIN DE TINTA CHINA O NEGATIVA:

1. Colocar una gota de tinta china sobre la lmina portaobjetos

COLORACIN AZUL DE LACTOFENOL:

1 Colocar una gota del colorante sobre la lamina portaobjetos

RESULTADO: Los microorganismos se observaran en un fondo azul celeste

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje la morfologa de los microorganismos observados

Son aquellas coloraciones que utilizan ms de un colorante y, generalmente el segundo colorante

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo realizado en prcticas.

COLORACION DIFERENCIAL DE ZIEHL-NEELSEN

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la prctica.

COLORACION ESPECIAL: COLORACION DE LEISHMAN Y VAGO

Es una coloracin especial policromtica utilizada para demostrar la presencia y morfologa de

1. Cubrir el frotis con el colorante y dejar actuar por 5 minutos.

Es utilizado para la coloracin de grmenes espirilares y espiroquetas, que no se colorean por el

Set de coloracin de Vago:

PROTOCOLO: Esquematice o dibuje lo observado en la prctica.

MEDIOS DE CULTIVO: SIMPLES, ENRIQUECIDOS, SELECTIVOS Y

Tiras de Papel indicador de Ph Tubos de 13x100 mm

Caldo nutritivo Agar simple o Agar nutritivo

I. MEDIOS DE CULTIVO SIMPLES

II. MEDIOS ENRIQUECIDOS

III. MEDIOS SELECTIVOS

IV. MEDIOS DIFERENCIALES

Realizar un cuadro indicando:

A. Los medios de cultivo preparados en cada mesa.

B. El color que presentan cada medio de cultivo preparado.

C. Materiales que usaron para la preparacin.

SIEMBRA BACTERIANA. MEDIOS DE AISLAMIENTO.

Cuando las bacterias se siembran en un medio de cultivo y en condiciones adecuadas, ocurre un

Las principales caractersticas morfolgicas que presentan las colonias son:

FORMA : Circular, elptica, puntiforme y filamentosa.

Con la ayuda del profesor:

METODOS DE SIEMBRA DESCRIPCION DE LA MEDIO DE CULTIVO

CARACTERISTICA OBSERVACION DE MEDIO DE CULTIVO

La identificacin bacteriana inicial puede realizarse mediante la determinacin de las

En el laboratorio, estos sistemas enzimticos se detectan inoculando una pequea porcin de la

I. ACCION SOBRE LOS CARBOHIDRATOS

Por definicin, la fermentacin es un proceso metablico de oxido- reduccin que ocurre en un

A) REACCIONES DE OXIDACIN- FERMENTACIN DE AZUCARES:

EN MEDIO TSI (Triple Sugar Iron)

Es indispensable que la lectura se haga en el tiempo de incubacin indicada.

B) PRODUCCION DE ACIDOS Y ACETIL- METIL- CARBINOL (Acetoina)

1. PRUEBA DEL ROJO DE METILO ( RM )